Analys av läkemedelsrester i fiskblod för att bedöma miljörisker vid exponering för avloppsvatten

Transkript

1 Rapport Nr Analys av läkemedelsrester i fiskblod för att bedöma miljörisker vid exponering för avloppsvatten Joakim Larsson Jeffrey Brown Nicklas Paxeus Lars Förlin Svenskt Vatten Utveckling

2

3 Svenskt Vatten Utveckling Svenskt Vatten Utveckling (SV-Utveckling) är kommunernas eget FoU-program om kommunal VA-teknik. Programmet finansieras i sin helhet av kommunerna, vilket är unikt på så sätt att statliga medel tidigare alltid använts för denna typ av verksamhet. SV-Utveckling (fd VA-Forsk) initierades gemensamt av Svenska Kommunförbundet och Svenskt Vatten. Verksamheten påbörjades år Programmet lägger tonvikten på tillämpad forskning och utveckling inom det kommunala VA-området. Projekt bedrivs inom hela det VA-tekniska fältet under huvudrubrikerna: Dricksvatten Ledningsnät Avloppsvatten Ekonomi och organisation Utbildning och information SV-Utveckling styrs av en kommitté, som utses av styrelsen för Svenskt Vatten AB. För närvarande har kommittén följande sammansättning: Anders Lago, ordförande Olof Bergstedt Roger Bergström Daniel Hellström Stefan Marklund Mikael Medelberg Anders Moritz Peter Stahre Jan Söderström Göran Tägtström Agneta Åkerberg Steinar Nybruket, adjungerad Thomas Hellström, sekreterare Södertälje Göteborgs VA-verk Svenskt Vatten AB Stockholm Vatten AB Luleå Roslagsvatten AB Linköping VA-verket Malmö Sv Kommunförbundet Borlänge Falkenberg NORVAR, Norge Svenskt Vatten AB Författarna är ensamma ansvariga för rapportens innehåll, varför detta ej kan åberopas såsom representerande Svenskt Vattens ståndpunkt. Svenskt Vatten Utveckling Svenskt Vatten AB Box Stockholm Tfn Fax svensktvatten@svensktvatten.se Svenskt Vatten AB är servicebolag till föreningen Svenskt Vatten.

4 Svenskt Vatten Utveckling Bibliografiska uppgifter för nr Rapportens titel: Title of the report: Analys av läkemedelsrester i fiskblod för att bedöma miljörisker vid exponering för avloppsvatten Analyses of pharmaceuticals in fish blood to assess environmental risks of exposure to sewage effluents Rapportens beteckning Nr i serien: Författare: Joakim Larsson och Jeffrey Brown (Institutionen för Neurovetenskap och Fysiologi, Sahlgrenska Akademi vid Göteorgs Universitet), Nicklas Paxeus (GRYYAB), Lars Förlin (Zoologiska Institutionen, Göteborgs Universitet) Projektnr: Projektets namn: Projektets finansiering: Analys av läkemedelsrester i fiskblod för att bedöma miljöeffekter av avloppsvatten VA-Forsk, MISTRA, FORMAS, VR Rapportens omfattning Sidantal: 24 Format: A4 Sökord: Keywords: Sammandrag: Abstract: Målgrupper: Omslagsbild: Rapporten beställs från: Läkemedel, avloppsvatten, fiskblod, modeller, miljörisk Pharmaceuticals, sewage effluents, fish blood, models, environmental risks En teoretisk modell för biokoncentration av läkemedel i fisk och påföljande miljöriskbedömning har utvärderats. Studier vid tre reningsverk visar en god potential för modellen, men också möjligheter för förbättringar. A model for bioconcentration of pharmaceuticals in fish and subsequent risk assessment have been evaluated. Studies at three sewage treatment works show a good potential for the model, but also room for improvement. Branschfolk, myndigheter, forskare, läkemedelsindustri Provtagning av fiskblod vid Ryaverket. Fotograf: Jeffrey Brown Finns att hämta hem som pdf-fil från Svenskt Vattens hemsida Utgivningsår: 2007 Utgivare: Svenskt Vatten AB Svenskt Vatten AB Grafisk formgivning: Victoria Björk, Svenskt Vatten

