Karakterisering av lakvatten med Nitocra Spinipes. RVF Utveckling 2003:02 ISSN 1103-4092. RVF Utveckling

Karakterisering av lakvatten med Nitocra Spinipes RVF Utveckling 2003:02 ISSN 1103-4092 RVF Utveckling

RVF Utveckling 2003:02 ISSN 1103-4092 RVF Service AB Tryck: Daleke Grafiska 2003 Upplaga: 1000 ex

FÖRORD Kraven på lokal lakvattenrening ökar och därmed också kraven på mer kunskap om utsläppens påverkan i recipient. För detta behövs tillförlitliga metoder att karakterisera lakvattnet. Sådana ekotoxikologiska metoder finns, men dessa är inte heltäckande i beskrivningen av val av testorganismer. Idag finns ett standardiserat fortplantningstest med kräftdjuret Ceriodaphnia. Detta djur är dock känsligt för ammonium och klorider. Istället används i detta förslag kräftdjuret Nitocra spinipes som är betydligt mer lämpat för test av lakvatten. Resultaten från testerna är av värde för avfallsanläggningar i stort, men framförallt förenklas valet av ekotoxikologiska testmetoder. Förhoppningsvis leder detta också till att mer ekologiskt relevanta bedömningar av lakvattnets miljöfarlighet kan göras. Studien har utförts under medverkan av Söderhalls Renhållningsverk AB (SÖRAB), Telge Återvinning och professor Bengt-Erik Bengtsson vid Institutet för Tillämpad Miljöforskning (ITM), Stockholms universitet. Lokalt behandlat lakvatten från två olika anläggningar har använts, från Löt avfallsanläggning och från Tveta Återvinningsanläggning. Rapporten har huvudsakligen skrivits av projektledare Emma Breitholtz vid SÖRAB och professor Bengt- Erik Bengtsson. Telge Återvinnings kontrakterade konsult Margareta Friman- Scharin vid Friman Ekologikonsult AB har också medverkat i projektet och rapporten. Malmö i mars 2003 Anders Assarsson Ordf. RVFs Utvecklingskommitté Weine Wiqvist VD RVF 1

INNEHÅLLSFÖRTECKNING FÖRORD... 1 INNEHÅLLSFÖRTECKNING... 2 SAMMANFATTNING... 3 INLEDNING... 4 LAKVATTEN... 6 Löt avfallsanläggning...6 Provtagning, Löt...6 Övriga ekotoxtester (Löt)...7 Kemiska analysresultat, Löt...8 Resultat från övriga ekotoxtester...8 Tveta Återvinningsanläggning...8 Provtagning, Tveta Återvinningsanläggning...9 Kemiska analysresultat, Tveta Återvinningsanläggning...10 TESTMETOD MED NITOCRA SPINIPES...10 Akut test...11 Kroniskt test...11 Testbetingelser...12 Giltighet...12 RESULTAT NITOCRA SPINIPES...12 Löt avfallsanläggning...12 Tveta Återvinningsanläggning...13 Övrigt...14 SLUTSATSER...15 REFERENSER...17 2

SAMMANFATTNING Ökade krav på karakterisering av lakvatten från avfallsdeponier och miljöriskbedömningar i samband med lokal behandling av lakvatten har tydliggjort behovet av stabila biologiska testmetoder. Hittills har saknats organismer som är lämpliga vid testning av lakvatten pga. av vattnens höga ammoniumkväve- och salthalter. I denna studie har kräftdjuret Nitocra spinipes användbarhet vid karakteriseringar av lakvatten studerats. Två olika lakvatten, från Löt avfallsanläggning i Vallentuna och Tveta Återvinningsanläggning i Södertälje har ingått i studien. Resultaten från de kroniska testerna som utfördes med lokalt behandlat lakvatten från Löt och Tveta visade att 50 respektive 33 % -iga koncentrationer inte gav någon påverkan på larvutveckling eller några subletala effekter på kräftdjur. N. spinipes är ett litet kräftdjur som förökar sig genom sexuell reproduktion och vars livscykel är väl definierad och relativt kort. Vidare lever N. spinipes vanligtvis i salta (bräckta) vatten, vilket gör den lämplig som testorganism för lakvatten. Kräftdjuret har i laboratorieförsök visats vara känsligt mot enskilda miljögifter såsom bromerade flamskyddsmedel och tydliga effekter på reproduktions- och populationsnivåer har observerats under experimentella förhållanden. Resultaten från studien visar att N. spinipes är ett lämpligt kräftdjur vid karakteriseringar av lakvatten. Detta tack vare att det har sexuell reproduktion vilket är av ekologisk relevans samt att det är en salttålig art. Vidare kan effekter på populationsnivå studeras, utöver individnivå som andra tester uteslutande mäter, vilket gör testet än mer ekologiskt relevant. Återstår problematiken med ammoniumkväve, vars exakta giftighet för N. spinipes inte är känd. N. spinipes är dock inte känsligare än andra kräftdjursarter, vilket gör att den trots detta är lämplig vid karakteriseringar av lakvatten. Vid fullständiga karakteriseringar, rekommenderas att val av testmetoder inkluderar tester som mäter såväl akuta som kroniska effekter och att en växt/alg, ett kräftdjur och en fiskart är representerade. Både akuttoxiska- och kroniska tester tjänar sina syften. Akuta tester vid bedömning av den omedelbara effekten (ofta dödlighet), vilket givetvis är av intresse att veta. Kroniska tester vid bedömning av ett lakvattens inneboende egenskaper som kan orsaka effekter under en längre tids exponering för bioackumulerbara och persistenta gifter. Vid en kombination av akuta och kroniska tester ges en total bild av ett lakvattens eventuella miljöfarliga inneboende egenskaper. Lakvatten från Löt avfallsanläggning, testades även för dess giftighet mot följande organismer; Vibrio fischeri (bakterie), Raphidoceles subcapitata (mikroalg) samt Danio rerio (sebrafisk), vilket är ett testpaket som kan användas vid mer ingående karakteriseringar. En allmän kemisk karakterisering ingick också, i enlighet med Handbok för lakvattenbedömning (Öman et al., 2000a). 3

