BIOSÍNTESIS Y REGULACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO EN Streptomyces clavuligerus

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1 BIÍTEI Y REGULACIÓ DE LA PRDUCCIÓ DE ÁCID CLAVULÁIC E treptomyces clavuligerus Paloma Liras, Irene antamarta, Rosario Pérez-Redondo, Juan P. Gómez-Escribano y Luis M. Lorenzana Área de Microbiología. Facultad de Biología. Universidad de León e Instituto de Biotecnología (IBITEC). León.

2 2 C 3 C C 2 C Cefamicina C Ácido Clavulánico treptomyces clavuligerus C 2 Alanilclavama olomicina R tras clavamas

3 Ácido clavulánico C X β-lactamasa C C PEICILIA G ACID PEICILIC

4 2 C 3 C C C 2 Ácido Clavulánico Cefamicina C treptomyces clavuligerus C Alanilclavama y otras clavamas olomicina R

5 R LMICIA. clavuligerus clavuligerus cyp::neo clar car cyp fd orf12 oppa2 X X X

6 Lisina lat pcd 2 C C 2 C C 2 Ácido α-aminoadípico Cisteína Valina pcbab/ ACV BIÍTEI DE ATIBIÓTIC β-lactámic 2 L C LLD-ACV Isopenicillin pcbc/ IP C cefd/ IPE Cephalosporin C Cephalosporium Penicillin G Penicillium 2 D cefe/ DAC 2 2 C3 C 3 C C C C C C C 2 cmc/ CDAC cmci cmcj Cephamycin C treptomyces

7 C3 (Gliceraldehido-3-P) C Arginina cea C C -Carboxietilarginina bls / β-l cas2 / C pah / PA BIÍTEI DE ÁCID CLAVULÁIC Y CLAVAMA 2 C Ácido Proclavamínico CLAVAMA cas2 / C 2 C car C Ácido Clavamínico ACID CLAVULÁIC

8 AGRUPACIÓ DE GEE DE CEFAMICIA C pbp57 cea bls bla pbp74 cmct pcd cs2 cefe cmci pah cmcj oat ceff oppa1 clar car cmc ccar blp lat cyp fd orf12 orf13 orf14 oppa2 orf16 orf17 orf18 orf10 pcbab pcbc pbp57 cea AGRUPACIÓ DE GEE DEL ÁCID CLAVULÁIC

