PLATELIA LYME IgG 72952 96 TEST

PLATELIA LYME IgG 72952 96 TEST KVALITATIV DETEKTION AV IgG-ANTIKROPPAR MOT BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO I HUMANT SERUM, PLASMA ELLER CEREBROSPINALVÄTSKA GENOM IMMUNOLOGISK ENZYMANALYS 1. ANVÄNDNINGSOMRÅDE Platelia Lyme IgG är en indirekt immunologisk analys av typen ELISA för kvalitativ detektion av IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum, human plasma eller cerebrospinalvätska (CSF). 2. KLINISK BETYDELSE Lyme borreliosis (borrelios) är en icke smittsam infektion som orsakas av en bakterie i gruppen spiroketer, Borrelia burgdorferi, som överförs av fästingar av släktet Ixodes (2). Olika djur fungerar som värdar för bakterien och överföring till människor sker genom bett av infekterade fästingar. Överföringsrisken ökar ju längre fästingen sitter kvar. Prevalensen av borrelia är hög i tempererade och kalla klimatzoner i norra hemisfären, från Kina till Nordamerika och från Skandinavien till Nordafrika. Uppskattningsvis rapporteras ca 17 000 fall varje år i USA (3) och förmodligen fler än 50 000 i Europa, med en positiv gradient från väst till öst (4). Det är nu tydligt visat att Borrelia burgdorferi som beskrevs 1984 som en unik bakterieart i själva verket består av ett flertal arter, varav tre är patogena för människor: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii och Borrelia afzelii (7). Alla dessa tre patogena arter finns i Europa medan endast B. burgdorferi sensu stricto finns i USA. Kliniska symptom på borrelios är skiftande och ibland svåra att identifiera (6). Tre stadier kan urskiljas under sjukdomens kliniska utveckling. Det första stadiet (stadium I) kan vara asymptomatiskt och karakteriseras av ett influensaliknande syndrom. I 50 till 80 % av fallen uppträder flera dagar eller veckor efter fästingbettet en typisk, avgränsad och ringformad hudrodnad, erythema migrans (EM). Utan behandling orsakar en hematogen spridning av borrelios flera veckor senare inflammatorisk artrit, neurologiska och meningeala störningar samt hud- och hjärtsymptom (stadium II). Efter flera månader eller år kan sjukdomen utvecklas till ett kroniskt stadium förknippat med acrodermatitis chronica atrophicans, encefalopati, encefalomyelit och kronisk artrit (stadium III) (1). Varje art av Borrelia burgdorferi har en speciell tropism. Erythema migrans i stadium I är förknippad med samtliga tre arter. Neurologiska komplikationer är dock oftare förknippade med B. garinii och artrit är oftare förknippad med B. burgdorferi ss, medan acrodermatitis chronica atrophicans är specifik för B. afzelii. Diagnosen av borrelia får inte bekräftas utan en noggrann undersökning av patientens medicinska bakgrund, kliniska och biologiska kriterier och en uppskattning av sannolikheten för fästingexponering. På grund av svårigheterna med direkt upptäckt av borrelios, isolerade odlingar och implementeringen av molekylärbiologiska metoder, kvarstår serologi som ett viktigt element för biologisk diagnostisering av borrelios (1,5,8). IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi uppträder ca 3 till 6 veckor efter kontamination och kan bestå under hela sjukdomsutvecklingen medan IgG-antikroppar uppträder senare och når en topp först efter flera månader eller till och med år. Även om serologi är mindre användbart under det tidiga stadiet är det mycket viktigt under det andra och tredje stadiet, framförallt vid avsaknad av erythema migrans. När man med serologi får ett negativt resultat trots att den kliniska statusen tyder på infektion, måste ny serologi utföras tre veckor efter det första testet. Förekomst av specifika IgM-antikroppar är inte synonymt med nyligen förvärvad infektion. På samma sätt är förekomst av specifika IgG-antikroppar inte alltid ett bevis för tidigare infektion. Bestämning av intratekalt syntesindex hos IgG-specifika antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato används som underlag vid diagnos när det finns misstanke om Lyme neuroborrelios (9,10,11). De antigener och antikroppar som används i analyser med Platelia Lyme IgG (ref. 72952) och Platelia Lyme IgM (ref. 72951) har utvalts för detektion av specifika IgG- respektive specifika IgM-antikroppar mot de olika amerikanska och europeiska stammarna av Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. PRINCIP Platelia Lyme IgG är ett kvalitativt test för detektion av IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum, human plasma eller CSF genom en indirekt immunenzymatisk analys av typen ELISA. Mikroplattan