Funktionell betydelse av co-lokalisering av transmittorer

Funktionell betydelse av co-lokalisering av transmittorer LARS ZANDÉN Examensarbete Stockholm, Sverige 2004 TRITA-NA-E04076

Numerisk analys och datalogi Department of Numerical Analysis KTH and Computer Science 100 44 Stockholm Royal Institute of Technology SE-100 44 Stockholm, Sweden Funktionell betydelse av co-lokalisering av transmittorer LARS ZANDÉN TRITA-NA-E04076 Examensarbete i biomedicinsk teknik om 20 poäng vid Programmet för datateknik, Kungliga Tekniska Högskolan år 2004 Handledare på Nada var Erik Fransén Examinator var Anders Lansner

Funktionell betydelse av co-lokalisering av transmittorer Sammanfattning I vissa nervceller förekommer både retande och hämmande transmittorer i axonterminalen, dvs. co-lokalisation. En synaps med en blandning av retande och hämmande transmittor uppvisar ett bifasiskt förlopp vars totaleffekt på cellen beror på storleken av den retande respektive den hämmande komponenten. I kombination med depression baserad på den postsynaptiska cellens aktivitet kan synapsen fungera som en switch med korttidsminnesegenskaper. I det fall att den hämmande överväger något och det dessutom finns korttidsplasticitet av konditioneringstyp, så finns möjligheten att synapsen efter en konditionering byter till att vara övervägande retande, dvs. switchteorin. Examensarbetet gick ut på att studera den postsynaptiska nervcellens membranpotential och undersöka hur den påverkades av synaptiska strömmar. Genom att använda olika parameterinställningar med simuleringsprogrammet Neuron Workshop och analysera simuleringsparameterintervall för stigtid och falltid för den hämmande och retande komponenten kom jag fram till att switchteorin fungerar. Functional signification of co-localization of transmitters Abstract In some neurons there are both excitatory and inhibitory transmitters in the axon terminal, i.e. co-localization. A synapse which has a mixture of excitatory and inhibitory transmitters presents a biphasic course, whose total effect on the cell depends on the strength of the inhibitory- and the excitatory component respectively. In combination with depression based on the postsynaptic neuron s activity the synapse may work as a switch with short memory characteristics. If the inhibitory component is the stronger one and in addition there is a short time plasticity of the conditioning kind, there is a possibility that the synapse after a conditioning may change from being inhibitory to becoming mainly excitatory, i.e. the switch theory. The aim of this Master s project was to study the postsynaptic neuron s membrane potential and investigate how it is influenced by synaptic currents. By using different parameter adjustments with the simulation program Neuron Workshop and analyze the rise time and decay time simulation intervals for the inhibitory and the excitatory component, I found that the switch theory works. ii

Förord Detta examensarbete inom inriktningen biomedicinsk teknik är avrundningen på min civilingenjörsutbildning vid Kungliga Tekniska Högskolan, KTH, Stockholm. Examensarbetet utfördes för SANS vid institutionen för Numerisk Analys och Datalogi, Nada. Främst vill jag tacka min handledare Erik Fransén för hans ovärderliga hjälp och engagemang i mitt examensarbete. Erik hade alltid värdefulla funderingar och synpunkter på de resultat jag kom fram till genom mina simuleringar. iii

Innehållsförteckning 1. Inledning... 1 1.1 Bakgrund... 1 1.2 Problemspecifikation... 1 1.3 Mål... 2 1.4 Metod... 2 2. Grundläggande teori... 3 2.1 Celler i nervsystemet... 3 2.1.1 Nervceller... 3 2.1.2 Gliaceller... 4 2.2 Elektrisk signalering... 4 2.3 Synaptisk transmission... 6 2.3.1 Elektriska synapser i den presynaptiska terminalen... 6 2.3.2 Kemiska synapser i den presynaptiska terminalen... 7 2.4 Neurotransmittorer... 8 2.4.1 GABA... 8 2.4.2 Glutamat... 9 2.5 Synapstransmissionens elektriska effekter... 9 2.5.1 EPC och EPP... 9 2.5.2 PSC och PSP... 10 2.5.3 EPSP och IPSP... 11 2.5.4 Summation av postsynaptiska potentialer... 11 2.6 Synaptisk plasticitet... 12 2.6.1 Synaptisk facilitering... 12 2.6.2 Synaptisk depression... 13 2.7 Co-lokalisation... 13 2.8 Konditioneringsexperiment... 14 2.9 Neuron Workshop...15 3. Utförande... 16 3.1 Värden för stig- och falltid...16 3.2 Förberedelser inför simuleringarna... 16 3.2.1 Modifiering av befintligt simuleringsprogram... 16 3.2.2 Matlabprogram... 17 3.2.3 IPSP-reducering... 18 3.2.4 Amplituder... 19 3.2.5 Nervcellsmembranets tidkonstant... 20 iv

3.3 Förfarande för en simulering... 21 4. Resultat... 23 4.1 Hur resultaten uppnåddes... 23 4.1.1 Samma PSP amplitud... 23 4.1.2 Fix kvot g e /g i... 24 4.1.3 Längre tidsintervall för potentialmätning med samma PSP amplitud... 25 4.1.4 Höjning av membranets tidskonstant... 28 4.1.5 Höjning av falltiden tau 2... 29 4.1.6 Höjning av både membranets tidskonstant och falltiden tau 2... 30 4.2 Jämförelse mellan de olika simuleringarna... 31 5. Diskussion... 33 6. Litteraturlista... 34 7. Bilaga A - Parametertabeller... 37 v

