Exam in Molecular Biotechnology (BB1060/3A1503), Tuesday 16/12, 2008, 14:00-18:00h.

Transkript

1 Exam in Molecular Biotechnology (BB1060/3A1503), Tuesday 16/12, 2008, 14:00-18:00h. All answers should be brief! Max 80p, Pass 40p. Write your name on all papers. State the relevant course code. Include your address on the cover, so that you can receive your result by For cultivation of cells, one can use either minimal media or rich media. What is the difference between the two media types (2p) and what are the advantages and disadvantages of these media types? (3p) 2. What is the difference between selection and screening of bacterial clones, and give a very brief description of common two screening strategies that are based on completely different principles. (4p) 3. During cloning of DNA-fragments into plasmids, one sometimes experience problems with so called re-ligated plasmids (this means that the bacterial clones will only contain empty plasmids). To reduce this problem, one can treat the plasmid with phosphatase before the ligation step. Briefly explain why this strategy helps and also how it come that a DNA-fragment still can be ligated into the vector after such a treatment. (4p) 4. For recombinant protein expression, it is desirable to use inducible promoter systems; an often used such system is the so called T7-system. Explan why this system is so popular. (3p) 5. E. coli is a popular host organsim for recombinant protein production. When the target protein contains several (tree or more) disulfide bridges, the expressed protein often ends up in an inactive form. Why is that so, and how can one go about to reduce this typ of problem? (4p) 6. Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris are two commonly used hosts for protein expression. What are the advantages and disadvantages with the two systems? (4p) 7. What is the prncipal difference between solid-phase pyrosequencing and liquidphase pyrosequencing (besides the obvious difference that one takes plase in liquid phase and the other an a solid phase) (2p) 8. Describe a method that enables DNA-diagnosis of a disease caused by a pointmutation in a gene. (4p) 9. Within the field of protein folding, the term molten globule is often used. What are the characteristics of a molten globule? (4p). 10. Your colleague has during her diploma work cloned a human gene in the form of cdna for protein production in E. coli. SDS-PAGE analysis shows very small

2 amounts of full-length recombinant protein. She is bewildered and cannot come up with any good theory that would explain the reasons for the low productivity. She asks you for help. You decide to analyze the gene sequence (cdna) in more detail and thereby identify the following region that you think is the cause for the low production: 5...ggcggtataaggaggaggggc...3 How would you explain the low amounts of full-length protein? It should be clear how you have reasoned. (4p) The reading frame for the given sequence is nr 1. A chart over codon usage is attached (see last page) You have been asked to make a plasmid map in which the positions for the restrictions sites BamHI and HindIII has to be you are supposed to mark the Du har fått i uppdrag att göra en plasmidkarta i vilken du skall markera positionen/erna för restriktionssiten BamHI och HindIII. Du har gjort i ordning tre stycken separata klyvningsreaktioner som du sedan kontrollerar på agarosgel. I första brunnen på agarosgelen har du endast klyvt plasmiden med HindIII och fick då två band, 1800 bp samt 1600 bp. I andra brunnen laddade du plasmid klyvd med BamHI och fick då endast en 1700 bp lång klyvningsprodukt. I tredje brunnen har du laddat plasmid klyvd samtidigt med både BamHI och HindIII, vilket gav upphov till följande fragmentstorlekar: 1400 bp, 1300 bp, 400 bp samt 300 bp. Rita upp en schematisk bild över plasmiden och placera ut positionen för var de olika restriktionssiten sitter, samt ange även plasmidstorleken. (4p) 12. Monoclonal antibodies are mportant diagnostic and therapeutic tools. Sometimes it is desirable to use so called humanized antibodies. Whay is that so, and what is the difference between such antibodies and more conventional monoclonal antibodies? (4p) 13. What are the advantages of using air lift columns (reactors) instead of stirred tank reactors? (3p) 14. RNA-interference (RNAi) is an important mechanism for regulation of gene expression. Describe (briefly) the RNAi-mechansim. (4p) 15. Agrobacterium tumefaciens can infect plants. This bacterium has a naturally occurring so-called Ti-plasmid, which they use in this process. Briefly describe the function of the different gene regions in such a Ti-plasmid. (4p) 16. Toxins from Bacillus thuringiensis are the most commoly used microbial insectisides. However, their use is somewhat hampered due to certain properties inherent to the toxin. Briefly discuss these limitations. (3p) 17. Functional SNPs have impact on several different levels. Give at least four examples of molecular properties/mechanisms that may be affected by SNPs. (4p) 18. What is a naked DNA-vaccine? (2p) Why are these modern vaccines such an attractive alternative to traditional vaccines? (2p)

3 19. Describe how one can use embryonic stem cells to establish a transgenic mouse. Your description should brief but contain all important steps. How is a knock-ot mouse constructed? (4p) 20. Describe the principle behind cdna-microarray analysis, and how this method can be used to analyze the trancsription level of genes in two different tissues, for example normal and cancer tissue. (4p) 21. 2D-PAGE is commolnly used as an analytical tool within the proteomic field. What are the advantages and disadvantages with this method? (4p)

