2014-03-20 Cellens organisation och rörelse I: Mikrofilament, kap 17. Åsa Mackenzie, Inst f Neurovetenskap! asa.mackenzie@neuro.uu.se!! nervcell hjärna beteende och sjukdom 1
Denna föreläsning: - Introduktion! - Mikrofilament och aktinstrukturer (17.1). - Aktinfilamentens dynamik (17.2). - Mekanismerna bakom aktinfilamentens sammanfogning (17.3). - Organisationen hos aktinbaserade cellstrukturer (17.4). - Myosiner: aktinbaserade motorproteiner (17.5). - Myosindrivna rörelser (17.6)! Medan organellerna är lika celler emellan, är deras form och inre organisation och också förmåga till rörelse olika. Varför är detta viktigt och hur blir det så? 2
Cellers olika former och strukturer, några exempel Chlamyodomona Makrofag Epitelcell från tunntarmen Purkinjecell från lillhjärnan Epitelcell från tunntarmen: transporterar näringsämnen från ena sidan till andra för utsläpp till blodet. Makrofag (vit blodcell i immunförsvaret): letar reda på bakterier och dylikt och förstör dem genom att krypa över dem och äta upp dem. 3
CYTOSKELETTET ger upphov till cellpoläritet och olika cellers former Cytoskelettet Är INTE en fixerad struktur utan en DYNAMISK struktur som kan ändra form och längd på mindre än en minut, men som också kan vara stabil i flera timmar. Vad består det av? 4
Cytoskelettets komponenter 3 filamentsystem där varje består av polymerer av sammanfogade enheter som sätts ihop och tas isär allt efter cellens behov av förändring. 1. Mikrofilament är polymerer av proteinet aktin. Viktigt för plasmamembranets organisation, tex mikrovilli i epitelcellerna. 2. Mikrotubuli är polymerer av proteinet tubulin. Finns över hela cellen och ger strukturstöd till organeller och i cilier och flageller. Viktig struktur för separering av kromosomerna i samband med mitosen. Finn föreläser! 3. Intermediärfilament är polymerer av olika proteiner, är vävnadsspecifikt, tex strukturstöd i hår, hud, naglar och nervceller. Finn föreläser! 5
Cellsignalering reglerar cytoskelettets form och function 6
Mikrofilament och aktinstrukturer (17.1). Mikrofilament kan sammanfogas till många olika strukturer i en cell. Varje struktur kan kopplas till en specifik funktion. FORM OCH FUNKTION HÖR IHOP! En och samma cell kan ha flera olika slags arrangemang av mikrofilament Ett exempel: en migrerande fibroblast med lamellipodium, filopodium och kontraktila stressfibrer. 7
Mikrofilamentes byggnadssten är AKTIN: Ett protein som har förmågan att reversibelt sammanfogas i ett poläriserat filament där de två änderna har funktioner. - Aktin är ett mycket välkonserverat protein som kodas av en stor och välbevarad genfamilj som ursprungligen dök upp i bakterier. - Vi människor har 6 aktingener som kodar för olika isoformer. - Aktin är ett mycket vanligt protein i den eukaryota cellen. - Muskelcellens protein massa består till ca 10 % av aktin, medan icke-muskelceller har ca 1-5 %. AKTIN som monomer kallas G-aktin (G för globulär) Består av 2 lika stora lober som skiljs åt av en ATP-bindande klyfta. Loberna består av 2 subdomäner vardera (I-IV). ATP (rött) binder i klyftan och har kontakt med båda loberna. Till ATPt binder joner som Mg2+ (gult); medverkar till polymerisering (F-aktin). 8
F-aktin består av två strängar uppbyggda av G-aktin-subenheter Vardera enhet består av 28 subenheter * (14* per sträng) som sträcker sig över totalt 72 nm. F-aktin har både strukturell och funktionell poläritet Polymeriseringsprocessen är reversibel: G-aktin polymeriserar till F-aktin och F-aktin depolymeriserar till G-aktin. Alla subenheter pekar åt samma håll. Detta ger filamentet en poläritet (de olika änderna är olika). I (+) änden sker mer tillväxt (G-aktin subenheter adderas). I (-) änden sker mer dissociation. 9
