Enzymologi och proteinsortering

Transkript

1 Enzymologi och proteinsortering Table of Contents Enzymer... 3 Generellt om enzymer... 3 Typer av enzymer... 3 Hur enzym fungerar... 3 Termodynamiska parametrar... 3 Delta G... 3 Aktiveringsenergi... 3 Inbindning... 4 Enzymkinetik... 4 Enzymhämning... 5 Enzymaktivtet Alloster reglering Isozymer Kovalenta modifieringar Proteolytisk klyvning... 5 Proteinsortering... 6 Signalsekvenser... 6 Signalpatches... 6 Typer av transporter... 6 Proteintransport till cellkärnan... 7 Kärnporkomplex (NPC)... 7 Aktiv transport in cellkärnan (import)... 7 Aktiv transport ut ur cellkärnan (export)... 7 Hur kommer Ran-GTP tillbaka in i cellkärnan?... 7 Reglering... 8 Proteintransport till mitokondrien... 8 Komponenter i proteinimporteringen... 8 Proteintransporten/Proteinimportering... 8 Proteintransport till Endoplasmatiska Retiklet... 9 Importering till ER... 9

2 Proteinntegrering i ER membranet... 9 Klyvbar... 9 Icke- Klyvbar... 9 Översikt av den sekretoriska passagen Golgi-apparaten Återvinning av ER proteiner som flytt Clathrin Lysosomer Proteinsortering i polariserade celler... 11

3 Enzymer Generellt om enzymer - Enzymer påskyndar reaktionshastigheter snabbare en kemiska katalysatorer (e.g. Mg). De är beroende av ett normalt tillstånd. Dvs låga temperaturer, normalt ph och lågt atmofäriskt tryck. Enzymerna är oftast väldigt specifika. - Enzymerna är beroende av hjälp. Därför finns kofaktorer. Det finns två typer av kofaktorer: 1) Oorganiska: joner som exempelvis Magneisum 2) Organiska: Oftast koenzymer från vitaminer. Exempelvis Acetyl Co-A som donerar acylgrupper eller ATP som donerar fosfatgrupper. Typer av enzymer 1) Reduktaser tar emot H + och ingår i exempelvis NAD + NADH bildningar. 2) Transferaser transporterar grupper. Exempel: PRP i Aminotransferaser 3) Hydrolaser bildar vatten genom att ta bort en funktionell grupp. Antinge O eller H 4) Lyaser bildar dubbelbindningar. 5) Isomeras ändrar en molekyl struktur genom att placera om de befintliga atomerna. 6) Ligaser bildar bindningar mellan C, S, O och N som exempelvis ett DNA Ligas Hur enzym fungerar Enzym har ett aktivt säte/en katalytiskt sajt. Substrat kan binda in till det aktiva säte och bildar på så sätt ett enzym substrat komplex. Vid reaktionens slut släpper enzymet från den färdiga produkten. Detta förhållande brukar i många fall vara reversibelt. E + S <---> ES <---> E + P Termodynamiska parametrar Delta G - Delta-G ger information ger information om mängden energi som krävs för att för att aktivera en reaktion. Det ger INGEN information om produkten. Det framgår från de tre exemplena, exotermisk, endotermisk och jämviktstillståndet. - Mängden energi, (hur snabbt en reaktion fortskrider), som krävs för Reaktion X beror påpå om rätt enzym är nävarande eller inte. Aktiveringsenergi - En reaktion kan nå ett transitionstillstånd. Vid transitionstillståndet är det samma

4 probabilitet för reaktionen att åka tillbaka till subtrat tillståndet som det är för reaktionen att fortsätta och bilda en produkt. - Enzym underlättar möjligheten att nå transitionstillståndet - Om en reaktion genomgår flera steg så är det steget som kräver högst aktiveringsenergi som bestämmer hastigheten. - När enzym och substrat binder så fri görs energi kallad ΔGB. Det är denna energi som används för att sänka aktiveringsnivån! Inbindning - Enzymen är alltid komplementära till substraten i transitonstillståndet. Det måste vara på detta vis. Subtratens konformation ändras under reaktionens gång vilket betyder att de även då måste passa enzymets aktiva säte. Därför har mamma-enzym tänkt ett steg för lillasubstrat och gjort sig redo för subbstratets konformationsförändring. ett steg för och säger aha jag måste vara förberedd - Efter att en produkt är bildad finns det kanaler som för bort obildat Substrat och nybildad produkt. - Den katalytiska klyftan är polär för att undvika onödigt vatten, och bildas att aminosyrror från olika aminosyrasekvenser. Enzymkinetik - V0 = Vmax [S] [S] + Km K m är ett värde på affiniteten av substratet för enzyme och är lika med den koncentration som ger halva maximala reaktionshastigheten. Om Km = S så gäller V 0 =V max/2 - Kcat anger hur många substrat som ombildas till en produkt vid det tillstånd allt enzym är mättat. Det anges i följande formel: Kcat = Vmax / [E]tota - Efter Kcat ger antalet subtrat som blir till produkt när alla enzym är mättade och Km är ett värde på affiniteten så ger formeln: Kcat/Km = enzymernas effektivitet.