5 Förord Det finns en växande oro i samhället kring förekomst av läkemedel i miljön. Mycket tyder på att den största spridningskällan till miljön är via avloppsvatten från reningsverk. Det är inte uteslutet att det i framtiden kan komma att ställas krav på hur effektiva reningsverk skall vara med avseende på att rena bort läkemedelsrester. I Storbritannien pågår redan studier som har syfte att utgöra underlag för att reglera utsläppen av östrogena ämnen från t.ex. p-piller. För det flesta läkemedel saknas idag relevanta effekt-studier för att bedöma sannolikheten för om de nivåer som återfinns har möjlighet att påverka organismer ute i miljön. Då det finns över 1000 aktiva läkemedelssubstanser enbart på den svenska marknaden är det en mycket stor uppgift att utföra effekt-studier för alla dessa. Om vi i steg ett i stället kunde använda oss av teoretiska modeller för att prioritera vilka läkemedel som har störst risk att ge en miljöpåverkan skulle det öka våra möjligheter att utföra relevanta effektstudier på de mest högprioriterade substanserna. Att så tidigt som möjligt få en uppfattning, om än grov, av vilka läkemedel eller grupper av läkemedel som har störst risk att påverka miljön skulle vara ett viktigt bidrag för att fokusera diskussioner kring möjliga åtgärder att begränsa spridningen av dessa, inklusive eventuella modifieringar av reningstekniker. Läkemedelsföretaget Pfizer har föreslagit en enkel modell att beräkna biokoncentration av läkemedel från vatten till fiskblod. Om man jämför koncentrationen läkemedel i fiskblod med den koncentration som man vet ger farmakologiska effekter i människa så är tanken att detta skall kunna ge en indikation om det är sannolikt att läkemedlet ger (farmakologiska) effekter också på vattenlevande djur vid en given vattenkoncentration. Vi har testat denna modell praktiskt för fisk exponerad för tre olika avloppsvatten, mätt läkemedelsrester i vattnet och i fiskblod med GC/MS och jämfört teoretisk framräknade värden med de faktiskt uppmätta för en handfull läkemedel. Med detta mycket realistiska angreppssätt ville vi göra en första utvärdering av modellens potential och se om det fanns några uppenbara möjligheter till förbättringar av modellen. Studierna har utförts vid Ryaverket i Göteborg, nedströms Gråbo reningsverk samt vid Spenshult Reumatikersjukhus. Studierna är samorganiserade med ett större MISTRA/FORMAS-finansierat projekt med titeln Läkemedel i miljön utveckling av biologiska fingeravtryck. Vi vill i denna delrapport passa på att tacka personal vid Spenshult Reumatikersjukhus (särskilt Ingemar Petersson och Carl-Gustaf Svensson), GRYYAB, Gråbo reningsverk, Zoologiska Institutionen (Jari Parkkonen, Eva Albertsson) och Institutionen för Neurovetenskap och Fysiologi (Lina Gunnarsson, Linda Samuelsson, Linda Augustsson) vid Göteborgs Universitet för hjälp vid olika delar av projektet. Vi vill också tacka VA-Forsk, MISTRA, FORMAS och Vetenskapsrådet (Medicin) för finansiellt stöd. Göteborg, Februari 2007 Joakim Larsson Jeffrey Brown Nicklas Paxeus Lars Förlin

6

7 Innehåll Förord Sammanfattning Summary Introduktion Material och metod Fisk Studier av upptag av läkemedel i akvarieförsök Studier vid tre olika reningsverk Ryaverket Gråbo reningsverk Spenshult reumatikersjukhus Kemikalier Analys av läkemedel i blodplasma från fisk Extraktion och derivatisering GM-MS analys Analys av avloppsvatten Fast-fas extraktion, kemisk derivatisering och GC-MS analys Fisk-plasma modellen Resultat Fältexponeringar uppmätta läkemedelskoncentrationer Fiskblod uppmätta läkemedelskoncentrationer Jämförelse av beräknade och uppmätta koncentrationer i blodplasma Riskbedömning/prioritering baserad på fisk-plasma-modellen Diskussion Slutsats Referenser

8

9 Sammanfattning Läkemedel sprids till den akvatiska miljön framför allt via avloppsvatten från reningsverk. Åtgärdsalternativ för att minska spridningen diskuteras, däribland möjligheten att anpassa reningsteknologier till läkemedel. För att kunna utvärdera nyttan med olika möjliga åtgärder är det viktigt att veta vilka läkemedel som utgör de största miljöriskerna. Tyvärr är kunskapen om miljörisker för de över 1000 olika läkemedelssubstanser som används i Sverige fortfarande mycket fragmentarisk. Om vi med hjälp av en teoretisk modell kan prioritera fördjupade forskningsinsatser för att avgöra vilka läkemedel som verkligen utgör en risk, så vore mycket vunnet. En strategi har föreslagits som utnyttjar kunskap om läkemedlens potens från humana studier; Om koncentrationen läkemedel i blodet hos exponerade vattenlevande organismer, t.ex. fisk, når ungefär samma nivåer som de terapeutiska nivåerna i människa så är risken för en farmakologisk påverkan på fisken stor. Om nivåerna i fisken å andra sidan är 1000-tals gånger lägre än koncentrationer man vet ger effekt på människor är risken för påverkan på akvatiska organismer liten. Vi har i denna studie undersökt hur väl en föreslagen teoretisk modell för biokoncentration kan förutspå verkliga nivåer i blodplasman på fisk för fem olika läkemedel. Metoder för att mäta läkemedel i blodplasma i fisk har därför utvärderats. Vi har även gjort en bedömning av risken för en farmakologisk effekt i exponerade fiskar baserat på en jämförelse med humana terapeutiska koncentrationer och koncentrationer i fiskens blodplasma. Vi har utfört studier vid tre olika reningsverk med komplexa avloppsvatten för att i ett tidigt skede kunna identifiera eventuella brister i en modell när denna appliceras i olika komplexa exponeringssitutationer. Överlag överensstämde den teoretiska rankningen av risker med läkemedlen väl med rankningen baserad på praktiska mätningar utom för ibuprofen vid Ryaverket där biokoncentrationen underskattades kraftigt. Rankingen stämde också väl överens in med tidigare observation av effekter av de olika läkemedlen på olika akvatiska organismer. En mycket viktig observation var att biokoncentrationsfaktorerna varierade betydligt mellan olika exponeringssituationer, trots liknande vattenkoncentrationer. Sammantaget visar studien på en god potential för den teoretiska modellen samtidigt som vi har visat att det finns ytterligare, hittills okända faktorer som det vore önskvärt att kunna ta hänsyn till och därmed öka modellens precision. 7