4 Exam in Molecular Biotechnology (3A1503/BB1060), Monday 17/12, 2007, 14:00-18:00h. All answers should be brief! Max 73 p, Pass 36.5 p. Write your name on all papers. State the relevant course code. Include your address on the cover, so that you can receive your result by What is the difference between a primary cell culture and an established cell line? (2p) 2. What is a dideoxynucleotide? (1p) What are they used for and why? (2p) 3. There are several systems available for cloning of DNA-fragments. Two relatively similar ones are the λ-system and cosmids. Briefly describe the principal differences between the two systems, and justify which one you think is the best. (3p) 4. E. coli is an often used host organism for recombinant protein production. When the target protein contain several/many disulfide bridges (w. a complex bonding pattern), it is not uncommon that the produced protein is inactive. Why is that so? Propose some preventative measures for this type of problem. (4p) 5. It is simple synthesize (chemical synthesis of DNA) short DNA sequences (up to around 100 bp), but for longer fragments it works bad. If you want to synthesize a long gene, 1,000 bp long, using chemical synthesis you have to use some tricks. How can you do this? (3p) 6. Briefly describe the principles for how ribosomal display can be used as a tool in combinatorial protein engineering for production of affinity reagents. All important components/steps should be included. (5p) 7. What allows RNA-polymerase to recognize different promoters? (2p) How is the promoter strength regulated? (2p) 8. What is an inclusion body? What is the problem with inclusion bodies and can they be of any benefit? (4p) 9. Differences in codon usage may give rise to certain problems when a human protein, encoded from a cdna, is expressed in a prokaryot (E. coli). What type of problems may occur? (2p) Propose some measures to minimize these effects. (2) 10. Describe, by help of drawing, how a Molecular beacon probe can detect the presence of a certain DNA sequence in a sample. (3p) 11. What type of problems/difficulties are associated with the usage of traditional vaccines (in the form of killed pathogenic organisms). (3p)

5 12. Establish a mathematical model that describes the cell growth in a batch culture. You do not need to take cell death into account. Name all parameters using correct SI-units. (2p) Illustrate how the growth curve can look like in reality and describe the different regions. (2p) 13. Briefly describe a method that allows a drug to exercise its mode of action only in (or mainly) the cell type it is designed for. (2p) 14. For genotyping of SNPs it is common to perform real-time PCR using a Taqmanprobe. Briefly decscribe the principles behind this method. (3p) 15. Within the field of human molecular genetics, there is a term called Lod score (or Z score ). What does it mean and how is it used? (3p) 16. In the procedure of establishing transgenic animals, viral vectors (retrovirus or lentivirus) can be used for one important step. Why can it be advantageous to use lentivirus instead of retrovirus? (1p) What are the other general advantages and disadvantages of using lentivirus for delivery of transgenes? (3p) 17. Usage of herbicides in agriculture has traditionally been considered leading to large negative environmental effects; due to the release of large quantities of chemicals in the environment, and also because genetically modified (herbicide resistant) plants are used. However, this view is now changing since it has been found that the combination of herbicides and herbicide resistant crops allow for tillage free agriculture. Describe the advantages, from an environmental point of view, with this technology. (3p) 18. Baculovirus can be used as an insecticide. Based on its mode of action, discuss potential advantages and disadvantages with this type of insecticide. (4p) 19. In genome sequencing projects, it is common to sequence shorter DNAfragments. A very important part in such a project is to assamble all sequence reads into the full genome sequence. This is not a trivial task at all (especially not for higher eukaryots)! Why is that so? (3p) 20. Based on their abundancy, the individual transcripts of a transcriptome (human) can be devided among three different categories; low, intermediate and high abundant. How large part of the transcriptome belong each of the three categories? (2p) Based on this, discuss some of the challenges that one faces in the context of transcriptome analysis. (2p) 21. You shall analyze and compare the protein composition of two samples. Give two examples of methods that allow you to do so in just one experiment. Briefly describe how one of the methods work. (5p)

6 Exam in Molekylär bioteknik (3A1503), Wednesday 13/12-06, 14:00-18:00h. All answers should be brief! Max 78p, Pass 39p. Write your name on all papers. Include your address on the cover, so that you can receive your result by Where in a cell does the transcription take place for a) eukaryotes and b) prokaryotes? (2p) 2. What is an operon? (2p) Why can it be beneficial to have such an organization? (2p) 3. Explain how a YAC-based cloning system works. (4p) 4. Briefly describe, in words and with a figure, the principle behind pyrosequencing. It should be clear what function/purpose all the important components have. (4p) 5. You have isolated and purified a small quantity of a heat stable lipase (an enzyme that attacks fatty acids) from a novel thermophile bacterium. You would like to clone the gene, encoding the said lipase, in E. coli because you have realized that the lipase would be of great use as an additive in laundry detergent. If you succeed, there is a great chance to earn big money if you sell the gene to Procter & Gamble. However, there are some obstacles. You don t know the gene sequence (the genome has never been sequenced since the bacterium was recently discovered). Moreover, unfortunately there is no good/easy way available to screen for lipase activity directly (such as a colorimetric assay for example). Describe and motivate how you anyway would go about to clone and isolate an E. coli colony that harbors the precious lipase gene. (5p) 6. Prokaryotic cells that are used for recombinant protein production are often exposed to a high metabolic pressure which, for example, is manifested as decreased growth rate, changed morphology, and more. State three reasonable causes behind this pressure and suggest actions to minimize the problem. (3p) 7. In recombinant protein production one can choose to produce the protein in the cytoplasm or having it secreted to the periplasm. What are the benefits with periplasmic production? (3p) 8. Give two common reasons for why it sometimes is impossible to produce a mammalian protein in an active form in bacteria even though the DNA sequence is correct. (2p) 9. Translation initiation efficiency depends on several factors. Briefly describe these factors and how they function in this context. (3p)