bestryks med inaktiverade antigener av Borrelia burgdorferi. En peroxidasmärkt monoklonal antikropp som är specifik för humana gammakedjor (anti-igg) används som konjugat. Testet består av följande steg: Steg 1 Patientprover (serum eller plasma) och kontroller späds ut 1:101. CSF-prover späds ut 1:2. De utspädda proverna fördelas i mikroplattans brunnar. Under inkuberingen, en timme i 37 C, binds IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi som finns i provet till mikroplattans brunnar belagda med Borrelia-antigen. Efter inkuberingen tas icke-specifika antikroppar och serumproteiner bort genom tvättning. Steg 2 Konjugatet (peroxidasmärkt monoklonal antikropp som är specifik för humana gammakedjor) tillsätts i mikroplattans brunnar.under inkuberingen, en timme i 37 C, binds den märkta monoklonala antikroppen till det serum-igg som fångats av Borrelia-antigenen. Obundet konjugat avlägsnas genom tvättning när inkubationsperioden är slut. 1

Steg 3 Förekomsten av immunkomplex (Borrelia-antigen, IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi, anti-igg-konjugat) påvisas genom tillsats av en enzymatisk framkallningslösning i varje brunn. Steg 4 Efter inkubering i rumstemperatur (+18 30 C) avbryts den enzymatiska reaktionen genom att 1 N svavelsyralösning tillsätts. Den optiska densiteten, som avläses med hjälp av en spektrofotometer inställd på 450/620 nm, är proportionell mot mängden IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi i provet. 4. PRODUKTINFORMATION Den tillhandahållna mängden reagens är beräknad för 96 test i maximalt 6 analysomgångar. Alla reagenser är enbart avsedda för in vitro-diagnostik. Märkning Typ av reagens Innehåll R1 Microplate Mikroplatta (färdig att användas) 12 remsor med vardera 8 brytbara brunnar, belagda med inaktiverade Borrelia-antigen. R2 Concentrated Washing Solution Koncentrerad tvättlösning (10x) Tampon TRIS-NaCl (ph 7,4), 1 % Tween 20 Konserveringsmedel: 0,01 % ProClin 300 R3 Negative Control Negativ kontroll Humant serum negativt för IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi samt negativt för HBs-antigen, anti-hiv1, anti- HIV2 och anti-hcv. Konserveringsmedel: 0,15% ProClin 300 R4 Cut-off Control Gränsvärdeskontroll Humant serum reaktivt för IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi samt negativt för HBs-antigen, anti-hiv1, anti- HIV2 och anti-hcv. Konserveringsmedel: 0,15% ProClin 300 R5 Positive Control Positiv kontroll Humant serum reaktivt för IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi samt negativt för HBs-antigen, anti-hiv1, anti- HIV2 och anti-hcv. Konserveringsmedel: 0,15% ProClin 300 R6 Conjugate (51x) Konjugat (51x) Murin monoklonal antikropp mot humana gammakedjor kopplade till pepparrotsperoxidas. Konserveringsmedel: 0,15 % ProClin 300 R7 Diluent Spädningsmedel för prover och konjugat (färdigt att användas) Tris-NaCl (ph 7,7), fosterkalvserum, 0,1 % Tween 20 och fenolrött Konserveringsmedel: 0,15 % ProClin 300 R9 Chromogen TMB Kromogen (färdig att användas) 3,3,5,5 tetrametylbenzidin (<0,1 %), H 2 O 2 (<1 %) 1 2 x 100 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,7 ml 2 x 65 ml 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Stopplösning (färdig att använda) 1 N svavelsyralösning 1 x 28 ml Plattförslutare 4 Mer information om förvaringsvillkoren och sista förbrukningsdag finns på förpackningen. 5. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Resultatens kvalitet är beroende av att god laboratoriesed (GLP) tillämpas: Använd inte reagenser vars bäst-före-datumet har passerat. Blanda inte reagenser från olika partier inom en bestämd analysomgång. KOMMENTAR: För tvättlösningen (R2, märknings-id: 10x orangefärgad), kromogen (R9, märknings-id: TMB turkosfärgad) och stopplösning (R10 märknings-id: 1 N rödfärgad) kan du använda andra partier än de som ingår i testet om dess reagenser är helt likvärdiga och om samma parti används inom en bestämd analysomgång. 2

