Delprov Dugga med svarsmallar Biokemi BI0968, 8:e dec 2008, 09 15-12 00. Max poäng = 50 p. Preliminära betygsgränser: 3 = 27p; 4 = 35p; 5 = 43p. 1. Tre viktiga grupper av biomolekyler är polymerer: proteiner, nukleinsyror och polysackarider (kolhydrater). Ange för var och en av dessa, i tabellen nedan, vilken typ av byggstenar (monomerer) de är uppbyggda av, deras huvudsakliga användning i organismer, samt om det är en viktig energikälla i vår föda. (6 p) Polymer Protein Nukleinsyra Polysackarid (kolhydrat) Monomerer (1.5p) Användning (3p) Energikälla ja/nej (1.5p) Polymer Monomerer Användning Energikälla (ja/nej) Protein Aminosyror Enzym-katalys (1p) eller struktur, Ja reglering, transport, signalering Nukleinsyra Nukleotider Genetisk information (1p) Nej Polysackarid (kolhydrat) Monosackarider Energilagring eller struktur (1p) eller märkning, cell-interaktion etc. Ja 2. a) Vilka är de 6 vanligaste grundämnena (atomslagen) i levande organismer? (1.5p) b) Vilka av dessa atomslag är mest respektive minst elektronegativa? (1p) c) Vilka atomslag brukar fungera som acceptor eller donor i vätebindningar i biologiska system? (1p) d) Ange de tre olika typer av icke-kovalenta bindningar som förekommer i proteiner och andra makromolekyler, i ordning från starkast till svagast (för ett bindningsavstånd i vattenlösning på 3.5 Å) (1.5p) a) De 6 vanligaste grundämnena (atomslagen) är H,C,N,O,P,S. (6x0.25p=1.5p) b) O är mest och H och C är minst elektronegativa. (1p) c) O,N,(S) brukar fungera som acceptor eller donor i vätebindningar. (1p) d) Elektrostatisk interaktion/saltbrygga/jon-par-bindning > Vätebindning > van der Waals-interaktion (1.5p) 3. a) Aminosyrorna Cys, Gly och Pro har speciella egenskaper som är betydelsefulla för strukturen hos det veckade proteinet. Ange för var och en av dessa tre aminosyror vilken egenskap och vilken strukturell funktion aminosyran ofta har i proteiner. (3p) Sidan 1 av 5
b) I många enzymer hittar man i aktiva ytan histidin med viktig katalytisk funktion. Vilka egenskaper hos histidin gör den lämplig att delta i enzymatiska reaktioner? (1p) c) Proteiners struktur kan beskrivas i fyra nivåer, primär, sekundär, tertiär och kvartenär. Förklara vad som avses med respektive begrepp. (4p) (8p) a) Cystein (Cys) kan para ihop sig och bilda disulfidbryggor som binder ihop olika delar av polypeptidkedjan och stabiliserar proteinets tertiär-struktur. Glycin (Gly) har ingen egentlig sidokedja utan bara väte på alfa-kolet vilket ger större vridbarhet runt alfa-kolet (phi och psi-vinklarna). Gly sitter ofta där det är trångt (där större sidokedja inte får plats) eller där det behövs en kraftig böj i huvudkedjan. Prolin (Pro) har en sidokedja som är kovalent bunden till peptidkvävet så att den bildar en ringstruktur där phi-vinkeln är fixerad och inte kan rotera. Detta ger minskad flexibilitet och stabilisering av huvudkedjan. Prolin passar inte i alfa-helix och hindrar dess bildning. Pro kan fungera som "helix-brytare" i änden av en helix och förekommer ofta i böjar tillsammans med Gly. b) Histidin har pka-värde omkring 6-7 och den kan gärna uppta/avge proton vid fysiologiskt ph och delta i syra/bas-katalys (1p). c) Primärstruktur är aminosyrasekvensen (1p). Sekundärstruktur bildas när avsnitt av polypeptidkedjan veckar ihop sig med regelbundna vätebindingar i sekundärstrukturelementen alfa-helix, beta-sträng, beta-böj (1p). Tertiärstruktur beskriver hela polypeptidkedjans veckning, hur sekundärstruktur-element och sidokedjor är packade (1p). Kvartenärstruktur beskriver hur olika subenheter sitter ihop i ett oligomert protein/proteinkomplex (1p). 