Diabetes bakgrund och biologisk orsak

Transkript

1 Diabetes bakgrund och biologisk orsak - Kapacitet i glukosupptag hos fettceller från människa respektive råtta odlade i humant och fetalt kalvserum Eva Lundberg Examensarbete i farmaci 15 hp Receptarieprogrammet 180 hp Rapporten godkänd: VT eller HT 2014 Handledare: Jan W. Eliasson Examinator: Gunnar Tiger

2 ABSTRACT Den nästintill epidemiska ökningen av typ II diabetes i världen har lett till en intensiv forskning för att finna svaren på vad som orsakar sjukdomens uppkomst. Typ II diabetes uppstår då kroppen inte längre förmår att upprätthålla blodsockerbalansen på grund av att produktionen och effekten av det blodsockerbalanserande hormonet insulin inte längre fungerar. Man vet idag att målvävnaderna, muskel-, lever- och fettvävnader blir insulinresistenta men inte vad som exakt orsakar detta. Bakgrunden till detta arbete ligger i två motsägelsefulla resultat från två olika studier som en forskningsgrupp genomfört. Den ena studien visar att insulinresistens hos fettceller från typ II diabetiker kan vara reversibel om dessa celler odlas under fysiologiska förhållanden i 24 timmar. Den andra studien, vars syfte var att undersöka om det finns faktorer i serum från typ II diabetiker som har betydelse för uppkomsten eller som kan förvärra redan uppkommen insulinresistens, sågs ingen reversibilitet hos fettceller från typ II diabetiker efter 24 timmars odling under fysiologiska förhållanden. Detta föranledde då forskningsgruppen att undersöka om fettceller reagerar olika vid odling i humant respektive fetalt kalv serum då detta var en av de få parametrar som skiljde de två studierna åt. Resultaten från denna studie visar att det inte verkar finnas någon skillnad på glukosupptagskapaciteten hos cellerna när de har odlats med dessa olika serum. Trots resultaten kan man ändå inte utesluta att det finns skillnader då det finns ytterligare omständigheter som man måste beakta och undersöka vidare. Dessa är bland annat koncentrationen på serum vid odling, kvaliteten och serum från flera olika personer samt antalet försök. INLEDNING Sjukdomen Diabetes delas in två typer, typ I och typ II(1). Vid typ I har kroppen ingen insulinproduktion och vid typ II är kroppen resistent mot insulinets effekter. Typ II diabetes räknas numera som en folksjukdom då utbredningen av sjukdomen ökar drastiskt över hela världen. En stor del av ökningen återfinns i utvecklingsländerna, där utflyttningen från landsbygden in till städer medför en förändrad livsstil. Detta leder till att alltfler människor blir överviktiga på grund av mindre fysisk aktivitet och intag av sämre kost än tidigare och det har visat sig att det finns en stark koppling mellan just

3 fetma och utvecklingen av typ II diabetes. Risken att drabbas av diabetes ökar även med åldern och en annan orsak till ökningen av sjukdomen är därför att människors livslängd och jordens befolkning ökar. Sjukdomen är således nära förknippad med överkonsumtion av mat i samband med för lite motion, speciellt om det föreligger ärftliga anlag. Diabetes är en ämnesomsättningssjukdom där metabolismen av socker (glukos) inte fungerar vilket leder till kroniskt förhöjt blodsocker (hyperglykemi).(1) Blodsockerhalten regleras av hormonet insulin som produceras av beta-celler i bukspottskörteln. Vid måltider frisätts insulin ut i blodet då glukoshalten stiger i blodet allteftersom maten spjälkas i mag- tarmsystemet. Som svar på den ökade insulinhalten reagerar målvävnaderna, framförallt muskel- och lever men även fettvävnad, med att öka sitt glukosupptag varvid glukoshalten så småningom sjunker till normala nivåer som ligger mellan 4,4 6,0 mmol/l. Tidigt i utvecklingen av typ II diabetes blir målvävnaderna resistenta mot insulinets verkningar. Då försöker bukspottskörteln kompensera för den minskade insulineffekten genom att frisätta mer insulin för att hålla blodsockret på en normal nivå. Av ännu inte helt kända orsaker orkar inte beta-cellerna hålla uppe den höga insulinproduktionen som med tiden kommer att avta. Vid detta tillstånd, när bukspottkörteln inte längre kan kompensera för den bristande insulineffekten har typ II diabetes uppstått, se figur nedan. En modell över utveckling av typ II diabetes Källa: Glucose and lipid metabolism in insulin resistance an experimental study in fat cells Jonas Burén ISBN Om forskningen kan identifiera precis vad insulinresistensen orsakas av kan kanske också sjukdomen förhindras. Trots att stora resurser har lagts ned på forskning om insulin och dess effekter kvarstår fortfarande en del frågor. De initiala, cellmembranknutna signalkedjorna såväl som de avslutande, är ganska väl kända men det återstår att identifiera mellanliggande signalvägar. Det råder idag en febril forskningsaktivitet för att finna svaren på dessa länkar. 2