Aktinfilamentens dynamik (17.2) G-aktinets polymerisering till F-aktin sker tre steg: Nucleation, Enlongering och Steady State (jämvikt). 1. Nucleation: G-subenheter kombineras ihop i korta, instabila oligomerer. Vid tre subenheter finns viss stabilitet: kärna (nucleus). 2. Elongering: utgår från kärnan, nya G-subenheter adderas. Tillväxten fortsätter tills jämvikt nås mellan G- och F-aktin enheter. 3. Steady state: när jämvikten nåtts, polymerisering och depolymerisering fortsätter men ingen ytterligare tillväxt sker. Lagg-fas i samband med bildningen av kärnan (nucleus) Sätts små kärnor (nuclei) till i början av experimentet så startar elongeringen direkt. 10
Aktinfilamenten växer snabbare i (+) än i (-) änden G-subenheterna adderas 10 gånger snabbare till (+) änden. Dissociationen sker ungefär lika snabbt i båda änderna. Critical concentration (Cc) är den kritiska koncentration då G-aktin monomerer är i jämvikt med F-aktin filament. Nucleation, Elongation and Steady State 11
(+) Additionshastigheten är 12, dissociationshastigheten 1.4 (-) Additionshastigheten är 1.3, dissociationshastigheten 0.8 Cc för (+) blir 0.12 um (1.4/12) och för (-) 0.6o um (0.8/1.3). Mellan 0.12 och 0.60 um fria G-subenheter kommer (-) änden förlora subenheter, medan (+) änden växer. Den lägre kritiska koncentrationen för (+) änden gör att fler G-subenheter adderas till (+) änden vid steady state. Detta fenomen kallas treadmilling. ATP-bundet G-aktin adderas till (+) änden medan ADP-bundet G-aktin dissocierar från (-) änden. ATP hydrolyseras till ADP + Pi i samband med additionen till (+) änden. Pi släpps av. Detta genererar 3 olika grupper av aktin subenehter i F-aktinet: (+) ATP-aktin, ADP-Pi-aktin, ADP-aktin (-) 12
In vitro kan man leka med olika koncentrationer men viktigt att veta är att in vivo växer aktinfilamenten bara i (+) änden. Aktintreadmillingen sker mycket snabbt in vivo, vad innehåller cellen som gör den en effektivare miljö än provröret? Aktinbindande proteiner! Profilin: Ett litet protein som binder det ADP-bundna G-aktinet (som lossnat från F-aktinets (-) ände) på motsatt sida som nucleotidklyftan (där ATP/ADP binder). När profilinet binder in öppnar den klyftan så ADP lossnar och ATP, som finns i överflöd, binder in istället. Profilinet ökar därmed tillgängligheten av ATP-G-aktin i cellen. Profilin-ATP-G-aktin subenheten binder effektivt in till (+) änden. Cofilin: Ett annat litet protein som binder specifikt till F-aktinets (-) ände, med ADP-bundna subenheter. Cofilinets inbindning ger större instabilitet med fler fria (-) änder som kan dissociera, vilket därmed ökar dissociationshastigheten i (-)änden. Tillsätts profilin och cofilin in vitro nås samma treadmillhastighet som finns in vivo, i cellen. 13
Thymosin-β4 binder upp fria ATP-G-subenheter: reservbuffert För att inte alla fria ATP-G-subenheter, som finns i överflöd i Cellen, ska polymerisera finns små proteiner som binder upp dem temporärt och släpper dem fria igen vid behov. Ett sådant protein är Thymosin-β4 som finns tex i blodets blodplättar. Vid bildning av sårskorpor frigörs ATP-G-subenheter i stora mängder för polymerisering. 14
Capping-proteiner reglerar polymerisering: binder till änderna och förhindrar okontrollerad tillväxt och dissociation CapZ binder med hög affinitet till (+) änden och begränsar filamentets tillväxt. När tillväxt ska ske förhindras i sin tur CapZ att binda. Tropomodulin binder (-) änden i celler som behöver stabila aktinfilament, tex röda blodkroppar och muskelceller. 15
Mekanismerna bakom aktinfilamentens sammanfogning (17.3). Det hastighetsbestämmande steget vid aktinpolymerisering: Bildningen av aktinkärnan (3 G-subenheter) Avgör när och var filamenten bildas. 2 klasser aktinkärnebildande proteiner hjälper till: 1. Forminer - för bildning av långa aktinfilament 2. Arp2/3 komplexet - för bildning av förgrenade nätverk av aktinfilament. Forminer - för bildning av långa, ogrenade aktinfilament - Forminer finns i de flesta eukaryota celler. Ganska nyupptäckta proteiner. - Består av domäner FH1 och FH2 (forminhomologi) 2 FH2-domäner bildar en munkliknande dimer: - Denna dimer hjälper till att lägga två G-aktinsubenehter bredvid varandra med (+) änden vänd mot FH2-domänen. Detta leder till sammanfogning av 3 G-aktinsubenheter (kärnan) och är starten på aktinpolymeriseringen (steg 1). 16