7 10. A researcher is planning a project in which she wants to create a peptide library, six amino acids long, from which she, by means of phage display, will select for peptides that bind a target of interest. She decides to use the degenerate codon C(A/G)(C/A/G/T) in all six positions that represent the randomized region of the displayed peptide. Which amino acids does the degenerate codon encode? What is the maximum theoretical number of peptide variants in the library? (4p) 11. You are running a PCR-based diagnostic detection method and unfortunately you get false positives. How can that be? Give two reasonable explanations, with practical examples, for this behavior. (4p) 12. Briefly describe the principle for how a non-pathogenic organism (ex. virus) can be used as a carrier in vaccination technologies and why this is such an interesting strategy. (5p) 13. Describe mathematically how the growth-rate for a microorganism depends on the substrate concentration (2p), and explain/interpret this dependency at a molecular/cellular level. (1p) 14. In the field of gene therapy, ribonucleic acids are sometimes used as therapeutics. Describe three different ways of action for these therapeutic nucleic acids. (3p) 15. Why are specific sets of SNPs overrepresented in certain populations? (2p) 16. You are constructing a knock-out mouse but only get pups (off-spring) that are heterozygot with respect to the knock-out gene. Explain this phenomenon and also propose how this problem may be solved. (4p) 17. When performing chromosome analysis (for example karyotyping) it is common to do a giemsa stain. This technique is now often replaced by a more modern method. Which method is it and why is it so popular? (4p) 18. Genetically modified plants are becoming increasingly more common. As a strategy to protect them against pests such as insects, the plant can be modified to express a bacterial toxin that acts on the insects. What are the advantages of expressing such a toxin in chloroplasts as compared to the cytoplasm of the plant cells? (3p) 19. Briefly describe the technique for achieving transient protein expression in plants and what the advantages are with this method compared to transgenic plants. (4p) 20. What are the technical difficulties with sequencing whole genomes for higher eukaryotic organisms and why is it difficult to find gene sequences (protein coding) in the chromosomal sequences? (4p)

8 21. Microarray analysis may be used for studying many different phenomena that can be grouped into three different areas. Which are these areas? (3p) 22. Within the field of proteomics one of the tasks is to map what proteins a cell/tissue express and how the corresponding protein concentrations differ depending on the specific circumstances. Briefly describe the, up to this day, most common strategy for this purpose. (5p)

9 Exam for Molekylär bioteknik (3A1503/3A1510), Wednesday 14/ , Maxpoints = 76p Minimum to pass = 38p Give short and concise answers! Write with clear handwriting! N.B.! Write your name on all answering papers! N.B.! 1. What does it mean that the genetic code is degenerated? (1p) 2. Name three types of vectors for cloning of large DNA-fragments, and give the approximate size of the fragments that can be cloned into them. (3p) 3. Name four principally different types of enzymes used to manipulate DNAmolecules, and explain their functions. (2p) 4. What is the natural function of restriction enzymes in a bacterial cell? (2p) 5. Bacteria are the most common host cells used for recombinant DNA work. Explain what are the advantages and disadvantages with these host cells compared to other cell types. (3p) 6. Name the four basic units of a bacterial expression vector, and describe their functions. (4p) 7. Describe how a typical negatively regulated prokaryote promoter works. (4p) 8. Suggest a few different strategies for increasing recombinant protein production in a bacterium. (3p) 9. Describe a general eucaryote expression vector (=plasmid): name the important basic units and describe their functions. A drawing is welcomed. (3p) 10. Name two advantages and one disadvantage for protein production in mammalian cells. (2p) 11. Some diseases are caused by a point mutation in a certain gene. Describe how you can perform a genotyping for an individual for such a gene, using PCR with fluorescently taged primers and utilizing primer mismatch for the detection of the point mutation. Use a figure to show how to do. (4p) 12. Describe how a forensic DNA analysis is performed by STR analysis. (3p)

10 13. Describe, using a figure, the two first cycles of a PCR. Start from one single double stranded DNA molecule as template. Indicate the 5 and 3 ends of all DNA strands including the primers. Indicate on the start molecule (template molecule) what part is copied and where the primers anneal. (5p) 14. What is a ribozyme? Describe how it can work as a medicine. (2p) 15. Describe briefly how filamentous phages can be used to produce antibodies, and describe how phages producing antibodies directed to the desired target protein can be screened for. (4p) 16. a) Explain briefly what is meant by subunit vaccine. (2p) b) Give two advantages with subunit vaccines (compared to traditional whole organism vaccines). (2p) 17. Describe the growth kinetics in a batch fermentation. Make a drawing and explain! (2p) 18. Describe, using a figure, the principle for gel electrophoresis of DNA fragments. (2p) 19. A two-hybrid system is a method for studying the interaction between proteins. Describe how a bacterial two-hybrid system works. (4p) 20. Name the three methods that are usually used to introduce DNA into mouse cells in the production of transgenic mice. (3p) 21. a) Which four large farm animals are most commonly used for transgenic production? (1p) b) What are transgenic farm animals used for? (2p) 22. Which two methods work best for transformation of plants? Describe briefly the two methods. (4p) 23. Explain with words, without calculations, what genetic linkage is. When can you be absolutely sure that two genes are not genetically linked? (3p) 24. In 2001, two articles, one in Science and one in Nature, were published the same week. The articles described how one association of academic research groups, and a commercial company, each had sequenced the human genome. Describe briefly the difference in the methods that the academic groups and the commercial company used for their respective sequence analyses. (3p) 25. In analysis of transcription levels using microarrays, the mrna is transformed to cdna as a part of the analysis. Why does one transform the mrna to cdna? Describe briefly how it is done. (3p)

