DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 1 av 12 1. Användningsområde Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits CE revision 5, januari 2014 Biofortuna HLA SSPGo Kits är kvalitativa DNA-baserade förpackningar för bestämning av HLA-alleler i förpackningar med låg upplösning eller gruppspecifik amplifiering av alleler i förpackningar med medelhög upplösning. Den vanliga definitionen av medelhög upplösning är när majoriteten av resultaten är tydligt definierade på en tvåsiffrig nivå t.ex. DQB1*02, DQB1*05. Hög upplösning definieras i allmänhet som majoriteten av alleler på fyrsiffrig nivå som DQB1*02:01, DQB1*05:01. Detta är en produkt för diagnostisk användning in vitro som endast är avsedd att användas av utbildad personal. 2. Introduktion HLA-molekyler spelar en nyckelroll för immunitet och igenkänning av kroppseget respektive kroppsfrämmande och därför är HLA-genotypning och HLA-matchning obligatoriskt före de flesta typer av transplantationer. Eftersom HLAantigen begränsar specificiteten för T-cellsmedierade immunsvar är HLA-genotypning ett användbart verktyg för undersökning av alla immunsjukdomar och alla immunsvar på patogener, vacciner och medicinska behandlingar. HLA-genotypning kan också användas som stöd vid diagnos av sjukdomar där vissa HLA-alleler har visat sig ha ett signifikant samband med sjukdomstillstånden. De flesta HLA-gener är mycket polymorfa och i allmänhet krävs DNA-genotypning för exakt bestämning av HLAantigen. PCR-genotypning med sekvensspecifika primrar (SSP) 1 är en snabb HLA-genotypningsmetod och är särskilt lämplig i situationer där det krävs medelhög upplösning. Alla Biofortuna SSP-förpackningar innehåller kompletta frystorkade reaktioner, inklusive polymeras, så att allt som användaren behöver göra före PCR är att tillsätta DNA. Förpacknings- Förpackningarna uppdateras hela tiden med nya uppgifter om HLA-inpassning från IMGT. uppdateringarna finns tillgängliga från www.biofortuna.com. 3. Beskrivning av analysen PCR SSP bygger på principen att endast primrar med 3 -terminaler som helt matchar en målsekvens amplifieras. Felmatchade primrar ger inga positiva amplifieringsprodukter 2. Ett internt kontrollprimerpar, som amplifierar en konserverad region av en hushållningsgen, ingår i alla PCR-reaktionsblandningar. Det interna kontrollprimerparet är en indikator för PCR-reaktionens integritet. Vid SSP-genotypning används i allmänhet flera reaktioner som när de analyseras tillsammans indikerar genotypen. De amplifierade produkterna kan visualiseras med agarosgelelektroforessystem som separerar DNA-fragmenten efter storlek.
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 2 av 12 4. Förpackningens innehåll PCR-plattor av polypropylen eller strips som består av mellan 8 och 96 PCR-brunnar (beroende på förpackning), där varje brunn innehåller fördispenserade frystorkade primrar, polymeras, dntp* och buffert. Varje platta eller strip levereras förseglad med ett förseglingsark eller lock och individuellt förpackad i en foliepåse som innehåller en torkmedelspåse. PCR-förseglingsark eller -lock. 1x bruksanvisning. Analyscertifikat Tolkningstabeller, säkerhetsdatablad (MSDS) och analyscertifikat kan laddas ned från Biofortunas webbplats www.biofortuna.com. Kontakta er lokala distributör om det inte går att ladda ned från webbplatsen. *CleanAmp dntp är licensierat av Trilink Biotechnologies Inc för användning i Biofortuna SSPGo-produkter. 