Visualisering av proteinstrukturer Januari 2011/LGM
Detta häfte är utformat för att studera proteinstrukturer. Genom att inhämta relevanta strukturer från en Protein data Bank och med hjälp av programmet PyMOL ska ni själva bekanta er med olika proteiner se hur de fungerar, inbindning av läkemedel till proteiner mm. Protein data bank I ett samarbetsprojekt kallat Research Collaboratory for Structural Bioinformatics deponeras alla koordinater från strukturer lösta med hjälp av NMR eller röntgenkristallografi. Detta är en stor databas som innehåller 70813 deponerade proteinstrukturer och DNA strukturer (26 januari 2011). Figur 1. Startsida från PDB inhämtad från www.rcsb.org
Strukturstudier av karboanhydras Du vill studera strukturen på humant karboanhydras II och vill därför inhämta koordinaterna för detta enzym. Nedan följer därför instruktioner för att hämta hem proteinstrukturer. 1) Gå till internetadressen www.rcsb.org/pdb/. Från denna hemsida kan du nu söka efter olika proteinstrukturer och länkar med relevant information om proteinstrukturer. 2) Gå under search för att söka på nyckelord, PDB kod eller författare. 3) Skriv carbonic anhydrase vid rubriken search. Du har nu fått en lista på ett 377 structure hits (26 Mars 2011) dvs 377 olika karboanhydras strukturer (Figur2) Figur 2. PDB resultat av sökning carbonic anhydrase.
4) Antag, att du nu vill veta mer om strukturen humant karboanhydras II dvs PDB kod 2CAB. Detta gör du genom att klicka på proteinstrukturen eller skriva in 2CAB i search fältet. Från denna sida får du en kort sammanfattning om proteinet med olika kristallografiska parametrar såsom upplösning, R-värde och rymdgrupp. (Figur 3) Figur 3. Resultat efter sökning på PDB kod 2CBA
5) För att kunna ladda ned koordinaterna för denna struktur gör ni så här: Klicka på DOWNLOAD FILES i vänsterspalten och ni får upp nedanstående sida (Figur 4) Figur 4. Sida för nedladdning av pdb filer (koordinater). 5) Under Enter PDB file skriv in 2CBA i textrutan. Klicka för PDB format under download type och uncompressed under compression type (Figur 4) Fönstret file.. save as öppnas och du kan nu spara koordinaterna under lämplig katalog. Du har nu i din dator koordinaterna för proteinet Humant Karboanhydras II och fortsättningsvis kommer du använda dessa koordinater tillsammans med ett molekylvridningsprogram för att visualisera strukturen. Tips: Om du vet PDB koden kan du ladda ned flera proteiner samtidigt genom att skriva in PDB koderna efter varandra i textrutan.
PyMOL Det program ni skall använda för att visualisera olika strukturelement är ett freeware program för användare inom utbildning och akademi som kan laddas ned.på följande websida, www.pymol.sourceforge.net. I detta program kan ni bland annat vrida molekyler, färga in olika strukturelement, mäta avstånd samt mycket mera. Programmet är uppdelat i två olika fönster ett textfönster och ett grafikfönster. I textfönstret laddar man ned strukturen, gör olika inställningar, visar aminosyrasekvens mm, medan i det grafiska fönstret, kan man modifiera strukturen, vilken typ av visualisering såsom sekundärstrukturmotiv (Cartoon) eller alla sidokedjor mm. Figur 5. Pymol utseende efter öpppnande av PDB fil (File...Open).
För att lättare se sekundärstruktur ( -helixar och -strängar). Klicka på H(ide) everything och sedan S(how) Cartoon och ni får nedanstående proteinstruktur (Figur 6) Figur 6. Struktur i PyMol med illustrerad sekundärstruktur (Cartoon).