10 Summary Pharmaceuticals enter the aquatic environment primarily via effluents from sewage treatment works. Alternatives to reduce the discharges of pharmaceuticals are currently discussed, including the possibilities to adapt sewage treatment technologies to pharmaceuticals. To be able to assess the benefit of different alternatives, it is important to know which pharmaceuticals that poses the largest risks to the environment. Unfortunately, the knowledge about the environmental risk of the over 1000 active pharmaceutical ingredients used in Sweden is still only fragmentary. If we, with the help of a theoretical model, could prioritize future research efforts to identify which pharmaceuticals we should be concerned about, much would be gained. A strategy has been proposed that takes advantage of the known potency of drugs based on human studies; If the concentration of a drug in the blood of aquatic organisms, for example fish, reaches approximately the same levels as the therapeutic blood levels in humans, then the risk for a pharmacological effect in the fish is large. However, if the concentrations within the fish are for example thousand fold lower than the concentrations known to have effects in humans, then the risk for an effect on aquatic organisms is small. In this study, we have investigated how well a previously suggested model for bioconcentration can predict actual concentrations in blood plasma of fish for five different pharmaceuticals. Methods to analyze these drugs in fish blood plasma have therefore been developed. We have also assessed the risks for a pharmacological effects in fish based on a comparison with human therapeutic concentrations. We have performed studies at three different sewage treatment works with complex effluents. We choose this somewhat elaborate approach in order to be able to identify potential problems with the theoretical model at an early stage problems that eventually would become apparent when applying the model in different, real, complex exposure scenarios. Overall, the theoretical model correctly ranked the risks of the individual pharmaceuticals in comparison with our actual measured data on water and blood concentrations, with the exception for ibuprofen where the bioconcentration was severely underestimated at one site. The ranking also agreed with earlier reports on effects of the investigated pharmaceuticals on different aquatic organisms. A very important observation was that the bioconcentration factors varied considerably between different exposure situations, despite relatively similar exposure concentrations. Altogether, the study indicates a good potential for the theoretical model. At the same time we show that there are other, yet unknown factors that would be desirable to include in the model and thereby improve its precision.

11 1 Introduktion Rester av läkemedel återfinns i såväl avloppsvatten som ytvatten och i vissa fall även dricksvatten (Heberer 2002; Kümmerer 2004). Detta är en utveckling som har skapat en oro kring möjliga effekter på miljön (Fent et al. 2006). Nivåerna som detekteras är vanligen mellan 1 ng/l och 1 µg/l. Endast i undantagsfall kan man se dramatiska akuta effekter av sådana nivåer på akvatiska organismer. Exponeringen är å andra sidan mer eller mindre kontinuerlig, och vissa utvecklingsstadier kan vara mycket känsligare än andra. I de flesta fall saknas studier med endpoints som man vet är känsliga för ett visst läkemedel, och ofta är det okänt om den eller de arter man studerat på lab ens har målmolekyler (t.ex. receptorer) för de undersökta läkemedlen. Fisk och groddjur är evolutionärt ganska lika oss, och har också många av de målmolekyler som läkemedlen är avsedda att verka på (Fent et al. 2006; Huggett et al. 2003). För många arter som används i toxicitetstestning (t.ex. vattenloppor) är det mer tveksamt hur väl konserverade målmolekylerna är. Det leder till att man kan ifrågasätta om det är lämpligt att extrapolera eventuellt negativa resultat (ingen detekterad effekt) från t.ex. vattenloppor till andra organismgrupper som kanske har målmolekyler (såsom fisk). Östrogen har t.ex. mycket begränsade effekter på kräftdjur, men även de extremt låga nivåer (kring 1 ng etinylöstradiol/l) som man ofta finner i avloppsvatten kan ha dramatiska effekter på fisk (Purdom et al. 1994; Desbrow et al. 1998; Larsson et al. 1999; Jobling et al. 2002). I Storbritannien, där också flest studier har utförts, har man funnit att feminisering av fisk nedströms reningsverk som en konsekvens av östrogenexponering är ett utbrett problem. Läsaren hänvisas till översikter av Kümmerer (2004), Williams (2005) och Fent m.fl. (2006) för mer data kring läkemedels förekomst och effekter i miljön. Från mitten av nittiotalet har det funnits krav i Europa på att en miljöriskbedömning skall göras vid registrering av nya läkemedelsprodukter. Fram till helt nyligen har fokus på dessa legat på grova akuta effekter (dödlighet) snarare än subletala effekter eller effekter vid långtidsexponering. Riskbedömningsprocessen speglar till stor del den som använts för traditionella industrikemikalier (Cleuvers 2004; Cleuvers 2005, Hutchinsson et al. 2003) där akuta LC 50 eller EC 50 tas fram och utifrån denna information beräknas kronisk toxicitet teoretiskt med hjälp av en justeringsfaktor. Detta är en strategi som har visats otillräcklig för läkemedel med specifik biologisk aktivitet, och behovet att bedöma kronisk toxicitet har nu nått betydande acceptans bland såväl myndigheter som industriföreträdare (EMEA 2006; Williams 2005). För nyregistrering av medicinska produkter krävs nu inom EU kroniska tester på vattenloppor och för fisk är den akuta dödlighetstesten ersatt med en längre studie av tidiga utvecklingsstadier. Dock saknas fortfarande krav på livscykeltester på fisk som tillsammans med groddjur utgör den mest relevanta av de vattenlevande organismerna baserat på konservering av målmolekyler för läkemedel. Det är dock oklart hur alla läkemedel som redan är godkända skall bedömas ur miljösynpunkt. Enbart på den svenska marknaden uppgår antalet aktiva substanser till ca 1200 (Carlsson et al. 2006). Det finns därför ett brinnande behov av att prioritera forskningsinsatser. Relevanta, kroniska effekt-data saknas helt för nästan alla läkemedel men vi måste ändå göra någon slags bedömning av riskerna baserade på tillgängliga data. Att använda fasta justeringsfaktorer från akut till kronisk toxicitet såsom tidigare gjorts (Fent 2006; Hutchinsson et al. 2003) har visats sig olämpligt då det finns en stor risk att man underskattar de möjliga långtidseffekterna (Sumpter & Johnsson 2005; Fent et al. 2006). Till skillnad mot t.ex. de flesta industrikemikalier så känner vi emellertid till en hel del om läkemedlens biologiska effekter fån de effektivitets och toxicitet/säkerhets-studier som utförts på människor och andra däggdjur när läkemedlen en gång togs fram. Det finns goda möjligheter att dessa data skulle kunna användas för en första prioritering av miljöriskerna med läkemedel (Hugget et al. 2005). Om målmolekylerna för ett läkemedel är konserverade från människa till en vattenlevande organism (t.ex. fisk) så är det sannolikt att ungefär samma koncentration av läkemedlet krävs i kroppen (fiskens eller människans) för att det skall ge upphov till en farmakologisk effekt. En så kallad Fisk-Plasma- Modell (FPM) har föreslagits för att dra nytta av denna stora kunskap om läkemedlens kemiska egenskaper och biologiska effekter från olika däggdjursstudier. Genom att utgå från koncentrationen av