1. Inledning Denna rapport sammanfattar ett examensarbete för SANS-forskargruppen (Studier av Artificiella Nervsystem) på institutionen för Numerisk Analys och Datalogi (Nada), KTH. Arbetet genomfördes under hösten och våren 2003-2004 och är en del av civilingenjörsutbildningen i datateknik på KTH. Rapporten vänder sig främst till KTHstudenter som gått biomedicinsk teknisk inriktning eller andra personer med biomedicinsk bakgrund. 1.1 Bakgrund Tidigare har man trott att endast en neurotransmittor frisläpps från varje nervcell, och inte som i co-lokalisationhypotesen där en nervcell kan frisläppa två snabba neurotransmittorer. Men nu har många experiment visat att så inte behöver vara fallet. Det finns bevis för att både excitatoriska och inhibitoriska neurotransmittorer co-existerar, är co-lokaliserade, co-transmitteras och har co-syntes. Yuri Zilberter vid Karolinska institutet, institutionen för neurovetenskap, har utfört konditioneringsexperiment, där bakåtpropagerande aktionspotentialer, BAP, uppstår i nervcellens dendriter. Dessa för med sig att antingen GABA eller glutamat frisläpps från den postsynaptiska nervcellen och fungerar då som en retrograd budbärare. Detta innebär att glutamatexocytosen respektive GABA-exocytosen inhiberas, dvs. depression, i den presynaptiska nervcellen, vilket resulterar i minskad EPSP amplitud respektive IPSP amplitud. Ur ovanstående har Erik Fransén satt ihop detta scenario som examensarbetet bygger på: En nervcell A har synaptiskt kontakt med nervcell B. Denna synaps har co-lokalisation. Om nervcell B är excitatorisk och har korttidsdepression, som t.ex. beror på en konditionering, kan denna nervcell fungera som en semistabil switch. Antag att B är aktiv och bakåtpropagerar glutamat till As presynaptiska terminal, vilket undertrycker GABA-komponenten. När A är aktiv kommer B att bli aktiverad och situationen är stabil. Om istället B inte är aktiv, så kommer GABA-komponenten inte att undertryckas och transmission från A kommer inte att aktivera B. Detta är också en stabil situation. Den kommer kanske till och med att undertrycka B om GABA-komponenten är starkare än glutamatkomponenten. På detta sätt kan kanske en synaptisk kontakt temporärt spara en positiv eller negativ vikt beroende av aktiviteten på både den presynaptiska och den postsynaptiska nervcellen. Detta examensarbete går ut på att undersöka om en synaps, som både har co-lokalisation och som konditioneras enligt Yuri Zilberters experiment kan fungera som en semistabil switch. Ingen har tidigare undersökt denna switchteori. 1.2 Problemspecifikation I vissa nervceller förekommer både retande och hämmande transmittorer i axonterminalen. Det är oklart vad den funktionella betydelsen av detta är. I kombination med depression baserad på den postsynaptiska cellens aktivitet kunde synapsen fungera som en switch med korttidsminnesegenskaper. Detta skall analyseras med biofysikalisk modellering. Examensarbetet går ut på att studera den postsynaptiska nervcellens membranpotential och undersöka hur den påverkas av synaptiska potentialer. En synaps med en blandning av retande och hämmande transmittor uppvisar ett bifasiskt förlopp vars totaleffekt på cellen beror på storleken av den retande respektive hämmande komponentens storlek. I det fall att den hämmande överväger något och det dessutom finns korttidsplasticitet av konditioneringstyp, så 1

finns möjligheten att synapsen efter en konditionering byter till att vara övervägande retande. Detta har veterligen aldrig observerats och är därför en mycket intressant möjlighet. Arbetet kommer att innebära att först finna lämpliga värden på de synaptiska potentialernas stigande och fallande tidskonstanter. Sedan kommer dessa att varieras i ett intervall, då förändringen i membranpotentialen analyseras. Konditioneringens storlek kommer att antas vara fix på 50 %. 1.3 Mål Målet med detta examensarbete är att genom simuleringar undersöka om co-lokalisering av neurotransmittorerna GABA och glutamat i kombination med synaptisk depression, baserad på den postsynaptiska cellens aktivitet, kan fungera som en switch med korttidsminnesegenskaper. Med korttidsminnesegenskaper menas att synapsen förändras endast tillfälligt. När konditioneringsdepressionen har avklingat är synapsen återigen hämmande. Så länge den postsynaptiska nervcellen är aktiv behålls dock konditioneringsdepressionen av GABA-komponenten. 1.4 Metod För att lösa problemet kommer en fallstudie att utföras. Parametrarna tau 1, stigtiden, och tau 2, falltiden, för det postsynaptiska svaret kommer att varieras för att få önskat resultat. Detta görs för både GABA- och glutamatkomponenten. För varje fall undersöks om switchteorin fungerar. Denna undersökning går ut på att beräkna deltav, V, som är potentialskillnaden före respektive efter konditioneringen. Samtidigt med detta kan även koncentrationen av GABA relativt glutamat som avgetts från den presynaptiska terminalen analyseras. Om svaret är en hyperpolarisation har mer GABA frisläppts medan om svaret är depolariserande har mer glutamat frisläppts. När en aktionspotential når den presynaptiska terminalen avges det GABA och glutamat. I det första försöket förutsätts att GABA > glutamat, så svaret i den postsynaptiska nervcellen kommer att bli inhibitoriskt, dvs. en hyperpolarisering av membranet kommer att ske och V<0, där V är potentialskillnaden mellan vilopotentialen och IPSP:n. Dock ska GABA bara vara ytterst lite större än glutamat. I det andra försöket sänds en våg av bakåtpropagerande aktionspotentialer, 10 stycken 50 Hz, från den postsynaptiska nervcellen, detta är själva konditioneringen som Yuri Zilberter har beskrivit i sina artiklar [42] [43]. Detta medför att glutamat frisläpps från den postsynaptiska nervcellen och tas upp av receptorer vid den presynaptiska terminalen. GABA minskar nu i den postsynaptiska nervcellen, minskningen kommer att vara 50 %. Den presynaptiska synapsen kommer nu att försvagas, dvs. depression av den presynaptiska terminalen. När återigen en aktionspotential utlöses i den presynaptiska terminalen kan svaret i den postsynaptiska nervcellen bli en EPSP (förhoppningsvis), dvs. en höjning av membranpotentialen alltså en depolarisation. Detta medför att V > 0, dvs. potentialskillnaden mellan vilopotentialen och EPSP:n. Eventuellt kan även en aktionspotential utlösas i den postsynaptiska nervcellen pga. den höjda membranpotentialen. Detta innebär att GABA < glutamat, tvärtemot det första försöket, och det är detta som menas med en switch i det här sammanhanget, V byter tecken. Man skulle kunna undersöka switchteorin genom att istället för att beräkna V, beräkna medelpotentialen före respektive efter konditioneringen eller beräkna arean under en kombinerad EPSP + IPSP-graf före och efter konditioneringen. Men valet av metod föll på att beräkna V, eftersom denna metod snabbt och tillförlitligt visar om switchteorin fungerar för ett intervall av värden. Eftersom många simuleringar skulle utföras, vilka i medeltal tog ca 45 minuter styck, skulle t.ex. areametoden ta alldeles för lång tid att genomföra. V-metoden tar ingen nämnvärd extra tid att genomföra. Därför valdes denna metod. 2