Genom att gunga mellan subenenheterna, och släppa en i taget, kan forminets FH2-domän hålla ihop aktinstrukturen samtidigt som en ny G-aktinsubenhet i taget kan läggas till (steg 2-4). Så länge FH2-domänen binder (+)-änden kommer denna inte cappas av CapZ, och strukturen kan fortsätta växa. På dessa sätt kan FH2-domänen hjälpa aktinfilamentet växa successivt från (+)-änden. Formin FH2-domän 17
Inmärkning av FH2-domänen gör denna synbar för ögat En elektronmikroskopibild Forminets aktivitet regleras genom interaktion med membranbundet Rho-GTP (GTPas). Forminets FH1-domän bidrar till aktinpolymeriseringen genom att docka till sig profilin-atp-aktin-subenheter. 18
Arp2/3 komplexet - bildning av förgrenade aktinnätverk. Arp2/3 komplexet består av 7 subenheter. 2 av dessa är aktinrelaterade proteiner. Ensamt är Arp2/3 inte effektiv kärnbildare. Arp2/3 komplexet jobbar ihop med reglerproteinet WASp och binder ett redan bildat aktinfilament (steg 1). Genom en konformationsändring antar Arp2/3 formen av (+) änden av aktinfilamentet (steg 2), varpå nya G-subenheter adderas hit och en förgrening uppstår (steg 3). WASp:s reglering av Arp2/3 komplexet WASp behöver binda till ett membranbundet Rho-protein (Cdc42) för att få rätt konformation och kunna interagera med Arp2/3 vilket i sin tur möjliggör nucleation vid nya förgreningen. 19
Aktinfilament förgrening (b) Förflyttning inom cellen - Tänk dig att du sitter på + änden 20
2014-03-20 Förflyttning inom cellen - Tänk dig att du sitter på + änden Vissa parasiter använder aktinpolymeriseringen för att förflytta sig inuti värdcellen kometsvans Bakterieparasiten Listeria monocytogenes (magtarmkanalen) - finns i kontaminerad mat; ger upphov till sjukdomen listerios - ger upphov till milda-allvarliga magtarmproblem, hjärnhinneinflammation, influensaliknande symptom - tar sig genom cellmembranet och delar sig i cytoplasman 21
Listerian använder sig av egna och värdcellens proteiner för sin transport i och mellan celler Act A i Listerian : 1) Binder till och aktiverar värdens Arp2/3komplex; förgreningar bildas 2) Förhindrar att (+) änden cappas Av CapZ, vilket ger fortsatt tillväxt. 3) Cofilinet snabbar upp dissociationen i (-) änden så fler monomerer släpps fria att medverka till polymerisering. På detta sätt kan bakterien transporteras runt i cellen. När den stöter ihop med cellens plasmamembran tar den sig igenom det och infekterar nästa cell. Aktinfilamenten bildar en kometsvans efter bakterien Kometer 22
Aktinbaserade cellstrukturers organisation (17.4) Chlamyodomona Makrofag Epitelcell från tunntarmen Purkinjecell från lillhjärnan Ett antal olika proteiner organiserar aktinfilamenten till olika funktionella strukturer F-aktinbindande domäner Fimbrin: bygger upp aktinfilamentbuntar av samma poläritet. Spectrin & Filamin: bygger upp olika slags aktinnätverk Cross-linking proteins : För att organisera aktin i olika former måste proteinerna ha två f-aktinbindande domäner 23
Adaptorproteiner länkar aktinfilamenten till cellmembranen och intracellulära strukturer Erytrocyt: aktinnätverk med spectrin Aktinfilamentens stödjefunktion vid cellytan är speciellt viktig för celler som utsätts för stort tryck och stress, tex blodets erytrocyter - nödvändiga för kroppens syre/koldioxidtransport Erytrocyternas filamentnätverk organiseras av spectrin som ger både flexibilitet och styrka Spectrinet som organiserar nätverket binder också till plasmamembranet för stabilitet: 1) via Ankryin till Band 3, och 2) via Band 4.1till glycoforin. 24
Mutationer i spectrin, band 4.1, akyrin kan ge sfärocytisk anemi - kännetecknas av runda, sköra blodceller som lätt går sönder. Lågt antal blodkroppar, trötthet, andfåddhet, bröstsmärtor. Behandlas med bl a blodtransfusioner. Cytoskelettets filament Aktin/Myosin Fortsättning Finn senare 25
