Histokemi och histologiska prov. Pertti Panula Institutionen för biomedicin 2012

Transkript

1 Histokemi och histologiska prov Pertti Panula Institutionen för biomedicin 2012

2 Skala: Alberts 5; s580 makroanatomi, mikroanatomi eller histologi, Öga (glasögon) Lupp Ljusmikroskop cellbiologi, molekylärbiologi, Ljusmikroskop EM-skop EM-skop kemi, (atomfysik) (partikelfysik) EM-skop Biokemi Kemi

3 Ljusmikroskopisk histologisk analys: fortfarande patologens viktigaste verktyg Levervävnad immunohistokemi, in situ hybridisering, elektronimikroskopi kompletterar diagnostik

4 Typer av prov: Traditionell vävnadsbiopsi Leikataan irti pala kudosta Nålbiopsi Endoskopiska prov Bestrykningspreparat Barretin ruokatorvi (metaplasia) Papa-prov

5 Celler utan färgning Odlad cell i ljusmikroskop Samma cell i faskontrastmikroskop Samma cell i interferensmikroskop (Nomarski) Ingen färgning Ingen färgning Ingen färgning Lähde: Alberts Svårt att se detaljer av cellen Enbart några korn syns Cellen och kärnans gränser syns, mera detaljer Samma detaljer, men 3D bild Organ eller vävnad kan inte mikroskoperas som sådan; celllager projiseras på varandra Lösning: tunna snitt färgas. Växtrotens tvärsnitt

6 Jämförelse av ljus- och elektronmikroskop Ljusmikroskop Gartner and Hiat: Color Textbook of Histology Saunders silmä Fluoresc. skiva Okular Projektionslins silmä Elektron mikroskop (uppochner) Snitt färjas med tungmetallsalt: - Osmiumtetroksid, - Uranylacetat - Blycitrat Objektiv Prov Kondensor Tungmetalllager strittas elektroner Mörk punkt Ljuskälla Anod Katod

7 Framställing av histologiska prov Fixering -oftast med formalin -fixerar viktiga komponenter, förbereder för behandling Förberedning av snittning Snittning -stärckning av vävnaden med paraffin, matrix -frysning med torris eller flytande kväve -kryostat, mikrotom, vibratom

8 Färgning av vävnadsnitt Deparaffinering med xylen Rehydrering till vattenfas Färgning i vatten eller buffertlösning eller annan lösning som alkohol (tex. hematoxylineosin) Täckning av snitt (med plast, glycerol)

9 Vävnadsbehandlingsapparat Kuva: Karppinen

10 Mikrotom för paraffinprov Kuva: Karppinen

11 Prov i paraffin Kuva: Karppinen

12 Snittning Kuva: Karppinen

13 Snitt, ännu skrynkligt Kuva: Karppinen

14 Paraffin- eller fryssnitt? Paraffinsnitt är bäst för rutinbruk och stora mängder -prov i rumstemperatur -passar oftast men inte alltid för immunfärgning Fryssnitt snabba och lämpliga för prov under operationen -fryssnitt kräver mera teknik och torris eller flytande kväve -fryssnitt riktigt lämpliga för immunfärgning Paraffinsnitt har ofta bättre struktur än ofixerade fryssnitt

15 Färgning Manuell (sidan) eller automatisk (under). Paraffin tas bort med xylen först Kuva:

16 Hematoxylin-eosin Enbart hematoxylin Enbart eosin HE Ross et Pawlina: Histology. A Text and Atlas. 5 p 2006 LWW

17 Histologisk färgning (HE) 1) Hematoxylin är ett blått färgämne. I lösning ioniseras det till en positiv ion (kationi) Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + 2) I vävnaden är DNA och RNA negativt laddade efter att ha donerat H+ 3) Positivt laddade hematoxylin-ioner binder till vävnadens negativt laddade element 4) I vävnaden färgas DNA och RNA med hematoxylin, alkalisk färgämne basofilt Kärnorna är färgade basofilt Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri DNA Väri Väri Väri RNA Väri Väri Väri Väri Väri Väri + Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Kerr: Atlas of Functional Histology. 1st edition, 1999 Mosby