2. Grundläggande teori Kanske den största anledningen till att neurovetenskapen kvarstår som ett så intressant område är den stora mängden av obesvarade frågor om de fundamentala strukturerna och funktionerna hos nervsystemet. Detta kapitel behandlar de funktioner och begrepp som är kända inom neurovetenskapen, vilket läsaren behöver förstå innan resten av examensarbetet läses. 2.1 Celler i nervsystemet Cellerna som finns i nervsystemet kan delas upp i två kategorier, nervceller och gliaceller. 2.1.1 Nervceller Nervcellerna är de celler som sänder och tar emot elektriska signaler i nervsystemet. Nervceller har ett typiskt utseende, se figur 2.1. Figur 2.1 Nervcellen. Källa: www.enchantedlearning.com En nervcell består av en cellkropp, eller soma, där cellkärnan finns. Soma har grenade utskott som kallas dendriter vilka tar emot signaler från andra nervceller [31]. Till soma fäster även ett långt axon. Axonet förmedlar vidare den inkommande signalen till andra nervcellers dendriter. Avgörande för om signalen sänds vidare till andra nervceller är axon hilloc. Axon hilloc är en trigger-komponent som avgör om en aktionspotential 1 ska aktiveras, vilket krävs för signalförmedling. Fäst på axonet finns fettrika isolerande cylindrar av myelin som produceras av Schwann celler. Dessa isolerade myelincylindrar ökar hastigheten med vilken en aktionspotential förmedlas över axonet, genom att det elektriska strömflödet förbättras då ingen ström kan läcka igenom myelinet. Myelincylindrarna täcker inte hela axonet och de ställen som är nakna kallas Ranviers noder. I Ranviers noder finns jonkanaler 2, vilket inte finns någon annanstans längs axonet, vilka medverkar i aktionspotentialgenerationen. I slutet av axonen finns axonterminalen där signalen skickas vidare till andra nervcellers dendriter via synapser 3. 1 Se Elektrisk signalering kapitel 2.2 2 Jonkanalernas funktion beskrivs i kapitel 2.2 3 Se synaptisk transmission kapitel 2.3 3

Nervceller som bär information mot hjärnan kallas afferenta nervceller och de som bär information från hjärnan kallas efferenta nervceller. Nervceller som endast deltar i lokala aspekter i ett nervnätverk kallas interneuron. Kroppen tillverkar inga nya nervceller, så nervceller kan inte ersättas. Dock byggs hjärnan och ryggmärgen upp av 100 miljarder nervceller. En nervcell varierar i storlek mellan 4 µm och 100 µm i diameter och har varierande längd beroende på hur långa dendriter och axon är. 2.1.2 Gliaceller Gliaceller 4 är inte kapabla att utföra elektrisk signalering och deltar ej heller i synaptiska interaktioner, ty dessa celler saknar både axon och dendriter [31]. Det finns tre sorters gliaceller, Astrocyter, Oligodendrocyter och Mikrogliaceller, se figur 2.2. Dessa cellers funktion är att upprätthålla en lämplig kemisk omgivning för neuronal signalering, slå in axon med myelin, bygga upp myelin, hjälpa till vid återhämtningen vid nervskador, kontrollera upptagningen av neurotransmittor samt makrofagiska funktioner. Gliaceller är flera till antalet än nervceller, ca 300 miljarder finns i nervsystemet. Figur 2.2 Två sorters gliaceller. Källa: Eberly College of Science, www.bmb.psu.edu. 2.2 Elektrisk signalering När nervcellen varken tar emot eller sänder information befinner sig nervcellen i ett viloläge. Detta viloläge kallas membranets vilopotential och är negativt laddad över nervcellen, -40 till -90 mv [31]. Om stimuli får membranets potential att bli mer negativ, hyperpolarisation, sker ett passivt svar dvs. det händer inte speciellt mycket. Däremot om stimuli får membranets potential att bli mer positiv än vilopotentialen, depolarisation, kan en aktionspotential utlösas om membranpotentialen når ett visst tröskelvärde. Elektriska signaler uppstår i nervcellens membran pga. två orsaker. 1. Koncentrationerna av joner är olika utanför och inuti nervcellen. 2. Membranet är selektivt permeabelt för några av dessa joner. 4 Glia kommer från grekiskan och betyder lim. Tidigare trodde man att nervsystemet hölls samman av gliacellerna. [31] 4

Dessa två orsaker beror i sin tur på två olika proteiner som finns i membranet. Jonkoncentrationerna sköts av aktiva jonpumpar som pumpar joner in/ut från nervcellen mot deras koncentrationsgradient, se figur 2.3. Den selektiva permeabiliteten beror på jonkanaler som endast tillåter vissa joner att passera i riktningen av deras koncentrationsgradient. Jonkanaler finns av två olika typer, spänningsstyrda jonkanaler och bindningsstyrda jonkanaler. Bindningsstyrda jonkanaler binder t.ex. glutamat och fungerar då som receptorer. Jonkanaler och jonpumpar arbetar mot varandra och detta medför att de genererar vilopotentialer, aktionspotentialer, synaptiska potentialer och receptorpotentialer som utlöser aktionspotentialer. Figur 2.3 Jonkanal och jonpump. Källa: www.evotecoai.com. Det stora problemet med att sända elektriska signaler längs ett axon är att axonet inte är en bra elektrisk ledare. Detta kompenseras dock av att nervcellerna, genom evolution, har fått ett hjälpsystem som förmedlar och förstärker dessa elektriska signaler. Den våg av elektrisk aktivitet som produceras av hjälpsystemet kallas aktionspotentialer, impulser eller spikar. Aktionspotentialen har ett allt-eller ingetbeteende, dvs. den uppstår fullt ut eller inte alls. Vid vilopotentialen finns det alltid en högre koncentration K + inuti cellen än utanför och högre koncentration Na + utanför cellen än inuti. Detta medför att vilopotentialen är negativ. När membranpotentialen blir depolariserad ökar Na + permeabiliteten och en aktionspotential uppstår. Höjningen i Na + permeabilitet är kortvarig och minskar snabbt samtidigt som K + permeabiliteten ökar igen för att återgå till vilopotentialen. Amplituden på aktionspotentialen är oberoende av storleken på strömmen som utlöste den. Detta innebär att en större ström inte innebär en större amplitud hos aktionspotentialen. Istället styr intensiteten av stimulus frekvensen av aktionspotentialer. 5

2.3 Synaptisk transmission Nervcellens synapser 5 används till kommunikation med andra nervceller för att förmedla elektriska signaler. En typisk nervcell har mellan 1000 och 10000 synapser, dvs. kommunicerar med 1000-10000 andra nervceller, muskelceller eller körtlar. Det finns två olika sorters synapser, elektriska synapser och kemiska synapser. 2.3.1 Elektriska synapser i den presynaptiska terminalen Elektriska synapser medger ett direkt passivt flöde av elektrisk ström från en nervcell till en annan [31]. Strömmen flyter genom s.k. gap junctions, specialiserade membrankanaler som förenar två nervceller, se figur 2.4. Ström kan flyta åt båda hållen, beroende på vilken av nervcellerna som nås av en aktionspotential. Denna synaps har en snabb transmission, eftersom kommunikationen ej har några förseningar. De elektriska synapserna är i minoritet men har en viktig huvudfunktion, nämligen att synkronisera den elektriska aktiviteten hos nervcellerna. Detta medför att alla nervceller i ett lokalt område avger aktionspotentialer samtidigt. Figur 2.4 Elektrisk synaps. Källa: www.physiology.wisc.edu. 5 Synaps kommer från grekiskan, syn, tillsammans, och haptein, att fastna. [19] 6