4 En tidigare studie hade som syfte att undersöka om insulinresistens hos fettceller från typ II diabetiker går att reversera om cellerna odlas under fysiologiska förhållanden (2). Humana fettceller från friska personer respektive personer med diabetes odlades med en fysiologisk glukosnivå (6mM) och med tillsats av fetalt kalvserum (FCS). Efter 24 timmars odling studerades glukosupptagsförmågan hos dessa celler som visade sig vara lika hög oberoende av om fettcellerna kom från friska eller personer med typ II diabetes. Denna studie visade således att insulinresistens skulle kunna vara reversibel. För att undersöka om det finns faktorer i serum från personer med typ II diabetes som har betydelse för utvecklingen av insulinresistens eller som kan förvärra redan uppkommen insulinresistens gjordes odlingar på fetceller. Dessa fettceller togs från friska personer respektive typ II diabetiker och odlades under fysiologiska förhållanden (normala nivåer av glukos) med tillsats av serum från friska respektive diabetessjuka individer(4). När glukosupptagsförmågan studerades i dessa celler efter odling var fettcellerna från typii diabetikerna fortfarande signifikant mycket sämre än de friska. Denna studie visade således att ingen reversibilitet av insulinresistens förelåg efter odling i fysiologiska förhållanden. Syftet med den här studien har varit att undersöka hur glukosupptagskapaciteten hos fettceller från friska människor respektive råtta reagerar på humant respektive kalvserum. Detta för att se om motsatsen mellan resultaten i de två tidigare studierna kan vara orsakade av att olika serum använts. Anledningen till att fettceller från råtta undersöks är att de ofta används i olika studier. Det kan då vara av intresse ifall även de uppvisar någon skillnad vid odling i dessa olika serum och för att undersöka om de eventuella gynnsamma faktorerna i humant serum är allmänna respektive artspecifika. MATERIAL OCH METODER Isolerade fettceller från människa respektive råtta har använts i försöken. Efter odling i 24 timmar mäts glukosupptagsförmågan i fettcellerna vid stimulering med olika insulinkoncentrationer. 3

5 Material Medium 199, Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM), fetalt kalvserum (FCS) och penicillin/streptomycin (PEST) var från Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK). Bovine serum albumin (BSA, fraction V,) och N 6 -(R-phenylisopropyl)adenosine (PIA) kom från Sigma Chemical Co (St Louis, MO). Collegenase A, adenosine deaminase (ADA) erhölls från Boehringer Mannheim (Mannheim, Tyskland). Humant insulin (Actrapid) tillverkat av Novo Nordisk A/S (Köpenhamn, Danmark). 14 C D-glukos (specifik aktivitet mci/mmol) kom från Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Tyskland). Humant serum från en frisk försöksperson. Människa Biopsier av underhudsfett från människa har erhållits från 4 friska försökspersoner med hjälp av nålbiopsi från den nedre delen av buken. Försökspersonerna har fastat över natten och biopsin har tagits efter lokalbedövning med lidocain (Xylocain, Astrazeneca, Södertälje, Sverige). Råtta Sprague Dawley hannar erhölls från B & K (Sollentuna, Sverige). Råttorna förvarades i grupper om 4 stycken och hade fri tillgång till foderpellets och vatten. De fick acklimatisera sig till miljön i minst 5 dagar innan försöken gjordes. Etiska nämnden för djurförsök i Umeå har gett tillstånd till försöken. Råttorna vägde mellan g när de avlivades med en gasblandning av koldioxid och syrgas. Epididymalt fett (från bitestikeln) avlägsnades för att användas i försöken. Metod Fettväven klipptes sönder i mindre bitar. För att få isolerade fettceller inkuberades fettbitarna med Collagenase A som bryter ner bindväven. Medium 199 innehållande 5.6 mmol/l glukos med 40 mg/ml BSA och 0.6 mg/ml Collagenase A tillsattes varefter blandningen skakades i vattenbad (37ºC) i minuter. Därefter filtrerades cellerna genom ett nylonnät och tvättades 4 gånger med nytt medium. De tvättade cellerna 4