9 Regulación por CcaR β α MTIRLLGPVTL-VKGVPIPIRGQRQRRFLALALRPGQVIKEAIIEDWDGEPPL MDADDCWARAGTVRIRLLGPVEL-ACGTRPVPVTGRRQLRVVAALALEAGRVLTAGLIALWADEPPR MEFGVLGPLYVRVGATTAPAP-KLRVLAMLLVAGQVVPVPLVRDLWDEDPPV MRIRVLGPLADVGVVVPAG-KPRQVLLLALYPGQIMPVPTLMEEIWGAAPPV MQIMLGPLVAGTVTPIAR-KPRQVFLLALQAGTVVPVPALMDELWGTQPPA α3 : :** β6 : β7..: * :... ::. * ** TVGQLQTAWMIR------TALAEAGLPRDALGDRGYELRVLPDIDLFVFREAVRAVRDLARGQ TAARQLQTVWMIRR------ALAVGAPQCVVRTPAGYLLDPAYELDDRFRAVLTARELQRDGR GLTTLQTYILLRKMFAVTGLTTAEVARDVLVTRAGGYALAAEAGVLDVRYQRLVTGREALARGD ALTTLQTYILQLRRRLGTAMGPEAPTAKDVLATRGGYVLQIPADTDVAYERKVREGQAAFEAGD ALTTLQTYILQVRRGITVALGAGPAKDVLRTCYGGYLLDVDPTTDVYAFERLAEEGKRACERGE *:: * : : ** * :. QEAERLDTALALWKGPAFADVTR-LRLRGETLEEERTAAVELRALIDVGLGYYGDAITRLELVD LAQARARVDEGLALWRGPALGAAAGAG-LQPRARRLEEERVFALEQRAGLDLALGRETAIGELLDLIA DAAGVRDLEALLLWRGPALADVPAGRVLERRRQLEERLAAFEYLVDVELRLGMYREVLAELAALTV DEAADTLREALALWQGPALVDVRCGPALIEVLRLEERLVTVERRIDADLRLGRCEIAELRDLTA LDLAARFRQALDLWRGDALVDVAGMRIGMEVARLEERLGVLEARMETDLRLGRAGLLPELALTA...* **:* *: * *... * * * α2 DPFREDLYVLMKAYYAEGRQADAIQVFRAKDILREQIGIPGERMTRVMQAILRQDEQVLRVGT-- QPLREAAYADLMLALYRGRQDALAVYRRAQRVLADELAVRPGPRLAGLERAILRQDELLAG---- EPLEGLGQYMWALLGRRAQALQVFRLRGALVAGLGLEPGPQVQRLQAVLADTAFEPRFT-- RPEGLQAMVALYRGRQAAALDLYRKLRVRLIEELGVEPPQMQRMQAMLVDPALDLATG-- RPMELWAQFMIALRGRTQALEAFIKLRKTLVELGVEPARLQLQAILRADPGIDR-G-- * * :. ** ** : : * :. *. : *:* : PA clavuligerus CcaR AAVP cattleya thienamycin regulator 44.3% VRRPAVAAPATAFGGGRY. galilaeus AclI 34% PRRGTFDLYAA treptomyces sp. griseorhodin A regulator 34% PEVPAAAVALA peucetius DnrI 31% CcaR es una proteína ARP

10 Probe ccar Probe neo neo 2.0 ccar ccar mel pb11b 8.75 kb tsr 1, 3. clavuligerus , 4. clavuligerus ccar::neo

11 Cefamicina C Ácido clavulánico 1.. clavuligerus clavuligerus ccar::neo 3.. clavuligerus ccar::neo [pb17b]

12 pcd cefe cef D cmci cmci ceff cmc ccar orf11 blp lat pcbab pcbc cea X Probe: clar WT ccar car WT ccar Cephamycin C Gene Cluster cea bls pah cs2 clar car cyp Clavulanic Acid Gene Cluster Probe: rda

13 cefd cmci ccar blp lat Genes de Cefamicina C 782 pb 245 pb 364 pb 550 pb Genes de Ácido Clavulánico clar car cyp 550 pb 520 pb

14 Promotor CcaR 242 bp onda Ensayo Ab anti-ccar Ab-anti-conejo Promotor DI, 782 bp onda Ensayo Ab anti-ccar Ensayo Ab anti-conejo

15 bla pbp74 cmct ccar blp pbp57 pcd cefe cefd cmci cmcj ceff cmc lat pcbab pcbc Lysine lat, pcd CcaR α-aaa+cys+val Penicillin Carbamoyl-DAC ACV pcbab pcbc cefd cefe ceff DAC cmc cmci, cmcj Cephamycin C Isopenicillin DAC

16 E REUME 1. CcaR E UA PRTEÍA AUTREGULADRA PITIVA QUE CTRLA LA EXPREIÓ DE L GEE DE BIÍTEI DE CEFAMICIA 2. CcaR CTRLA IDIRECTAMETE LA EXPREIÓ DEL GE REGULADR clar Y PR TAT LA FRMACIÓ DE ÁCID CLAVULAIC

17 A ITERVEID E EL PRYECT: Anteriormente: Francisco J. Pérez-Llarena Antonio Rodríguez-García Alvaro de la Fuente Actualmente: Irene antamarta Rosario Pérez-Redondo Luis M. Lorenzana Juan P. Pérez-Escribano onia Baños Mª Teresa López ajimi, Moshem EL PRYECT A CTAD C LA FIACIACIÓ DE: Proyecto CICYT Bio Proyecto Fundación Ramón Areces