Segmentering av celler med hjälp av aktiva konturer och level sets - Modifiering av befintlig algoritm Abstrakt Detta projekt är en modifiering av en redan befintlig algoritm med en hypotes att kunna segmentera celler bättre. Detta genom att man modifierar metoden till att beräkna lokala energier för mindre områden än de globala som beräknas för hela bilden i den befintliga algoritmen. Modifieringen visade sig vara bättre i vis mån och sämre i vis mån. Text: Andreas Andersson, Ali Hedayati, Fredrik Sikén Bilder: Fredrik Sikén Matlab implementation: Fredrik Sikén
2
Innehållsförteckning 1. Inledning...4 2. Biomedicinsk bakgrund...5 3. Befintlig metod...6 3.1 Level set metoden...6 3.2 Aktiva konturer...7 3.3 LoG filter...8 4. Modifierad metod...9 4.1 Lokalisera celler...10 4.2 Olika trösklingsmetoder...10 4.2.1 Otsus trösklingsmetod...10 4.2.2 Framprovade värden...11 4.3 Undersöka de lokala energierna...12 5. Resultat...14 6. Referenser...17 3
1. Inledning Ända sedan det upptäcktes att hjärnceller kan genomgå celldelning för att producera nya neuroner i en process kallad neurogenes, har de flesta studier inom detta område baserats på att försöka förstå denna process. Neurogenesen tros bero på de stamceller som finns i den vuxna hjärnan. Detta ger hopp till dem som lider av hjärnsjukdomar där bristen på hjärnceller är orsaken till sjukdomen. Stamceller är celler som kan dela sig i många andra celltyper. Ända sedan forskare använde en kemisk markör för att upptäcka nyligen bildade neuroner har målet varit att utveckla automatiska bildsystem för att segmentera och spåra cellerna i bilderna. Man har då använt mikroskop för att följa cellernas rörelse, med avsikt att kunna följa stamcellernas delning. Att använda bildanalys för att spåra stamceller har varit ett projekt som startade på Chalmers 2001 och har finansierats av Vetenskapsrådet. Specialister inom neurologi på Sahlgrenska har höjt frågor som rör expertis från medicinsk bildanalys. Frågorna har handlat om att ta bilder med hög pålitlighet och kvalitet, att spåra cellerna i en bildsekvens, vart går gränsen för manuellt arbete och att kunna få fram statistisk viktig information om bilderna. Man vill få fram en lösning som resulterar i ett användarvänligt verktyg som kan användas i den fortsatta forskningen. Projektet vi skulle göra i kursen bioteknisk fysik blev en liten del av vad institutionen för bildanalys hjälper specialisterna på Sahlgrenska med. Vi fick undersöka en studie som gjorts angående segmentering och spårning av stamceller med hjälp av en metod som kallas aktiva konturer som använder sig av level sets. Vi kommer i denna rapport att gå in djupare på denna metod och beskriva dem mer i detalj. 4
2. Biomedicinsk bakgrund Stamceller är ospecialiserade celler som har potential och möjlighet att utvecklas till mer specialiserade celltyper genom en process som kallas differentiering. De har också förmågan att föröka sig genom celldelning. Forskning på stamceller kan delas i två områden, forskning på mogna och omogna stamceller. Omogna stamceller härstammar från embryot och har potential att bli en rad olika specialiserade celler som t.ex. neuroner eller muskelceller. Mogna stamceller är ospecialiserade celler som finns i specialiserad vävnad. Dom har möjlighet att bli specialiserade celler i vävnaden de bildades i. Exempel på detta kan vara neuroner, oligodendrocyter eller astrocyter om det gäller celltyper i hjärnan. De mogna stamcellerna brukar oftast utveckla ett förstadium till de tre celltyperna vi berättade om innan, kallade progenitorceller och de är mer specialiserade än stamceller. En annan distinktion är att när stamceller delar sig så resulterar det i att minst en av de resulterande cellerna kommer ha samma egenskaper som den ursprungliga, emedan när en progenitorcell delar sig så kan båda cellerna bli specialiserade celler. Genom historien har forskare trott att när hjärnan har blivit skadad så finns det ingen möjlighet för den att reparera det och att utveckling av nya neuroner i hjärnan på en vuxen människa var omöjlig. Men under de senaste åren har man upptäckt att hjärnan visst ändrar sig genom livet och kan reparera skador som uppstått i den. Neurogenes, födelsen av nya neuroner har gett hopp till individer som lider av hjärnsjukdomar där sjukdomen orsakas av bristen på hjärnceller, exempel på detta är Parkinson, Huntington och Alzheimers. 1960- och 1970-talets forskare upptäckte att vissa delar av hjärnan kunde reparera sig själv. Vid ett antal studier under denna tid fann man att axoner till neuronerna i hjärnan och ryggraden kunde återväxa till viss del efter ett trauma. Nyligen, under 1998 fann en man vid namn Eriksson och hans kollegor på Sahlgrenska Universitets Sjukhus att neuroner i hippocampus hade återbildats, man fann detta när man studerade död hjärnvävnad. Hippocampus har hand om regleringen av minne och inlärningsförmåga. Forskare har också funnit att neurogenes sker i fullvuxna möss, fåglar och andra primater. Forskare studerar nu hur neurogenes sker naturligt och hur det kan användas i medicinsk behandling. 5