2.3.2 Kemiska synapser i den presynaptiska terminalen Kemiska synapser kommunicerar genom frisläppandet av neurotransmittorer 6 [31], se figur 2.5. I den presynaptiska delen av synapsen finns synaptiska vesikler som innehåller neurotransmittorer. Frisläppandet av neurotransmittorer utlöses av att en aktionspotential når den presynaptiska terminalen och depolariserar terminalmembranen. Detta leder till en inströmning av Ca 2+ genom de spänningsstyrda jonkanalerna i den presynaptiska terminalen. Den kortvariga koncentrationsökningen av Ca 2+ får de synaptiska vesiklerna att smälta samman med det presynaptiska plasmamembranet och frisläppa neurotransmittorn i synapsklyftan, dvs. exocytos. Eftersom denna kommunikation är indirekt uppstår en synaptisk fördröjning, 0.5-1.0 ms från det att en aktionspotential uppstår i det presynaptiska axonet tills en EPSP 7 registreras i den postsynaptiska cellen. Om individuella vesikler inte släpps samtidigt kan man få latensvariationer. Latensvariationer kan ha effekter på stigtiden för det synaptiska svaret, speciellt stigtiden för den synaptiska strömmen [19]. Figur 2.5 Kemisk synaps. Källa: www.physiology.wisc.edu. 6 Se kap 2.4. 7 Se kap 2.5.3 7

2.3.3 Postsynaptiska effekter Bindningen av neurotransmittorer, antingen direkt genom elektriska synapser eller indirekt av kemiska synapser, får jonkanaler i det postsynaptiska membranet att öppna eller stänga sig. Detta medför att det uppstår en sekundär ström, en PSC 8, i det postsynaptiska membranet, då joner börjar röra sig in/ut ur nervcellen via jonkanalerna. Den resulterande strömmen ändrar membranpotentialen och ökar/minskar sannolikheten för att nervcellen ska avge en aktionspotential. Huruvida den postsynaptiska effekten blir inhibitorisk eller excitatorisk beror på vilken klass av jonkanalreceptorer som neurotransmittorn påverkar och på koncentrationen av joner innanför och utanför nervcellen [31]. Det finns två sorters receptorer, receptorer där receptormolekylen är en jonkanal, och receptorer där receptor och jonkanal är separerade molekyler. Bindningsstyrda jonkanaler, som den första sorten kallas, ger upphov till snabba postsynaptiska effekter som bara varar i några få millisekunder. Den andra sorten kallas metabotrofa receptorer, vilka producerar långsamma postsynaptiska effekter som varar längre än några millisekunder. 2.4 Neurotransmittorer För att avgöra om en molekyl är en neurotransmittor måste molekylen uppfylla dessa kriterier [31]: 1. Molekylen måste finnas i den presynaptiska nervcellen. 2. Molekylen måste under en presynaptisk depolarisation frisläppas, och frisläppningen måste vara Ca 2+ -beroende. 3. Det måste finnas specificerade receptorer för molekylen på den postsynaptiska cellen. Det finns två kategorier av neurotransmittorer, neuropeptider och småmolekylära neurotransmittorer. Neuropeptider är stora transmittor molekyler som består av tre till trettiosex aminosyror. Småmolekylära neurotransmittorer består av enkla aminosyror såsom GABA och Glutamat. Småmolekylära neurotransmittorer frisläpps fortare än neuropeptider. Detta beror på att neuropeptidvesiklerna befinner sig längre bort från plasmamembranet i den presynaptiska terminalen och hinner då inte smälta samman med plasmamembranet under den korta tid då koncentrationshöjningen av Ca 2+ sker. För att neuropeptiderna ska frisättas krävs en hög frekvent stimulation, dvs. flera aktionspotentialer under ett kort tidsintervall. Det finns många nervceller som innehåller och frisläpper två eller flera olika neurotransmittorer, t.ex. två stycken småmolekylära neurotransmittorer. Detta fenomen kallas co-lokalisation. Enskilda neurotransmittortyper packas in i egna synapsvesikler i den presynaptiska terminalen, men det finns bevis för att två eller fler neurotransmittorer finns i samma synapsvesikel [31]. 2.4.1 GABA De flesta inhibitoriska nervcellerna i centrala nervsystemet använder GABA, γ-aminobutyric acid, som transmittor. Frisläppandet av GABA minskar sannolikheten för att en nervcell ska avge en aktionspotential. Det finns tre sorters receptorer som använder GABA som neurotransmittor, GABA A, GABA B och GABA C [31]. GABA A - och GABA C -receptorer är bindningsstyrda jonkanaler medan GABA B -receptorn är en metabotrof 9 receptor. GABA A - och GABA C -receptorerna är inhibitoriska eftersom deras jonkanaler är permeabla för Cl -, vars reverseringspotential 10, E rev, är mer 8 Se kap 2.5.2 9 Se kap 2.3.3 10 Se kap 2.5.1 8