5. Reagens och utrustning som inte medföljer Lämpliga kalibrerade pipetter och sterila spetsar, t.ex. P10-pipett med filterspetsar på 10 µl. DNA-isoleringskit/-utrustning. UV-spektrofotometer. Polypropylenrör. Sterilt vatten för molekylär användning. En termocykel med följande specifikationer ska användas: Termocykel med värmelock för 96 brunnar med en temperatur på 104 C för oljefri drift Ramptakt på 1,0 o C/s. Temperaturområde på 4,0 C till 99,9 C Temperaturprecision på ±0,25 C för området 35 C till 99,9 C Temperaturkalibrering som kan spåras till en referensstandard Programmera termocykeln med hjälp av PCR-cyklingsparameterna i avsnitt 8 nedan. Anmärkning: För specifik termocykelinformation, se tillverkarens användarmanual. Termocykeln ska kalibreras i enlighet med reglerna för ackreditering från ASHI (American Society of Histocompatibility and Immunogenetics) eller EFI (European Federation of Immunogenetics). Gelelektroforesreagens (agaros, 0,5x TBE, 1 000 bp DNA-molekylviktmarkör, 10 mg/ml etidiumbromid). Gelelektroforesutrustning (geltankar, strömförsörjning, geldokumentationssystem med UV-transilluminator). Programvara för att hjälpa till i den manuella analysen av SSPGo kit testresultat och arkiv datalagring kan laddas ner från Biofortuna webbplats www.biofortuna.com. Anmärkning: ändringar i de specificerade tillstånden, som termocykelns ramptakt, kan påverka tolkningen av testresultatet. 6. Säkerhetsföreskrifter För diagnostisk användning in vitro. Analyser får endast utföras av lämpligt utbildad personal. Alla typningsresultat ska verifieras av fackkunnig personal och om resultaten ska användas för kliniska beslut ska de konfirmeras med en annan typningsmetod. Alla reagens ska hanteras i enlighet med god laboratoriesed. Håll områdena för pre- och post-pcr åtskilda. Material som genomgått post-pcr får inte återföras till området för pre-pcr. Biologisk risk: Hantera alla blodprodukter som potentiellt smittfarliga.
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 3 av 12 Biologisk risk: Etidiumbromid är ett potentiellt karcinogent ämne. Vid användning av detta ämne ska alltid skyddshandskar, laboratorierock och skyddsglasögon användas. Biologisk risk: Var försiktig vid användning av UV-källor använd alltid skyddshandskar, laboratorierock och skyddsglasögon. Titta aldrig direkt på UV-ljuset. Säkerhetsdatablad (MSDS) finns tillgängliga från www.biofortuna.com. 7. Förvaring och stabilitet Förpackningarna till Biofortuna SSPGo ska förvaras i 2-28 C. När PCR-brunnarna har tagits fram ur foliepåsarna ska reagensen rehydreras med DNA inom 3 timmar. Se sista förbrukningsdag på förpackningen. Använd inte produkterna efter den sista förbrukningsdag som finns tryckt på förpackningen. Använd inte förpackningarna om foliepåsen har revor eller hål eller om det inte finns någon torkmedelspåse där. Använd endast förseglingsarken eller locken som medföljer för att se till att PCR-brunnarna förseglas ordentligt efter att DNA tillsatts, annars kan avdunstning förekomma under PCR-amplifieringen. Var särskilt noga med kanter och hörn. Anmärkning (1): Vid behov kan de icke -hydratiserade PCR-plattorna och -stripsen hållas utanför påsen upp till 3 timmar innan man tillsätter DNA vid en temperatur på upp till 21 o C och luftfuktighet som inte överstiger 60%. Anmärkning (2): När de har hydratiserats med DNA kan PCR-strips och -plattor från nyöppnade påsar lagras upp till 24 timmar vid 2-8 C innan PCR-steget, förutsatt att brunnarna är väl förseglade för att undvika avdunstning. 8. Anvisningar för användning Krav för DNA-prover Varje reaktion i analysen har optimerats för användning av mellan 50 och 100 ng DNA, men det är mycket viktigt att varje reaktion rehydreras med exakt 10 µl vätska. Därför kan analysen utföras med 10 µl DNA vid 5 till 10 ng/µl. Spä endast ut DNA:t till erforderlig koncentration i sterilt vatten för molekylär användning. Försiktighet: Se till att det slutliga DNA-provet inte innehåller mer än 2,5 mm Tris/0,25 mm EDTA. Använd endast DNA extraherad från citrat- och EDTA-insamlade prov. Eftersom heparin kan hämma PCR bör DNA inte extraheras från hepariniserade blodprover. Hemoglobin har visat sig störa SSPGo HLA kits när det återfinns i DNA-prov med en högre koncentration än 1 mg/dl. DNA kan extraheras med hjälp av alla traditionella extraktionsmetoder. Se till att DNA-provets OD 260/280 ligger inom 1,66 och 1,94 enligt mätning med UV-spektrofotometri. Anvisningar för pre-pcr i. Ta fram en SSPGo-platta eller -strip ur en förseglad påse. ii. Anteckna analysens