Cellens organisation och rörelse I: Mikrofilament, kap 17. Del 2 av 2. Denna föreläsning: - Introduktion! - Mikrofilament och aktinstrukturer (17.1). - Aktinfilamentens dynamik (17.2). - Mekanismerna bakom aktinfilamentens sammanfogning (17.3). - Organisationen hos aktinbaserade cellstrukturer (17.4). - Myosiner: aktinbaserade motorproteiner (17.5). - Myosindrivna rörelser (17.6)! 26
Aktinpolymerisering kan användas för att ge rörelse, både inne i cellen och cellens egen motilitet tex Listeria och makrofag Ett annat system för att generera motilitet i cellen är via motor proteiner, sk myosiner Myosiner: aktinbaserade motorproteiner som rör sig längs med aktinfilamenten mha ATP hydrolys Först upptäcktes myosin II som finns i skelettmuskulatur och som är nödvändig för muskelns kontraktion. Andra myosiner har andra roller, tex flyttar runt organeller i cellen eller bidrar till cellmigration etc. CELLEN ÄR DYNAMISK! 27
Myosiner: aktinbaserade motorproteiner Myosin II är det mest studerade myosinet. I skelettmuskulaturen är myosinet samlat i dipolära tjocka fiberbuntar, filament, som interagerar med aktinfilamentet för att dra ihop muskeln. Myosiner har huvud, hals och svans -domäner; alla med distinkta funktioner -2 tunga kedjor och 4 lätta. - Svansen på de tunga bildar en sk coiled coil. - Varje hals har två lätta kedjor bundna till sig. - Klyvning av strukturen med enzymer ger olika fragment: S2 och LMM är svansfragment, S1 är huvud och hals. - I S1 ligger ATPas-aktiviteten och ett F-aktin-bindande säte (bevarad mellan olika myosiner). - ATPas-aktiviteten är aktinaktiverad: ett kännetecken för alla myosiner. 28
I huvud och halsregionen (S1) finns både det aktinbindande sätet och det ATP/ADP-bindande sätet De lätta kedjorna gör halsstrukturen stelare, så den kan fungera som en hävstång för huvudet. Myosin-driven rörelse kan detekteras experimentellt. Det är aktinet som rör sig och myosinet som driver rörelsen. ATP är nödvändigt för att rörelsen ska ske. Aktinet rör sig åt (-) hållet i de allra flesta fall. 29
Sliding filament motor assay Myosinerna bildar en stor familj av mekanokemiska motorproteiner (dvs omvandlar ATP hydrolys till arbete) Vi människor har 40 olika myosingener, bananflugan har nio, och jäst har fem. Fylogenetisk analys av S1 visar hur närbesläktade våra olika myosiner är. 3 olika klasser: Myosin I, II och V. Olika klasser - olika slags motorfunktioner. 30
Myosin I, II och V: myosinet rör sig mot aktinets (+) ände Myosin I: Variabelt antal lätta kedjor,en svans, ett huvud Myosin II: Dipolär, kort hals, alltid 2 lätta kedjor Myosin V: Lång hals, 6 lätta kedjor. Tunga kedjorna har domäner som binder till organeller som den transporterar Obs! Myosin VI annorlunda: rör sig mot (-). Viktig i endocytos: förflyttar endocytiska vesiklar längs aktinfilamenten bort från plasmamembranet. Myosin II: enda som bildar dipolära filament och medverkar till kontraktion. 14 olika gener kodar för klass II tunga kedjor: dessa medverkar till olika slags kontraktila rörelser (olika slags muskelcellers och icke-muskelcellers kontraktioner). Kontraktion: Myosinets S1 rör sig mot aktinets (+) ände, varpå aktinet rör sig mot (-). Hur gör myosinet för att förflytta aktinfilamenten? 31
Konformationsändring i myosinhuvudet kopplar ATP-hydrolys till rörelse. I avsaknad av ATP binder myosinet till aktinet och ingen rörelse sker. S1 huvudet har ATPas-aktivitet och kan hydrolysera ATP till ADP + Pi. En ATP molekyl hydrolyseras för varje steg en myosinmolekyl tar längs aktinet. Energin från hydrolysen behövs för att myosinhuvudet ska rotera. 32
33
Summering av hela proceduren 34
Myosinförflyttning av aktin Ländgen på myosinets hals är avgörande för hastigheten 35