Vänta 30 minuter så att reagenserna uppnår rumstemperatur (18 30 C) innan du använder dem. Rekonstituera och späd noggrant reagenserna och undvik all kontaminering. Utför inte testet i närvaro av reaktiva ångor (syraångor, alkaliska ångor, aldehydångor) eller damm som skulle kunna ändra konjugatets enzymatiska aktivitet. Använd glasvaror som noggrant har diskats och sköljts med avjoniserat vatten, eller ännu hellre engångsmaterial. Tvättningen av mikroplattan är ett kritiskt steg. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda. Felaktig tvättning kan leda till felaktiga resultat. Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren och innan reagenset har hällts i. Använd aldrig samma behållare till att fördela konjugatet och framkallningslösningen. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metaller och metalljoner. Därför får ingen metall komma i kontakt med de olika lösningar som innehåller konjugatet eller kromogenen. Kromogenlösningen (R9) ska vara färglös. Om den är blåfärgad är detta en indikation på att reagenset inte kan användas utan måste ersättas. Använd en ny pipettspets för varje prov. Kontrollera precisionen för pipetterna och annan utrustning och att de fungerar korrekt. Hälso- och säkerhetsanvisningar Material av humant ursprung som använts vid beredning av reagenserna har testats och befunnits vara icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBsAg), antikroppar mot hepatit C-virus (anti-hcv) och antikroppar mot humant immunbristvirus (anti-hiv1 och anti-hiv2). Eftersom ingen testmetod med säkerhet kan garantera frånvaron av smittsamma ämnen, ska reagenser av humant ursprung och patientprover hanteras som potentiellt smittsamma. Betrakta allt material, däribland tvättlösningar, som kommer i direkt kontakt med prover och reagenser av humant ursprung som potentiellt smittsamt. Använd engångshandskar vid hantering av prover och reagenser. Pipettera inte med munnen. Undvik att spilla prover eller lösningar som innehåller prover. Spill måste sköljas bort med blekmedel som spätts till 10 %. Vid spill av syra måste den först neutraliseras med natriumbikarbonat och därefter renas med blekmedel som spätts ut till 10 %, och torkas upp med absorberande papper. Materialet som används för rengöring måste kastas i en behållare för smittfarligt avfall. Prover, reagenser av humant ursprung liksom smittfarligt material och smittfarliga produkter får endast kastas efter sanering: - antingen genom att sänkas ned i blekmedel vid en slutlig koncentration på 5 % natriumhypoklorid i 30 minuter - eller genom att autoklaveras i 121 C i minst 2 timmar. VARNING! Ställ inte in lösningar som innehåller natriumhypoklorit i autoklaven Undvik all hud- och slemhinnekontakt med både kromogenlösningen och stopplösningen (risk för förgiftning, irritation eller brännskador). Kemiskt och biologiskt avfall måste hanteras och avlägsnas enligt rutiner för god laboratoriesed (GLP). Alla reagenser som ingår i testet är enbart avsedda för in vitro-diagnostik. Xi - Irriterande Varning: Vissa av reagenserna innehåller ProClin 300 0,15 % R43: Kan ge allergi vid hudkontakt S28 37: Vid kontakt med huden, tvätta genast med mycket tvål och vatten. Använd lämpliga skyddshandskar 6. PROVTAGNING, -BEREDNING OCH -FÖRVARING 1. Serum, plasma (EDTA, heparin eller citrat) och CSF är rekommenderade provtyper. 2. Följ nedanstående anvisningar för hantering, bearbetning och förvaring av blodprover. Ta alla blodprover med venpunktion och vidtag vanliga försiktighetsåtgärder. Låt serumproverna koagulera fullständigt före centrifugering. Rören ska alltid vara förslutna. Separera serum eller plasma från koaglet eller erytrocyterna och förvara i väl förslutet rör efter centrifugering. Proverna kan förvaras i +2 8 C om testet genomförs inom 7 dagar. Om testet inte kommer att slutföras inom 7 dagar, eller om proverna ska skickas iväg, ska proverna frysas ned till 20 C eller kallare. Använd inte prover som tinats mer än fem gånger. Prover som har varit frysta ska blandas ordentligt (vortex) efter upptining innan testet utförs. 3. Serum- eller plasmaprover som innehåller upp till 90 g/l albumin eller 100 mg/l okonjugerat bilirubin, lipemiska prover som innehåller motsvarande 36 g/l triolein (triglycerid) och hemolyserade prover som innehåller upp till 10 g/l hemoglobin påverkar inte resultaten. 4. Värm inte proverna. 5. För att demonstrera en IgG-intratekal syntes använder du CSF-prover som tagits med lumbalpunktion samtidigt som serum eller plasma. Observera rekommendationerna för CSF-prover. Det är särskilt viktigt att man inte använder problemprover med heterogen aspekt (i det fallet föredras supernatant efter centrifugering) eller höghemolyserade prover. CSF ska testas omedelbart efter provtagningen. Om förvaring är nödvändig för senare testning ska det ske vid 4-8 C (kort tid) eller vid -20 C (längre tid) (10). OBS! CSF-provernas stabilitet vid 4-8 C eller -20 C, efter flera infrysningar och upptiningar eller påverkan av någon av komponenterna som anges i punkt 3 ovan har inte undersökts. 3