produktlotnummer. iii. Se till att alla frystorkade pelletar (PCR-reagens) ligger i botten av plattans/rörets brunn innan du tar bort förseglingen eller locket. Om inte, knacka lätt för att få ner pelletarna till botten av röret. Observera att den första reaktionen för varje testlokus alltid är ljusrosa till skillnad från resten av förpackningen. (Röd om den är hydratiserad). Vissa PCR-plattor innehåller en lilafärgad obligatorisk NTC-reaktion ("No Template Control", kontroll utan mall) i plattans sista brunn. iv. Använd steril utrustning och pipettera 10 µl DNA-lösning till varje reaktion på plattan eller stripen. Se informationen i avsnitt 8 om krav för DNA-prover. Om plattan innehåller en lilafärgad obligatorisk NTCreaktion ska 10 µl provspädningsvätska (utan DNA) pipetteras till den. Se anmärkningen om NTC i avsnitt 8. v. Se till att DNA-lösningen har kontakt med de torra reagensen i varje reaktion före termocyklingen.
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 4 av 12 vi. vii. viii. Försegla reaktionerna med förseglingsarket eller de medföljande locken för PCR-rör. Se till att förseglingen sluter så tätt som möjligt för att förhindra avdunstning. Var särskilt noga med kanter och hörn. Placera plattan eller stripsen direkt i termocykeln. Se till att kärlen har förts in helt och hållet i blocket och att locket är fullständigt komprimerat. Annars kan enskilda PCR-fel uppstå på grund av PCR-avdunstning och kondensering. Kör PCR-programmet (se PCR-parametrar). ANMÄRKNING OM RESUSPENDERING: När PCR-brunnar tas ur foliepåsarna ska reagenserna rehydreras med DNA omedelbart. Se anmärkning (1) och anmärkning (2) för ytterligare information. ANMÄRKNING OM NTC: Vissa förpackningar innehåller en NTC (kontroll utan mall) som sista reaktion på plattan. Denna reaktion innehåller ett lila färgämne för att särskilja den från de övriga reaktionerna. NTC:n är utformad för att detektera PCR-kontaminering med genomiskt DNA som kan förekomma i vattnet som används för att resuspendera ditt DNA. Om det förekommer PCR-kontaminering kommer amplikoner av varierande storlek att observeras.. ANMÄRKNING OM PCR-PLATTANS/-STRIPSENS HÖJD: Plattorna och stripsen bör vara lika höga om de placeras i samma PCR-maskin. Olika höjd kan orsaka dålig kontakt med PCR-maskinens värmelock. Detta kan leda till dålig eller utebliven PCR-amplifiering. PCR-parametrar Följande PCR-parametrar ska användas. Se till att ramphastigheten är 1 C per sekund och aktivera värmelocket. Läs tillverkarens användarmanual för termocykeln för att få en fullständig handhavandebeskrivning. Termocyklar ska kalibreras i enlighet med reglerna för ackreditering från American Society of Histocompatibility and Immunogenetics (ASHI) eller European Federation of Immunogenetics (EFI). Denaturering 94 C 5 minuter Denaturering 96 C 15 sekunder Bindning 66 C 50 sekunder 10 cykler Förlängning 72 C 30 sekunder Denaturering 96 C 15 sekunder Bindning 64 C 50 sekunder 20 cykler Förlängning 72 C 30 sekunder HÅLLTEMPERATUR vid 15 C under maximalt 72 timmar innan man kör gelerna. Vid behov kan PCRplattan lagras vid 2-8 C i upp till 24 timmar innan man kör gelerna. Se alltid till att plattorna är väl förseglade. Gelelektrofores Dessa anvisningar gäller horisontell agarosgelelektrofores: Bered en 2-procentig agarosgel i 0,5x TBE-buffert. När gelen har svalnat till cirka 60 C ska etidiumbromid tillsättas så att den slutliga koncentrationen blir 0,5 µg/ml. Härda gelen och sätt i mikrotiterkammar (t.ex. 12 x 8 brunnar med 9 mm mellanrum). När gelen har stelnat ska kammarna tas ur och gelen täckas med 0,5x TBE-buffert. Ladda hela PCR-produkten i sekvens på den 2-procentiga agarosgelen och notera positionen för varje reaktion. En stege på 1000 bp rekommenderas som hjälp vid storleksbestämningen. Kör gelen i 20 minuter vid 10 V/cm. Se tillverkarens bruksanvisning till elektroforessystemet för särskild information som gäller utrustningen. Gelerna ska avbildas med ett UV-geldokumentationssystem med UV-transilluminator.