INLEDNING Förordningen (2001:512) om deponering av avfall och tillhörande föreskrifter (NFS 2001:14) medför ökade krav på karakterisering av lakvatten från avfallsdeponier. Vid karakteriseringen ska nyckelparametrar som återger lakvattnets egenskaper och innehåll av ämnen som kan orsaka negativa effekter på människors hälsa och miljön fastställas. Vid nyetablering av deponier ställs dessutom krav på lokal behandling av lakvatten, vilket innebär att ökade krav på kunskaper om lakvattnets eventuella påverkan i recipienten ställs på huvudmän för deponier. Lakvattens farlighet för miljön är svår att fastställa och en tillförlitlig bedömning bör baseras på en kombination av kemiska och ekotoxikologiska (biologiska) tester. Principen för val av biologiska tester är att hellre testa flera, organisatoriskt skilda arter, än att fördjupa effektstudierna på en art (SNV 1989). Praxis är att välja en art av fisk, kräftdjur samt alg. Korttidstester, sk. akuta tester, med överlevnad som testvariabel har begränsat värde för bedömning av skador som uppstår vid längre tids exponering för ett utsläpp (sk. kroniska skador). Screeningtester av akut slag fångar således inte in effekten av persistenta och bioackumulerbara ämnen som ofta förekommer i lakvatten. Val av testmetoder bör delas upp i flera steg, där man initialt testar vattnets akuta toxicitet och efter utvärdering av dessa går vidare med kroniska testmetoder. På senare tid har man även diskuterat om lakvattnet kan orsaka fortplantingsstörande effekter hos vattenlevande organismer, vilket ställer än högre krav vid testning av lakvattens miljöfarlighet. I dagsläget finns ett fåtal standardiserade biologiska testmetoder avseende kroniska effekter av lak- och avloppsvatten. De som finns är inte lämpliga vid testning av lakvatten pga. deras känslighet mot höga ammoniumkväve- och salthalter, som är vanligt förekommande i lakvatten. Av de tester som är standardiserade saknas dessutom arter med sexuell förökning, vilket är av betydelse vid bedömning av ett förorenat vattens effekter på fortplantningen (reproduktionen). IVL har gett ut en handbok för lakvattenbedömning (Öman et al, 2000a) i vilket ovanstående delvis behandlas. Handboken presenterar upplägget vid val av ekotoxikologiska testmetoder men är inte heltäckande i beskrivningen av val av testorganismer. Exempelvis saknas förslag på kroniska tester med fisk- och kräftdjursarter som är salt- och ammoniumtåliga och som har sexuell förökning. Idag finns ett standardiserat fortplantningstest för vattenloppa (Daphnia magna). Detta kräftdjur är dock en sötvattensorganism, vilket gör den mindre lämplig som testorganism vid testning av lakvatten, som ofta har förhöjd salthalt. Vidare förökar sig arten asexuellt (via jungfrufödsel), vilket gör den mindre ekologisk relevant än en art som förökar sig sexuellt (via parning mellan ha- 4

nar och honor). De flesta kräftdjur förökar sig nämligen genom sexuell förökning, varför toxiska effekter på en art med sexuell förökning bättre representerar de stora risker som föreligger genom skador hos endera könet. Kräftdjuret Nitocra spinipes är ett litet (0,6 0,8 mm) kräftdjur, som förekommer längs hela Sveriges kust. Djuret förökar sig sexuellt och har i akuta försök visats vara en salttålig art (tolererar sötvatten och upp till 35 salthalt) och kan därför antas vara en lämplig testorganism vid testning av lakvatten (Öman et al, 2000a). Det finns ingen fastställd akuttoxisk nivå för N. spinipes avseende ammoniumkväve. Ammoniums (egentligen ammoniumsulfats) giftighet mot N. spinipes har undersökts flertalet gånger (se även Öman et al. 2000b), men utan reproducerbarhet. I en studie testades ammoniumsulfats giftighet 8 gånger och EC-50 varierade mellan 10 500 mg/l. Värsta fallet visade på en akut giftighet i intervallet 10-50 mg/l (NBL 1980). Vid Institutet för Tillämpad Miljöforskning (ITM) har ett 2-generationstest med N. spinipes utvecklats som mäter den totala toxikologiska effekten på populationsnivå, utöver effekter på individnivå som övriga tester är begränsade till. Testet är ett kroniskt test och studerar bl.a. artens förmåga att kunna föröka sig. Att studera effekter på populationsnivå är av ekologisk relevans, eftersom effekter på denna nivå kan medföra att hela populationer och i förlängningen hela artbestånd slås ut. Syftet med denna studie var att studera användbarheten av 2-generationstest med N. spinipes vid karakterisering av lakvatten. Speciellt avsågs följande frågeställningar att besvaras: Är 2-generationstestet lämpligt som ekotoxikologisk metod vid karakterisering av lakvatten? Vilka svårigheter med testning av lakvatten föreligger? Vilka övriga metoder bör användas som komplement till 2- generationstestet för att ge en heltäckande bild av det testade vattnets miljöfarlighet? Studien omfattar lakvatten från två stycken anläggningar, Löt avfallsanläggning, som ligger i Vallentuna kommun och Tveta Återvinningsanläggning, som ligger i Södertälje kommun. Lakvattnen har testats i akut och kroniskt test med N. spinipes som testorganism. Lakvatten från Löt, har relativt låga klorid- och ammoniumkvävehalter, till skillnad mot lakvatten från Tveta, som vanligtvis innehåller höga halter av dessa ämnen. Skillnaden mellan lakvattnens karaktär beror dels på att de uppkommer vid infiltration genom olika typer av avfallsslag, dels på att de testats i olika skeden av (olika) reningsprocesser i anläggningarna. 5