7. TESTFÖRFARANDE 7.1 NÖDVÄNDIGT MEN EJ BIFOGAT MATERIAL Vortexmixer. Avläsare för mikroplattor med 450 nm och 620 nm filter (*). Inkubator för mikroplattor, termostatstyrd till 37±1 C (*). Automatisk, halvautomatisk eller manuell tvättanordning för mikroplattor (*). Sterilt destillerat eller avjoniserat vatten. Engångshandskar. Skyddsglasögon. Absorberande papper. Automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda pipetter eller multipipetter för mätning och fördelning av 10 till 1 000 µl respektive 1, 2 och 10 ml. Mätcylindrar med volymerna 25 ml, 50 ml, 100 ml och 1 000 ml. Natriumhypoklorit (blekmedel) och natriumbikarbonat. Behållare för smittförande avfall. Engångsrör. (*) Begär gärna mer information om den rekommenderade utrustningen från vår tekniska avdelning. 7.2 REAGENSREKONSTITUERING R1: Låt påsen stå 30 minuter i rumstemperatur (+18 30 C) innan den öppnas. Ta ut brickan och lägg omedelbart tillbaka oanvända remsor i påsen samt kontrollera att det finns torkmedel. Återförslut påsen noggrant och förvara den i +2 8 C. R2: Späd tvättlösningen R2 1/10 med destillerat vatten, till exempel 100 ml R2 och 900 ml destillerat vatten till en tvättlösning som är färdig att använda. Bered 350 ml utspädd tvättlösning för en platta med 12 remsor om tvättningen sker manuellt. R3, R4, R5: Späd 1/101 med spädningsmedel (R7) (exempel: 10 µl R3 + 1 ml R7). R6+R7 : Konjugat (R6) är koncentrerat 51x och måste homogeniseras före användning. Späd 1/51 med spädningsmedel (R7). Till en platta späds 0,5 ml konjugat (R6) i 25 ml spädningsmedel (R7). Dela dessa volymer i 5 portioner så att den volym som behövs för två remsor erhålls. 7.3 FÖRVARING AV OCH VALIDITET HOS ÖPPNADE OCH/ELLER REKONSTITUERADE REAGENSER Testet måste förvaras vid +2 8 C. När testet förvarats vid +2-8 C innan det öppnas kan varje komponent användas till det bäst-före-datum som anges på testets yttre etikett. R1: Efter öppnandet är remsorna hållbara i en månad vid förvaring i +2 8 C i samma väl förslutna påse (kontrollera att påsen innehåller torkmedel). R2: Så snart tvättlösningen är utspädd kan den förvaras i 2 veckor i +2 8 C. Den koncentrerade tvättlösningen är stabil till det bäst-före-datum som anges på etiketten om den förvaras i +2 8 C utan att utsättas för kontaminering. R3, R4, R5, R6, R7: Reagenser som förvaras i +2-8 C utan att utsättas för kontaminering är stabila i en månad. R6+R7: När konjugatarbetslösningen är utspädd är den stabil i 8 timmar i rumstemperatur (+18-30 C) och i 24 timmar vid +2-8 C. R9: Om reagenset förvaras i +2-8 C utan att utsättas för kontaminering är det stabilt i 2 månader. R10: Om reagenset förvaras i +2-8 C utan att utsättas för kontaminering är det stabilt till det bäst-före-datum som anges på etiketten. 7.4 METOD FÖR SERUM- ELLER PLASMAPROVER Följ beskrivningen av testförfarandet och god laboratoriesed noggrant. Låt reagenserna uppnå rumstemperatur (+18 30 C) före användning. Använd de negativa, gränsvärdesrelaterade och positiva kontrollerna vid varje analysomgång för validering av testresultaten. 1. Fastställ fördelnings- och identifieringsplanen noggrant för kontroller och patientprover. 2. Bered den utspädda tvättlösningen (R2) [se avsnitt 7.2]. 3. Ta ut brickan och remsorna (R1) ur skyddsförpackningen [se avsnitt 7.2]. 4. Späd kontrollerna R3, R4, R5 och patientproverna (S1, S2 ) med spädningsmedel (R7) så att spädningen blir 1/101: 10 µl prov och 1,0 ml spädningsmedel (R7). Blanda de utspädda proverna med vortexmixern. 5. Följ den angiva sekvensen nedan noggrant och fördela i varje brunn 200 µl av de utspädda kontrollerna och patientproverna: 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Täck mikroplattan med självhäftande folie. Tryck sedan till ordentligt på plattan så att folien sluter tätt. Inkubera mikroplattan direkt i ett termostatkontrollerat vattenbad eller i en torr inkubator vid 37±1 C i 1 timme ±5 minuter. 7. Ta bort den självhäftande folien när den första inkuberingsperioden är slut. Aspirera samtliga brunnars innehåll till en behållare för smittfarligt avfall (innehållande natriumhypoklorit). Tvätta mikroplattorna 4 gånger med 350 µl tvättlösning (R2). Vänd mikroplattan upp och ned och slå med lätta slag mot det absorberande papperet så att resterande vätska försvinner. 8. Bered konjugatarbetslösningen (R6+R7) [se avsnitt 7.2]. Fördela omedelbart 200 µl av konjugatarbetslösningen (R6+R7) i alla brunnar. Lösningen måste skakas varsamt före användning. 9. Täck mikroplattan med självhäftande folie. Tryck sedan till ordentligt på plattan så att folien sluter tätt. Inkubera mikroplattan direkt i ett termostatkontrollerat vattenbad eller i en torr inkubator vid 37±1 C i 1 timme ±5 minuter. 