negativ än tröskelvärdespotentialen. GABA B receptorer är också inhibitoriska, men de fungerar på ett annat sätt. GABA B -orsakad inhibition beror på aktiveringen av K + -jonkanalerna samt på att GABA B receptorer blockerar bl.a. Ca 2+ -jonkanalerna, vilket leder till att den postsynaptiska cellen hyperpolariseras. 2.4.2 Glutamat Glutamat är en excitatorisk transmittor och är den viktigaste transmittorn för normal hjärnfunktion [31]. Nästan alla excitatoriska nervceller i nervsystemet är glutamaterga. Frisläppandet av glutamat ökar sannolikheten för att en aktionspotential ska avges. Det finns flera kända glutamatreceptorer, som alltid producerar excitatoriska postsynaptiska svar, i det postsynaptiska cellmembranet. Tre av dessa är bindningsstyrda jonkanaler och kallas NMDA receptorer (N-metyl-D-aspartat), AMPA (α-amino-3-hydroxyl-5-metyl-4-isoxazolpropionat) receptorer och kainat-receptorer. Alla dessa kanaler är icke selekterande jonkanaler vilket medför att de låter Na +, K + och små mängder av Ca 2+ att passera. De postsynaptiska strömmar som produceras av NMDA receptorer är långsamma och långtidsverkande medan strömmarna producerade av AMPA/kainat receptorer är snabba och korttidsverkande. 2.5 Synapstransmissionens elektriska effekter De neurotransmittorer som binder till receptorer ger upphov till olika strömmar och spänningar i den postsynaptiska cellen. 2.5.1 EPC och EPP Neurotransmittorerna som släpps ut i synapsklyftan och binder till receptorer i muskelmembranet får Na + -jonkanaler att öppna sig och K + -jonkanaler att stänga sig. De öppnade Na + - jonkanalerna bidrar till att det uppstår en summerad makroskopisk ström, som kallas end plate current, EPC. Normalt flyter strömmen in i cellen, ty Na + -koncentrationen är lägre inuti nervcellen, vilket för med sig att den postsynaptiska membranpotentialen depolariseras. Denna depolariserande ändring i potential kallas end plate potential, EPP, och medför eventuellt att en postsynaptisk aktionspotential utlöses. MiniatyrEPP, mepp, är spontana deplolarisationer som uppstår under slumpartade intervall som i medeltal är runt en per sekund [19]. En ensam mepp uppstår genom frisläppandet av en neurotransmittorvesikel från den presynaptiska terminalen. En EPP består av multiplar av mepp som uppkommer då de makroskopiska strömmarna uppstår. Kvantumhypotesen säger att variationen av EPPs amplitud beror på variationen av antalet mepp som släpps fria och som kan bygga upp en EPP [19]. Ju större EPP desto större chans att en aktionspotential utlöses. När den postsynaptiska membranpotentialen är lägre än vilopotentialen blir amplituden för EPC:n större, och den minskar när den postsynaptiska membranpotentialen ökar [31]. Vid ca 0 mv existerar ingen EPC, ty inflödet av Na + och utflödet av K + är balanserat. Vid ännu högre potentialer byter strömmen polaritet och blir istället utåtriktad. Potentialen där EPC byter polaritet kallas reverseringspotentialen, E rev. Vid 0 mv byter EPP polaritet och vid ännu högre potentialer hyperpolariseras EPP:n. Detta medför att polariteten och storleken för EPP beror på den elektrokemiska pådrivande kraften (postsynaptiska membranpotentialen reverseringspotentialen) vilket i sin tur bestämmer polaritet och amplitud på EPC, se ekvation 2.5.1. EPP kommer att depolariseras när membranpotentialen är mer negativ än E rev, och hyperpolariseras när membranpotentialen är mer positiv än E rev. Meningen med en neurotransmittor som binder till en receptor är att få membranpotentialen att gå på mot E rev för just den jonkanal som neurotransmittorn aktiverar. 9

EPC = GS *( V ) x m Erev { 14243 jonisk konduk tan s elektrokemisk pådrivande kraft, (Ekvation 2.5.1) [31] När en jonkanal är öppen beror strömmen som flyter genom jonkanalen på kanalens konduktans och den elektrokemiska pådrivande kraften. Om varje jonkanal skulle öppna sig samtidigt och hålla sig öppna skulle den totala synaptiska konduktansen bli summan av alla jonkanalers konduktanser, se ekvation 2.5.2 nedan. G S N = G (Ekvation 2.5.2) [31] x= 1 Sx När kanalerna är öppna, se figur 2.6, flyter en ström genom kanalerna enligt ekvation 2.5.1. EPC laddar membrankapacitansen, C m, och flyter genom membrankonduktansen, G r. När neurotransmittorkoncentrationen blir låg och jonkanalerna stänger avtar membran potentialen som skapats över C m med en hastighet som bestäms av τ m [19]. Detta är falltiden tau 2. För synaptiska händelser som är snabbare än τ m, kommer avtagningen av den synaptiska potentialen att styras av τ m, medan för synaptiska händelser som är långsammare än τ m kommer tidsförloppet för den synaptiska potentialen att styras av tidsförloppet för konduktansändringen. Riktningen på EPC, och därmed polariteten på potentialen över C m under EPC flödet, bestäms av E S relativt E r. Avtagningen för EPC är spänningsberoende. För hyperpolariserade potentialer är avtagningen långsammare än för depolariserade potentialer.. G r och E r är vilokonduktansen respektive vilopotentialen för den postsynaptiska nervcellen. C m är membrankapacitansen och V m är membranpotentialen, se figur 2.6. Figur 2.6 Schema för bindningsstyrd jonkanal. 2.5.2 PSC och PSP När neurotransmittorerna binds till receptorerna, produceras en postsynaptisk konduktansändring 11, pga. att jonkanaler öppnas [31]. Den postsynaptiska konduktansen ökar när jonkanalerna öppnas och minskar när jonkanalerna stängs. Denna konduktansändring ger upphov till en elektrisk postsynaptisk ström, PSC, som i sin tur ändrar membranpotentialen och ger en postsynaptisk potential, PSP. På liknande sätt som EPP kommer PSP att vara depolariserande om dess reverseringspotential är mer positiv än membranpotentialen och vara hyperpolariserande om dess reverseringspotential är mer negativ. 11 Konduktans är inversen av resistans. 10

2.5.3 EPSP och IPSP De postsynaptiska konduktansändringarna och de potentialändringar som följer ändrar sannolikheten för att en aktionspotential ska utlösas i den postsynaptiska nervcellen [31]. En PSP kallas excitatorisk PSP, EPSP, om den ökar sannolikheten för att en postsynaptisk aktionspotential ska uppstå. Om PSP:n minskar sannolikheten för att en postsynaptisk aktionspotential ska uppstå, kallas den inhibitorisk PSP, IPSP. Det som bestämmer huruvida ett postsynaptiskt svar är en IPSP eller EPSP är vilken typ av kanal, Na +, K +, Ca 2+ eller Cl -, som är kopplad till receptorn och på koncentrationen av jonerna utanför och innanför nervcellen. Detta medför att den enda faktor som skiljer postsynaptisk excitation från inhibition är reverseringspotentialen för PSP:n i relation till tröskelvärdet för att generera en aktionspotential. En EPSP depolariserar nervcellen med målet att nå tröskelvärdespotentialen och utlösa en aktionspotential, se (A) i figur 2.7 nedan, medan en IPSP försöker hålla membranpotentialen mer negativ än tröskelvärdespotentialen, se figur (B) i figur 2.7 nedan. En EPSP depolariserar alltid den postsynaptiska nervcellen, medan en IPSP både kan depolarisera och hyperpolarisera. I en inhibitorisk synaps kan en IPSP depolarisera när t.ex. vilopotentialen är 60 mv, tröskelvärdet 40 mv och E rev är 50 mv. IPSP:n får alltså potentialen att höjas till 50 mv, vilket är en höjning av potentialen och är alltså en depolarisering, se C) i figur 2.7 nedan. Dock når aldrig potentialen tröskelvärdespotentialen, så en aktionspotential uppstår aldrig. Allmänt gäller att: Erev > tröskelvärde = excitatorisk [31] E < tröskelvärde = inhibitorisk rev Figur 2.7 Reverseringspotentialer och tröskelvärdespotentialer bestämmer postsynaptisk excitation och inhibition. [31 sida 148] 2.5.4 Summation av postsynaptiska potentialer De enskilda PSP som uppkommer är väldigt små och når aldrig tröskelvärdespotentialen själva [31]. För att nå tröskelvärdespotentialen kan varje aktiv synaps summera ihop sina PSP med målet att bestämma om den postsynaptiska nervcellen ska utlösa en aktionspotential eller inte, se figur 2.8 nedan. De excitatoriska synapserna och inhibitoriska synapserna ger upphov till EPSP:er respektive IPSP:er vilka summeras samman om de uppkommer ungefär samtidigt i nervcellen. Summation av EPSP:er och IPSP:er möjliggör att en nervcell kan integrera den elektriska information som synapserna skickar. Om summation av PSP:erna resulterar i en aktionspotential beror på balansen mellan excitation och inhibition. Om summering av alla EPSP:er och IPSP:er ger en 11