LAKVATTEN Löt avfallsanläggning Löt avfallsanläggning är en modern avfallsanläggning som tar emot industrioch hushållsavfall, slagg från förbränningsanläggningar och asbest. Vidare rymmer anläggningen en behandlingsyta för förorenade jordar. Lak- och dagvatten från anläggningen behandlas i en lokal reningsanläggning bestående av luftade dammar i kombination med överstrilnings/våtmarksområde. Det behandlade lakvattnet släpps ut i ett ytvattendike, vilket mynnar i en mindre sötvattensjö. Lakvattnet har en relativt lång uppehållstid i behandlingsanläggningen (från 3 veckor till flera månader). Detta innebär att vattnets sammansättning (kvalitet) är relativt homogen över årets driftsmånader. Provtagning, Löt Prov för ekotoxtester togs 2002-04-02 i utsläppspunkten från behandlingsanläggningen. Val av provtagningstidpunkt gjordes utifrån den tid på året då behandlingen kunde förväntas vara minst optimal, s.k. värsta fall. Flödet i punkten uppgick till 6,2 m 3 /h vid provtagningstillfället. 26 stycken stickprover (0,5 l plastflaskor) med behandlat lakvatten togs under två timmars tid efter överfall vid skibord. Dessutom togs prov i glasflaska för analys av syrgashalt på laboratorium. Proverna förvarades mörkt och väl kylt under transporten till laboratoriet. Konduktiviteten uppmättes till 87 ms/m och ph till 7,8 med fältinstrument (Jenway 3150 och Jenway 4200). Fältmätningsinstrumentet kalibrerades innan provtagningen. Prov för analys av kemiska parametrar skickades till AlControl Laboratories i Linköping. Allmänna kemiska parametrar analyserades såväl i behandlat som i obehandlat lakvatten. Dessutom gjordes en mer omfattande karakterisering av organiska parametrar i obehandlat lakvatten och lakvattensediment. Metodiken var att söka föroreningarna nära källan och vid anmärkningsvärda halter även söka dem i behandlat lakvatten. Extraprover togs i behandlat lakvatten och frystes ned för eventuell senare analys av särskilt utvalda organiska föreningar. Stickprov togs även för analys av det behandlade lakvattnets giftighet gentemot bakterien Vibrio fischeri (enl. Microtox-metoden), mikroalg (Raphidoceles subcapitata) och sebrafisk (Danio rerio). Detta för att undersöka giftigheten på olika trofinivåer. Den förstnämnda är ett s.k. akut test medan algtestet mäter ökningen av antalet algceller över ett antal cellgenerationer. Fisktesterna inkluderade även reproduktionsstörande effekter. 6

Övriga ekotoxtester (Löt) Microtox (EC50-test) Ett standardiserat screeningtest i vilket bakteriers (Vibrio fischeri) ljusalstrande förmåga mäts. Ju mer toxiskt ett vatten är desto svagare ljusalstring. Grönalg ( Raphidoceles subcapitata) ISO 8692 Testmetoden mäter tillväxthämning hos grönalgen efter ett visst antal timmar. Ju mer toxiskt vattnet är desto långsammare ökning av antalet nya celler/individ hos grönalgen. Studier av sebrafisk (Danio rerio) De tester som utfördes på sebrafisk har tidigare använts för bedömning av enskilda kemikalier och avloppsvatten (Carlsson et al, 2000, Norrgren, 2000, Petersen et al. 2002). Testerna är idag under internationell utvärdering och kommer att ingå i av OECD rekommenderade tester för fisktoxicitet och fiskreproduktion. Korttidsstudie Inledningsvis bedöms lakvattnets generella toxicitet genom att sebrafisk exponeras under tidiga utvecklingsstadier för en spädningsserie (100%, 50%, 10%, 1%, 0%) av det behandlade lakvattnet. Studien inleds med att en grupp avelsfiskar placeras i en specialutformad lektratt för reproduktion. Inom en timme efter befruktning fördelas rom i enskilda mikrobrunnar i en total volym om 0.25 ml. Varje lakvattenkoncentration bedöms genom exponering av 24 individer/koncentration. Exponering genomförs under 4 dygn och under denna period bedöms romstorlek, allmän embryogenes, organanläggning, spontan rörelse, hjärtfrekvens, kläckningstid och mortalitet. Partiell livscykeltest Denna studie inleds genom att avelsfisk placeras i en lektratt. Nybefruktad rom överförs till ett yngelakvarium där de förvaras fram till dag 20 efter kläckning. Ynglen fördelas därefter till exponeringsakvarier innehållande 60 individer. Val av exponeringskoncentration görs beroende på de resultat som erhålls i korttidsstudien. Varje lakvattenkoncentration testas i tre parallella akvarier. Exponeringen genomförs semistatiskt dvs. 50% av vattenvolymen byts 3 ggr per vecka. Exponeringen pågår under totalt 40 dagar dvs. från dag 20 till dag 60 efter kläckning. Dag 38 provtas 10 slumpvis utvalda individer från varje akvarium för vitellogeninanalys. Resterande fiskar provtas dag 60 för studier av gonaddifferentiering och könskvoter. Som positiv kontroll används en grupp som exponeras för etinylestradiol (10ng/l). Den partiella livscykeltesten speglar exponering för såväl östrogena (vitellogenin, könskvoter) som androgena ämnen (könskvoter). 7