18 Nucleolus Är mörk Kärnans strukturer H = Heterokromatin är mörkt E = Eukromatin är ljust Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby TEMbild

19 Nissl korn Ribosomala ansamlingar syns i ljusmikroskop som basofiliska Nissl korn Neuronen har ett väl utvecklat RER, med mycket ribosomer Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Lähde: J.F.Kerr, Atlas of Functional Histology

20 Hematoxylin färgar kärnans DNA och cytoplasmiskt RNA HE Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Ross et Pawlina: Histology. A Text and Atlas. 5 p 2006 LWW

21 Histologisk färgning (HE) 1) Eosin är ett rött färgämne. Det är syrligt och ioniseras till en Negativt laddad ion (anion) 2) Vävnadsproteinernas aminogrupper laddas positivt i vattenlösnig Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini - Eosiini Eosiini- - Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini - Eosiini - Eosiini- Eosiini - Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini- p r o t e i + i n i

22 Histologisk färgning (HE) 1) Eosin är ett rött färgämne. Det är syrligt och ioniserad till anioni Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini - Eosiini- 2) Proteinernas aminogrupper är Positivt laddade i vattenlösning Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini + Eosiini p r Eosiini Eosiini o t Eosiini e i Eosiini i n i Eosiini 3) Negativt laddadt eosin binder till positivt laddade strukturer (särskilt proteiner) - Kollagen och cellens stödproteiner, mm + Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini + Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini 4) I snitten färgas proteinerna eosinofilt (=acidofilt) Muskelcellernas proteiner färgas röda med eosin, Kärnorna blåa med hematoxylin Kerr: Atlas Heikki of Functional Hervonen Histology HY, 1999, BLL, Mosby 2004

23 Proteinhaltig cytoplasma färgas i allmänhet eosinofilt Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Svettkörtelcellens cytoplasma färgas starkt eosinofilt Magepitelcellernas och körtelcellernas cytoplasma färgas starkt eosinofilt

24 HE-färgade glattmuskelceller Proteinirik cytoplasma färgas rött, kärnorna i periferin blått Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

25 Också extracellulära proteiner, här kollagen, färgas med eosin Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Föreg. bild fibroblasternas kärnor mellan kollagenfibrer är basofilt färgade

26 Slät endoplasmatiskt retikel och mitokondrier (EM) Viktiga särskilt för lipidernas och steroidernas metaboli Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Heikki Hervonen HY, BLL, 2004

27 Slät endoplasmatisk retikel och mitokondrier i steroidproducerande celler M = Mitokondrier innehåller mycket proteiner eosino/acidofila färgningsegenskaper Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby SER innehåller mindre proteiner och färgas inte lika starkt på kanterna

28 En exokrin cell i bukspottkörteln Hur färgas cellen med HE? Kornen innehåller proteiner dvs färgas.? Omkring kärnan rikligt med RER Basdelen färgas.? Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

29 En exokrin cell i bokspottkörteln Kornen har mycket protein och Färgas eosinofilt Omkring kärnan mycket RER:a, bsdelen färgas basofilt

30 Körtelstruktur in exokrin pancreas Basofilt grovt endoplasmatiskt retikel (RER, ribosomer!) och eosinofila korn (proteiner)

31 Fettdropparna har lösts från ett vanligt prov Fettcellens cytoplasma syns som en tunn ram Fett kan färgas med specifika metoder = triglyserider Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby N = fettcellens kärna Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

32 Specialfärgning för elastin Skiljer elastin från kollagen och intracellulära proteiner Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Elastinet är mörkt S = glattmuskelcell C = kollagen