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 5 av 12 Anmärkning: Otillräcklig elektrofores kan leda till att stora amplikoner över 600 bp går samman med kontrollamplikon. Se till att elektroforesen är tillräcklig för att visualisera sådana amplikoner. För lång elektrofores kan resultera i att man förlorar små amplikoner i föregående brunnar på en gel. 9. Tolkning SSPGo-förpackningarna är utformade så att resultaten kan bestämmas manuellt med hjälp av tolkningstabeller som finns tillgängliga från www.biofortuna.com. Kontakta er lokala distributör om det inte går att öppna webbplatsen. Tolkningstabellerna kan innehåller lotspecifika anmärkningar som kan vara relevanta för tolkningen. Fäst gelfotografiet på motsvarande tolkningsformulär genom att matcha förpackningens nummer och lotnummer. Undersök gelbilden. Varje reaktion ska innehålla ett positivt kontrollband. Se tolkningstabellerna eftersom det kan vara olika storlekar i olika SSPGo-produkter. Interna kontrollband kan synas mycket svagare vid förekomst av allelspecifika band. Om ett allelspecifikt band förekommer men inget kontrollband, ska det ändå betraktas som ett positivt resultat. Ignorera alla band som är kortare än 70 bp eftersom dessa är primrar som inte omfattas. Bestäm de positiva reaktionerna. Positiva reaktioner indikeras av band i den förväntade storlek som anges i tolkningstabellerna. Tänk på att det kan finnas fler än en produktstorlek i en viss reaktion, dessa är multiplexa reaktioner och finns angivna i tolkningstabellerna. Jämför de positiva reaktionerna med tolkningstabellerna. Ett positivt resultat i en reaktion visar på förekomst av minst en av de angivna allelerna i tolkningstabellen. Alla angivna alleler kan amplifieras i flera rör. Om allelen finns i reaktionen ska det vara en positiv reaktion i alla relevanta reaktioner. Kontrollband Allelspecifikt band Elektroforesens riktning Fig. 1: Exempel på positiva reaktioner som indikeras av förekomst av allelspecifika band och kontrollband (reaktion 13), negativa reaktioner som indikeras av förekomst av kontrollband men inga allelspecifika band (reaktion 4-7) och en misslyckad reaktion som indikeras av att det inte finns några band alls (reaktion 8). Se till att förpackningens lotnummer stämmer överens med lotnumret i tolkningstabellen. Programvara för att hjälpa till i den manuella analysen av SSPGo kit testresultat och arkiv datalagring kan laddas ner från Biofortuna webbplats www.biofortuna.com. 10. Kvalitetssäkring och kvalitetskontroll Varje lot av SSPGo genomgår en kvalitetskontroll innan produkten lämnar Biofortuna. Prover från varje förpackningslot kontrolleras mot en definierad panel med humana DNA-prover för att säkerställa att produkten fungerar korrekt. Varje reaktion har validerats mot minst 47 DNA-prover med väl karaktäriserade cellinjer. Biofortuna rekommenderar att alla laboratorier validerar alla nya typningsprodukter internt innan de används på kliniska prover. Endast fackkunnig personal med genomförd utbildning får utföra diagnostisk typning och resultaten ska kontrolleras av ytterligare en utbildad person på laboratoriet. 11. Kliniska data En diagnostisk in vitro-enhetsstudie utfördes vid fem testcentrer, och den jämförde prestandan hos SSPGo HLA Typing Kits med enheten som den är baserad på, "One Lambda" Labtype SSO. Lokustypningen som slutfördes för SSPGo-testet gav testresultat för HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPB1, DPA1 och HLA-DQA1*05, DQB1*02, DQ8.