5 Enzymhämning Reversibla hämningar - Kompetetiv hämning: Innebär att substraten eller inhibitorn slåss om den katalytiska sajten. En hög koncentration av substratetet kan konkurrera ut hämmaren. - Icke-kompetetiv hämning: Inhibitorn binder på andra ställen än den katalytiska sajten. Substratet kan fortfarande binda till enzymet. - Blandad hämning: Inhibitorn kan sätta sig på både det katalytiska sätet och på andra ställen än det katalytiska sätet. Irreversibla hämningar Hämmarna/inhibitorerna binder irreversibelt genom kovalenta eller starka icke-kovalenta bindningar. - Acetylkolinesteras får en modifierad serin i det aktiva sätet och kan således inte återbilda Acetylkolin - Penicillin hämmar glykopeptid-transpeptidaser (ett enzym som bidrar till bildningen av bakteriernas cellväggar) Enzymaktivtet Beror på ph och temperatur. - Alloster reglering: Reglering kan både vara positiv och negativ, men det finns två typer. 1) är den homotropa regleringen då substratet själv binder in och aktiverar enzymet genom konformationsändring. 2) Heterotrop regelering då en annan molekyl (exempelvis en hämmare) ger upphov till en konformationsförändring. - Isozymer: Katalyserar exakt samma reaktion fast på olika platser De skiljer sig någorlunda i deras aminosyrasekvens. De skiljer sig i vilka molekyler som reglerar deras aktivtet. Exempelvis i Laktatdehydrogenas som producerar pyruvat från laktat i hjärta och skelettmuskler - Kovalenta modifieringar: Sker oftast genom kinsas-fosforyleringar eller fosfatasdefosforyleringar. ATP är donatorer av fosfatgrupper. - Proteolytisk klyvning: När proenzymer/zymogener klyvs för att bilda ett aktivt enzym i senare skede. Exempelvis Kymotrypsinogen Trypsin eller Pepsinogen Pepsin.

6 Proteinsortering Signalsekvenser: Fungerar som adresslappar på proteiner. Kan finnas både på N-terminalen och C-Terminalen. Vanligast är dock på N-terminalen. Varje organell har egna signalsekvenser. Signalsekvenser tar proteiner till: ER Mitokondrien Peroxisomer Kärnor Cytoplasmiska protein saknar signalsekvenser. Signalpatches däremot dirigerar proteiner till: Kärnor Lysosomer Typer av transporter 1)Genom nuklärkärna! Aktiv transport av stora proteiner och passiv diffusion. Proteinet är redan färdigveckat 2) Genom membran! Translokon, en styrd kanal. Sker i ER och mitkondrier Proteinerna är ickeveckade 3) Transportvesiklar som laddas med cargoproteiner. Ex. Genom exocytosis Proteiner är färdigveckade. Transportmekanismer 1) Post-translationellt transport. Protein är redan färdig translaterat Kärnproteiner Mitkondriella proteiner Peroxisomala proteiner 2) Ko-translationell transport sker under translationen ER Golgi Lysosome Plasmamembran Sekretoriska proteiner