33 Histokemi och enzymhistokemi Histokemiska färgningar: PAS-färgning för kolhydrerad, Alcian-Blue för sura mukopolysakkarider, Silversaltbaserade färgningar för retikulinfibrer och nerver Enzymhistokemi utnyttjar cellernas egna enzym som kan åskådlingsgöras som substrat används metallsalt, som enzymet reagerar på och produkten är precipitat som kan visualiseras i mikroskop

34 Silverfärgning visar tunna retikulinfibrer Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby I levern på sinusoiodväggarna Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Lynfnodernas stödvävnad

35 Kolhydraterna syns inte med hematoxylin-eosin Bägarcellernas sekret (kolhydrater) syns som det ofärgade området i epitelet Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

36 PAS-färgning för kolhydrater PAS-färgning färgar bägarecellernas Kålhydrater grannrött PAS-färgning färgar Också glycocalyx Och basalmembranglycoproteiner PAS = PeriodicAcid- Schiff dvs perjodsyra-schiff Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

37 Immunohistokemi Bild: Minna Takkunen: Epithelialmesenchymal transition in oral squamous carcinoma cells. Avhandling

38 Immunohistokemi Immunohistokemi utnyttjar kroppens egna antikroppar, dvs. humoral immunrespons Djuret immuniseras (vaccineras) med (makro)molekylen (antigen/immunogen). Denna stimulerar lymfocyter till produktion av specifika antikroppar och ja minnesceller. Upprepade immuniceringar leder till förstärkt respons Efter 2-4 immuniseringarkan man dra serum med antikroppar, som på ett specifikt sätt binder till antigenen Monoklonala antikroppar produceras i cellkultur

39 Antikroppens struktur Antigen bindande del antigeenia sitova alue Varierande del F ab -fragment aminotermin al Två identiska tunga kädjor och två identiska lätta kädjor, Y-form Y-formade delens varierande område binder immunogen kevyt ketju raskas ketju F c -fragment karboxyter minal Ross & Pawlina: Histology. A Text and Atlas, LWW 2011

40 Indirekt immunohistokemi Antigenens oleva antigeeninen rakenne A Primära antikroppar: producerade in kaninen mot antigen A I får producerade sekundära antikroppar, som har markör Alberts et al.: Molecular Biology of The Cell 5.ed, 2008 Garland Science 1. Sk. polyklonal kaninantikropp mot antigen A 2. I fåren producerad antikropp mot kaninens antikroppens Fcdel,som är markerad Markören kan vara fluorokrom, tex fluoreskein enzymmolekyl guldpartikel (EM)

41 Vimentinfibrer (intermediära filament) Fibroblast

42 Immunfärgning i diagnostik: i Lupus-nefrit (njursjukdom) samlas protein i glomerulus Virtanen 2009

43 in situ hybridisering Enkel RNA tai DNA kädja (probe, sond) binder specifikt till motsvarande sekvens (DNA, mrna) Reaktionen kan ske i lösning, gel eller vävnad (in situ) Reaktionen identifierar kända sekvenser och kan lokalisera dem i kromosomer/celler/vävnader Med hjälp av olika fluorokromer kan man identifiera flera sekvenser

44 In situ hybridisering a. grundelement: DNA-sonden och målsekvensen b. Sonden kan märkas direkt med fluorokromen c. Sonden och mål-dna denatureras för att åstadkomma enkelsträngad (single stranded) DNA d. Enkelsträngade DNA-kedjor binder på varandra e. Fluorokrom -markerad sond syns under mikroskop

45 Glukokortikoidreceptorer i de limbiska strukturerna

46 TH1 och TH2 mrna i sebrafiskens hjärna: in situ hybridisering (Chen et al. 2009)

47 Intresserad av neurovetenskap? Möjligheter finns till fördjupade studier och avhandlingsarbete inom tex. Motorisk reglering, addiktionsmekanismer på möss, råttor och sebrafiskar, även på människans postmortemmaterial Kontakt: Pertti Panula , ,