10. Ta bort den självhäftande folien när den andra inkuberingsperioden är slut. Aspirera samtliga brunnars innehåll till en behållare för smittfarligt avfall (innehållande natriumhypoklorit). Tvätta mikroplattorna 4 gånger med 350 µl tvättlösning (R2). Vänd mikroplattan upp och ned och slå med lätta slag mot det absorberande papperet så att resterande vätska försvinner. 11. Fördela snabbt, skyddat från ljus, 200 µl kromogenlösning (R9) i alla brunnar. Låt reaktionen fortgå i mörker i 30 ±5 minuter i rumstemperatur (+18 30 C). Använd inte självhäftande folie under denna inkubering. 12. Stoppa den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 100 µl stopplösning (R10) i varje brunn. Använd samma ordningsföljd och samma fördelningshastighet som för framkallningslösningen. 13. Torka noggrant av mikroplattans botten. Avläs den optiska densiteten vid 450/620 nm med hjälp av mikroplattans avläsare inom 30 minuter efter det att reaktionen har avbrutits. Remsorna måste alltid skyddas mot ljus innan de läses av. 14. Kontrollera överensstämmelsen mellan avläsningarna och fördelningsplanen för plattan och proven innan du rapporterar resultaten. 7.5 METOD FÖR PROVER MED CEREBROSPINALVÄTSKA OBS! Bestämning av intratekal syntes hos anti-lyme IgG-antikroppar baseras på Reibers formel. För varje patient där det finns misstanke om Lyme neuroborrelios, tas prover av både serum/plasma och CSF samtidigt. Båda proverna testas i samma analysomgång. Späd ut CSF-prover i utspädningsvätska (R7) i förhållandet 1:2: 150 µl CSF-prov och 150 µl utspädningsvätska (R7). Följ noggrant anvisningarna ovan för serum- och plasmaprover och späd bara ut CSF-prover enligt dessa anvisningar. 8 BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT 8.1 Beräkning av gränsvärdet (CO) Gränsvärdet (CO) utgör medelvärdet av de optiska densitetsvärdena (OD) hos de dubbla gränskontrollerna (R4): CO = medelvärdet av OD R4 8.2 Beräkning av provkvot (serum eller plasma) Provresultat uttrycks som en kvot med hjälp av följande formel: Provkvot = provets OD/CO 8.3 Kvalitetskontroll Inkludera alla kontroller för varje mikroplatta vid varje analysomgång och analysera de erhållna resultaten. För att analysen ska kunna valideras måste följande villkor uppfyllas: Värden för optisk densitet: - CO > 0,200-0,80 x CO < OD R4 replikat 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 replikat 2 < 1,20 x CO (Individuella OD för varje replikat av gränsvärdeskontrollen (R4) får inte avvika med mer än 20 % av COvärdet). Kvoter för optisk densitet: - R3-kvot (OD R3 / CO) < 0,5 - R5-kvot (OD R5 / CO) > 2,0 Om kvalitetskontrollkriterierna inte är uppfyllda ska testet göras om. 5

8.4 Utvärdering av resultaten (serum eller plasma) Provkvot Resultat Utvärdering Kvot < 0,80 Negativt Provet anses vara icke-reaktivt med avseende på förekomsten av IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato. 0,80 kvot < 1,2 Tveksamt Provet anses vara tveksamt med avseende på förekomsten av IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato. Resultatet måste bekräftas med ett nytt test som ska göras på ett andra prov taget minst 3 veckor efter det första provet. Kvot 1,2 Positivt Provet anses vara reaktivt med avseende på förekomsten av IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato. Om infektion misstänks kan kompletterande serologiska test som detektion av IgM anti-borrelia-antikroppar vara användbara för bekräftelse av diagnosen. Om serologitestet utfaller positivt eller tveksamt bör provet testas med en konfirmeringsmetod, till exempel ett Western-Blot (8). 8.5 Bestämning av intratekal syntes Bestämning av intratekal syntes görs med beräkning av IgG-antikroppsindex (AI IgG ) med hjälp av Reibers formel (9,10,11). Bestäm respektive OD-värden (OD IgG Serum, OD IgG CSF ) för varje par serum- och CSF-prov och kontrollera att OD hamnar mellan 0,000 och 3,000. VARNING! Om serum-od (OD IgG Serum ) eller CSF-OD (OD IgG CSF ) inte ligger inom OD-intervallet ovan, ska provet testas igen med högre utspädning i R7-utspädningsvätska (medföljer). Efter utspädningen ska provets OD ligga mellan 0,000 och 3,000. Observera i detta fall utspädningsfaktorn som används för beräkning av index för intratekal IgG-syntes (se nedan). Bestäm följande data för varje serum som testas: Albumin (g/l) = albumin Serum Totalt IgG (g/l) = totalt IgG Serum Bestäm följande data för varje CSF som testas: Albumin (mg/l) = albumin CSF