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 6 av 12 Den kliniska prestandan hos SSPGo HLA Typing Kits gav en total 98.3-100% överensstämmelse med enheten den är baserad på (SSO-metoden) med inte mindre än 95% tillförlitlighet för genotypning klass I och II HLA-alleler testade från DNA erhållen från helblod vid 5-10ng/μl. Förutom tre (3) bekräftade icke-överensstämmande genotypningsresultat, uppnåddes 100% överensstämmelse för 1222 prov för 3 lots för varje testpaket över kliniska testplatser i USA och Storbritannien. Plats-till-plats-reproducerbarhet för SSPGo HLA Typing kits utfördes av tre platser med hjälp av en representativ panel med 8 SSPGo PCR-reaktioner mot medföljande DNA-prov formulerade vid 4ng/μl och 11ng/μl, ytterligheterna inom testpaketets koncentrationsområde. Totalt 958/960 individuella reaktioner distribuerade jämnt över tre externa platser överensstämde med DNA-prov, vilket resulterade i en total överensstämmelse på 99,7% (0,995 LCL). Plats-plats-reproducerbarhet utfördes på tre lots från ett representativt SSPGo HLA Test kit av en enskild plats/operatör med DNA-koncentrationsintervallet 5-10 ng/μl. Plats-till-plats-reproducerbarhet för SSPGo HLA Typetestning hade 100% överensstämmelse med enheten som den är baserad på för 130/130 DNA-prov testade över tre (3) lots med de representativa SSPGo HLA Type-testerna för totalt 390 tester. Överensstämmande positiv SSPGo HLA-verifiering uppnåddes för klass I- och klass II-alleler vid jämförande testning med LABType SSO-testade kliniska prov. SSPGo HLA-intern testning gav resultat som överensstämde med referens- DNA-prov förutom för otillgängliga prov, som vissa ovanliga HLA-DPB1-alleler och ovanliga HLA-B-alleler och allelgrupper som B*59:01, B*78 och B*83:01. Följande ovanliga allelgrupper bekräftades inte. B*59, B*78, B*83, DPB*21:01, DPB*26:01:02, DPB*27:01, DPB*28:01, DPB*29:01, DPB*31:01, DPB*34:01, DPB*35:01:01, DPB*39:01, DPB*45:1, DPB*46:01, DPB*51:01, DPB*55:01, DPB*59:01, DPB*63:01, DPB*81:01, DPB*85:01 & DPB*105:01 12. Referenser 1) Bunce M et al Tissue Antigens. 1995 Nov;46(5):355-67. 2) Saiki RK et al. Nature. 1986 Nov 13-19;324(6093):163-6.
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 7 av 12 13. Felsökningsguide för SSPGo Problem Sannolik orsak Åtgärd Ingen amplifiering i någon reaktion Den använda DNA-koncentrationen är inte korrekt Mät mängden DNA genom att mäta vid OD 280 och se till att totalt 50-100 ng DNA har tillsatts i en volym om 10 µl per reaktion. PCR-hämmare förekommer i DNA-provet Använd inte hepariniserat blod, undvik DNA-prov som innehåller mer än 1 mg/dl hemoglobin. Det använda DNA-provet har dålig kvalitet Mät DNA-kvaliteten. Förhållandet OD 260/280 ska vara 1,66-1,94 med UV-spektrofotometri. Se till att DNA:t har resuspenderats fullständigt i lösningen före användning. Reagensen har inte resuspenderats fullständigt Termocykeln har inte konfigurerats på rätt sätt Se till att DNA-provet späddes ut i vatten för molekylär användning och inte innehåller mer än 2,5 mm Tris/0,25 mm EDTA Se till att pelletarna har rehydrerats ordentligt när DNA tillsätts. Se till att 10 µl DNA-lösning används per reaktion. Se till att PCR-programmet har angivits korrekt och i enlighet med bruksanvisningen. Se till att termocykelns värmelock har hakat i ordentligt och slutit tillräckligt tätt. Problem med elektroforesen Se bruksanvisningen till termocykeln för ytterligare vägledning. Se till att elektroforestanken har ström. Kontrollera strömförsörjningsdelen och rengör elektroderna. Kör gelen i 0,5X TBE-buffert. Se till att 0,5 µg/ml ny etidiumbromid används. Kontrollera att UV-ljuset är tillräckligt starkt när gelerna avbildas. Plattorna har inte förseglats på rätt sätt Se tillverkarens bruksanvisningar till geltanken och strömförsörjningsdelen för ytterligare vägledning. Otillräckligt förseglade plattor kan leda till avdunstning under PCR. Biofortuna tillhandahåller rekommenderade förseglingsark. För ytterligare material, kontakta din distributör) Se till att förseglingen är tillräcklig över alla brunnar. Var särskilt noga med brunnarna nära PCR-plattans eller stripens kanter.