11 Tentamen i Molekylär bioteknik (3A1503), tisdag 16/12-08, kl 14:00-18:00. Svara kortfattat!! Max 80p, godkänd 40p. Skriv namn på alla inlämnade blad! Ange även er adress på försättsbladet, så att jag kan maila er resultatet. 1. För cellodling kan man använda sig av två olika medietyper, nämligen minimal eller rikt medium. Vad är det för skillnad på de två medietyperna (2p) samt vad finns det för för- och nackdelar med dem? (3p) 2. Förklara den principiella skillnaden mellan selektion och screening av bakteriekloner, samt ge exempel (förklara kortfattat metoden) på två principiellt olika metoder för screening. (4p) 3. Vid kloning av DNA-fragment in i plasmid kan man ibland få problem med att de flesta bakteriekolonier endast innehåller återligerad plasmid, dvs saknar det önskade DNA-fragmentet. För att minska detta problem kan man fosfatasbehandla sin klyvna plasmid före ligeringssteget. Förklara kortfattat varför detta hjälper samt varför det fortfarande fungerar att ligera det önskade DNA-fragmentet. (4p) 4. I samband med rekombinant proteinproduktion kan det vara önskvärt med ett reglerbart promotorsystem; ett vanligt använt sådant är det s.k. T7-systemet. Förklara de bakomliggande orsakerna till varför detta system är så populärt. (3p) 5. E. coli är en vanligt använd värdorganism för rekombinant proteinproduktion. När målproteinet innehåller ett flertal/många disulfidbryggor (med komplex disulfidbindningsmönster) blir ofta det producerade proteinet inaktivt. Varför förhåller det sig så, samt ge några förslag på åtgärder som skulle kunna minska detta problem. (4p) 6. Saccharomyces cerevisiae och Pichia pastoris är två vanligt använda värdsystem för expression av proteiner. Vad finns det för för- och nackdelar med respektive system? (4p) 7. Vilken är den stora principiella skillnaden mellan fastfas-pyrosekvenering och vätskefas-pyrosekvenering (frånsett det att den ena sker på fast fas och den andra i vätska)? (2p) 8. Beskriv en metod (förtydliga gärna även med figur/er) som möjliggör DNAdiagnosticering av en sjukdom orsakad av en punktmutation i en gen. (4p) 9. För dem som är verksamma inom proteinveckningsfältet (protein folding) är begreppet molten globule välbekant. Vad kännetecknar en s.k. molten globule? (4p).

12 10. Din kollega har under sitt exjobb bl. a. klonat en eukaryot gen i form av cdna för proteinproduktion i E. coli. När hon med hjälp av en SDS-PAGE-gel analyserar produktionsnivån av det eukaryota målproteinet så visar det sig att hon fått mycket lite fullängdsprotein. Hon har spontant ingen bra förklaring till den låga produktiviteten och frågar därför dig om hjälp. Du bestämmer dig därför att analysera gensekvensen (cdnat) lite mer i detalj och identifierar följande region som du tror kan vara orsaken till problemet: 5...ggcggtataaggaggaggggc...3 Vad ger du för förklaring till den låga produktionsnivån? Det skall tydligt framgå hur du resonerat. Läsramen för givna sekvens är nr 1. (4p) Använd bifogad kodontabell som stöd. 11. Du har fått i uppdrag att göra en plasmidkarta i vilken du skall markera positionen/erna för restriktionssiten BamHI och HindIII. Du har gjort i ordning tre stycken separata klyvningsreaktioner som du sedan kontrollerar på agarosgel. I första brunnen på agarosgelen har du endast klyvt plasmiden med HindIII och fick då två band, 1800 bp samt 1600 bp. I andra brunnen laddade du plasmid klyvd med BamHI och fick då endast en 1700 bp lång klyvningsprodukt. I tredje brunnen har du laddat plasmid klyvd samtidigt med både BamHI och HindIII, vilket gav upphov till följande fragmentstorlekar: 1400 bp, 1300 bp, 400 bp samt 300 bp. Rita upp en schematisk bild över plasmiden och placera ut positionen för var de olika restriktionssiten sitter, samt ange även plasmidstorleken. (4p) 12. Monoklonala antikroppar är mkt viktiga diagnostiska och terapeutiska verktyg. Ibland är det önskvärt att använda sig av s.k. humanized antibodies. Varför då och vad är det som skiljer dessa antikroppar från mer konventionella monoklonala antikroppar? (4p) 13. Vilka är fördelarna med att använda bubbelkolonner jämfört med omrörda tankreaktorer? (3p) 14. RNA-interferens (RNAi) är en viktig mekanism som reglerar geners uttryck. Beskriv kortfattat RNAi-mekanismen. (4p) 15. Agrobacterium tumefaciens kan infektera växter. Denna bakterie bär naturligt på en s.k. Ti-plasmid som de utnyttjar i denna process. Beskriv kortfattat funktionen hos de olika genregionerna i en Ti-plasmid. (4p) 16. Toxiner från Bacillus thuringiensis är de vanligast använda mikrobiella insekticiderna. Nyttjandet av dessa begränsas dock pga vissa inneboende egenskaper/verkningssätt hos toxinerna. Diskutera dessa mkt kortfattat. (3p) 17. Funktionella SNPs kan ha verkan på ett flertal olika plan. Ge exempel på minst fyra olika molekylära egenskaper/mekanismer som kan påverkas av SNPs. (4p) 18. Vad menas med naket DNA-vaccin? (2p) Varför är dessa ett intressant alternativ till traditionella vacciner? (2p)