Övningsexempel Uppgift 1: Karboanhydras: För att studera proteinet skall vi nu använda de koordinater som ni nyss hämtat hem från Protein Data Bank eller fått tilldelade och använda dessa koordinater för att studera proteinet. Följande PDB filer behövs för detta moment: 2CBA (Humant karboanhydras II), 1CNW (Humant karboanhydras me inhibitorn,sulfonamid), 1KOP (karboanhydras från bakterien Neisseria gonorrhoeae) Aktiva ytan och metallbindning 1) Öppna programmet: Klicka på PyMOL-ikon på skrivbordet eller klicka på någon av ikonerna för koordinaterna 2CBA. 2) Öppna filen: Klicka på FILE.Open i textfönstret. Proteinet illustreras komplett med sidokedjor, vatten och ligander. (Figur 5) 3) För att lättare kunna visualisera strukturmotiv gör ni följande gå till högerspalten i grafikfönstret, Klicka på H(ide) och klicka på everything. 4) Klicka sedan på S(how) fortfarande i högerspalten och klicka på Cartoon. På bildskärmen kan du nu se HCA II illustrerad med enbart sekundärstrukturelement. (Figur 6) 5) Bekanta dig med knapparna på musen för att t.ex. kunna rotera, translatera och zooma molekylen. 6) För att illustrera olika sidokedjor t.ex. karboanhydras metalligander görs på följande sätt. Gå till DISPLAY i textfönstret, klicka på Sequence. Aminosyrasekvensen (som enbokstavskod!) visas då i överkanten av grafikfönstret. Klicka på H94, H96 och H119. Gå till högerkanten av grafikfönstret under (sele) och klicka på S(how) och klicka sedan på Sticks. Metalliganderna visas då på skärmen. Bindning av inhibitor (sulfonamid) till karboanhydras 1) Öppna filen 1CNW och kolla hur inhibitorn binder till aktiva ytan. 2) illustrera 1CNW som yta genom att klicka S(how) och surface.
Strukturellt släktskap bakteriellt karboanhydras och humant karboanhydras 1) Öppna filerna 1KOP. I fönstret får ni upp två proteinmolekyler. klicka Display... Sequence. Ni får då aminosyrasekvensen för de två proteinmolekylerna i grafikfönstret. Ta bort den ena proteinmolekylen genom att klicka sequence mode... Chains. I grafikfönstret är nu sekvensen illusterad med A oh B. Klicka på B och gå till menyn till höger och (sele) och A(ction) och sedan remove atoms 2) Centrera molekylen med A(ction) och center. Illustrera strukturen med Cartoon. Vad finns det för skillnader och likheter mellan denna struktur och den humana strukturen? 3) Jämför strukturerna genom att öppna PDB kod 2CBA. Illustrera strukturen med Cartoon. Under 2CBA fliken klicka på A(ction)...Align...1KOP. Strukturen passas nu till varandra och man ser tydligare skillnader i strukturen 4) Klicka på Display... sequence (sequence mode residues). Klicka på Cys28 och Cys181. Illustrera dessa aminosyror som sticks under fliken (sele) och S(how). Färga sedan in dem genom att klicka på C(olor) och välj valfri färg. 5) Bakteriellt karboanhydras har en disulfidbrygga i denna position och som skiljer sig från den humana varianten.
Övningsexempel för olika strukturmotiv i proteiner Motiv i protein Strukturer Aspartate transcarbamoylase Bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) Human Carbonic anhydrase II Erabutoxin Flavodoxin Plastocyanin Staphylococcus nuclease Subtilisin Thioredoxin Triose phosphate isomerase Troponin-C 1ACM 1AAL 2CBA 3EBX 0FX2 1IUZ 1A2T 1AK9 1SRX 1YPI 1NCX 1) Identifiera antiparallella och parallella -strängar i humant karboanhydras II, vilka är vad? Detta är ett exempel på blandade flak 2) Kolla även twisten av strängar (högervriden) i HCA II:s flak 3) Kolla strukturen av Troponin-C, identifiera EF-handen 4) Kolla strukturen av BPTI identifiera hairpin-motiv (fig 2.14) 5) Kolla strukturen av Staphylococcus nuclease, kan du identifiera en grekisk nyckel från detta motiv? 6) Identifiera en klassisk Rossman fold ( motiv) i Triose phosphate isomerase -domän Strukturer Cytochrome b 562 Myohemerythrin Human Growth hormone Myoglobin ROP protein 256B 2MHR 1HGU 1AZI 1GTO 1) Kolla 4-helix buntar i human growth hormone, kolla hydrofil utsida och hydrofob insida.