Totalt IgG (mg/l) = totalt IgG CSF Beräkna de olika kvoterna med hjälp av formlerna nedan: Q alb = albumin CSF /[albumin Serum x 1000] Q lim(igg) = 0,93 x [Q Alb 2 + (6 x 10-6 )] 1/2 1,7 x 10-3 Q IgG = totalt IgG CSF /[total IgG Serum x 1000] Q Spec(IgG) = OD IgG CSF /[OD IgG Serum x 50,5] VARNING! Om till exempel CSF- och serumproverna spätts ut med 1:5 och 1:10 för att hamna inom ODintervallet 0,000 och 3,000, ska CSF-OD (OD IgG CSF ) multipliceras med 5 och serum-od (OD IgG Serum ) med 10 innan formeln Q Spec(IgG) används. Bestäm IgG-antikroppsindex (AI IgG ) med en av formlerna nedan: AI IgG = Q Spec(IgG) /Q IgG [om Q IgG < Q lim(igg) ] eller AI IgG = Q Spec(IgG) /Q lim(igg) [om Q IgG > Q lim(igg) ] 8.6 Tolkning av antikroppsindex (AI IgG ) för bestämning av intratekal syntes Reibers formel för bestämning av IgG-antikroppsindex får inte användas i följande situationer: CSF-provkvot < 0,50 (*) CSF-provkvot 0,50, men med serum-/plasmakvot < 0,50 (*) (*) Kvot = OD/medelvärde R4 6

Tolka CSF-resultaten enligt algoritmen nedan: Bestäm CSF-kvot CSF-kvot < 0,50 CSF-kvot 0,50 CSF IgG negativ Bestäm Serumkvot Serumkvot < 0,50 Serumkvot 0,50 CSF-kvot < 0,80 CSF-kvot 0,80 Reibers formel Utvärdera inte CSF-resultat CSF IgG positiv Utvärdering av Ig G -a ntikrop p sinde x Algoritm för bestämning av IgG-antikroppsindex med testkitet Platelia Lyme IgG IgG-intratekal syntes bekräftas när IgG-antikroppsindex är högre än 1,30. IgG-intratekal syntes förekommer inte när IgGantikroppsindex är högre än 0,70 men lägre än eller lika med 1,30. Resultatet är inte giltigt när IgG-antikroppsindex är lägre än eller lika med 0,70 (bearbetningsfel, serum- och CSF-prov togs inte samma dag, CSF kontaminerat osv.) Tolkning av AI IgG Positivt AI IgG > 1,30 Negativt 0,70 < AI IgG 1,30 Ogiltigt resultat AI IgG 0,70 8.7 Ofta förekommande problem Icke validerade eller icke repeterbara reaktioner orsakas ofta av följande: Otillräcklig tvättning av mikroplattan. Kontaminering av negativa prov med serum eller plasma med hög antikroppstiter. Kontaminering av framkallningslösningen med kemiska oxidationsmedel (blekmedel, metalljoner ). Kontaminering av stopplösningen. 8.8 Beräkningsexempel (serum eller plasma) Obs: Följande uppgifter är endast exempel och får inte användas i stället för faktiska resultat. Kontroller och patientprover OD (450/620 nm) Kvot Resultat R3 0,144 0,29 Negativt R4 0,502 / / R4 0,498 / / R5 1,440 2,88 Positivt Prov 1 1,650 3,30 Positivt Prov 2, osv... 0,120 0,24 Negativt Gränsvärde: - CO = (0,502+0,498)/2 = 0,500 Värden för optisk densitet: - OD CO = 0,500 (N > 0,200) - OD R4 replikat 1 = 0,502 (0,80 x OD CO < OD R4 replikat 1 < 1,20 x OD CO) - OD R4 replikat 2 = 0,498 (0,80 x OD CO < OD R4 replikat 2 < 1,20 x OD CO) 7

Kvoter för optisk densitet: - Kvot R3 = 0,29 (N < 0,5) - Kvot R5 = 2,88 (N > 2,0) Kvalitetskontroll: Godkänt 9 PRESTANDA 9.1 Prevalens Prevalensbestämning av IgG-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato i humanserum beräknades med hjälp av en panel av 295 prover från blodgivare från norra Frankrike. Följande resultat erhölls: 291 negativa, 1 ej påvisat och 3 positiva sera. Prevalens med användning av Platelia Lyme IgG-analysen fastställdes vid 1,02 % (3/295). 9.2 Specificitet 9.2.1 Specificitet i ett icke-endemiskt område Specificiteten beräknades med en panel av 279 sera som tagits från friska blodgivare, boende i ett icke-endemiskt område i norra Frankrike. Prover utvaldes från negativa resultat erhållna från en kommersiell EIA-analys som används i Europa (CE-märkt) och som betraktas som referensanalys. 9.2.2 Specificitet i ett endemiskt område Specificiteten bestämdes också med en panel av 193 sera från friska blodgivare som bor i ett endemiskt område i östra Frankrike, av vilka ingen uppvisade kriterier relaterade till Lymes sjukdom (inga kliniska symptom på borrelios eller historia av fästingbett). Prover utvaldes från negativa resultat erhållna från en kommersiell EIA-analys som används i Europa (CE-märkt) och som betraktas som referensanalys. Erhållna resultat presenteras i tabellen nedan: Serapanel Negativt Ej påvisat (1) Positiva (2) Specificitet Icke-endemiskt område (n=279) [IC 95 Endemiskt område (n=193) [IC 95 278 1 0 190 2 1 (278/278) [98,9 %-100,0 99,5 % (190/191) [97,1 %-99,9 (1) Ej påvisade resultat exkluderades för specificitetsberäkningen. (2) Ett prov som var positivt med Platelia Lyme IgG-analysen befanns vara negativt med Western blot-analys. IC 95 %: 95 % konfidensintervall. 