12 läkemedel (beräknad eller uppmätt) i vatten tillsammans med kemisk/fysikaliska egenskaper hos substansen så beräknar modellen en steady-state fisk-plasma koncentration (F SS PC). Kvoten eller effekt-ratio (ER) mellan F SS PC och den humana terapeutiska blodplasma-koncentration man vet ger en effekt i människa (H T PC) ger ett värde på risken för att man skall få en farmakologisk påverkan på fisken (Figur 1-1). Om ER 1 så är koncentrationen av läkemedel i fiskplasman större eller lika med koncentrationen som ger en terapeutisk effekt i människan. Ju lägre ER desto större sannolikhet för en biologisk respons i fisken. Hugget m.fl. (2004) gjorde en teoretisk ER beräkning för 28 substanser uppmätta i ytvatten eller kommunalt avloppsvatten. Av dessa beräknades etinylöstradiol (den östrogena substansen i kombinations-p-piller, p-plåster och p-ringar) och östradiol utgöra störst risk för akvatiska organismer med en beräknad ER på <1. Detta stämmer väl överens med att man i en lång rad studier visat att etinylöstradiol och östradiol feminiserar fisk nedströms reningsverk (Desbrow 1998; Larsson 1999; Fent et al. 2006). Det skall påpekas att det är sannolikheten för en farmakologisk interaktion som modellen har möjlighet att prediktera, inte skadlig effekt. Vissa farmakologiska interaktioner leder till skadliga effekter på individen, andra inte. En förutsättning för att en skadlig effekt skall uppstå är dock att den föregåtts av en biologisk interaktion. Om modellen skulle fungera idealiskt skulle den därför i bästa fall kunna peka ut en lång rad läkemedel som inte kommer att påverka akvatiska organismer negativt. Samtidigt skulle den kunna peka ut en rad läkemedel som ger upphov till farmakologiska effekter i t.ex. fisk, men den kan inte skilja mellan vilka av de senare läkemedlen som är skadliga och vilka som påverkar receptorer etc utan att vara skadliga. Det måste avgöras på annat sätt, t.ex. genom praktiska studier. Väldigt mycket är dock vunnet om vi kan prioritera vilka läkemedel som i första hand bör genomgå mer extensiv testning. Vi ser främst en möjlighet för prioritering av läkemedel som redan finns på marknaden, men det är även möjligt att en validerad modell skulle kunna fungera som en tidig trigger i en standardiserad miljöriskbedömning för att avgöra i vilken utsträckning vidare testning är nödvändig. Det bör noteras att modellen kan vara helt teoretisk eller förfinas genom att man i ett relativt enkelt biokoncentrationsförsök mäter koncentrationen av läkemedlet i fiskens blodplasma. Modellen omfattar inga mätningar av några biologiska responser i fisken över huvud taget. Att veta vilken biologisk respons som är lämplig att studera kan ofta Human terapeutisk plasma koncentration (H T PC) Läkemedelsstudier Steady state plasma koncentration i fisk (F ss PC) Exponering via vatten Beräknad/uppmätt biokoncentration H T PC som ger mätbara effekter Teoretisk eller uppmätt F ss PC Effekt Ratio (ER) = H T PC / F ss PC Ju lägre ER desto större risk för farmakologiska effekter på fisk Figur 1-1. Fisk-Plasma-Modellen (anpassad från Huggett et al. (2003)). 10