13 19. Beskriv hur man med hjälp av embryonala stamceller tillverkar (etablerar) en transgen mus. Förklara kortfattat men ta med alla principiellt viktiga steg. Hur gör man en knockout mus? (4p) 20. Beskriv principen (beskriv kortfattat, men hela proceduren med alla viktiga steg ska vara med) för hur man m.h.a. cdna-microarray-analys kan jämföra transkriptionsnivån av gener i två olika vävnader, t.ex. frisk vävnad och tumörvävnad. (4p) 21. 2D-polyakrylamide gelelektrofores (2D-PAGE) används frekvent som analytisk metod inom proteomikfältet. Vad finns det för styrkor och svagheter med denna analysmetod? (4p)

14 Tentamen i Molekylär bioteknik (3A1503/BB1060), måndag 17/12, 2007, kl 14:00-18:00. Svara kortfattat! Max 73 p, godkänd 36.5 p. Skriv namn på alla inlämnade blad! Ange vilken kurskod som gäller. Ange även er adress på försättsbladet, så att jag kan maila er resultatet. 1. Vad är det för skillnad på en primär cellkultur och en etablerad cellinje? (2p) 2. Vad är en dideoxynukleotid? (1p) I vilket sammanhang används sådana och varför? (2p) 3. För kloning av DNA-fragment finns det ett antal olika vektorsystem tillgängliga. Två snarlika sådana är λ-systemet samt cosmider. Redogör kortfattat för de principiella skillnaderna mellan dessa två system, samt motivera vilket av dessa du anser vara det bästa. (3p) 4. E. coli är en vanligt använd värdorganism för rekombinant proteinproduktion. När målproteinet innehåller ett flertal/många disulfidbryggor (med komplext disulfidbindningsmönster) är det inte ovanligt att det producerade proteinet är inaktivt. Varför förhåller det sig så? Ange några förslag på åtgärder som skulle kunna minska detta problem. (4p) 5. Det är enkelt att syntetiskt tillverka (chemical synthesis of DNA) korta DNAsekvenser (upp till cirka 100 bp långa) men för längre fragment fungerar det dåligt. Om man ändå, m.h.a. kemisk syntes, vill tillverka en gen som är 1000 bp lång så måste man ta till lite knep. Hur gör man? (3p) 6. Beskriv kortfattat de bakomliggande principerna för hur ribosomal display kan användas som verktyg inom kombinatorisk protein engineering för framtagning av t.ex. affinitetsreagenser. Alla principiellt viktiga komponenter/steg skall finnas med. Använd gärna figur/er. (5p) 7. Vad är det som gör att RNA-polymeras kan känna igen olika promotorer? (2p) Vad är det för mekanism som reglerar promotorstyrkan? (2p) 8. Vad är en inklusionskropp (inclusion body)? Vad är problemet med dessa inklusionskroppar? Kan man ha någon fördel av dem? (4p) 9. Vad kan skillnader i codon usage få för konsekvenser när man producerar ett humant protein kodat från cdna i en prokaryot värd? (2p) Ge förslag på åtgärder som kan minska problemen. (2p) 10. Beskriv, gärna med figur, hur man m.h.a. en Molecular beacon probe kan detektera närvaron av en viss DNA-sekvens i ett prov. (3p) 11. Vad finns det för problem/svårigheter med användandet av traditionella vacciner i form av avdödade patogena organismer? (3p)

15 12. Beskriv med en matematisk modell hur celltillväxten sker i en satsvis odling av celler. Hänsyn till celldöd behöver inte tas. Namnge parametrar med korrekt SIenhet (2p) Skissa hur denna kurva kan se ut i verkligheten och beskriv de olika tillväxtregionerna. (2p) 13. Beskriv kortfattat en metod för att åstadkomma att ett läkemedel verkar endast (eller huvudsakligen) i den celltyp där läkemedlet behövs. (2p) 14. I genotypningssyfte är det vanligt att man kör s.k. realtids-pcr och utnyttjar då en s.k. Taqman-probe. Redogör kortfattat för principerna bakom detta förfarande. (3p) 15. Inom molekylärgenetiken förekommer begreppet Lod score eller ( Z score ). Vad innebär detta och hur används det? (3p) 16. I samband med framtagning av transgena djur kan man använda sig av virala vektorer, exempelvis retrovirus eller lentivirus. Varför kan det vara fördelaktigt att välja lentivirus framför retrovirus? (1p) Vad finns det i övrigt för generella föroch nackdelar med lentivirus i detta sammanhang? (3p) 17. Utnyttjande a herbicider inom jordbruket har traditionellt ansetts ha negativa effekter på miljön, på grund av att man släpper ut stora mängder kemikalier i miljön, och att man använder genetiskt modifierade (herbicidresistenta). Kombinationen av herbicider och herbicidresistenta grödor möjliggör dock att man tillämpar plöjningsfri odling. Beskriv fördelar med denna odlingsteknik ur miljösynpunkt. (3p) 18. Baculovirus kan användas för att bekämpa skadeinsekter. Diskutera, med utgångspunkt från dess verkningssätt, potentiella för- och nackdelar med systemet. (4p) 19. När man sekvenerar hela genom så sekvenerar man kortare, hanterbara DNAfragment. En mycket viktig del i sådana projekt är att sedan pussla ihop (assembly) alla sekvenser till fullängdssekvenser. Detta är en inte helt trivial uppgift (särskilt inte för högre eukaryota organismer). Förklara varför. (3p) 20. När man tittar på den totala mrna-uppsättningen i en cell så kan man grovt indela transkripten i tre grupper baserat på hur vanligt förekommande de är; low, intermediate and high abundant. Hur stor andel av transkriptomet hör till respektive gruppering? (2p) Baserat på detta, resonera lite kring de utmaningar man står inför i samband med transkriptomanalys? (2p) 21. Du har två prover vars proteinsammanstättning skall jämföras. Ange vilka metoder som ger dig möjligheten att göra detta med ett enda experiment samt redogör kortfattat för hur en av metoderna fungerar. (5p)