9.3 Sensitivitet Platelia Lyme IgG-analysens sensitivitet beräknades och inkluderades med sensitivitetsresultat från Platelia Lyme IgM-analysen (Ref. 72951) med en panel av 70 prover från patienter som hade olika former av Lymes sjukdom i varierande kliniska stadier. Resultaten presenteras i tabellen nedan och jämfördes med sensitivitetsresultat erhållna med kommersiella EIA-analyser som används i Europa (CE-märkta) och som anses som referensanalyser: Kliniskt stadium Erythema migrans (Stadium I) [IC 95 Neuroborrelios (Stadium II) [IC 95 Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadium III) [IC 95 Antal sera 17 33 5 Platelia Lyme (1) Referens Europa (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM 66,7 % [38,4 %-88,2 96,9 % [83,4 %-99,9 [54,9 %-100,0 58,8 % [32,9 %-81,6 36,7 % [19,9 %-56,1 20,0 % [0,05 %-71,6 82,4 % [56,6 %-96,2 96,9 % [83,4 %-99,9 [54,9 %-100,0 93,3 % [68,1 %-99,8 97,0 % [84,2 %-99,9 [54,9 %-100,0 Lyme Artrit (Stadium III) [IC 95 15 [81,9 %-100,0 (1) Ej påvisade resultat exkluderades för sensitivitetsberäkningen. IC 95 %: 95 % konfidensintervall. 0,0 % [0,0 %-18,1 [81,9 %-100,0 [81,9 %-100,0 8

Platelia Lyme IgG-analysens sensitivitet visades också på en dokumenterad panel av prover tillhandahållna av CDC (Center for Disease Control), och jämfördes med sensitivitetsresultat erhållna med kommersiella EIA-analyser som används i Europa (CE-märkta) och USA (FDA-godkända) och som anses som referensanalyser. Resultaten presenteras i tabellen nedan: Kliniskt stadium Erythema migrans [IC 95 Antal sera 28 Platelia Lyme (1) Referens Referens USA Europa (1) (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM IgG + IgM 38,5 % [20,2 %-59,5 73,7 % [48,8 %-90,9 86,4 % [65,1 %-97,1 70,4 % [49,8 %-86,3 87,0 % [66,4 %-97,2 Artrit / artralgi [IC 95 6 [60,7 %-100,0 40,0 % [5,3 %-85,3 [60,7 %-100,0 [60,7 %-100,0 [60,7 %-100,0 Okänt stadium [IC 95 4 100,0% [36,8 %-100,0 100,0% [0,05 %-100,0 100,0% [47,3 %-100,0 [19,4 %-99,9 [36,8 %-100,0 (1) Ej påvisade resultat exkluderades för sensitivitetsberäkningen. IC 95 %: 95 % konfidensintervall. 9.4 Beräkning av IgG-antikroppsindex för bestämning av intratekal syntes En extern utvärdering har gjorts av 104 parade prover från patienter utan Lyme neuroborrelios (n=19), eller med misstanke om (n=29), sannolik (n=36) och bekräftad (n=20) Lyme neuroborrelios. De detaljerade resultaten visas i tabellen nedan i de olika kategorierna: Status Totalt CSF ej tolkningsbart Negativt CSF Positivt CSF Positivt AI IgG-index Negativt AI IgG-index Ogiltigt AI IgG-index Ingen LNB 19 0 18 1 0 0 0 Misstanke om LNB Sannolik LNB Bekräftad LNB 29 0 11 0 14 4 0 36 1 6 2 22 4 1 20 0 0 0 17 2 1 Status Totalt Positivt (CSF-kvot eller AI IgG ) Negativt (CSF-kvot eller AI IgG ) Ej tolkningsbart (CSF-kvot eller AI IgG ) Ingen LNB 19 1 (5,3 %) 18 (94,7 %) 0 (0,0 %) Misstanke om LNB 29 14 (48,3 %) 15 (51,7 %) 0 (0,0 %) Sannolik LNB 36 24 (66,7 %) 10 (27,8 %) 2 (5,5 %) Bekräftad LNB 20 17 (85,0 %) 2 (10,0 %) 1 (5,0 %) 9.5 Precision Precision inom körning (repeterbarhet): För att utvärdera repeterbarheten inom analysen analyserades ett negativt, ett ej påvisat och två positiva prover 30 gånger under samma körning. Kvoten (Prov OD / CO) fastställdes för varje prov. Medelkvot, standardavvikelse och variationskoefficient (CV %) för vart och ett av de fyra proverna kan ses i tabellen nedan: 9

Precision inom körning (repeterbarhet) N=30 Negativt prov Ej påvisat prov Lågpositivt prov Högpositivt prov Kvot (Prov OD / Gränsvärde) Medel 0,10 0,95 1,38 6,31 Standardavvikelse 0,007 0,082 0,116 0,134 CV % 6,0 % 8,6 % 8,4 % 2,1 % Precision mellan körningar (reproducerbarhet): För att utvärdera reproducerbarheten mellan analyser analyserades ett negativt, ett ej påvisat och två positiva prover i duplikat med två körningar om dagen över en period av 20 dagar. Kvoten (Prov OD / CO) fastställdes för varje prov. Medelkvot, standardavvikelse och variationskoefficient (CV %) för vart och ett av de fyra proverna kan ses i tabellen nedan: Precision mellan körningar (reproducerbarhet) N=80 Negativt prov Ej påvisat prov Positivt prov Högpositivt prov Kvot (Prov OD / Gränsvärde) Medel 0,19 0,85 3,92 6,67 Standardavvikelse 0,032 0,115 0,335 0,650 CV % 17,3 % 14,8 % 8,4 % 9,7 % 9.6 Korsreaktivitet 384 blodprover med karakteristika som potentiellt kunde resultera i icke-specifika reaktioner testades med Platelia Lyme IgG-analysen. Resultaten presenteras i tabellen nedan: Panel Antal prover Ej påvisat (1) Positivt Korsreaktivitet % Syfilis 83 4 1 1,3 % (2) CMV 50 1 1 2,0 % (2) EBV 22 1 0 0,0 % Leptospiros 15 1 1 7,1 % (2) Malaria 20 1 1 5,3 % (2) Antinukleära antikroppar (ANA) Heterofila antikroppar (HAMA) 22 0 0 0,0 % 10 0 0 0,0 % Reumafaktor 44 1 1 2,3 % (2) HSV 30 0 0 0,0 % Toxoplasmos 38 0 0 0,0 % Röda hund 10 0 0 0,0 % Mässling 10 0 0 0,0 % Påssjuka 10 0 0 0,0 % HIV 10 0 0 0,0 % VZV 10 0 0 0,0 % TOTALT 384 9 5 1,33 % (1) Ej påvisade resultat exkluderades för beräkningen av korsreaktiviteten. (2) Ingen signifikant skillnad från prevalens i endemiskt område (Fisher test, p>0,05).. 10