depolarisation som får membranpotentialen att nå tröskelvärdet, utlöses en aktionspotential. Annars sker ingenting. Figur 2.8 Summation av postsynaptiska potentialer. [31 sida 150] 2.6 Synaptisk plasticitet Med synaptisk plasticitet menas ändringskapaciteten för nervsystemet. Den vuxna hjärnan måste ha en viss plasticitet för att kunna lära sig nya färdigheter, skapa minnen och hantera nervcellsskador. Alla mekanismer för dessa ändringar är inte kända men kan bero på reglerade ändringar i synapsens styrka [31]. Synaptisk styrka kan variera mellan olika tidpunkter. 2.6.1 Synaptisk facilitering Synaptisk facilitering är en kortvarig ökning i synaptisk styrka som uppkommer då två eller fler aktionspotentialer når den presynaptiska terminalen i följd. Facilitation tros bero på ett minskat presynaptisk Ca 2+ -borttag, vilket för med sig att en högre Ca 2+ -koncentration byggs upp i den presynaptiska terminalen. Detta för i sin tur med sig att mer av neurotransmittorn frisläpps av varje ny aktionspotential. Detta resulterar i att den postsynaptiska EPP:n ökar stadigt, dvs. amplituden för EPP:n ökar. Om en högfrekvent våg av aktionspotentialer når den presynaptiska terminalen i följd, kan en ännu högre koncentration av Ca 2+ uppkomma. Detta fenomen kallas post-tetanisk potentiation, PTP. PTP är fördröjd och uppstår först efter några minuter efter det att vågen av stimuli har upphört, se figur 2.9 nedan. Skillnaden i varaktighet skiljer PTP från vanlig synaptisk facilitering. Long-term potentiation, LTP, är en synaptisk aktivitet som producerar en långvarig eller t.o.m. en permanent ökning i synaptisk styrka [31]. LTP tros ligga bakom långtidsminnet. 12

2.6.2 Synaptisk depression Synaptisk depression uppstår när många presynaptiska aktionspotentialer utlöses i snabb följd och beror på hur mycket neurotransmittor som frisläpps, se figur 2.9 nedan. Depression uppkommer pga. den progressiva förbrukningen av synaptiska vesikler, då det till sist inte finns några vesikler kvar med neurotransmittor som kan smälta samman med plasmamembranet. Under synaptisk depression avtar styrkan hos synapserna, tills förrådet av synapsvesikler blir återfyllt. Detta medför att EPP-amplituden minskar, medan mepp-amplituden inte minskar. Excitatoriska synapser råkar oftare ut för synaptisk depression än inhibitoriska synapser [38]. Även återhämtningen efter depressionen skiljer dessa synapser åt. Under en repeterande aktivering av excitatoriska synapser framträder en frekvensberoende synaptisk depression. Även hos inhibitoriska synapser uppstår synaptisk depression, dock skiljer sig depressionen åt. Depression hos excitatoriska synapser reducerar återkommande excitation och depression hos inhibitoriska synapser ökar den återkommande excitationen. Efter ca 10 presynaptiska aktionspotentialer visar excitatoriska synapser större depression än inhibitoriska synapser och det bli mer tydligt ju högre frekvens man använder. Long-term-depression, LTD, är en form av synaptisk plasticitet som får synapserna att bli mindre effektiva [31]. Detta behövs eftersom om synapserna bara skulle kunna öka i styrka, som en följd av LTP och till sist nå en maximal nivå, skulle det bli svårt att få in mer information. Därför finns det processer - t.ex. LTD - som selektivt försvagar synapser. I LTD ändras de postsynaptiska signaleringsprocesserna eventuellt så att AMPA-receptorerna producerar mindre elektriska signaler med avseende på det glutamat som frisläpps. Detta försvagande av synapserna är det slutgiltiga stadiet av LTD. LTD är liksom LTP långvarig. Figur 2.9 Korttidsplasticitet vid en neuromuskulär synaps. [31sida 539] 2.7 Co-lokalisation Tidigare har man trott att endast en snabb neurotransmittor frisläpps från varje nervcell, och inte som i co-lokalisation där en nervcell kan frisläppa två snabba neurotransmittorer. Men nu har många experiment visat att så inte behöver vara fallet: Co-transmission har påvisats genom att nervceller har frisläppt både GABA och glycin som aktiverar funktionellt helt olika receptorer i deras postsynaptiska nervceller. Båda dessa neurotransmittorer är inhibitoriska [20]. Det som bl.a. stödjer denna hypotes är: 1. En snabb neurotransmittor kan frisläppas tillsammans med en neuropeptid. 13