16 Tentamen i Molekylär bioteknik (3A1503), onsdag 13/12-06, kl 14:00-18:00. Svara kortfattat!! Max 78p, godkänd 39p. Skriv namn på alla inlämnade blad! Ange även er adress på försättsbladet, så att jag kan maila er resultatet. 1. Var i cellen sker transkriptionen hos a) eukaryoter och b) prokaryoter? (2p) 2. Vad är ett operon? (2p) Varför kan det vara fördelaktigt att ha en sådan genorganisation? (2p) 3. Redogör för hur ett YAC-baserat kloningssystem fungerar. (4p) 4. Beskriv kortfattat i ord och figur principen för pyrosekvenering. Det skall tydligt framgå vad de olika komponenterna har för funktion/syfte. (4p) 5. Du har isolerat en liten kvantitet värmestabilt lipas (enzym som kan spjälka fettsyror) i ren form från en nyupptäckt termofil bakterie. Nu skulle du vilja klona genen för detta lipas i E. coli eftersom du har insett att lipaset skulle kunna vara mkt användbart som tvättmedelstillsats. Lyckas du finns det goda chanser att tjäna stora pengar om du säljer din klonade lipasgen till Procter & Gamble. Du har dock några problem att brottas med. Du känner inte till sekvensen för lipasgenen och tyvärr har du heller inget sätt att direkt screena (t. ex. kolorimetriskt) för lipasaktivitet. Beskriv och motivera (kortfattat) hur du skulle gå till väga för att ändå isolera en E. coli-koloni innehållande den värdefulla lipasgenen. (5p) 6. Prokaryota celler som används för rekombinant proteinproduktion utsätts ofta för hög metabol belastning, som märks bl.a. av minskad celltillväxt, förändrad form och storlek på cellerna. Ge tre exempel på bakomliggande orsaker till denna belastning, samt ange åtgärder för att minska problemen. (3p) 7. Vid produktion av rekombinanta proteiner kan man välja om man vill att proteinet skall sekreteras till periplasman eller stanna i cytoplasman. Vad finns det för skäl till att sekretera proteinet till periplasman? (3p) 8. Ge två vanliga skäl till att det ibland ej går att producera ett aktivt mammalieprotein i bakterier trots att DNA-sekvensen är korrekt. (2p) 9. Translationsinitieringseffektiviteten påverkas av ett antal olika faktorer. Redogör kortfattat för vilka dessa är och hur de fungerar i detta sammanhang. (3p) 10. En forskare sitter och planerar ett projekt där hon vill skapa ett bibliotek av sex aminosyror långa peptider, för att med hjälp av fagdisplay-tekniken hitta peptidvarianter som binder ett visst målprotein. Hon bestämmer sig för att använda

17 det degenererade kodonet C(A/G)(C/A/G/T) i de sex positionerna som motsvarar det randomiserade avsnittet i den displayade peptiden. Vilka aminosyror kommer att kunna ingå i peptidbibliotekets variabla sekvens? Hur många olika peptidvarianter kan hon maximalt erhålla i sitt bibliotek? (4p) 11. Ge två tänkbara orsaker, ge ett praktiskt exempel på varje, till att man får ett falskt positivt resultat vid användning av en PCR-baserad diagnostisk detektionsmetod. (4p) 12. Beskriv principen för hur en icke-patogen organism (ex. virus) kan användas som bärare ( carrier ) i vaccinationssammanhang samt varför detta är en intressant strategi. (5p) 13. Beskriv matematiskt hur tillväxthastigheten hos en mikroorganism beror av substratkoncentrationen (2p) och förklara/tolka detta beroende (utseende) på en för cellen molekylär nivå. (1p) 14. Inom genterapin används ibland ribonukleinsyror som terapeutika. Ange tre olika användningsområden/verkningssätt för dessa terapeutiska nukleinsyror. (3p) 15. Varför hänger set av SNPs ihop i olika etniska populationer? (2p) 16. Du håller på att konstruera en knock-out mus, men får endast avkomma som är heterozygota med avseende på knock-out genen. Ge en rimlig förklaring till detta fenomen samt föreslå även hur man eventuellt skulle kunna lösa problemet. (4p) 17. I samband med kromosomstudier (exempelvis karyotypning m.m.) är det vanligt att man gör en traditionell giemsainfärgning. Denna börjar dock allt oftare att ersättas av en modernare metod. Vilken är metoden och varför har den blivit så populär? (4p) 18. Genmodifierade växter blir allt vanligare. Som en strategi för att skydda dessa mot t.ex. skadeinsekter kan man exempelvis låta växten uttrycka ett bakteriellt toxin som skadar insekten. Vad finns det för fördelar med att uttrycka ett sådant toxin i kloroplasterna jmf med cytoplasman hos växtens celler? (3p) 19. Beskriv kortfattat tekniken för transient proteinuttryck i växter samt vad det finns för fördelar med denna teknik jämfört med en transgen växt. (4p) 20. Vad finns det för tekniska svårigheter med att sekvenera hela genom för högre eukaryota organismer och vad finns det för svårigheter med att hitta gensekvenser (proteinkodande) i den kromosomala sekvensen? (4p) 21. Mikromatrisanalys (DNA chip) kan tillgripas för att studera en mängd olika fenomen som kan grupperas in i tre områden. Vilka är dessa? (3p) 22. Inom proteomikfältet vill man på ett storskaligt sätt bl.a. kartlägga vilka proteiner som finns i en cell/vävnad och hur deras nivåer (koncentrationer) fluktuerar under