3. Befintlig metod Den befintliga metoden som ska modifieras bygger på aktiva konturer som i detta fall använder sig av en level set metod för att hitta celler i bilder som den nedan i figur 3. Figur 3 Original bild med celler som ska segmenteras För att den aktiva konturen ska kunna segmentera cellerna så bra som möjligt låter man också bilden genomgå ett Laplacian of Gaussin filter. Nedan ska varje del av den befintliga metoden beskrivas i detalj. 3.1 Level set metoden Metoden bygger på att man tänker sig en kurva som omsluter ett objekt eller en region. Denna kurva kommer att kommer att röra på sig och förändra sig med en hastighetsfunktion. Hastighetsfunktionen kan bero på många faktorer bl.a. lokal geometrisk information. Kurvans front kommer att röra sig med denna hastighetsfunktion och fronten kommer att kunna förflytta sig både framåt och bakåt. För att kunna hålla koll på denna förändring så skapas en level set funktion som är en dimension större och tidsberoende. På så sätt så kan man följa den tidsberoende level set funktionen och dess propagerande i tiden. I varje ögonblick så kommer fronten ges av nollte level set:en (zero level set) och för att man skall kunna beräkna rörelseekvationen funktionen antar värdet noll för fronten. Frontens position vid tidpunkten t ges av zero level set: φ( x( t), t) = 0 Fördelen med level set metoden är att den klarar hörn och topologiska förändringar väldigt bra. 6
Figur 3.1 Ett exempel på hur level set funktionen utvecklar sig, fronten kan återfinnas för φ=0 3.2 Aktiva konturer Aktiva konturer eller snakes som dem också kallas baseras på att forma en kurva baserat på olika villkor kring objekt i en bild. Metoden går ut på att man startar med en yttre kurva runt objektet som sedan söker sig in och sluter kring objektets gränser. Många av dessa metoder bygger på att man tar hänsyn till gradientskillnader och att man vill minimera den totala energin längs konturen, både den interna och externa energin tas alltså hänsyn till. Det gäller att minimera uttrycket: E( Γ) = α Γinnanför u 2 0 ( x) C1 d x+ u0 ( x) Γu tan för C 2 2 d x Där u 0 är bilden och Γ utgör kurvan. C 1 och C 2 är medelenergier innanför och utanför kurvan. Genom att utnyttja level set metoden och utöka energin som ska minimeras med faktorer såsom objektets längd och area så kan C 1 och C 2 beräknas: C ( φ) = 1 H ( φ( x)) d x u ( x) H ( φ( x)) d x 0 7
C ( φ) = 2 (1 H ( φ( x))) d x u ( x)(1 H ( φ( x))) d x 0 Där H är heavisidefunktionen. 3.3 Laplacian of Gaussian (LoG) filter För att ta bort utsmetningar i bilden så används ett Laplacian of Gaussian (LoG) filter. Den består egentligen av två filter, ett laplace filter som tittar på bildens andraderivator, dvs. tar fram de snabba förändringarna i bilden. För att reducera det högfrekventa bruset som kan bildas så används ett Gaussiskt filter innan laplacianen. Eftersom dessa är linjära filter som använder faltningsoperationer går det att lägga ihop dessa två filter till ett LoG filter. LoG 2 2 2 x + y x + y 2σ 2 2σ ( x, y) = e 6 2πσ 2 2 Där σ är filtrets bredd. Figur 3.3 Ett exempel på en LoG funktion 8
4. Modifierad metod Då vissa celler klassificeras som samma t.ex. i cellkluster i original metoden, se figur 4-1 nedan (t.ex. klustret längst ner till vänster), så undersöks en ny metod som innebär att man kontrollerar energierna lokalt för varje enskild cell istället för globalt för alla celler. Figur 4-1 Celler som klassificeras som samma i ett kluster Hypotesen är att detta ska medföra en bättre segmentering av cellerna och på så vis kunna urskilja celler som tidigare blev sammansatta med andra celler. Metoden fungerar som tidigare beskrivet men med skillnaden att den nu letar reda på alla celler eller cellkluster i bilden först, för att sedan välja ut enbart dessa områden och behandla dem som enskilda bilder, som kan ses i figur 4-2. 9
Figur 4-2 Ett mindre område som väljs ut och behandlas på samma sätt som tidigare metoden 4.1 Lokalisera celler En metod för att lokalisera cellerna eller kluster av celler är med hjälp av funktionen bwlabel i MATLAB. Algoritmen använder sig av en procedur som beskrivs i referens [3] och fungerar som följande 1. Run-length kodar original bilden. 2. Söker igenom längderna, tilldelar preliminära numreringar och sparar likheter i numreringarna i en lokal tabell för detta. 3. Tar mot ekvivalenta klasser. 4. Döper om längderna baserade på de mottagna ekvivalenta klasserna. 4.2 Olika trösklingsmetoder Först måste bilden trösklas för att få fram en binär bild för att sedan kunna leta reda på kluster av ettor. Detta kan göras med hjälp av olika metoder men i detta projekt används Otsus trösklingsmetod [4] och värden som är framprovade för att ge bra resultat. 4.2.1 Otsus trösklingsmetod Otsus metod försöker minimera variansen mellan ettor och nollor. Trösklingen med hjälp av denna metod appliceras på bilden som har genomgått en LoG filter, ett sådant resultat kan ses i figur 4.2.1. 10