13 vara mycket svårt att veta (Larsson et al. 2006), det kan vara kostsamt att sätta upp mätmetoder för effektstudier och processen är tyvärr ofta tidsödande. Som en första tier är därför plasmamodellen mycket attraktiv. För att möjliggöra en vidare användning av plasma-modellen är det nödvändigt att utvärdera den på flera plan. Det första steget är att utvärdera hur väl vi teoretiskt kan bedöma koncentrationen av läkemedel i fiskblod från en given vattenkoncentration. Det är detta steg som vi fokuserat på inom ramen för denna rapport. Nästa steg innebär att man bör förankra relationen mellan koncentrationen i human-plasma och en farmakologisk effekt i människa också återspeglas i fisken. Detta steg omfattar således mätningar av farmakologiska effekter i fisk, vilka t.ex. kan vara rent molekylära. I ett tredje steg vill man gärna få en uppfattning av relationen mellan farmakologiska effekter och skadliga effekter på t.ex. tillväxt, överlevnad och fortplantning. Som tidigare nämnts har inte modellen för sig självt i sin nuvarande form, potential att skilja mellan skadliga farmakologisk effekter och mer eller mindre oskadliga farmakologiska effekter. Det är möjligt att man i framtiden kan bygga ut modellen för att även ge information om detta. Vi bedömer dock att modellen även utan en sådan potential skulle vara mycket värdefull om den med god precision kan bedöma risken för en farmakologisk effekt då den skulle möjliggöra en fokusering av biologiska effektstudier mot ett mycket mer begränsat antal substanser än i dagsläget. Steg ett av utvärderingen är således att utvärdera möjligheterna att beräkna biokoncentration för läkemedel från vatten till fiskblod. Vi är rädda för att man med ett alltför simplistiskt angreppssätt riskera förbise problem som blir aktuella när man försöker applicera en modell på en mer komplicerad verklighet. Försök med rent vatten med tillsatt läkemedel är en ganska enkel modell (Mimeault et al. 2005; Schwaiger et al. 2004; Triebskorn et al. 2004). Vi ville därför redan från början använda en mer realistisk exponeringsmodell. Tidigare studier har visat att biokoncentrering av diklofenak till olika fiskvävnader mycket beror på hur hög koncentrationen är i omgivande vatten. Vid låga koncentrationer biokoncentrerades läkemedlet mycket effektivt, men koncentrationerna i fisken ökade sedan endast marginellt när vattenkoncentrationerna ökades kraftigt (Schwaiger et al. 2004; Triebskorn et al. 2004). Biotillgängligheten för olika läkemedel i vatten kan också vara betydligt lägre än 100 % beroende på adsorption till partiklar och kolloider av organiskt material i vattnet. Flera av de mer fettlösliga läkemedelsubstanserna (t.ex. gemfibrozil och 17α ethinylestradiol) vet man binder till partiklar i avloppsvatten, vilket också kan vara en betydande faktor för att avgöra hur väl reningsverket klarar av att avskilja/ bryta ned substansen i fråga. När väl ett läkemedel har nått recipienten via avloppsvattnet så kan det fördelas mellan olika faser. Det är välkänt att fördelningen mellan partiklar, kolloider och fullständigt löst substans påverkar upptaget av många andra kemikalier, vilket i sin tur påverkar hur toxiska de är för akvatiska organismer (Haitzer et al. 1998). Om en substans binder till kolloider tror man att detta kommer att begränsa transporten över gälarna hos fisk, så att det i princip endast är den helt lösliga fraktionen som kan tas upp (Erickson et al. 1990). Östrogen binder till kolloider i ytvatten (Liu et al. 2005), men data för icke-hormonella läkemedel i relation till biotillgänglighet och biokoncentration saknas. NSAIDs eller icke-steroidala anti-inflammatoriska medel används i stor utsträckning i hela världen som smärtstillande medel och för att minska olika inflammatoriska responser (Figur 1-2, nedan). De bryts dessutom enbart delvis ned i reningsverken (20 95 %) (Fent 2006). Man har funnit nivåer av NSAIDs i ytvatten i Sverige och andra länder i nivåer mellan 0,01 och 2 µg/l (Ternes 1998; Bendz et al. 2005; Fent et al. 2006). Biokoncentrering av diklofenak (en NSAID) i regnbåge (Onchorynhus mykiss) har påvisats i akvariestudier och kroniska effekter har dokumenterats vid miljörelevanta koncentrationer, inklusive histopatologiska och cytopatologiska skador på lever, njurar och gälar (Schwaiger et al. 2004; Triebskorn et al. 2004). Liknande effekter har visats i öring (Salmo trutta) (Hoeger et al. 2005). Vi har tidigare utvecklat mätmetoder för att NSDAIDs i avloppsvatten (Bendz et al. 2005). Detta tillsammans med jämförelsevis goda kunskaper kring deras förekomst och effekter i miljön skulle kunna göra dem lämpliga för en initial utvärdering av plasmamodellen. En annan läkemedelssubstans som vi bedömde som relevant att undersöka var gemfibrozil, en fibrat som används som blodfett-sänkande medel (figur 1-2, nedan). Man finner ofta att mer än 30 % av detta läkemedel passerar reningsverken (Fent et al. 2006), 11

14 Diklofenak Log K ow = 4,02 pk a = 4,15 visar på såväl potential för modellen som behov av/ möjligheter för förbättringar för att teoretiskt kunna beräkna biokoncentration för olika läkemedel under naturliga, komplexa exponeringsförhållanden. Ibuprofen Log K ow = 3,80 pk a = 4,40 2 Material och metod Naproxen Log K ow = 3,10 pk a = 4,20 Ketoprofen Log K ow = 3,00 pk a = 4,60 Gemfibrozil Log K ow = 4,80 pk a = 4,80 Figur 1-2. Studerade läkemedelssubstanser i avloppsvatten och fiskblod. vilket resulterar i koncentrationer i miljön mellan 1 ng/l och 1 µg/l (Ternes 1998; Bendz et al. 2005; Fent et al. 2006). Man har i akvarieförsök visat att gemfibrozil tas upp över gälarna i guldfisk (Carassius auratus) och att exponering för miljörelevanta koncentrationer orsakar reducerade nivåer av fiskens manliga könshormon (testosteron) i blodet (Mimeault et al. 2005). Vi rapporterar i denna studie hur en grupp NSAIDs och gemfibrozil biokoncentreras i fisk. Uppmätta koncentrationer i fisken jämförs med beräknade nivåer enligt tidigare föreslagen modell. Jämförelse med humana terapeutiska koncentrationer ger en god indikation om vilka av de studerade läkemedlen som har störst risk att påverka akvatiska organismer. Resultaten från dessa underökningar 2.1 Fisk Juvenila regnbågar (Oncorhynchus mykiss) av båda könen införskaffades från en lokal fiskodling i samband med varje försök. Fisken vägde i medel 70 g och matades inte under försöken dels för att få en så homogen grupp som möjligt, dels för att tillåta insamling av galla till parallella studier. Alla studier var godkända av djurförsöksetisk nämnd (tillstånd till J Larsson). I alla delförsök provtogs fisken efter att först ha avlivats genom ett slag i nacken. Blod (0,4 1,5 ml/fisk) togs från kaudalkärlen med en spruta preparerad med heparin för att undvika koagulation. Efter centrifugering (2 min, 6000 rpm) frystes blodplasman i flytande kväve och förvarades sedan i 18 C i väntan på analys. 2.2 Studier av upptag av läkemedel i akvarieförsök Huvudsyftet med den första delstudien var att utvärdera om de studerade läkemedlen över huvud taget tas upp i fisk och se om en fastfas extraktion (se nedan) fungerar för att extrahera läkemedel som i blodplasman delvis kan transporteras bundna till plasmaproteiner (såsom albumin). Därför användes inte enbart spikade plasmaprover för att testa metodiken utan även plasmaprover från fisk som exponerats via vatten för en blandning av de olika läkemedlen i ett tvådagars semi-statiskt exponeringsförsök. Fisken placerades i 35 liters akvarier med luftbubbling där 12