6 delades i två lika stora delar och odlades i teflonflaskor innehållande DMEM med totalt 6 mmol/l D-glukos, penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 µg/ml) samt 10 % humant eller fetalt kalv serum. Efter inkubation i 24 timmar (37ºC) tvättades cellerna 4 gånger med medium 199 utan glukos. Detta för att cellerna inte ska vara mättade så att de lättare ska ta upp 14 C-glukos som tillsätts senare. Efter sista tvätten späddes celler (lipocrit 3-5 %) och 450 l av cellsuspensionen tillsattes dubbla rör innehållande: ADA (1 U/mL), PIA (1 µmol/l) samt olika koncentrationer av insulin (0, 5, 50, 1000 µu/ml). Efter 15 minuter i vattenbad (37ºC) tillsattes 14 C-glukos (0.86 µmol/l) och cellerna inkuberades i ytterligare 45 minuter. Cellerna separerades från blandningen genom centrifugering med silikonolja. Pelletterna sögs upp med pipett och blandades med Ready-Safe i plaströr. Mängden upptaget 14 C-glukos mättes med hjälp av Beta-räknare. Under dessa experimentella förhållanden bestäms cellernas glukosupptag främst av glukostransporten genom cellmembranet och beräknas enligt följande: Cellulärt upptag av glukos från medium = [Cpm (celler) x volym]/ [Cpm (medium) x cellantal x tid] (Cpm betyder counts per minute dvs. de värden som erhålls från Beta-räknaren) RESULTAT Humana celler Efter odling av humana fettceller i 24 h i närvaro av FCS eller humant serum ses ingen skillnad på den basala respektive insulinstimulerade glukosupptagskapaciteten. Resultaten är en sammanställning av 4 separata försök Den maximala insulineffekten uttryckt som andel av det basala upptaget var cirka 150 % ( %) efter 24 timmars odling. 5

7 Tabell 1. Kön, ålder, BMI, insulin [s] och glukos [s] hos försökspersonerna vid det aktuella försökstillfället. Kön Ålder BMI (kg/m2) Insulin (mu/l) Glukos (mmol/l) kvinna 69 28,2 18,0 4,9 man 70 29,9 10,0 5,7 kvinna 26 26,3 4,2 4,8 kvinna 46 26,0 6,5 4,6 Fig 1 14 C-glukos upptag (fl/cell/s) Humana celler FCS 40 Humant Fig 1. Basalt och insulinstimulerat glukosupptag hos humana fettceller efter 24 timmars Insulin ( U/mL) Fig.1 Basalt och insulinstimulerat glukosupptag hos humana fettceller efter 24 timmars odling med FCS respektive humant serum (n=4).. Fig 2 14 C-glukosupptag (% av basal) Humana celler Insulin ( U/mL) Fig2. Den insulinstimulerade glukosupptagskapaciteten hos humana celler uttryckt som andel av det basala upptaget. 6 FCS Humant

8 Råttceller Inte heller hos råttceller syns någon skillnad på den basala respektive insulinstimulerade glukosupptagskapaciteten vid odling i FCS respektive humant serum. Resultaten är en sammanställning av 3 försök av totalt 4 genomförda. Ett försök föll bort på grund av ett kontaminerat tvättrör som orsakade celldöd. Den maximala insulineffekten uttryckt som andel av den basala var cirka 300 % ( %) efter odling i 24 timmar. Fig 3 60 Råttceller 14 C-glukos upptag (fl/cell/s) FCS Humant Insulin ( U/mL) Fig. 3. Basalt och insulinstimulerat glukosupptag efter odling av fettceller från råtta under 24 timmar i FCS respektive humant serum. (n=3) Fig 4 14 C-glukos upptag (% av basal) Råttceller Insulin ( U/mL) FCS Humant Fig. 4. Den insulinstimulerade glukosupptagskapaciteten hos råttceller uttryckt som andel av det basala upptaget. 7