7 Proteintransport till cellkärnan Proteiner som ska in i kärnan: DNA polymeras RNA polymeras Transkriptionsfaktorer Proteiner som ska ut ur kärnan mrna rrna snorna snrps Kärnporkomplex (NPC) Porerna består av ca. 30 proteiner som bildar ett komplex liknandes en korgstruktur. Består av filament som innehåller repetetiva Phe-Glydelar som trycker ned transporterade protein. Aktiv transport in cellkärnan (import) 1) Cargoprotein med en NLS-adresslapp vill binda till Phe-Gly- delen på kärnporkomplexet men är förvirrad.. 2) Importin känner igen adresslappen på Cargoproteinet och binder in. 3) Nu kan cargoproteinet tillsammans med importin tryckas ned i kärnan av filamenten. 4) I kärnan finns en liten G-protein vid namn Ran-GTP som har hög affinitet för importin. När Ran-GTP binder till importin så ändras konformationen på importinet som gör att den släpper Cargoproteinet. 5) Nu kan importin-ran-gtp komplexet transporteras ut i cytosolen igen. 6) I cytosolen finns nu ett protein som heter Ran-GAP. Ran-GAP aktiverar GTP-asen som gör att Ran-GTP blir till Ran-GDP. På så sätt släpps importinet och kan börja cykeln igen. OBS! Sättet importin tas ut ur cellkärnan har ingenting att göra med den generella mekanismen för hur andra proteiner tas ut ur cellkärnan. Export av proteiner förklaras nu: Aktiv transport ut ur cellkärnan (export) 1) I detta fall finns också ett cargoprotein. Den har däremot en annan adresslapp vid namn NES. Detta cargoprotein är ännu mer förvirrad en det tidigare så därför har exportin initalt svårt att binda NES sekvensen. 2) Därför måste Ran GTP och exportin först bilda ett komplex tillsammans. 3) Nu kan Ran-GTP och exportinkomplexet binda NESadresslappen på cargoproteinet. 4) Därför kan cargoproteinet tas ut ur cellkärnan. 5) På utsidan finns Ran-GAP som aktiverar GTP-asen i Ran-GTP som gör att det dissocierar från cargoproteinet. Hur kommer Ran-GTP tillbaka in i cellkärnan? I cytosolen har följande reaktion tagit plats: Ran-GTP Ran-GDP.

8 Ran-GDP har en proteinhjälpare som tar in den tillbaka till cellkärnan där Ran-GEF BYTER UT Ran-GDP mot Ran-GTP. Det fo Ran-GDP: I cytosolen Ran-GTP: I cellkärnan. Reglering NF-kB är = cargoproteinet. Väg 1 1) 1kB inhiberar importin från att binda NLS adresslappen. 2) 1kB fosforyleras och proteolyseras 3) Importin kan binda NLS och ta in cargoproteinet. Väg 2 1) Pho4 har en fosfatgrupp står i vägen för importin 2) Pho4 defosforyleras. 3) Importin kan binda in. Proteintransport till mitokondrien Komponenter i proteinimporteringen 1) Mitokondriella signalsekvenser på proteinet. Som tidigare nämnt behöver alla protein en signalsekvens. I mitokondriens fall måste de vara positivt laddade aminosyror (MTS Matrix targeting Sequence). 2) Translokon: TOM: Translocase of the Outer mitochondrial Membrane TIM Translocase of the Inner mitochondrial Membrane 3) Energi I form av ATP. Måste finnas i både cytoplasman och i mitokondriematrixet (läs elektrontransportkedjan här) 4) Elektronpotential (läs elektrontransportkedjan igen) 5) Chaperoner. Tidigare i föreläsningen vart det nämnt att proteiner är oveckade när de tar sig in i mitokondrien. Proteintransporten/Proteinimportering 1) MTS(Matrix targeting sequence) binder in på en receptor på mitokondriens yttre membran på TOM. TOM-receptorn är en ligand som öppnar upp translokonet. 2) Proteinet tar sig ner i intermembrantmatrix. 3) Proteinet binder på TIM-receptorer som öppnar upp translokoner som ligger i inre membranet. Eftersom MTS sekvensen är positivt laddad så repeller protonerna i intermembranmatrixet ned proteinet genom det inre membranet samtidigt som de negativt laddade partiklarna på insidan av inre membranet suger åt sig det positivt laddade proteinet.

9 4) Så fort hela polypeptidkedjan (proteinet) tagit sig in genom inre membranet så släpper chaperonerna så att proteinet kan vecka sig. Undantag i transporten a) Det finns stop transfer sekvenser. Det gör att proteinet som försöker färdas genom membranet istället förflyttas lateralt och blir ett integral protein i det yttre membranet. b) Chaperoniner kan vecka proteinet så att det inte kan ta sig från intermembranrummet genom inre membranet. c) Proteiner kan ta sig in genom inre membranet, lossas från sina chaperonener, men vilja tas tillbaka till intermembranrummet. När den gör detta kan sekvenser detekteras som gör att den fastnar i inre membranet och förflyttas lateralt. Detta är liknande process som integralproteiner i det yttre membranet. Proteintransport till Endoplasmatiska Retiklet Importering till ER 1) Translation av mrna börjar i cytosolen. N-Signalsekvensen på mrna kommer alltid ut först ur ribosomet. 2) I cytosol finns Signal Recognition Proteins. De har två domäner. En domän binder signalsekvens och den andra domänen binder till själva A-sajten av (Kom ihåg E-P-A) ribosomen och stoppar på så sätt translationen. 3) SRP-mRNA komplexet binder till en transolokonbunden receptor på ER-membranet vilket gör att translokonet öppnas. 4) Härifrån framåt återupptas translationen av mrna:t igen men eftersom ribosomet nu sitter fastbundet i receptorn kan SRP:t släppa och återanvändas 5) I membranet finns en klyvande peptidas som klipper bort signalsekvensen. 6) Translationen fortskrider och blir färdigt 7) Ribosomets två delar dissocierar från receptorn och translokonet stängs. Proteinntegrering i ER membranet Klyvbar Polypeptidkedjor kan ha interna hydrofoba stop-transfersekvenser (klyvbara av signal peptidaset) som gör att proteinet inte importeras helt och hållet men som i mitokondriens fall, blir fast i membranet och förflyttas lateralt. Detta kan både ske så att N-Terminalen hamnar på den lumenala sidan och C-terminalen på den cytosoliska sidan och vice versa. Icke- Klyvbar Det finns även varianter då peptidkedjan har en icke-klyvbar signalsekvens vilket gör att protein veckar sig två eller flera gånger i ERs membran.