4. Proteinrening a) När man isolerar proteiner är jonbyteskromatografi en ofta använd metod. Vilka principer bygger metoden på? (1p) b) Proteinet Y har visat sig binda till en jonbytare med liganden DEAE (positvt laddad ligand) vid ph 6.8. Vad säger det om Y:s isoelektrisk punkt? (1p) c) Du har bestämt molekylvikten på Y med hjälp av gelfiltrering och funnit att den är 280.000 Dalton. Du misstänker dock att Y består av mer än en subenhet. Föreslå ett relativt enkelt sätt att reda ut detta. (1 p) (3 p) a) I jonbyteskromatografi utnyttjar man förmågan hos laddade molekyler, i detta fall proteiner, att binda reversibelt till immobiliserade laddade grupper. Beroende på proteinets laddning vilket i sin tur beror av ph väljer man positivt eller negativt laddade ligander. (1 p) b) Y binder till en positiv ligand och bör sålunda ha en negativ nettoladdning vid det aktuella ph:t. Isoelektriska punkten kan därför antas vara under (eller lika med) ph 6.8. (1 p) c) Prova att köra en SDS-Polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). Den bör ge information om molekylvikt(er) på eventuella subenheter. (1 p) 5. a) Definiera och beskriv kortfattat de tre stegen i molekylärbiologins "centrala dogma", flödet av den genetiska informationen. (3p) Sidan 2 av 5
b) Varför kan man förutsäga ett proteins aminosyrasekvens om man känner genens nukleotidsekvens, men ej bestämma en gens nukleotidsekvens om man känner proteinets aminosyrasekvens? (2p) a) DNA -> DNA = replikering. DNA kopieras genom att varje kedja bildar mall för komplementär kopiering. DNA -> RNA = transkription. Vissa delar av DNA kopieras till RNA. En kedja i DNA är mall för komplementär kopiering. RNA -> protein = translation. mrna används som mall för syntesen av protein på ribosomen. För varje aminosyra som inkorporeras i proteinet passas tre baser i mrna (kodonet) ihop med antikodonet på den trna-molekylen som för in aminosyran till peptidsyntesen. b) Varje kodon i gensekvensen svarar mot en enda aminosyra (1p), därför kan vi förutsäga proteinets sekvens från gensekvensen. Däremot så finns det mer än ett kodon för de flesta aminosyrorna (1p), dvs. flera alternativa sekvenser är möjliga. 6. Förklara kortfattat följande begrepp: a) Intron (1p) b) Restriktionsenzym (1p) c) cdna (1p) (3 p) a) Intron: Bitar av eukaryota gener som inte översätts till protein (1p) utan klyvs bort under processning av RNA till mrna, som sedan används som mall för proteinsyntes. b) Restriktionsenzymer känner igen sekvenser i dubbelsträngat DNA, och klyver båda strängarna på ett specifikt ställe i den igenkända sekvensen. (1p) c) cdna: 'complementary DNA', "omvänd" DNA-kopia av ett mrna som görs med hjälp av enzymet omvänt transkriptas ('reverse transcriptase'). (1p) 7. Enzymet E som följer Michaelis-Menten-kinetik har K m = 40 µm (mikromolar). Initiala reaktionshastigheten v 0 är 10 µm/min (mikromolar/minut) vid en substratkoncentration på 20 mm (millimolar) och enzymkoncentrationen [E] tot 2 nm (nanomolar). Vad blir den initiala hastigheten v 0 a) om vi dubblar substratkoncentrationen vid samma enzymkoncentration, [S] = 40 mm (millimolar)? (1p) b) om substratkoncentrationen [S] är 40 µm (mikromolar) vid samma enzymkoncentration? (1p) c) om substratkoncentrationen [S] är 10 µm (mikromolar) vid samma enzymkoncentration? (1p) d) om vi istället dubblar enzymkoncentrationen vid samma substratkoncentration, ([S] = 20 mm, [E] tot = 4 nm)? (1p) e) Hur påverkar enzymets K m respektive k cat förhållandet mellan koncentrationerna av substrat och produkt vid jämvikt? (1p) (5p) Sidan 3 av 5
När [S] = 20 mm gäller [S] >> K m (substratkonc är mycket större än K m ), och alltså är v 0 = Vmax = 10 µm/min a) v 0 = 10 µm/min. För varje substratkoncentration större än 20 mm gäller fortfarande att v 0 = Vmax = 10 µm/min. b) v 0 = 5 µm/min. När [S] = K m gäller att v 0 = Vmax/2, eller 5 µm/min. c) v 0 = 2 µm/min. Eftersom K m och V max är kända, kan Michaelis-Menten ekvationen användas för att beräkna v 0 vid varje substratkoncentration: v 0 = V max [S] / ( K m + [S] ). För [S] = 10 µm gäller: v 0 = (10 µm/min) (10 µm) / (40 µm + 10 µm) = 100/50 µm/min = 2 µm/min. d) v 0 = 20 µm/min. Hastigheten är proportionell mot enzymkoncentrationen. Dubbelt så hög enzymkoncentration ger dubbel hastighet. e) Inte alls (1p). Förhållandet mellan koncentrationerna av substrat och produkt vid jämvikt bestäms av den termodynamiska skillnaden i fri energi mellan substrat och produkt, medan K m och k cat är uttryck för förhållanden mellan hastighetskonstanter. 