De 2 CMV- och Malaria-serumproverna som visade sig vara positiva med Platelia Lyme IgG-analysen visade sig också positiva med den kommersiella EIA-analys som används i Europa (CE-märkt), men var inte konfirmerade med en Western blot-metod. Det Reumfaktorserum som var positivt med Platelia Lyme IgG-analysen konfirmerades som positivt med den kommersialiserade EIA-analys som används i Europa samt med en Western-blot-metod. Det leptospiros-serum som var positivt med Platelia Lyme IgG-analysen visade sig ej påvisat med den kommersiella EIA-analysen som används i Europa (CE-märkt) och konfirmerades som negativt med en Western blotmetod. Det syfilisserum som var positivt med Platelia Lyme IgG-analysen konfirmerades som negativt med den kommersialiserade EIA-analys som används i Europa samt med en Western-blot metod. 10 TESTETS BEGRÄNSNINGAR En diagnos av nyligen förvärvad Borrelia burgdorferi-infektion kan endast fastställas utifrån en kombination av kliniska och biologiska data. Resultatet från ett enda test för detektion av IgG anti-borrelia burgdorferi-antikroppar är inte tillräckligt för diagnos av infektion av Borrelia burgdorferi sensu lato. Om serologitestet utfaller positivt eller tveksamt bör provet testas med en konfirmeringsmetod, till exempel ett Western-Blot (8). Diagnos av Lyme neuroborrelios kan endast fastställas utifrån en kombination av kliniska och biologiska data. Endast CSF-resultat och tolkning med hjälp av det här protokollet utgör inte tillräckligt med bevis för diagnos. Beräkning av IgG-antikroppsindex med Reibers formel i det här protokollet är inte giltig om inte alla biologiska data utvärderas (albumin Serum, albumin CSF, totalt IgG Serum, totalt IgG CSF, OD IgG Serum och OD IgG CSF ). Det är även viktigt att korrekta enheter används, se formeln ovan. Det här protokollet gäller endast för anti-borrelia IgG-antikroppar. Det har inte utvärderats för anti-borrelia IgMantikroppar eller andra IgG-antikroppar. Det här protokollet gäller endast för testning av CSF. Inga andra biologiska vätskor (synoviska vätskor ) har utvärderats. 11 TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla tillverkade reagenser bereds i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till kommersialiseringen av den slutgiltiga produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och lanseras på marknaden endast om det överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroller av varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad. 12 REFERENSER 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G. 2005. Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: 484-509. 2. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P. 1982. Lyme disease a tick-borne spirochetosis? Science. 216: 1317-1319. 3. Center for Disease Control and Prevention. 2004. Lyme disease United States, 2001-2002. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: 365-369. 4. Hubalek, Z., Halouzka, J. 1997. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: 951-957. 5. Reed, K. D. 2002. Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: 319-324. 6. Stanek, G., Strle, F. 2003. Lyme borreliosis. Lancet. 362: 1639-1647. 7. Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J. 1999. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: 633-653. 8. Wilske, B. 2003. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3: 215-227. 9. Bednarova, J. 2006. Cerebrospinal-Fluid profile in neuroborreliosis and its diagnosis significance. Folia Microbiol. 51: 599-603. 10. Deisenhammer F., Bartos A., Egg R., Gilhus N.E., Giovannoni G., Rauer S., Sellebjerg F. 2006. Guidelines on Routine Cerebrospinal Fluid Analysis. Report from EFNS Task Force. Europ. Journ. of Neurol.. 11. Reiber H., Lange P. 1991. Quantification of Virus-Specific Antibodies in Cerebrospinal Fluid and Serum: Sensitive and Specific Detection of Antibody Synthesis in Brain. Clin. Chem. 37: 1153-1160. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 880096 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 06/2009 11