2) Kolla hopdockningen human growth hormone Strukturer Triose phosphate isomerase Glycolate oxidase trna tyr Synthetase Carboxypeptidase Arabinose binding protein Flavodoxin Ribonuclease inhibitor 1YPI 1GYL 4TS1 4CPA 1BAP 1RCF 2BNH 1) Kolla TIM-tunna av Triose phosphate isomerase ( -tunnor) 2) Kolla hur -strängarna bildar tunnan, R-grupperna inuti tunnan bildar en hydrofob kärna och -helixarna täcker utanför. helixarna hydrofila på utsidan och hydrofoba på insidan mot -tunnan 3) Lokalisera aktiva ytan i ögletratten vid -strängarnas C-terminaler. 4) Kolla hästsko strukturen på -loop- -motivet som repeteras hos ribonuclease inhibitor. 5) Kolla flavodoxin som exempel på open twisted -sheet. Kolla topologisk brytpunkt. 6) Identifiera var aktiva ytan sitter på flavodoxin 7) Rita ett topologidiagram över flavodoxin. Strukturer Superoxide dismutase Retinol binding protein -lactoglobulin Neuraminidinase -crystallin Hemagglutinin Pyruvate kinase Concanavalin A Pectate Lyase 1SXC 1BRP 1BEB 1NNC 4GCR 1HGE 1PKM 1NLS 1IDK
1) Kolla up-and-down -sheet hos superoxide dismutase och retinol binding protein som bildar en tunna. 2) Kolla superbarrel av neuraminidinase identifiera 4 antiparallella -strängar som upprepas 6 gånger 3) Identifiera grekiska nycklar hos -crystallin. Gör topologidiagram och identifiera en grekisk nyckel (varje domän (tunna) består av 2 nycklar) 4) Identifiera Jelly-roll motiv i Concanavalin A 5) Kolla -helix strukturen på Pectate lyase Folding och flexibilitet Hen egg white lysozyme Bovine pancreatic trypsin inhibitor Cyclophilin CDK2 DsbA GroEl/GroES Komplex GroEL GroES (NMR struktur ) Ovalbumin Phosphofructokinase 1LPI 1AAl 1A33 1AQ1 1A2J 1AON 1KID 1EGS 1OVA 2PFK 1) Kolla strukturen på GroEL och GroES. 2) Kolla strukturen på cyclophilin med dess ovanliga topologi, vad är ovanligt med detta motiv? 3) Identifiera serpin fold hos ovalbumin. DNA Strukturer DNA Z-DNA 127D 145D 1) Identifiera major- och minor groove i B-DNA strukturerna. 2) Kolla skillnad i uppbyggnad mellan B-DNA och Z-DNA.
DNA igenkänning i prokaryoter med helix-turn-helix motiv Cro repressor 1ORC Cro bunden till operator 6CRO Lambda repressor 1LLI Lambda repressor med operator 1LMB Met-repressor 1CMA CAP-DNA complex 1BER Trp-repressor 1WRP 434 repressor 2CRO 1) Kolla strukturen av Cro repressorn och kolla hur den binder till DNA 2) Identifiera igenkänningshelixen på Cro repressorn. 3) Kolla hur den binder till major groove i DNA. 4) Kolla hur 434 repressorn binder till DNA försök identifiera de aminosyror som binder till baserna i major groove. Strukturmotiv hos eukaryota transkriptionsfaktorer TATA-box binding protein -repressor P53 1PCZ 1LMB 1C26 1) Kolla strukturen på TATA box binding protein och identifiera de olika domänerna, rita ett topologi diagram 2) Kolla in strukturen av p53 och försök identifiera de olika domänerna, rita ett topologidagram. Specifika transkriptionsfaktorer tillhör ett fåtal familjer Zinc finger DNA complex Leucine zipper GCN4 Glucocorticoid receptor 1AAY 2ZTA 1LAT 1) Kolla hur ett zink-finger är uppbyggt, hur är Zn koordinerad? 2) Kolla glucocorticoid receptorn, vilken del binder till DNA?