Kemiska analysresultat, Löt Klorid- och ammoniumkvävehalten uppgick vid provtagningstillfället till 120 mg/l respektive 4,9 mg/l. Vid samma tillfälle gjordes kemisk analys av både obehandlat och behandlat lakvatten samt lakvattensediment. Sammanfattningsvis innehöll lakvattensedimentet relativt låga halter av de flesta föroreningar, undantaget cancerogena polycykliska aromatiska kolväten (PAHer) som förekom i relativt höga halter. Andra föroreningar som påträffades i något förhöjda halter i sedimentet var kadmium, zink, PCB, stora alifater och bromerade flamskyddsmedel. Förekomsten av dessa föroreningar i sedimentet är inte något problem idag, utan snarare ett tecken på att denna typ av oönskade kemikalier, till stor del eller helt, hamnar i sedimentet, innan de ens når våtmarken. Av alla de organiska föroreningar som analyserades var det endast ett fåtal som påträffades i vattenfasen, och dessa förekom i så låga halter att de var och en för sig inte ansågs nödvändiga att analysera i det färdigbehandlade lakvattnet. Samtliga tungmetaller klassades som låga i det behandlade lakvattnet. Kvarstår de allmänna kemiska parametrarna fosfor, kväve, totalt organsikt kol och klorid. Halterna av totalt organiskt kol och närsalter är mycket höga i utgående vatten enligt bedömningsgrunder för sjöar och vattendrag. Resultat från övriga ekotoxtester Bakterie (Microtox), rapport AlControl Det behandlade lakvattnets akuta toxicitet gentemot bakterien Microtox var låg. EC50 (v/v%) > 90 (efter 5, 15 och 30 min). Mikroalg (Rhaphidoceles subcapitata), rapport Toxicon, 50/02 Det testade lakvattnet innehade en låg akut toxicitet mot grönalgen. EC50 (v/v%) > 90 (efter 72 tim). Sebrafisk (Danio rerio), rapport Borg och Norrgren, 2002 Det behandlade lakvattnet påverkade sebrafiskembryon genom dosberoende minskad hjärtfrekvens och förlängd kläckningstid, vid koncentrationen 100 % behandlat lakvatten, men ej i lägre lakvattenkoncentrationer. Det behandlade lakvattnet orsakade ingen vitellogenin-induktion eller avvikelse i könskvoter, vilket indikerar att lakvattnet inte innehöll några könshormonliknande ämnen som påverkar sebrafisk. Tveta Återvinningsanläggning Tveta Återvinningsanläggning är en stor återvinningsanläggning som har använts som deponi sedan 1960-talet. Avfall som hanteras är hushållsavfall, industriavfall, byggavfall, askor, förorenade schaktmassor, oljor mm. Utvecklingen går från deponering av avfall mot sortering, behandling och återvinning. 8

Sedan en tid tillbaka rötas och komposteras hushållsavfallet. Lakvattnet från hela anläggningen samlas upp och pumpas till ett kommunalt reningsverk. På Tveta Återvinningsanläggning pågår utveckling av ett lokalt omhändertagande av lakvattnet. Lakvattnet från hela anläggningen samlas upp i en stor damm, Lv1. Från Lv1 pumpas vattnet genom en reningsanläggning för utfällning av metaller och därefter till en komprimerad våtmark för att minska närsalthalterna. Den komprimerade våtmarken består av fyra par dammar. Varje par består av en substratfylld damm, växtbädd, som är ihopkopplad med en tom damm. Substratet består av torv och sand och är bevuxet med kaveldun. Det metallrenade vattnet får perkolera ner genom substratet tills växtbäddsdammen och den tomma dammen är fyllda. Påfyllningen tar ca 3 dygn. Dammarna står fyllda i minst 6 dygn varefter de får luftas i 6 dygn medan ett annat par dammar används. Efter behandling i våtmarkerna skall det renade vattnet användas för bevattning och överskottet skall därefter släppas ut i en lokal recipient. Bevattning sker för närvarande endast i ett försöksområde på en f.d. åkermark som är bevuxen med ungskog av gran, tall björk och vide. Utsläpp till lokal recipient kommer att ske först när den lokala reningen är färdigutbyggd och uppfyller fastställda villkor. Det orenade lakvattnet har mycket höga klorid- och ammoniumkvävehalter, i medeltal 1000 resp. 95 mg/l. Målet är att metallhalterna före bevattningssteget skall vara i nivå med vad som bedöms som låga halter för recipienter. Efter bevattning skall mängden ammoniumkväve i det vatten som går vidare till lokal recipient vara högst 350 kg vilket motsvaras av en halt på ca 5 mg/l i den ursprungliga lakvattenmängden. Provtagning, Tveta Återvinningsanläggning För att kunna ta prov på ett renat lakvatten som inte blivit utspätt av nederbörd i bevattningsområdet så togs provet i en damm i den komprimerade våtmarken. Provet togs den 27:e augusti när vattnet först renats på metaller och sedan behandlats i den komprimerade våtmarken i åtta dygn. Ett samlingsprov gjordes av 12 vattenprov från olika delar i den vattenfyllda dammen (utan substrat). Provflaskan sänktes hastigt ner 20-40 cm under vattenytan. Från samlingsprovet togs också ett vattenprov för kemisk analys. Prov för analys av kemiska parametrar skickades till AlControl Laboratories i Linköping. Allmänna kemiska parametrar analyserades såväl i behandlat som i obehandlat lakvatten. Orenat och renat lakvatten har tidigare analyserats beträffande förekomst av 80 organiska miljögifter. Eftersom organiska miljögifter huvudsakligen transporteras med partiklar och samlas i sediment har prov också tagits på sediment i dammen för orenat lakvatten. Sedimentet analyserades med avseende på 130 organiska miljögifter. 9