15 läkemedel tillsattes. Efter 24 h byttes vattnet genom att ta ut vatten från botten av akvariet med en sifon (8 l/min) samtidigt som nytt vatten tillsattes i ytan med samma hastighet. Eter 20 minuter hade 160 liter flödat genom akvariet vilket betraktades som tillräckligt. Därefter tillsattes en ny dos med läkemedel till akvariet och exponeringen fortgick ytterligare 24 h. Nominella exponeringskoncentrationer och uppmätta nivåer i plasma efter två dygn redovisas i Tabell 2-1. Resultaten i Tabell 2-1 visar att de studerade läkemedlen tas upp i fisk och kan mätas i blodplasma. Uppmätta värden i detta försök (mycket höga nominella koncentrationer jämfört med realistiska koncentrationer i fält) visar att uppmätta plasmakoncentrationsnvåer var ca 1/10 av beräknade nivåer enligt plasmamodellen utan hänsyn taget till att en stor del av läkemedlen sannolikt föreligger i laddad form (Hugget et al. 2003). För ketoprofen var uppmätta koncentrationer knappt en 100-del av beräknade nivåer och biokoncentrationsfaktorn var endast 0,1. Vi vill påpeka att det finns flera skäl att inte använda dessa biokoncentringsfaktorer för att beräkna upptag vid mer realistiska exponeringar. Dels är det ett kort-semistatiskt försök och vi vet ej om vi har hunnit närma oss jämvikt, dels har vi inte uppmätt verkliga vattenkoncentrationer (kan ha påverkats av den ganska höga fisk/vattenvolym ration), dels är koncentrationerna av läkemedel flera hundra gånger högre än vad som är uppmätts i miljön, och det finns skäl att tro, åtminstone för diklofenak, att biokoncentrationsfaktorn är koncentrationsberoende. 2.3 Studier vid tre olika reningsverk De tre studerade reningsverken spänner över väldigt skilda storlekar och skilda reningsteknologier. Detta ökar validiteten att extrapolera genererade resultat Ryaverket Ryaverket i Göteborg behandlar avloppsvatten från ca människor och tar också hand om avloppsvatten från sjukhus, tvätterier, industrier av olika storlek, bland annat för produktion av livsmedel, papper, kemisk industri m.m. Dagvatten behandlas också i reningsverket. Det inkommande avloppsvattnet behandlas via primär sedimentering, kemisk fosfor-avskiljning, aktiverad slamanläggning och biologisk kvävereduktion. Det renade avloppsvattnet släpps ut i Göta Älvs mynning via en 1 km lång tunnel. Regnbåge exponerades för utgående avloppsvatten i två rostfria stålburar (30 st 70 g fiskar per bur) i den utgående bassängen på Ryaverket, precis vid mynningen till röret som leder ut till Göta Älv. Fisk (n=10 13 per tillfälle) provtogs vid tidpunkterna 0, 2, 8 och 16 dagar. Vid tidpunkten för försöket (Februari/Mars 2006) var lufttemperaturen under 0 C medan vattentemperaturen var i medel 12 C. Vid inspektion efter 2 dygn hade en del fisk dött, sannolikt p.g.a. igentäppning av hål i en av burarna som lett till begränsad syretillgång. Tätare rengöring av burarna förhindrade ytterligare dödlighet. Avloppsvatten provtogs med hjälp av en tids-proportionerlig automatisk vattenprovtagare på plats. Tabell 2-1. Resultat från 48h exponeringsförsök i akvarier med syfte att kvalitativt avgöra om fisk kan ta upp och koncentrera de studerade läkemedlen i blodplasma Nominell exponerings koncentration (µg/l) Beräknad plasma koncentration (ng/ ml) Uppmätt plasma koncentration (ng/ml) Biokoncentreringsfaktor (uppmätt plasma/nominell) Ibuprofen Naproxen Diklofenak Ketoprofen ,1 Gemfibrozil