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 8 av 12 Problem Sannolik orsak Åtgärd Slumpmässiga bortfall av kontroll- och/eller allelspecifika amplikoner Gelfel Se till att alla brunnar har placerats på gelen i rätt följd och att samma volym PCR-reaktion har tillsatts till var och en av brunnarna. Kalibrera pipetterna i enlighet med tillverkarens anvisningar. Kontrollera att brunnarna har formats korrekt i gelen. Var försiktig när kammarna tas bort eftersom det finns risk att brunnarnas botten går sönder. Se till att agarosen har lösts upp fullständigt innan gelen härdas. Se till att gelen inte körs för länge eftersom mindre amplikoner kan rinna av från kanten. Se till att gelen körs tillräckligt länge så att banden hinner separeras. Problem med termocykeln Använd ny etidiumbromidlösning. Fel, särskilt runt analysens kanter, kan bero på att locket inte sluter ordentligt tätt. Det kan leda till att PCRreaktionen avdunstar och kondenserar halvvägs upp i PCR-brunnen, vilket i sin tur kan leda till PCR-fel. Var noga med att följa tillverkarens anvisningar för underhåll och kalibrering av termocykeln. Avdunstningsproblem Sporadiska fel på grund av DNA-problem Kontrollera att PCR-parametrarna är korrekta i enlighet med bruksanvisningen. Se till att förseglingen är tillräcklig över alla brunnar. Var särskilt noga med brunnarna nära PCR-plattans eller stripens kanter. Se till att värmelocket är aktiverat och att tillräcklig kompression anbringas via locket. Se till att Biofortuna förseglingsark (medföljer) används. För ytterligare material, kontakta din distributör) Inget DNA: Se till att det finns DNA i alla brunnar. Felaktig volym: Se till att 10 µl DNA-lösning läggs till per reaktion. För mycket tillsatt DNA: Koncentrationer över 200 ng eller mindre än 20 ng kan orsaka PCR-fel. Kontaminanter i DNA:t kan leda till sporadiska eller utbredda problem med amplifieringen. Suddig gelbild DNA Kontrollera DNA:ts koncentration och renhet. Om för
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 9 av 12 Problem Sannolik orsak Åtgärd mycket DNA tillsätts till PCR-reaktionerna kan det leda till suddiga gelbilder. Svag amplifiering Problem med DNAkoncentrationen Degraderad eller låg renhet kan vara orsaken. Anskaffa ett färskt prov med DNA Se till att DNA-koncentrationen varken är för hög eller för låg. Sikta på 50-100 ng DNA per reaktion, i 10 µl. Icke-specifik amplifiering Amplifieringsmönstret går inte att tolka Problem med termocykeln Gelfel Problem med DNAkoncentrationen Reaktionerna kommer i fel ordning Nya alleler har identifierats Inkorrekt tolkning av en artefakt som ett specifikt band Var noga med att följa tillverkarens anvisningar för underhåll och kalibrering av termocykeln. Kontrollera att PCR-parametrarna är korrekta i enlighet med bruksanvisningen. Se till att samma volym av reaktionen har tillsatts i alla brunnar, mellan 5 µl och 10 µl. Kalibrera pipetterna i enlighet med tillverkarens anvisningar. Använd ny etidiumbromidlösning. Se till att DNA-koncentrationen varken är för hög eller för låg. Sikta på mellan 50 och 100 ng DNA per reaktion, i 10 µl. Kontrollera inpassningen av PCR- och gelbanorna. Förhindra att innehållet från intilliggande brunnar flödar över i elektroforesen genom att inte överfylla brunnarna och se till att gelen har stelnat innan kammarna avlägsnas. Tidigare icke-sekvenserade alleler kan förekomma och uppvisa ett nytt amplifieringsmönster. Vid användning av gamla tolkningsformulär ska en mer aktuell inpassningsuppdatering laddas ned från www.biofortuna.com. Om denna inte tillgodoser det nya mönstret ska detta kontrolleras med en annan Biofortuna-förpackning eller så ska sekvensen identifieras med sekvensbaserad typbestämning. Kontrollera de specifika tolkningstabellerna för den korrekta bandstorleken. Reaktionerna kommer i fel ordning Enskilda PCR-fel Kontrollera att alla specifika amplifieringar har rätt storlek eller om det är så att en artefakt (överföring mellan prover, primerdimer) har misstolkats som en amplifiering. Kontrollera inpassningen av PCR- och gelbanorna. Kontrollera att alla interna positiva kontroller syns. Gör en ny tolkning utan eventuellt uteblivna reaktioner.