9 DISKUSSION Resultaten tyder på att det inte finns någon skillnad på glukosupptagskapaciteten hos fettcellerna när de har odlats i kalv- respektive humant serum. Den ganska stora spridningen på försöken med råtta kan bero på att det endast är tre försök och det är ett som avviker. Det finns dock en del omständigheter som gör att studien kan behöva utredas ytterligare. Den ursprungliga frågeställningen har inte fått ett säkert svar då det finns några olika aspekter att ta hänsyn till. Vid en av de tidigare studierna, där man ville undersöka om det finns faktorer i serum från typ II diabetiker som påverkar redan uppkommen insulinresistens användes 25 % humant serum. Det skulle kunna vara så att skillnaden bara uppträder när en högre andel humant serum tillsätts i odlingsmediet då t ex faktorer som skulle kunna ha en gynnsam effekt på humana celler finns i en högre koncentration. Detta är något som man måste gå vidare med och undersöka. En annan viktig sak att tänka på är att det kan behöva undersökas serum från flera olika personer då den individuella skillnaden kan vara stor med avseende på innehåll i serum. Det skulle ha varit mer korrekt att använda serum från kanske 2-3 individer men försöken begränsades av den knappa tillgången på fettvävnad och även tidsaspekten. En förklaring till skillnaden i reverseringsförmågan i de två tidigare studierna skulle kunna vara att försökspersonerna har haft diabetes olika lång tid. Det kan vara så att insulinresistens är reversibel i början av sjukdomen men inte sedan. Dock var det inte så stor skillnad i antalet år som försökspersonerna hade haft diabetes mellan studierna. I den studie insulinresistensen inte gick att reversera hade personerna haft diabetes i snitt 7 +/- 1 år och i den andra 5 +/- 1 år. Eventuellt kan även läkemedelskonsumtion påverka resultaten där läkemedlets art och tidslängden på konsumtionen kan ha betydelse. Den maximala insulineffekten uttryckt som andel av den basala används för att kontrollera eventuella förändringar på insulinkänsligheten där stimulering med en viss mängd insulin ger samma insulinsvar med avseende på glukosupptag. Om man efter nålbiopsi isolerar fettceller och direkt testar cellernas glukosupptagskapacitet ligger den normalt på ca % hos humana celler och upp till 1000 % hos råtta. Men det normala är att den insulinstimulerade glukosupptagskapaciteten försämras vid 24 timmars odling. I försöken blev andelen för humana celler cirka 150 % vilket är ungefär detsamma som i tidigare försök och för råtta blev det cirka 300 % vilket också är som i tidigare försök (3,4,5). Detta är således en av fördelarna med att arbeta med fettceller från råtta då de svarar så bra på insulin. Om man vill studera olika effekter på 8

10 glukosupptagskapacitet så är det ju mycket lättare att upptäcka skillnader om cellerna från början har ett tydligt insulinsvar m a p glukosupptagsförmågan. Ett stort tack till Frida Renström, Magdalena Lundgren och Ewa Strömqvist-Engbo för all hjälp och vägledning med detta projekt. REFERENSER 1. Diabetes typ II. Sjukvårdsrådgivningens hemsida [www]. [Publicerad Hämtad ]. Hämtat från 2. J. Burén, S. Lindmark, F. Renström och J.W. Eriksson et al: In vitro reversal of hyperglycemia normalizes insulin action in fat cells from type 2 diabetes patients: Is cellular insulin resistance caused by glucotoxicity in vivo. Metabolism, vol 52, No 2 (February), 2003: pp DOI: 3. F. Renström, J. Burén, J.W. Eriksson et al: Insulin Receptor Substrates-1 and -2 Are Both Depleted but via Different Mechanisms after Down-Regulation of Glucose Transport in Rat Adipocytes. Endocrinology, July 2005, 146(7): DOI: 4. M. Lundgren, J. Burén, T. Ruge, T. Myrnas, J.W. Eriksson. Glucocorticoids Down- Regulate Glucose Uptake Capacity and Insulin-Signaling Proteins in Omental But Not Subcutaneous Human Adipocytes J Clin Endocrinol Metab. 2004; DOI: 5. M. Ishiki, A. Klip. Minireview: recent developments in the regulation of glucose transporter-4 traffic: new signals, locations, and partners. Endocrinology [ ] Ishiki år:2005 vol.:146 nummer:12 sid:

11 1

12