10 Översikt av den sekretoriska passagen Golgi-apparaten Golgi apparaten består av: Cis-Golgi-Nätverket (CGN) Sista sorteringssorteringssationer Cis-Golgi Medial-Golgi - Riktiga biokemiska compartments. Här sker O glykoslyeringar och så vidare. Trans-Golgi Trans-Golgi-nätverket (TGN) Sorteringsstationer 1) Proteiner kommer till CGN. Ibland kan proteiner som tillhör i ER fly och ta sig till CGN. Här sorteras de bort och skickas tillbaka till ER. I övrigt är CGN första anhalten för proteiner som ska vidare. De skickas vi vesiklar som fuserar ut ur ER:s membran och fuserar med massa andra vesiklar som kommit från ER för att bilda Cis nätverket. 2) Slutfasen i TGN sker sista sorteringen. Sekretion kan ske via: a) Konstitutiv sekretion är proteiner som utgör ECM. Exempel Kollagen, fibronektin, immunoglobulin b) Regulatorisk sekretion, är reglerande hormon och substanser. Insulin, neuropeptider,matsmältningsenzymer exempelvis, kan bevaras i reservvesiklar. c) Proteiner som är verksamma i lysosomer skickas via endosomer lysosomer. Återvinning av ER proteiner som flytt 1) Vesiklar har COPII höljen som detekterar KDEL receptorer. COPII vesiklar följer en anterograd transport. 2) När de fuserar i CGN så har de otillåtna ER proteinerna en KDEL receptor. COPII vesiklar detekterar denna receptor och fångar upp proteinerna. 3) Nu måste proteinet färdas tillbaka till ER. Det görs vi vesklar med ett COP I hölje som tar följer en retrograd färdväg tillbaka till ER 4) Där fuserar de med ER membranet igen och släpper ut de uppfiskade proteinerna. COPII: Anterograd COPI: Retrograd Clathrin Utöver de två höljena finns ett tredje hölje som kallas Clathrin. 1) Arrestin rekryterar Clatrintäckta vesiklar. 2) Clatrin hjälper till att kröka membranet och formar en vesikel i membranet. När detta hänt så kan Clatrin släppa 3) Adaptiner tar emot de cargoproteiner som finns i den clatrintäckta vesikeln. 4) Nu kan Clathrinlagret släppa eftersom en vesikel bildats av membranet. Transport sker.

11 Lysosomer 1)Innehåller massor av olika enzymer: Peptidaser, hydrolaser, nukleaser, proteaser, lipaser, fosfolipaser och så vidare. Alla dessa glykosyleras i ER. 2) I golgi fosforyleras hydrolaserna med en GlcNAc adresslapp. Då kan de ta sig in i lysosomen och fungera som en hydrolyserande enzym. 3) Proteiner som ska brytas ned får en Mannose-6-fosfat lapp. Detta gör att den tas in i lysosomen. Lysosomerna bryter sedan ned, exempelvis, åldrande molekyler och främmande bakterier. De har även en ATP driven H + kanal Endsomer Sen endosom Lysosom Proteinsortering i polariserade celler De flesta mammala cellen är polariserade. Det finns olika lipid- och proteinsammansättningar i apikala och basolaterala membran. 1) Det finns adresslappar som skickar rätt proteiner till apikala eller basolaterala membran. Det finns dock inga generella adresslappar. 2) Sådana adresslappar kallas för topogena signaler. 3) Specifika korta aa-sekvenser för basolaterala membran och GPI-ankare till apikala membran. Topogena signaler känns av av membranproteiner och lipider som fungerar som sorteringsreceptorer. Proteiner med GPI ankare har högre affintet till lipid rafts.