18 olika betingelser för att bättre förstå proteinernas funktion etc. Beskriv kortfattat den fram till idag allra vanligaste strategin för detta ändamål. (5p)

19 Tentamen i Molekylär bioteknik (3A1503/3A1510), onsdagen 14/ kl Maxpoäng = 76p Godkänd = 38p Ge kortfattade svar! Skriv tydligt! Obs! Skriv namn på alla inlämnade blad! Obs! 1. Vad menas med att den genetiska koden är degenererad? (1p) 2. Nämn tre typer av vektorer för kloning av stora DNA-fragment, samt ange ungefär hur stora fragment som kan klonas in i respektive vektor. (3p) 3. Nämn fyra principiellt olika typer av enzymer som används för att manipulera DNA-molekyler, och ange deras funktion. (2p) 4. Vad är den naturliga funktionen av restriktionsenzymer i en bakterie-cell? (2p) 5. Bakterier är vanligaste värdcellen vid arbete med rekombinant DNA-teknik. Ange för- och nackdelar med dessa värdceller i jämförelse med andra celltyper. (3p) 6. Ange de fyra grundenheter som måste finnas i en bakteriell expressionsvektor, och beskriv deras funktion. (4p) 7. Beskriv hur en typisk negativt reglerad prokaryot promotor fungerar. (4p) 8. Föreslå några olika strategier för att öka rekombinant proteinproduktion i en bakterie. (3p) 9. Beskriv en generell eukaryot expressionsvektor (=plasmid): nämn de viktiga grundenheterna och beskriv deras respektive funktion. Rita gärna. (3p) 10. Nämn två fördelar och en nackdel med proteinproduktion i däggdjursceller (= mammalieceller). (2p) 11. Vissa sjukdomar är orsakade av en punktmutation i en viss gen. Beskriv hur man m.h.a PCR med fluorescensinmärkta primers kan utnyttja primermismatch för att göra en genotypning av en individ för en sådan gen. Visa m.h.a. figur. (4p) 12. Beskriv hur en kriminalteknisk DNA analys m.h.a den s.k. STR-analysen går till. (3p)

20 13. Beskriv, genom att rita, de två första cyklerna av en PCR. Utgå ifrån en enda dubbelsträngad DNA-molekyl som templat. Ange 5 - och 3 -änden av alla DNA strängar och primers. Markera på den ursprungliga molekylen (templatmolekylen) vilken del som blir kopierad och var primrarna fäster. (5p) 14. Vad är en ribozym? Beskriv hur den kan fungera som ett läkemedel. (2p) 15. Beskriv kortfattat hur filamentösa fager kan användas för att producera antikroppar, och hur fager som producerar antikroppar riktade mot det önskade målproteinet kan screenas fram. (4p) 16. a) Förklara kortfattat vad som menas med ett subenhetsvaccin. (2p) b) Ange två fördelar med subenhetsvaccin (gentemot traditionella helorganism-vacciner). (2p) 17. Hur ser tillväxtkinetiken ut i en batchodling? Rita en bild och förklara! (2p) 18. Beskriv, m.h.a. figur, principen för hur gelektrofores av DNA-fragment går till. (2p) 19. Tvåhybridsystem (Two-hybrid system) är ett sätt att studera ineraktionen mellan proteiner. Beskriv hur ett bakteriellt tvåhybridsystem fungerar. (4p) 20. Nämn de tre metoder som vanligen används för att introducera det främmande DNA:t in i muscellerna vid framställning av transgena möss. (3p) 21. a) Vilka fyra jordbruksdjur (farm animals) är mest använda för transgen produktion? (1p) b) Vad används sådana transgena jordbruksdjur till? (2p) 22. Vilka två metoder fungerar bäst för transformation av växter? Beskriv kortfattat de två metoderna. (4p) 23. Förklara med ord, utan siffror, vad genetic linkage är. När kan man vara helt säker på att två gener inte är länkade (genetically linked)? (3p) publicerades under samma vecka en artikel i Science och en i Nature som beskrev hur en akademisk sammanslutning av forskargrupper respektive ett kommersiellt företag var för sig hade sekvensat det humana genomet. Beskriv kortfattat skillnaden i de metoder som den akademiska sammanslutningen och det kommersiella företaget hade använt sig av vid denna sekvensanalys. (3p) 25. Vid analys av transkriptionsnivåer m.h.a. microarrays omvandlas mrna:t som man vill analysera till cdna som en del av analysen. Varför omvandlar man mrna:t till cdna? Beskriv kortfattat hur man gör. (3p)