För att kontrollera att organiska miljögifter ej transporteras förbi reningssystemet tas från och med i år sedimentprov även i den komprimerade våtmarken. Sedimentprov från damm med renat lakvatten togs för första gången i år och analyserades med avseende på 16 PAH, 7 PCB, 13 bromerade flamskyddsmedel och nonylfenol. Kemiska analysresultat, Tveta Återvinningsanläggning Klorid- och ammoniumkvävehalten uppgick vid provtagningstillfället till 440 mg/l respektive 7,3 mg/l. Vid samma tillfälle gjordes kemisk analys av både obehandlat och behandlat lakvatten samt lakvattensediment. Sammanfattningsvis innehöll det renade lakvattnet låga halter av de flesta föroreningar. Metallhalterna i det renade lakvattnet var låga enligt Naturvårdsverkets klassning för naturliga vatten utom kopparhalten som var måttligt hög. Halterna av BOD, COD och TOC var 17, 150 resp. 53 mg/l. Beträffande de tidigare analyserna av organiska miljögifter påträffades i det orenade vattnet mycket låga halter av PAH (fluoranten och pyren) och i det renade vattnet påträffades mycket låg halt av ftalaten DEHP som eventuellt härrörde från de nya ledningarna i reningsanläggningen. I sedimentprov från dammen med orenat lakvatten påträffades 13 PAH, 6 PCB, 2 pesticider och 1 flamskyddsmedel. Halterna av ämnena var högre än för vanliga sjösediment men lägre än vad som är tillåtet i rötslam för spridning på åkermark. Vid provtagningen av sediment från damm med renat vatten påträffades endast fluoranten som är ett PAH. Halten var medelhög, 0,02 mg/kg TS, enligt Naturvårdsverkets tillståndsklassning som grundar sig på jämförelser med halter i utsjösediment (NV Rapport 4914). TESTMETOD MED NITOCRA SPINIPES Harpacticoiden Nitocra spinipes är ett litet (0,6-0,8 mm) kräftdjur som tillhör gruppen hoppkräftor (Copepoda) och som främst förekommer i bräckta vatten runt större delen av världen. Djuren kan på lämpliga lokaler förekomma i stora mängder, särskilt i anslutning till bottnar och sedimenterade partiklar och har stor betydelse som föda för såväl för fiskar (särskilt unga stadier) som andra organismer. De kan därför anses ha stor betydelse för näringskedjor och ekosystem. De försöksdjur som använts i denna undersökning härstammar från Tvären utanför Sörmlandskusten och har hållits som en isolerad laboratoriestam vid Institutet för tillämpad miljöforskning (ITM) sedan 1975. Ett mycket stort antal tester avseende såväl akut, subkronisk och kronisk toxicitet har sedan dess utförts på kemikalier och komplexa avloppsvatten. 10

Akut test Detta test utfördes enligt Svensk Standard (SIS 1991) och bestämmer vid vilken koncentration av lakvattnet som 50 % av försöksdjuren dör efter 96 timmars exponering. Resultatet benämns 96-tim LC50 och uttrycks som procent av det koncentrerade lakvattnet + ett konfidensintervall, som beskriver osäkerheten i bestämningen. I detta försök används fullväxta individer som inte utfodras under testet. Testet genomförs i ca 20 o C genom att djuren exponeras i en geometrisk utspädningsserie (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 och 100%) av lakvattnet. Varje testkoncentration representeras av ett testkärl (provrör av glas) innehållande 10 ml testlösning och 20 testorganismer. Det primära syftet med detta test är att ge underlag för val av ett lämpligt koncentrationsintervall för det efterföljande kroniska testet. Kroniskt test Kroniskt test som i detta fall också kan kallas 2-generationstest genomfördes enligt den semistatiska metod som beskrivs av Breitholtz & Bengtsson (2001) och redovisas översiktligt i figur 1. Dödlighet Dödlighet Dag 0 6-8 10-12 14-16 18-22 22-26 Startar med nyfödda ungar Ca 50% copepoditer Vuxna Äggbärande honor Avslutar exponering Avslutar exponering av isolerade äggbärande honor Figur 1. Testvariabler relaterade till utveckling, reproduktion och populationstillväxthastighet som studeras i det kroniska testet med Nitocra spinipes (ovanför tidslinje). Ungerfärligt antal dagar från start av försök till viktiga händelser i livscykeln (nedanför tidslinje). Försöksdjuren är vid försöksstarten högst 36 tim gamla ungar (s k nauplier), som slumpmässigt placeras ut 10-15 st vardera i scint-burkar av glas innehållande 10 ml utspätt lakvatten i en geometrisk koncentrationsserie. Varje koncentration representeras av 8 st replikat, vilket innebär att för varje test åtgår 600-700 försöksdjur. Varje testkärl tillförs 30µl fodersuspension vid starten. Därefter sker utbyte av 70 % av testlösning samt fodertillförsel varannan dag under hela försöket, som pågår ca 22 dagar i ca 22 o C och i mörker. I likhet med övriga leddjur så tillväxer försöksdjuren via ett antal hudömsningar, totalt 11 st. Det 6:e nauplii-stadiet och det 1:a copepoditstadiet utgör två stadier som lätt kan åtskiljas i mikroskop. Under de givna försöksbetingelserna brukar ca 50 % av djuren uppnått copepoditstadium efter ca 1 vecka. Därmed ges en möjlighet att beräkna larvutvecklingshastigheten (LDR) genom att beräkna kvoten mellan antalet copepoditer och det antal nauplier som fanns från början i varje replikat. Därvid kan snabbare eller långsammare utveckling än 11