8. Enzymatiska processer är reglerade för att de ska ske vid rätt tid och på rätt plats. Genom kontroll av genuttryck, dvs hur ofta en gen läses, bestäms hur många molekyler som ska bildas av ett visst enzym. Dessutom kan aktiviteten hos enskilda enzymmolekyler regleras med olika mekanismer. De tre viktigaste är: a) Allosterisk reglering; b) Protein-fosforylering; c) Proteolytisk aktivering. Beskriv kortfattat hur de fungerar och ange för var och en om den är reversibel eller irreversibel (1.5p för varje korrekt svar). d) Vilka steg i en metabolisk väg brukar vara reglerade? Svar: a) Allosterisk reglering. Den reglerande molekylen binder på särskild regulatorisk plats i enzymet och påverkar aktiviteten genom konformationsförändringar i aktiva ytan (1p). Oftast oligomera proteiner. Reversibel. b) Fosforylering. Genom att sätta på (kinaser) och plocka bort (fosfataser) fosfatgrupper kan enzymets aktivitet påverkas (1p). Reversibel. c) Proteolytisk aktivering. Enzymet syntetiseras som ett inaktivt proenzym (zymogen) och blir aktivt först när en del av peptidkedjan hydrolyserats/klyvts av ett proteas/peptidas (1p). Irreversibel. d) Metaboliskt irreversibla steg brukar regleras, dvs reaktioner som frigör mycket energi. 9. Utan biologiska membran skulle inget liv kunna existera. a) Rita den kemiska strukturformeln för en membranlipid. (2.5p) b) Beskriv med en enkel skiss uppbyggnaden av ett biologiskt membran. (1p) c) Vad kallas den drivande kraften som gör att membraner hålls ihop (och som gör att proteiner veckar sig)? Hur fungerar den (1p)? a) Lipidfigur: Glycerol med esterbindningar till fettsyror (R1, R2) på två hydroxyler och fosfat på den tredje som i sin tur har en polär grupp bunden (etanolamin, serin, kolin). Sidan 4 av 5
b) Membranfigur: Dubbellager, hydrofila huvuden utåt, hydrofoba svansar inåt (1p). c) Hydrofoba effekten. Hydrofoba delar av t.ex. lipider eller proteiner klumpar ihop sig med varandra för att undgå kontakt med vatten (1p). 10. Kanaler, pumpar, lipider, membraner, signalöverföring: a) Vad är skillnaden mellan aktiv och passiv transport av små molekyler genom lipidmembraner? (1p) b) Ge två exempel på hur ett lösligt protein kan associera till lipidmembraner. (1p) c) Vid hormonell kontroll och i många sinnesceller sker signalöverföring med 7TMreceptorer, G-proteiner och adenylatcyklas. Rita schematiskt hur proteinerna är organiserade vid cellmembranet, och beskriv kortfattat hur en signal produceras av receptor, trimert G-protein och adenylatcyklas? Hur sker signalförstärkningen i denna kedja? Vad kallas den typen av signalförstärkning? (3p) a) Aktiv transport sker över/genom ett membran mot en koncentrationsgradient (koncentrationen m.a.p. den typ av molekyl som skall transporteras) och kräver energi. Passiv transport sker med en koncentrationsgradient, dvs koncentrationsutjämnande, och utnyttjar den lagrade energin i gradienten. b) Exempel på mekanismer för association av protein till membran: GPI-ankare (Cterminal), palmitoylering (på cystein), farnesylering (på cystein), myrostylering (Cterminal), association till annat redan membranbundet protein (0.5p per exempel, max 1p) c) Korrekt skiss med 7TM-receptor integrerad i membranet, med G-protein bunden på insidan bestående av alfa, beta, gamma-subenheter, och adenylatcyklas integralt i membranet. Aktivering av en receptor, t.ex. genom binding av epinefrin (adrenalin) leder till en förändring på insidan av membranet som aktiverar G-proteinet. Den aktiverade receptorn fungerar som en G-nukleotidutbytare vilket medför att G-proteiner byter ut GDP mot GTP när alfasubenheten dissocieras från betagamma-subenheterna och kan röra sig längs membranet. Den aktiva alfasubenheten med GTP kan genom att binda till adenylatcyklas göra detta enzym aktivt varvid camp bildas. Ökad mängd camp sätter igång flera olika processer i cellen, t.ex. aktiverar proteinkinas A. Vid varje steg kan flera molekyler aktiveras vilket åstadkommer en förstärkning. Varje receptor aktiverar flera G-proteiner, varje G-protein aktiverar flera adenylatcyklaser osv.. Det kallas kaskadeffekt. Sidan 5 av 5