2. En ensam neurotransmittor kan co-aktivera flera metabotrofa- och bindningsstyrda receptorer. 3. Både GABA och glycin medför inhibitorisk synaptisk transmission. 4. Både glycinreceptorer och GABA-receptorer finns på postsynaptiska dendriter. Co-syntes av glutamat tillsammans med GABA eller ACh, acetylcholin, i GABAerganervceller och Cholinerga-nervceller har påvisats i experiment [26]. Dessa nervceller frisläpper glutamat tillsammans med GABA eller ACh. Co-transmission av glutamat och ACh kan fysiologiskt vara viktigt eftersom både glutamat och ACh är excitatoriska. Detta kan leda till att glutamat receptorer och ACh receptorer adderar de potentialförändringar de bidrar med, dvs. summation. Denna summation medför en större sannolikhet för utlösandet av en aktionspotential. Glutamat som frisläppts från ACh-terminaler kan även fungera som modulatorer för frisläppande av ACh. Denna mekanism fungerar även tvärtom, ACh kan även modulera frisläppande av glutamat. Co-transmission av glutamat och aspartat från cholinerga- och GABA-synaptosomer 12 har visats genom experiment [9]. Dessa synaptosomer frisläpper glutamat och aspartat och sin huvudsakliga neurotransmittor ACh/GABA. GABA kan ha en excitatorisk roll genom att facilitera förmågan hos andra excitatoriska transmittorer, speciellt glutamat, för att inducera aktionspotentialer. Det finns alltså en period där både GABA- och glutamatmediterad depolarisation co-existerar. [13] Co-lokalisation av GABA och glutamat har påvisats i glutamaterga nervceller. Dessa nervcellers terminaler innehöll signifikanta koncentrationer av både glutamat och GABA [26]. Co-existens av en excitatorisk aminosyra och en inhibitorisk aminosyra i samma excitatoriska presynaptiska terminal medför möjligheten till co-transmission av glutamat och GABA. Detta medför i sin tur att kontrollen av nervaktiviteten är mer komplex än vad man tidigare har trott [33]. I de terminaler där GABA och glutamat är co-lokaliserade finns det en möjlighet att de frisläpps vid olika frekvenser av neural urladdning och/eller att de aktiverar olika receptorer vid olika postsynaptiska och/eller presynaptiska ställen [26]. Glutamat kan undertrycka frisläppandet av GABA genom att aktivera presynaptiska glutamat receptorer. På liknande sätt kan GABA undertrycka frisläppandet av glutamat. Det särskiljande frisläppandet mellan GABA och glutamat, där GABA och glutamat är co-lokaliserade, och aktiveringen av terminalreceptorer kan bero på olika avfyrningsfrekvenser i nervcellerna. 2.8 Konditioneringsexperiment I de två experiment som Yuri Zilberter har utfört vid Karolinska institutet, Stockholm, och Max- Planck institutet för medicinskforskning, Heidelberg Tyskland, har samma konditioneringsmekanism använts. De två experimenten hade följande resultat: I excitatoriska synapser mellan pyramidnervceller och interneuron 13 i en råttas neocortex 14, produceras bakåtpropagerande aktionspotentialer, BAP, i interneuronets dendriter [43]. Dessa BAP för med sig en kortvarig ökning av Ca 2+ -koncentration i den postsynaptiska nervcellen som då frisläpper GABA från dendriten. GABA kommer nu att fungera som en retrograd budbärare och aktiverar presynaptiska GABA B -receptorer som resulterar i en inhibition av glutamat 12 Isolerade nervslut. 13 Se kapitel 3.1.1. 14 Hjärnans cortex byggs upp av sex lager och kallas neocortex. 14

exocytos från den presynaptiska axonterminalen. När interneuronet stimulerades 250 ms efter det postsynaptiska tåget av tio stycken BAP, var EPSP amplituden minskad. I det andra experimentet undersöktes inhibitoriska synapser mellan pyramidceller och FSN 15 interneuroner i en råttas neocortex. Samma konditioneringsmekanism användes, dvs. ett tåg av tio BAP, 50 Hz, i en postsynaptisk pyramidnervcell orsakar en kortvarig ökning i den dendritiska koncentrationen av Ca 2+. Detta resulterade i en signifikant minskning av IPSP-amplitud 250 ms efter konditioneringen, dvs. IPSP-depression. IPSP-depressionen kunde reproduceras genom repeterad konditionering, men amplituden minskade mindre och mindre för varje konditionering. Den synaptiska IPSP-depressionen beror på att en retrograd budbärare, glutamat, frisläpps från pyramidcellens dendriter pga. en förhöjd Ca 2+ koncentration. Glutamat fungerar som en retrograd budbärare, precis som i det första försöket med GABA, som leder till att glutamatreceptorer aktiveras i axonterminalen hos det presynaptiska FSN neuronet. Aktiveringen av dessa receptorer medför att sannolikheten för GABA frisläppning minskar. Detta får då den postsynaptiska IPSP-amplituden att minska [42], [28]. Dessa experiment visar att utvecklingen av synaptisk depression sker under den första minuten av konditioneringen. Experimenten visar också att den synaptiska transmissionen återhämtar sig med två tidskonstanter, en snabb på x ms och en långsam på y ms efter det att konditioneringen har avslutats [42]. 2.9 Neuron Workshop För att utföra simuleringarna användes programmet Neuron Workshop 4.2.1. skapat av Michael Hines och John W. Moore vid sektionen för neurobiologi, Duke University. Neuron Workshop är en simulationsmiljö som används för att bygga upp och testa modeller av nervceller samt nätverk av nervceller. Programmet är speciellt anpassat till modelleringsproblem där ledningsegenskaperna hos nervcellerna spelar en viktig roll, såsom jonkanaler och jonpumpar. [15] Neuron Workshop tillåter användaren att skapa komplexa nervcellsmodeller genom att koppla ihop multipla nervcellssektioner (t.ex. soma, dendriter och axon) som har många olika membranegenskaper i dessa sektioner, såsom jonkanaler, jonpumpar, synapser och jonkoncentrationer. [18] Forskare hittar hela tiden nya fenomen, som medverkar i elektrisk och kemisk signalering. Mekanismerna som ligger bakom dessa fenomen skiljer sig åt på olika sätt: till vilken djurart mekanismen hör, vilken utvecklingsnivå mekanismen har och vilken nervcellsklass den tillhör. Ett simulationsprogram som är till nytta i forskning måste vara både flexibelt och kraftfullt, så att det kan lägga till nya biofysiska mekanismer i modellerna. Programmet måste också hjälpa användaren att hålla fokus på de viktiga anatomiska och biofysiska delarna av modellen och inte på programmeringen. Dessa krav på programmet uppfylls genom Neuron Workshops högnivåspråk NMODL, Neuron Model Description Language. Det första man gör är att skapa en textfil, en mod-fil, som beskriver en mekanism som en mängd olinjära algebraiska ekvationer, differentialekvationer eller reaktionsscheman. Denna text skickas sedan till en översättare som konverterar varje sektion till flera sektioner i C-kod. Utdata från översättaren kompileras sedan så att Neuron Network kan använda den. Man skriver också hoc-filer (High Order Calculator) 16 som används för att utföra de simuleringsmoment man är intresserad av. Dessa hoc-filer refererar till mod-filerna där mekanismerna finns. [15] [16] [17] 15 FSN Fast Spiking Neuron 16 hoc är ett programmeringsspråk som baseras på floating point calculator som utvecklades i The Unix Programming Environment av Kerighan och Pike 1984. 15