Myosin I, II och V: myosinet rör sig mot aktinets (+) ände Myosin I: Variabelt antal lätta kedjor,en svans, ett huvud Myosin II: Dipolär, kort hals, alltid 2 lätta kedjor Myosin V: Lång hals, 6 lätta kedjor. Tunga kedjorna har domäner som binder till organeller som den transporterar Myosin VI annorlunda: rör sig mot (-). Viktig i endocytos: förflyttar endocytiska vesiklar längs aktinfilamenten bort från plasmamembranet. Det olika utseendet på myosin II och V bidrar till skillnader i steglängd och processivitet. Myosin II (kontraktion): kort hals - små steg. Interagerar inte hela tiden med aktinet (bara ca 10% av ATPas cykeln = duty ratio), kallas icke-processiv motor. skyfflar aktinet fram och tillbaka Myosin V (organelltransport): Lång hals - långa steg. Många steg utan att släppa aktinet, kallas att är en processivt motor, har hög duty ratio. transporterar organeller genom cellen till en slutstation 36
Medan myosinets huvud och hals ansvarar för motoraktiviteten, svarar svansen för specificering av vad som transporteras, dvs lasten. 2 exempel: Myosin II - aktinfilament för kontraktion Myosin V - organeller (längs med aktinfilamenten) För många myosiner är det inte känt vad de transporterar Muskeln 37
Muskelcellens sarkomer är den kontakterande (sammandragande) enheten -Muskelceller har en uppgift: kontraktion - Snabbt, repetitivt, långa avstånd, kraftfullt. - En skelettmuskelcell är stor, cylindrisk och har massa kärnor. -Varje muskelcell består av myofibriller bestående av sarkomerer, repeterade enheter av aktin och myosinfilament. -Vid kontraktionen dras sarkomeren ihop med 70%! - Hur går detta till? Aktinfilamentens (+) änder är inbäddade i en struktur som kallas Z-disk vilket ger olika riktning på filamenten A-bandet representerar överlappet mellan myosin och aktinfilamenten vid kontraktion 38
Vid kontraktion glider myosinets tjocka filament och aktinets tunna filament förbi varandra Vid hydrolys av ATP flyttar sig myosinhuvudet mot aktinets (+) ände och drar så aktinet mot (-) hållet. Eftersom aktin-filamenten i sarkomeren har olika riktningar kortas, kontraheras, denna. Många enheter jobbar tillsammans för att hela muskeln ska dras ihop. Sarkomerens struktur stabiliseras av flera proteiner CapZ: aktinets (+) ände. Tropomodulin: aktinets (-) ände. Nebulin: gigantiskt protein som sträcker sig längs hela aktinet. Titin: sitter ihop med Z-disken och hjälper till att hålla myosinet på plats. 39
Kalciumjoner och aktinbindande proteiner reglerar skelettmuskelns kontraktion Ca2+-jonkonc:n i cytoplasman regleras av sarkoplasmatiska retikulum (SR). Genom att hålla en buffert av kalciumjoner kan dessa släppas ut från SR till cytoplasman när en aktiverande signal, en nervimpuls, kommer från intilliggande nervcell. Ökningen av kalcium inducerar konformationsändringar i proteiner som binder till aktinet. Troponin och tropomyosin ändrar konfirmation när Ca2+-konc. ökar, varpå myosinet kan komma åt att interagera med aktinet och kontraktion ske. Denna process kallas thin filament regulation. 40
Även i icke-muskelceller kan myosin II och aktin bidra till kontrakerbara strukturer, ex. vid celldelningen. Myosin II deltar aktivt i själva celldelningsprocessen. Myosin I har en annan roll: fäster aktinet vid plasmamembranet för struktur. Kontraktion av icke-muskelceller och av glatt muskulatur regleras genom fosforylering av myosinets lätta kedjor. Glatt muskulatur finns tex i hjärtat, blodkärlen, magtarmkanalen och luftvägarna. När kalciumjonkoncentrationen stiger fosforyleras myosinets lätta kedjor, som omger halsregionen på strukturen, av myosin LC kinaset. När detta sker aktiveras ATPas-aktiviteten i huvudregionen och kontraktion kan ske. Nervimpulser, men även kemiska signaler som noradrenalin, kan stimulera kontraktion av glatt muskulatur. (CaM=calmodulin) 41
2014-03-20 Myosin V transporterar organeller och vesiklar längs aktinfilamenten i tex jästceller. Inte mycket känt om myosin V i människor men mutationer kan ge upphov till sjukdomar, tex epileptiska anfall. Hos människor används mikrotubuli för att transportera organeller. Avslutningsvis: Genom cytoskelettets olika komponenter och filament kan celler alltså få olika former, strukturer och förmåga till rörelser, både inne i cellen (transport), och cellens egen motilitet. TACK! 42