3) Kolla hur en leucine zipper (GCN4) är uppbyggd. 4) Kolla hur -helixarna är ihopdockade och bildar en coiled-coil dimer, vilken riktning har de? 5) Var i sekvensen dyker detta motiv upp och var hamnar de i rymdstrukturen? Exempel på enzym katalys: Serin proteaser Chymotrypsin Elastase Trypsin Subtilisin 1AB9 1EZM 1ANE 1AK9 1) Kolla in kymotrypsin och försök identifiera den katalytiska triaden och se vilka öglor dessa aminosyror sitter på 2) Försök hitta den bindande fickan och jämför med bindande fickan i trypsin och elastase 3) Kolla in strukturen på subtilisin, förvissa er om att b - har en vänstervriden korsförbindelse och att detta undantag är nödvändigt för att den katalytiska triaden ska bli intakt. Membranproteiner Colicin A 1COL Photosynthetic reaction center 1PRC Porin (Ompf porin) 1 GFM 1) Kolla strukturen av photosynthetic reaction center och identifiera de olika subenheterna 2) Kolla strukturen av colicin A, vilka delar av proteinet tror du är inbäddade i membranet? Signal transduktion CH-Ras p21 G-protein Elongation factor Tu 1AGP 1B9Y 1EFT
Human Growth hormone/receptor Human growth hormone Transducin 1AXI 1HGU 1AOR 1. Kolla strukturen av CH-Ras p21, vad för typ av struktur är detta? 2. Identifiera den topologiska brytpunkten, rita topologidiagram 3. Jämför strukturen av H-Ras p21 och elongation factor Tu. 4. Kolla in strukturen av G proteinet kan du identifiera den sjubladiga propellern ( 5. Kolla strukturen av human growth hormone med och utan inhibitor, identifiera bindningssiten. Kan du se några konformationsändringar i de olika strukturerna Fibrösa proteiner Collagen Transthyretin Myosin Myosin/Actin komplex(teoretisk modell) 1A3J 1BM7 1B7T 1ALM 1) Kolla in strukturen av Collagen 2) Kolla in strukturen av transthyretin, identifiera de -strängar som är involverad i fibrilbildning hos personer som har en punktmutation Val Met 3) Kolla strukturen av Myosin/actin komplexet Immunsystemets proteiner Immunoglobulin FAB-fragment HLA-A2 T-cell receptor CD4 receptor 1BAF 1HLA 1AC6 1CDH 1) Jämför konstant och variabel domän i immunoglobuliner, identifiera CDR1, CDR2 och CDR3 i variabla domänen, mellan vilka strängar går de? 2) Kolla om grekisk nyckel kan identifieras i den konstanta domänen och se hur CDR-regionerna från 2 domäner bildar antigenbindningsställe.