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 10 av 12 Problem Sannolik orsak Åtgärd Små amplikoner saknas Elektroforesen var för lång, små amplikoner har runnit av gelkanten eller förbi etidiumbromidfronten, eller så har de lösts upp genom att gå in i föregående gelbrunn. Tillämpa elektroforesförhållanden som är lämpliga för gelsystemet. Ny allel har identifierats i provet Ibland kan nya alleler upptäckas, vilket kan ge ett amplifieringsmönster som inte motsvarar någon av de befintliga allelerna. Kontakta er lokala distributör för ytterligare information.
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 11 av 12 14. Revisionshistoria Revision: Från version 4 till revision 5 Revisionsdatum: 21 januari 2014 Avsnitt Avsnitt 4: Förpackningens innehåll Avsnitt 5: Reagens och utrustning som inte medföljer Revisionsbeskrivning Tillägg av plattförseglingar inom paket Uppdaterade specifikationer för termocykel för 96 brunnar Förvaringsvillkor uppdaterades till 2-28 o C Hantering av icke-hydratiserade PCR-plattor och strips Hantering av hydratiserade PCR-plattor och strips Avsnitt 8: Anvisningar för användning Utspädning av DNA i sterilt vatten för molekylär användning Tillägg till störande substanser och uppdatering av riktlinjerna för DNA-renhet Uppdaterade OD 260/280 -mått Tillägg med positionen för frystorkade pellets innan provet läggs till Tillägg med förstärkta produktlagringsvillkor Tillägg med anmärkning angående gelelektroforestider Avsnitt 9: Tolkning Kommentar angående batchspecifika anmärkningar Förpackningens lotnummer ska stämma överens med lotnumret i tolkningstabellen. Avsnitt 11: Kliniska data Avsnitt 14: Revisionshistoria Hela detta avsnitt lades till Hela detta avsnitt lades till
DOT119v8: Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE revision 5 Sida 12 av 12 15. Symbolförklaring X P i M V H 4: s 28 : g Antal tester EG-represantant Läs bruksanvisningen Tillverkningsplats In vitro-diagnostik Sista förbrukningsdag Förvaringstemperatur Lotnummer Distribuerad av Global Trade Item Number 16. Tillverkarens kontaktinformation Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough, CH62 3RJ, UK Tel: +44 (0) 151 334 0182 E-post: info@biofortuna.com Webb: www.biofortuna.com 17. Översättningar Français: Deutsch: Español: Italiano: České: Danske: Έλληνες: Magyar: Norsk: Polska: Português: Россию: Slovenskému: Türk: Svenska: Traductions disponibles Übersetzungen verfügbar Traducciones disponibles Traduzioni disponibili Překlady k dispozici Tilgængelige oversættelser διαθέσιμες μεταφράσεις Fordítások Oversettelser tilgjengelig Dostępne tłumaczenia Traduções disponíveis Переводы доступны Preklady k dispozícii Çeviriler mevcut Översättningar tillgängliga www.biofortuna.com