21 Tentamen i Molekylär bioteknik (3A1503), torsdag 16/12-04, kl Svara kortfattat!! Max 80 p, godkänd 40 p. Skriv namn på alla inlämnade blad! Ange även din epostadress på försättsbladet, så att jag kan skicka dig resultatet. 1. Para ihop följande term/begrepp med dess korrekta funktion/användning/definition. 1p/rätt, fel ger 1p! Om du är osäker på en viss specifik kombination och inte vill riskera att få minuspoäng kan du avstå att göra just denna specifika ihopparning. A. SSCA I. Expression i insektsceller B. AcMNPV II. Nukleinsyravaccin C. B. thuringiensis III. Selektivt tryck D. A. tumefaciens IV. Kloning av stora DNA-fragment E. SFV V. Mutationsdetektion F. BAC VI. Insekticid G. Ampicillin VII. cdna-syntes H. RT-PCR VIII. Transgena växter 2. Beskriv kortfattat vad som ingår i en typisk kloningsplasmid. (2p) 3. Redogör i korta ordalag för två olika, i samband med storskalig sekvenering vanligt förekommande, strategier för sekvenering av stora DNA-fragment. I vilket skede är den ena strategin att föredra framför den andra (motivera)? (4p) 4. För kloning av DNA-fragment kan ett flertal olika vektorer användas. Ett sådant är cosmider. Beskriv kortfattat hur detta system fungerar samt peka på eventuella begränsningar med det. (4p) 5. I samband med rekombinant proteinproduktion i E. coli är det vanligt att man styr genexpressionen m.h.a. olika reglerbara promotorer. Nämn två stycken vilka induceras på olika sätt samt ange hur detta görs. (4p) 6. Monoklonala antikroppar är ett mkt användbart redskap och har stort värde t.ex. som diagnostiskt verktyg eller terapeutika. Traditionellt så framställer man monoklonala antikroppar med s.k. hybridomteknik. Idag har denna dock fått stark konkurrens av en kraftfull in vitro teknik som möjliggör framtagning av monospecifika antikroppar och antikroppsfragment. Beskriv kortfattat (översiktligt, gärna med figur) principen bakom denna nya teknik. (4p) 7. Vilka olika molekylärbiologiska faktorer kan man manipulera för att optimera/modulera rekombinant proteinproduktion i en cell? Motivera dina svar. (4p)

22 8. När du planerar produktion och rening av ditt favoritprotein kan du underlätta reningen genom att genetiskt koppla ditt protein till en affinitetsreningstag. Efter reningen kan denna tag behöva tas bort m.h.a. enzymatisk eller kemisk klyvning. Nämn två fördelar med enzymatisk klyvning jämfört med kemisk. Ge också två exempel på proteaser vilka vanligen används för detta ändamål. (4p) 9. Du arbetar som doktorand. Det är en tidig fredagsmorgon och du befinner dig på labbet när din chef just kommer inrusande med något vilt i blicken. På måndag kväll skall han nämligen vara på en konferens i Boston där han förväntas presentera era senaste data rörande en viss nukleär receptor. I sin hand har han dels ett rör med renad vildtypsreceptor samt ett par rör med två olika mutanter av receptorn. Han vill nu att du snabbt, d.v.s. över helgen-tyvärr ett inte helt osannolikt scenario!-analyserar dessa mutanter m.a.p. deras struktur och stabilitet jämfört med vildtypsreceptorn. Beskriv kortfattat hur skulle du gå till väga. Du kommer att ha tillgång till det du behöver, men du skall motivera dina val av metoder etc. (5p) 10. Redogör för hur oligo ligation assay (OLA) fungerar samt vad metoden utnyttjas till. (5p) 11. När man utför oligonucleotide-directed site mutagenesis är det vanligt att man i ett steg utnyttjar sig av s.k. dut ung stammar av E. coli. Förklara kortfattat varför man använder dessa stammar samt redogör även för vilken funktion dessa (dut ung) mutationer har i detta sammanhang. (3p) 12. Redogör kortfattat för principerna bakom nukleinsyravacciner samt diskutera kring eventuella för- och nackdelar med DNA-vaccin jämfört med t.ex. levande vacciner. (5p) 13. Hur skulle man kunna modifiera baculovirus så att de blir effektivare insekticider? (2p) 14. Vilka olika odlingstekniker används vid odling av mikroorganismer i bioreaktorer? Motivera även vilken av dessa metoder som under ideala förhållanden borde ge den jämnaste produktkvaliteten. (4p) 15. Vilka är de två vanliga selektionsmarkörerna som används i samband med homolog rekombinering i eukaryota celler? (2p) Beskriv kortfattat hur dessa selektionsmarkörer fungerar. (2p) 16. När man skall välja mellan olika vektorer för genterapeutiska ändamål bör ett antal parametrar beaktas. Ge exempel på några av dessa samt varför de är av vikt. (4p) 17. Förklara begreppet karyotyp. (2p)

23 18. Ge tre exempel på hur genteknik kan användas för att utveckla nya biotekniska metoder för massa- och pappersindustrin. (3p) 19. Du har gjort en länkningsanalys av två genetiska loci och räknat ut Lod score till, Z(0,05)=1,705. Är de två loci länkade? Motivera ditt svar. (2p) 20. Vilka är de främsta användningsområdena för s.k. DNA-mikromatriser? (2p) 21. Beskriv kort hur en isotope-coded affinity tag analys (ICAT) utförs samt vad den utnyttjas till. Vilken är den största fördelen med ICAT jämfört med storskalig transkriptionsanalys? (5p)