3) Kolla hur konstanta respektive variabla domänen dockar ihop, konstanta delen ungefär vinkelrätt arrangemang mellan 4-strängsflaken. 4) Kolla hur den variabla domänen med de 6 hypervariabla regionerna kommer nära varandra 5) Titta på HLA-A2 (MHC), titta på det antigenbindande stället och dess 2 wdomäner. 6) Kolla strukturen av T-cell receptorn, identifiera antigenbindande sitet. Virusstrukturer MS2 protein capsid Tomato bushy stunt virus Satellite tobacco necrosis virus Sindbis capsid protein 1ZDI 2TBV 2STV 1KXB 1) Kolla strukturen av satellite tobacco necrosis virus och identifiera jelly-roll motivet 2) Kolla strukturen av MS2 med up-and-down antiparallella -strängar 3) Kolla strukturen av sindbis viruset coat protein och jämför likheter med kymotrypsin
Strukturer ur: Proteins Structure and function David Whitford Kapitel 3 Chymotrypsin Bovine pancreatic trypsin inhibitor λ repressor protein Cytochrome b-562 Human thioredoxin Plastocyanin Human cis-trans proline isomerase Human γ-crystallin: Cytochrome b5 Sulfite oxidase Neuraminidase Tailspike protein of bacteriophage P22 Lactate dehydrogenase Cro repressor from phage 434 Fab region of IgG Monoclonal antibody fragment Fab and lysozyme bacteriocin AS-48 microcin J25 MCoTI-II RTD-1 kalatab1 SFTI-1 2CGA 5PTI 1LMB b562 1ERU 1AG6 1VBS 2GCR 3B5C 1SOX 1F8D 1TSP 1LDG 4CRO 7FAB 1FDL 1E68 1HG6 1HA9, 1IB9 1HVZ 1KAL 1SFI, 1JBL Kapitel 4 Leucine zipper DNA binding protein GCN4 c-jun c-fos proto-oncogene dimer plus DNA gp41 core domain of SIV Silk polymers Collagen EGF domains from fibrillin-1 1YSA 1FOS 2SIV 2SLK 1BKV 1EMN Kapitel 5 Bacteriorhodopsin G subunit of transducin Reaction centre from Rh.viridis OmpF -hemolysin bovine cytochrome bc 1 complex 1C3W 1TND 1PRC 2OMF 7AHL 1BE3
Bovine cytochrome oxidase subunit of ATPase c ring monomer of F o ATPase SR Ca-ATPase 1OCC, 2OCC 1BMF 1A91 1EUL Kapitel 6 Tuna cytochrome c 3CYT Yeast iso-1 cytochrome c 1YCC P. denitrificans cytochrome c550 155C R. rubrum cytochrome c 2 1C2R Horse cytochrome c 1CRC Chymotrypsin 2CGA Elastase 1QNJ Trypsin 1TGN Kapitel 7 RNase A 1FS3 Lysozyme 1HEW Tyrosyl trna synthetase plus tyrosyl adenylate 3TS1 Gln-tRNA synthetase in complex of trna and ATP 1GSG Binary complex formed between trypsin and BPTI 2PTC Cyclo-oxygenase 1PRH Phosphofructokinase 1PFK Aspartate transcarbamoylase 1AT1 Kapitel 8 Cdk2 1HCK Cdk2 +cyclin binary complex 1FIN T7 RNA polymerase 1CEZ Transcription factor Zif268 in complex with DNA 1A1H GCN4 transcription factor complexed with DNA 1YSA, 2ZTA Max transcription factor plus DNA 1AN2 Ubx homeobox 1B8I Phenylalanyl trna 6TNA C terminal domain of E. coli ribosomal subunit L7/L12 1CTF L30 domain of the large ribosomal subunit of T. thermophilus 1BXY N-terminal domain of the spliceosome RNA binding protein U1A 1FHT EF-Tu in a complex with Phe-tRNA 1TTT EF-G 2EFG FfH subunit from T. aquaticus 2FFH Mouse importin- 1EJL 20S proteasome T. acidophilum 1PMA
Kapitel 10 Tendamistat Interleukin-1β Thioredoxin β tubulin dimer Green fluorescent protein 2AIT, 1HOE 7I1B 1TRU 1TUB 1EMA Kapitel 11 GroEL monomer GroES Thermosome Complex of transthyretin/ retinol binding protein Transthyretin SH3 domain Mouse PrP c protein 1GRL 1G31 1RYP 1RLB 1BMZ 1PNJ 1AG2 Kapitel 12 gp120 core in a complex antibody and CD4 HA1/HA2 monomer Neuraminidase Neuraminidase substrate bound to active site β secretase p53-dna complex α1-antitrypsin 1G9N 2HMG 2BAT 1MWE 1M4H 1TUP 2PSI, 7API
Referenser: RCSB: hemsidan: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do Hemsida PyMOL: www.pymol.org Manual PyMOL: www.pymolwiki.org Molecule of the Month, Carbonic anhydrase http://www.rcsb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_mon th/pdb49_1.html Proteins Structure and function David Whitford http://www.wiley.com//legacy/wileychi/whitfordproteins/