kontrollen lätt fastställas. Denna mätvariabel är som regel den mest känsliga i hela testet. Vid försökets slut, efter ca 22 dagar, bestäms även följande variabler: antalet dagar för en hona att föda sin första kull; antalet honor som får ungar; antalet ungar per hona; könskvot. Dessa variabler kan användas var för sig som toxikologiska variabler på individnivå, men kan också utnyttjas tillsammans i en ekvation (Breitholtz 2002) för att beräkna populationstillväxthastigheten (the intrinsic rate of natural increase). I och med uppskattningen av möjliga effekter på populationsnivå är denna effektvariabel av synnerligen hög ekologisk relevans vid en miljöriskanalys. Testbetingelser Den akuta testmetoden enligt SIS är utformad för testning av komplexa avloppsvatten. De lakvatten som har testats i denna undersökning avsågs att testas med avseende på toxiciteten hos långlivade (eventuella okända) organiska substanser eller metaller. Eftersom lakvatten ofta innehåller relativt höga halter av ammoniumkväve, som är akuttoxiska för vattenorganismer, var det viktigt att eliminera dess toxicitet före försöken. Erfarenhetsmässigt är halter <5mg ammoniumkväve/l inte toxiskt för N. spinipes (ITM, opubl.) och för lakvattnet från Tveta genomfördes därför ca en timmes luftning av vattnet före infrysning av vattenproverna. Som nämnts ovan har lakvatten ofta förhöjda kloridhalter, vilket medför att vissa sötvattensorganismer enbart av denna orsak inte överlever. För N. spinipes, som har en hög tolerans för olika salthalter, utgör detta inte något problem och arten är därför väl lämpad att testa även i outspädda lakvatten. För att det kroniska testet skall kunna genomföras med naturligt hög reproduktion fordras dock en salinitet som är åtminstone 3-5. I föreliggande försök har valts att m h a tillsats av NaCl erhålla den salthaltsnivå som redovisats av Breitholtz & Bengtsson (2001), nämligen ca 6 i samtliga testade koncentrationer. Därmed undviks också att testet utförs i en salthaltsgradient till följd av att lakvattnets utspädning i testkoncentrationsserien. Giltighet För att akuttestet skall anses giltigt skall dödligheten i kontrollen efter 96 tim. vara < 10 %, samt syremättnaden vid försökets slut och början överstiga 70 % och ph skall ligga inom intervallet 6-9. För det kroniska testet gäller samma villkor för syremättnad och ph samt att kontrolldödligheten efter 22 dygn inte får överstiga 30 %. RESULTAT NITOCRA SPINIPES Löt avfallsanläggning Lakvattnets ph-värde låg inom det, för testmetoden, godkända intervallet 6-9 och syrgasmättnadsvärdena var minst 86 %. Temperaturen under försöket låg 12

mellan 20,1 och 21,4 o C. I det akuta försöket ingick 100 % lakvatten som högsta koncentration och medförde en tendens till förhöjd dödlighet. Trots detta kunde inget regelrätt LC50-värde fastställas efter 96 tim, vilket indikerar en mycket låg eller obefintlig akut toxicitet av lakvattnet gentemot N. spinipes. I det kroniska testet testades 50 % lakvatten som högsta koncentration. Inte heller i detta försök kunde vare sig förhöjd dödlighet eller subletala effekter konstateras efter 6 resp. 22 dygn. Det var något överraskande att larvutvecklingshastigheten inte var påverkad ens i 50 % lakvatten, eftersom en viss förhöjd dödlighet i det outspädda lakvattnet i akut-försöket observerades. Tveta Återvinningsanläggning Lakvattnets ph-värde låg inom det godkända intervallet 6-9 och syrgasmättnadsvärdena var minst 85 % under hela försöket. Försökstemperaturen varierade mellan 20.1 och 21.4 o C. I figur 2 ses att det akuttoxikologiska testet gav ett 4-dygns LC50 på 59.3 (50.1-70.8) % av utgående renat lakvatten från växtbädd, vilket fortfarande kan klassas som en förhållandevis låg giftighet för ett lakvatten av denna typ. De subkroniska och kroniska testerna visar att det aktuella lakvattnet från Tveta inte är giftigt för hoppkräftan N. spinipes vid upp till 33% koncentration som djuren exponerades för under försöket, se figur 3. En effekt på könskvot kunde konstateras i den högsta koncentrationen (33%) men är inte uppenbart dos-relaterad (d v s det finns ingen successiv förändring i könskvot från lägre till högre koncentrationer) och kan vara slumpmässigt betingad. En annan möjlig förklaring skulle kunna vara en svag gödningseffekt (Emil Olafsson, muntl.), men för närvarande saknas vetenskapliga belägg för att näringstillgången skulle kunna påverka Nitocra s könskvot. I övrigt är resultatbilden snarlik den som observerats för Löt, nämligen att den subkroniska och kroniska exponeringen gav få effekter, trots att exponeringen innefattade testkoncentrationer som låg mycket nära den akuttoxiska. 13