16 2.3.2 Gråbo reningsverk Gråbo ligger drygt 3 mil NO om Göteborg. Det lokala reningsverket tar i princip enbart emot avloppsvatten från hushåll motsvarande ungefär 4000 personekvivalenter och har konventionell reningsteknik (inga anaerobiska steg). Regnbåge (två stålburar med ca 30 fiskar i varje) placerades ca 20 meter nedströms utloppet. Den genomsnittliga inblandningen av avloppsvatten vid denna plats var ungefär 50 %. Fisk (n=10 13) provtogs efter 1, 2, 8, 16 och 23 dagar. Vattenprover precis i anslutning till burarna insamlades vid dessa tillfällen i flaskor och frystes i väntan på analys. Vattentemperaturen under försöket (Februari/Mars 2006) var ca 2 C. Inga döda fiskar påträffades. var ca 16 m 3 /dygn, och det behandlade vattnet släpps ut i Nissan där det sker en betydande utspädning (40 m 3 /s). Reningsverket har två reningssteg, en luftad bassäng och en sedimenteringsbassäng om vardera 60 m 3, vilket ger en total retentionstid om ca 6 dygn vilket är lång tid jämfört med de allra flesta kommunala reningsverk. Reduktion av BOD, COD och kväve är i nivå med större reningsverk medan reningsverkets fosforreduktion inte är lika bra. Regnbågar exponerades i November 2004 på Spenshults reningsverk i PVC-kar för avloppsvatten (50 %) i ett kontinuerligt genomflödessystem där avloppsvattnet blandades med lika stor mängd vatten från en närliggande damm (Figur 2-1). Vattentemperaturen under försöket var i genomsnitt 13,6 C. Vattenprover togs varannan dag och frystes i väntan på kemisk analys av läkemedelrester Spenshult reumatikersjukhus Spenshult reumatikersjukhus nära Halmstad är ett sjukhus med knappt 200 behandlingsplatser som erbjuder specialiserad vård till patienter med reumatiska sjukdomar. Då sjukhuset har ett eget reningsverk erbjuder det tämligen unika möjligheter att studera ett reningsverk som belastas med, åtminstone för vissa läkemedel, relativt höga inkommande koncentrationer jämfört med ett vanligt kommunalt reningsverk. Flödet genom reningsverket under Kemikalier Referenssubstanser (renhet >97 %) köptes från Sigma-Aldrich och Promochem Standard Supplies. Lösningsmedel och vatten var av HPCL-kvalitet (Rathburn, Scotland). Myrsyra, pentafluorobenzyl bromide (PFBBr) och triethylamin var of purriskvalitet (Fluka). Figur 2-1. Exponeringsanläggning på reningsverket vid Spenshult reumatikersjukhus. 14

17 2.5 Analys av läkemedel i blodplasma från fisk Extraktion och derivatisering Utspädd blodplasma (300 µl spätt i 900 µl 1 % myrsyra samt internstandarder) extraherades med hjälp av Evolute ABN 25 mg fast-fas extraktions kolonner (Argonaut Technologies, Tokyo) som pre konditionerats with 1 ml metanol och 1 ml 0,1 % myrsyra (löst i vatten). Interfererande substanser eluerades med 5 % metanol i vatten och läkemedlen eluerades med 1 ml metanol. Efter vakuumtorkning löstes extrakten i 1 ml aceton och överfördes till 1,5 ml GC rör varefter de intorkades under kvävgas. Toluen (200 µl) med 2 % PFBBr plus 8 µl triethylamin som katalysator tillsattes för att derivatisera läkemedlen vid 100 o C i 1 h (Reddersen et al. 2003). Derivatiserade extrakt indunstades under kvävgas, varefter 1 ml toluen tillsattes och partiklar avlägsnades med hjälp av filtrering (0,45 µm PTFE syringe filters ). Efter ytterligare en omgång industning under kvävgas tillsattes återigen 100 µl toluen och proverna överfördes till 250 µl glasbehållare inför analys. karakteristiska joners relativa intensitet jämfört med derviatiserade autentiska standarder. De jonfragment som användes för detektion och kvantifiering (understrukna) var: ibuprofen (161; 386), gemfibrozil (309; 430), naproxen (185; 410), diclofenac (214; 475; 477) och ketoprofen (209; 434) samt för interna standarder klofibrat (128; 394) och flurbiprofen (199; 424). Kalibrering utfördes genom att tillsätta (spika) standarder i fiskplasma (från oexponerad fisk) och behandling av spikade prover på samma sätt som övriga prover. Prover kvantifierades m ha av en 5 6 punkters kalibrering per substans. Detektionsgränsen för metoden definierades som en area under kurvan som var tre gånger större än bakgrundsbruset. Blankprover av bland annat plasma från oexponerade fiskar och olika reagenser som processats på samma sätt som proverna uppvisade inga spår av läkemedel vid något tillfälle. 2.6 Analys av avloppsvatten Fast-fas extraktion, kemisk derivatisering och GC-MS analys GM-MS analys PFBBr derivativaten analyserades på en GCQ Plus (ThermoFinnigan, USA), utrustad med en A200S autoinjektor (CTC Analytics, Switzerland) och en VF-200ms kolonn (factor FOUR, 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm bonded phase) från Varian Inc. (USA). Injectorn kördes in splitless mode vid 275 o C. Tryck och temperatur hos gaskromatografen var enligt följande: konstant hastighet om 40 cm/s He; initial temperatur 80 o C konstant i 2 min; 30 o C/min höjning till 180 o C följt av konstant temperatur i 2 min; 3 C/min höjning till 205 C och konstant temperatur i 1 min; 10 C/min höjning till 260 C och konstant temperatur i 5 min; 20 C/min höjning till 300 C och konstant temperatur i 10 min. Jonkällan och transfer line temperaturer var 175 C respektive 250 C. Mass-data med elektron jonisering vid 70 ev insamlades i full-scan mode. Identifiering gjordes genom att jämföra retentionstider och Metoder för extration och analys av avloppsvatten och ytvatten har beskrivits tidigare (Paxeus 2004). Korfattat så extraherades proverna med hjälp av RP C18 (6 ml, 1 g sorbent) fast-fas extraktions kolonner (IST Inc, UK) och eluerades med 10 ml aceton. Efter industning över kväve derivatiserades provet (metylerades) med metylkloroformat. Analys med GC-MS utfördes enligt ovan men med ett temperaturprogram och karakteristiska joner som beskrivits tidigare av Paxeus (2004). 2.7 Fisk-plasma modellen Teoretiska plasmakoncentrationer (steady-state) i fisk har beräknats enligt Hugget m.fl I modellen så beräknas biokoncentrationen av läkemedel till blodplasman. Fördelningen mellan vattenfasen och 15