3. Utförande Detta kapitel beskriver det arbete och de förberedelser som utfördes innan simuleringarna kunde börja samt beskriver hur en vanlig simulering genomförs. 3.1 Värden för stig- och falltid Under inläsningsdelen av examensarbetet ingick det att hitta värden på de fyra parametrar som ger GABA- och glutamatreceptorerna sina egenskaper. Stigtiden tau 1 och falltiden tau 2 för både den excitatoriska receptorn, AMPA, och den inhibitoriska receptorn GABA A skulle varieras under simuleringarna. Dessa parametervärden finns angivna i vetenskapliga artiklar. Det finns en stor variation i stig- och falltid för AMPA och GABA A receptorer, se bilaga A. De parametervärden som användes som standardvärden i examensarbetet valdes enligt Koch och Segev [22], dels för att de verkar representativa, dels för att de ligger mitt i intervallet av rapporterade värden och dels för att samma värden därmed kunde användas både för den excitatoriska och för den inhibitoriska komponenten av synapsen, se tabell 3.1. Tabell 3.1 Standardvärden för parametrar [22] tau 1i tau 1e tau 2e tau 2i 1 ms 1 ms 6 ms 6 ms 3.2 Förberedelser inför simuleringarna För att kunna göra simuleringar i Neuron Workshop behövs ett simuleringsprogram. Ett simuleringsprogram till Neuron Workshop består av s.k. hoc-filer och mod-filer, se kap 3.9. 3.2.1 Modifiering av befintligt simuleringsprogram Det simuleringsprogram som användes var ett befintligt simuleringsprogram, skrivet av Björn Svennenfors som tidigare gjort sitt examensarbete vid SANS [35]. Det befintliga simuleringsprogrammet bygger upp en typisk synaps mellan interneuronet och pyramidcellen, dvs. med alla tillhörande jonkanaler, jonpumpar, axoner, terminaler, dendriter och nervcellssoman. I de två nervcellernas soman mäts potentialerna med två elektroder. Detta sköts i huvudsak av tre hocfiler, Network.hoc, Simulator.hoc och Main.hoc, samt en mängd mod-filer. I Network.hoc byggs hela nätverket av nervceller och dess sektioner upp och här bestäms också hur stora amplituderna för den inhibitoriska- och den excitatoriskadelen ska vara. Simulator.hoc utför själva simulationen och i Main.hoc anger användaren vilken av de fyra parametrarna som simuleringen ska beräknas. I Main.hoc anges också övriga ingångsvärden som hur lång simulationen ska vara o.s.v. Många av originalprogrammets funktioner kunde raderas, då de inte var av intresse för detta examensarbete, och ersättas med mina nya funktioner. Dessa funktioner var de som lades till det befintliga simuleringsprogrammet: En funktion som sparar alla somapotentialer för FSN-cellen och Pyramidcellen under simuleringen till två olika textfiler för att senare kunna plotta dem i Matlab. 16

En funktion som under simuleringen sparar värdena för de fyra olika potentialerna V 1, V 2, V 3 och V 4 samt för vilket tau-värde dessa potentialer genererats. Dessa värden sparas i en textfil för att man senare ska kunna göra beräkningar på potentialerna och plotta resultatet i Matlab. En funktion som varierar tau-värden i ett intervall under en simulering. För att kunna göra detta kopplades de fyra tau-parameterna till en mod-fil där standardvärdena för parametrarna finns. 3.2.2 Matlabprogram För att ett tau 2e/i -värde skulle räknas som ett giltigt tau 2e/i -värde måste det uppfylla två villkor: 1. V = V V 0 (Ekvation 3.1) 1 2 1 < 2 4 3 > 2. V = V V 0 (Ekvation 3.2) Om ekvation 3.1 eller ekvation 3.2, se figur 3.1. inte är uppfyllda så är de inte intressanta för denna undersökning, eftersom för dessa värden kommer inte synapsen att byta från att vara inhibitorisk till excitatorisk, dvs. switchteorin blir ej uppfylld. Figur 3.1 Tidpunkter då potentialerna V 1, V 2, V 3 och V 4 mäts. I Matlab-programmet beräknar jag V1 och V2 för varje tau-värde och beräknar skillnaden mellan dem, V, V = V2 - V1. Dvs. skillnaden mellan synaptisk potential före och efter konditioneringen. Denna skillnad är egentligen nettodepolarisationen för den andra aktionspotentialen minus nettohyperpolarisationen för första aktionspotentialen. Sedan plottas skillnaden V mot tau-värdena. 17

3.2.3 IPSP-reducering IPSP-reduceringen efter konditioneringen ska vara 50 % [43]. GABA minskar då i pyramidnervcellen. Detta p.g.a. att glutamat frisläppts från pyramidnervcellen och tagits upp av receptorer vid terminalen hos interneuronet. Interneuronsynapsen kommer nu att försvagas, dvs. depression av interneuron terminalen. Detta kunde inte programmeras in i simuleringsprogrammet utan behövdes ställas in manuellt genom prövning. I filen Network.hoc finns de parametrar som bestämmer de inhibitoriska och excitatoriska delarnas amplitudstorlek. Genom att sätta den excitatoriska parametern (EPSP bidraget) till noll och göra en simulering och sedan plotta resultatet, kunde en kontroll utföras för att se om IPSP-reduceringen verkligen var 50 % vid vilopotentialen 62.04 mv. Från början var den naturligtvist inte det. Då byttes värde på den inhibitoriska parametern i Network.hoc och en ny kontroll utfördes. När detta inte heller gav något bra värde på IPSP-reduceringen modifierades filen Fsn2Pyr.mod. Genom att höja värdet för IPSP-reduceringen i Fsn2Pyr.mod med 31 % erhölls till sist 50 % IPSP-reducering. Se figur 3.2 nedan. Att det verkligen var 50 % reducering kunde kontrolleras genom följande samband: V1 = 2 V 2, dvs. 50 % reducering. V1 = -62.04 (- 63.75) = 1.71 mv. V2 = -62.04 (-62.895) = 0.855 mv. Därmed hade jag ställt in 50 % IPSP reducering, ty 2x 0.855 = 1.71 mv. Figur 3.2 50 % IPSP-reducering. 18

3.2.4 Amplituder När simuleringarna påbörjades, insågs det ganska snart att EPSP-delen efter konditioneringen var alldeles för liten, se figur 3.3 nedan. Meningen var att IPSP-delen före konditioneringen och EPSP-delen efter konditioneringen skulle ha samma amplitud för standardvärdena för tauparametrarna. Figur 3.3 Amplitud för IPSP och EPSP innan respektive efter konditionering. För att få amplituden för IPSP-delen före konditioneringen och amplituden för EPSP-delen efter konditioneringen lika stora för basfall 1 17, multiplicerades den excitatoriska parametern i Network.hoc med en faktor vilket ledde till att amplituderna blev lika stora, se figur 3.4. 17 Se kapitel 4.1 19

Figur 3.4 IPSP-amplituden före konditionering lika stor som EPSP-amplituden efter konditionering. 3.2.5 Nervcellsmembranets tidkonstant För att ta reda på vilket värde nervcellsmembranets tidskonstant hade, sattes synapsernas parametervärden till noll. Dvs. den excitatoriska parametern och den inhibitoriska parametern i Network.hoc fick värdet noll. Detta innebär att inga EPSP:er eller IPSP:er kommer att uppstå i pyramidnervcellen. Endast konditioneringsvågen kommer att registreras i pyramidecellen. Sedan sattes strömmen över membranet < 0 genom att pyrstim[0].amp = -0.001. Detta innebär att konditioneringsdelen inte kommer ha ett sicksackmönster utan gå ned i en enda djup dal, se figur 3.5 nedan. Figur 3.5 Mätning av nervcellsmembranets tidskonstant. 20