Figur 4.2.1 En bildsekvens som LoG filtrerats och sedan trösklats med Otsus metod 4.2.2 Framprovade värden Ovan i figur 4.2.1 ser man att Otsus metod inte klarar detta speciellt bra då flertalet celler försvinner vid tröskling. Det är därför av intresse att undersöka hur bra resultat man får om man provar fram ett värde och håller detta statiskt för en bildsekvens. Nedan i figur 4.2.2 kan två olika bilder från samma sekvens ses, en i början och en i slutet av sekvensen, först LoG bilderna innan de trösklats och sedan efter det att de trösklat med ett framprovat tröskelvärde. 11
Figur 4.2.2 T.v. Bildsekvens som genomgått LoG filter, t.h. samma bild trösklat med framprovat värde. Det är en klar förbättring i figur 4.2.2 jämfört med figur 4.2.1 och trösklingen ger även bra resultat både för bilderna i början och slutet av sekvensen. 4.3 Undersöka de lokala energierna När trösklingen är klar kan cellernas eller klustrernas placering lokaliseras med metoden bwlabel beskriven ovan i 4.1 och det rektangulära område som omsluter dessa kan klippas ut. Detta görs genom att man låter detta område elementvis multipliceras med originalbilden och LoG bilden och man får då ett resultat som ger den urklippta bilden i figur 4-2. Sedan så genomförs original metoden med aktiva konturer för att finna konturen på detta nu mindre område. För att tydligare visualisera detta så färgkodar vi detta på originalbilden så resultatet syns tydligare. I figur 4.3 nedan kan en sådan färgkodad bild betraktas. 12
Figur 4.3 Segmenterad och färgkodad bild 13
5. Resultat Den första mycket avgörande delen av metoden visade sig vara att trösklingen gav bra resultat. Detta beroende på att placeringen av tröskelvärdet spelar roll då vissa celler kan komma att förloras, samtidigt som en annan nivå kan medföra att för mycket axon och dendriter från cellerna kommer med och gör det svårt att urskilja vad som är celler. Nedan i figur 5-1 kan ses tre bilder, den första innan tröskling, nästa med Otsus metod och den sista med framprovat värde. Figur 5-1 ö.t.v LoG av originalbild innan tröskling, ö.t.h Otsus trösklingsmetod, u.t.v. framprovat tröskelvärde Det är nu av stort intresse att se ifall denna modifierade metoden gav bättre eller sämre resultat än original metoden. I figur 5-2 kan resultatet av en bild ses och jämföras mellan den nya och den gamla metoden. 14
Figur 5-2 Över: segmentering och färgkodning med original metoden, Under: segmentering och färgkodning med den modifierade metoden. Man ser i figur 5-2 ovan att vissa celler segmenterats bättre i den modifierade metoden, t.ex. klustret nere till vänster som nu delats upp i ett kluster om två celler och en ensam cell. I original metoden var detta ett kluster om tre celler. Andra liknande segmenteringar har skett i den modifierade metoden. Det finns dock ett fåtal celler som har uteblivit i den modifierade varianten som är med i original varianten. Detta är givetvis inte alls bra och ofta är det troligtvis viktigare att identifiera alla celler på något vis, även om de hittas som en och samma, än att missa någon cell. 15
En annan sak som skiljer de två metoderna ifrån är att den modifierade metoden har visat sig vara snabbare än original metoden. Detta p.g.a. att då bilden delas upp runt cellerna så medför det att allt område där det inte är celler inte behöver beräknas. Det sker alltså bara beräkningar på delar av bilden istället för hela bilden. Samtidigt så blir det lättare för metoden att hitta cellerna när man valt ut enbart de områden som de finns i. Sammanfattningsvis kan man säga att den modifierade metoden ibland är bättre och ibland sämre. Troligtvis kan man modifiera denna så att man kommer att kunna hitta cellerna bättre. Att man bara plockar ut de delar där cellerna finns och behandlar de styckvis bör medföra att bättre resultat kan uppnås då man för ett lokalt problem med mer specifika värden kring den cellen, än en generell för alla celler. 16
6. Referenser [1] Tony F. Chan, Luminita A. Vese, Active contours without edges, IEEE Transactions on image processing, Vol 10, No.2, Februari 2001 [2] Javier Herrera Rodrigues, Segmentation and tracking of neural stem cells using level sets, Göteborg, Mars 2006 [3] Haralick, Robert M., and Linda G. Shapiro, Computer and Robot Vision, Volume I, Addison-Wesley, 1992, pp. 28-48. [4] Otsu, N., "A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms", IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics, Vol. 9, No. 1, 1979, pp. 62-66 17