100 90 80 70 % dödlighet 60 50 40 30 20 10 0 Kontroll 1 52 10 3 20 4 405 60 6 80 7 100 8 % lakvatten Figur 2. Akut giftighet vid testning med lakvatten från Tveta Återvinningsanläggning 2,50 Könskvot antal honor/hanar 2,00 1,50 1,00 0,50 * 0,00 Kontroll 1,8% 3,3% 5,6% 10% 18% 33% lakvatten Figur 3. Könskvoter (hannar/honor) efter test med lakvatten från Tveta Återvinningsanläggning Övrigt I de tester som genomförts på rena substanser, t ex syntetiska myskämnen och bromerade flamskyddsmedel (Breitholtz 2002) har det observerats mycket hög känslighet och i vissa fall ca 100 ggr eller högre toxicitet i det kroniska Nitocratestet jämfört med det akuta. Det har dock kunnat konstateras att fodertillförsel (som sker enbart i det kroniska försöket) kan påverka biotillgängligheten av 14

giftiga ämnen, bl a beroende på ämnenas vattenlöslighet. Övriga komplexa avloppsvatten (3 st. skogsindustrier) som testats med samma metod vid ITM uppvisar en liknande resultatbild som för de båda aktuella lakvattnen, d v s låg akut toxicitet och endast ringa eller ingen kronisk toxicitet. SLUTSATSER Samtliga tester har kunnat genomföras i enlighet med de försöksmanualer som upprättats och de krav som uppställts för testernas giltighet har varit uppfyllda. Båda lakvattnen (från Löt och Tveta) hade låg eller ingen akut toxicitet och uppvisade inte heller någon signifikant toxicitet i de kroniska försöken. Resultaten från studien visar att 2-generationstestet är lämpligt som ekotoxikologisk metod vid karakterisering av lakvatten. Det är av ekologisk relevans att använda kräftdjur och studera hela livscykeln och alla dess länkar, som kan vara olika känsliga för olika ämnen. Det faktum att metoden i detta fall inte uppvisat tydliga effekter skall inte tolkas som att metoden är okänslig. Tvärtom så har tidigare tester med enstaka kemikalier visat att metoden är mycket känslig. Därmed kan också anses att resultaten i föreliggande undersökning visar att behandlat lakvatten från de undersökta anläggningarna inte har någon potentiell giftverkan på kräftdjur. Arbetet med att vidareutveckla metoden mot en OECD Test Guideline för enskilda kemikalier har pågått i drygt ett år och utvecklingen mot en Svensk Standard för testning av komplexa avloppsvatten har också påbörjats. När arbetet är klart kan testmetoden introduceras på kommersiella laboratorier. Relativt höga salthalter är inget problem vid testning av lakvatten i tester med N. spinipes. Återstår ammoniumkväve, vars exakta giftighet mot N. spinipes inte är känd. I det fall ett färdigbehandlat lakvatten som ska släppas ut i en naturlig recipient testas, är även ammoniumkväves akuta giftighet intressant eftersom det direkt påverkar recipienten. Eftersom akuttoxtestet i detta fall även tjänar som förtest inför 2-generationstestet med Nitocra kan det ändå vara nödvändigt att lufta vattnet, dvs. avdriva kväve, så att de subletala effekterna inte döljs bakom de akuta. Eventuell luftning bestäms i varje enskilt fall. En annan viktig aspekt utgör kostnaden för testets genomförande. Det pris som tillämpades för test av dessa vatten är 80 000:-/test. Eftersom varje test fordrar minst en veckas förberedelse, tar drygt tre veckor att genomföra och åtföljs av en resultatbearbetningsperiod omfattande 2-3 manveckor så är detta pris att betrakta som relativt lågt. Eftersom många anläggningar har svårt att bära sådana kostnader annat än i undantagsfall finns ett behov av billigare testalternativ. Som tidigare nämnts så är erfarenheten att larvutvecklingshastigheten, LDR, (under den första veckan) som regel är den mest känsliga effektvariabeln. I den mån som man anser sig kunna avstå från ett 2-generationstest som inkluderar både sexuell reproduktion och populationseffekter, kan man möjligen begränsa undersökningen till denna variabel (LDR) samt yngelmorta- 15

litet efter ca 7 dagar. Kostnaden skulle i så fall kunna bli hälften så hög eller strax därunder. Det skulle därmed innebära att man (i vissa fall) ersätter ett kroniskt test med ett subkroniskt dito med samma art. Bland de osäkerheter som identifierats under denna studie finns bl.a. provtagningsmetodiken. Vid kort uppehållstid i behandlingssystemen för lakvatten föreligger risk för icke-representativa prover. Samlingsprovtagning, t ex veckovis, rekommenderas för lakvatten som fluktuerar mycket i kvalitet. Stickprover tas då under ett bestämt intervall och förvaras djupfrysta. Inför testningen blandas samtliga stickprover till ett flödesproportionellt samlingsprov. Goda erfarenheter av detta finns t ex från SNV s s.k. STORK-projekt (SNV 1997). Val av lakvattenströmmar görs utifrån syftet med testningen. Vid en undersökning där syftet är att studera eventuella risker för recipienten rekommenderas att färdigbehandlat lakvatten testas. Om syftet däremot är att undersöka eventuell förekomst av reproduktionsstörande ämnen i lakvattnet bör obehandlat lakvatten testas. Dessa kräver oftast en större insats avseende förbehandling av provet med hänsyn tagen till höga ammoniumkvävehalter. Val av ekotoxikologiska metoder bör, som påpekats tidigare, baseras på ett urval av akuta och kroniska tester. I denna studie har valts att fokusera på kroniskt test med N. spinipes, men givetvis är den akuta giftigheten, av exempelvis ammoniumkväve, inte försumbar. Vid effekter i akuta tester är det uppenbart att åtgärder behöver göras i form av haltreduktioner i lakvattnet. N. spinipes fungerar även bra som testorganism vid studie av akuta effekter, förutsatt att man inte har för avsikt att undersöka vattnets giftighet avseende salter på sötvattenorganismer. Eventuell avsaknad av toxisk effekt i akuta tester, friklassar dock inte vattnet eftersom eventuella kroniska effekter inte kan mätas i dessa. Kroniska tester bör om möjligt inkludera primärproducenter (växter), ryggradslösa djur (t ex kräftdjur) och fisk. Vid studie av reproduktionsstörningar kan de tester som Löt avfallsanläggning använt vara lämpliga. Vidare kan t ex en konstaterad hormonell störning i fiskförsöket föranleda ett provfiske i den berörda recipienten för att undersöka om könsutvecklingen hos vild fisk är påverkad. Idag finns väl utvecklad metodik för att analysera sådana effekter på fiskar i sötvatten (mört, abborre) och marin miljö (tånglake). I samband med provtagningen rekommenderas att en allmän kemisk karakterisering görs av det testade vattnet. I Handbok för lakvattenbedömning, Öman et al (2000a), finns förslag på kemiska parametrar som bör analysers ofta respektive sällan. Vidare bör, som tidigare påpekats, vattenprover frysas för eventuell kompletterande kemiska analyser, i de fall effekter fås i de ekotoxikologiska testerna. 16

REFERENSER AlControl (2002) rapport 02058719 Borg D., Norrgren L. (2002) Utvärdering av lakvatten från Löt avfallsanläggning; Exponering av sebrafisk. Institutionen för patologi, SLU, Uppsala Breitholtz, M. (2002) Ecotoxicological Assessment of Chemicals by Subchronic and Chronic Tests with Copepods. Doktorsavhandling i Marin Ekotoxikologi vid Institutionen för Systemekologi vid Stockholms Universitet. Breitholtz, M. & Bengtsson, B.-E. (2001) Oestrogens have no hormonal effect on the development and reproduction of the harpacticoid copepod Nitocra spinipes. Mar. Poll. Bull. 42(10): 879-886 Carlsson G, Örn S, Andersson PL, Söderström H and Norrgren L (2000) The impact of musk ketone on reproduction in zebrafish (Danio rerio) Marine Env. Res. 50, 337-241 NBL (1980), Jämförande undersökning av akuttoxicitet hos aktuella motorbränsle och tillsatsämnen med kräftdjuret Nitocra spinipes. NBL Rapport 103. ISSN 03478815, NFS 2001:14, Naturvårdsverkets föreskrifter om deponering av avfall (2001:14) Norrgren L. (2000) Zebrafish, a model species for evaluation of endocrine disrupting chemicals. Fourth Network Neeting on Development of Test Guidelines, Oslo October, 2000 Petersen GI, Madsen TH, Holbech H and Norrgren L. (2002), Partial life cycleevaluation of a 40-day juvenile zebrafish (Danio rerio) assay. Tema Nord SNV (1989) Biologisk Kemisk karakterisering av industriavloppsvatten Naturvårdsverket, Allmänna råd 89:5, ISBN 91-620-0036-5. SNV (1997) Characterization of discharges from the chemical industry The STORK Project. Statens Naturvårdsverk, Report 4766. ISBN 91-620-4766-3 SIS (1991) Vattenundersökningar Bestämning av toxicitet hos kemiska produkter och avloppsvatten med kräftdjuret Nitocra spinipes Boeck Statisk metod, akut toxicitet. Svensk Standard SS 02 81 06. Toxicon, (2002) Rapport 50/02, Ekotoxikologiskt test på lakvattenprov från SÖ- RAB 17

Öman, C., Malmberg, M. och Wolf-Watz, C. (2000a) Handbok för lakvattenbedömning, Metodik för karakterisering av lakvatten från avfallsupplag, IVL rapport B- 1354 Öman, C., Malmberg, M. och Wolf-Watz, C. (2000b), Utveckling av metoder för karakterisering av lakvatten från avfallsupplag slutrapport. IVL rapport B-1353 18

Rapporter från RVF 2003 2003:01 Rening av lakvatten i markbaserade växtsystem. Vägledning vid dimensionering 2003:02 Karakterisering av lakvatten med Nitocra Spinipes RVF - Svenska Renhållningsverksföreningen och RVF Service AB. Prostgatan 2, 211 25 Malmö. Tel 040-35 66 00. Fax 040-35 66 26. Hemsida www.rvf.se E-post office@rvf.se