18 blodet är baserat på en ekvations som är framtagen av Fitzimmons m.fl. (2001): 3 Resultat log P blood:water = 0,73 x log K ow 0,88 I ekvationen är P blood:water ekvivalent med biokoncentrationsfaktorn (BCF), och K ow är läkemedels oktanol:vatten-fördelningskoefficient, som i sin tur är ett mått på läkemedlets hydrofobicitet. En steady state plasma-koncentration för en exponerad fisk (F ss PC) räknas sedan enkelt ut som produkten av P blood:water och exponeringskoncentrationen enligt: F ss PC = exponeringskoncentration (µg/l) x P blood:water Som en första tier är det ofta bättre att ha en konservativ modell än en icke-konservativ. Vi har därför i denna studie valt att inte korrigera det teoretiskt beräknade upptaget i fisk för substansernas pka värden utan har utgått från ett worst-case d.v.s. att substanserna föreligger till 100 % i oladdad form. Vi har använts oss av de lägsta humana C max värdena (maximal uppmätt koncentration efter en normal dosering) som vi kunnat finna i litteraturen. 3.1 Fältexponeringar uppmätta läkemedelskoncentrationer Medelkoncentrationen för varje läkemedel i det vatten som fiskarena exponerades för under försökstiden (14 23 dygn) vid de tre olika reningsverken anges i Tabell 3-1. De uppmätta exponeringskoncentrationerna för de olika läkemedelssubstanserna varierade på lite olika sätt mellan de olika reningsverken. Notera att fisken vid Ryaverket exponerades för 100 % avloppsvatten medan fisken i Spenshult och Gråbo exponerades för ca 50 % avloppsvatten. Angivna värden i tabellen syftar på det utspädda avloppsvattnet. Om man räknar tillbaka till 100 % avloppsvatten så var nivåerna av gemfibrozil och ketoprofen mest lika mellan reningsverken, följt av diklofenak (överrepresenterat vid Ryaverket) och naproxen (underrepresenterat vid Ryaverket). För ibuprofen, som är ett läkemedel som används i stora mängder men bryts ned ganska lätt, var skillnaderna störst, med de högsta nivåerna i Spenshult och lägsta i Ryaverket. Tabell 3-1. Uppmätta exponeringskoncentrationer (µg/l) för de olika läkemedelssubstanserna vid de tre reningsverken (medel ± standardavvikelse). Aktiv substans Reningsverk Ryaverket nedströms Gråbo Spenshult (50 %) Ibuprofen 0,0045 (0,0027) 0,014 (0,013) 0,048 (0,029) Naproxen 0,25 (0,17) 0,68 (0,33) 0,043 (0,016) Diklofenak 2,32 (0,48) 0,64 (0,28) 0,28 (0,08) Ketoprofen 0,28 (0,18) 0,10 (0,04) 0,23 (0,08) Gemfibrozil 1,05 (0,25) 0,54 (0,23) Approx. 1 5 a a Interferens med en fettsyra med lång kolkedja förhindrade en säker kvantifiering. 16

19 3.2 Fiskblod uppmätta läkemedelskoncentrationer Trots med lätthet uppmätta mängder av ketoprofen i vattnet vid alla reningsverken kunde inte denna substans detekteras i blodplasman på någon plats vid någon tidpunkt (5 6 fiskar analyserade per tidpunkt och plats). Detta stämmer med resultaten från akvariestudien som visade på en förhållandevis låg biokoncentrationsfaktor om 0,1. Alla andra NSAIDs samt gemfibrozil kunde detekteras i blodplasma från fisk exponerad vid Ryaverket (Tabell 3-2). Förutom gemfibrozil som återfanns i blodplasman hos fisk i Spenshult kunde inget annat läkemedel detekteras i fisk exponerad nedströms Gråbo reningsverk eller vid Spenshult (Tabell 3-2). Vid Ryaverket var uppmätta halter av alla läkemedlen i blodplasman ungefär lika höga vid det första mättillfället (2 dygns exponering) som efter 8 respektive 16 dygn, vilket tyder på att steady state uppnåddes inom 2 dygn. Medelvärden för Ryaverket i Tabell 3-2 är ett medelvärde av alla tre provtagningarna. 3.3 Jämförelse av beräknade och uppmätta koncentrationer i blodplasma Vid en jämförelse av beräknade biokoncentrationsfaktorer från plasmamodellen (baserat på fettlöslighet enbart) så stämmer uppmätta biokoncentrationsfaktorer för naproxen och gemfibrozil beräknade via uppmätta nivåer från försöket vid Ryaverket ganska bra överens (Tabell 3-3). Då vi inte kunde detektera ketoprofen har vi inget jämförelsevärde för denna substans, men om plasmakoncentrationerna skulle ligga strax under detektionsgränsen är detta inte långt under beräknade nivåer för modellen. För diklofenak var den uppmätta biokoncentrationsfaktorn vid Ryaverket drygt 20 ggr lägre än den modellerade, och för ibuprofen drygt 200 ggr högre än modellerade värden. I fisk från Gråbo och Spenshult kunde inte ibuprofen detekteras alls. Det tyder på en mycket lägre biokoncentrationsfaktor än vid Rayverksförsöket. Gemfibrozil uppvisade en låg biokoncentrationsfaktor vid Spenshult jämfört med såväl modellerade data som uppmätt biokoncentration vid Ryaverket. Tabell 3-2. Uppmätta koncentrationer av läkemedelssubstanser i blodplasma (ng/ml) hos fisk exponerad för avloppsvatten (medel ± standardavvikelse). Aktiv substans Exponeringsplats Ryaverket nedströms Gråbo Spenshult (50 %) Ibuprofen 84 (62) <mdl <mdl Naproxen 14 (9) <mdl <mdl Diklofenak 12 (14) <mdl <mdl Ketoprofen <mdl <mdl <mdl Gemfibrozil 210 (400) <mdl 8,0 (5,5) <mdl = mindre än metodens detektionsgräns, det vill säga ca <3 ng/ml. Tabell 3-3. Beräknade biokoncentrationsfaktorer från plasmamodellen samt uppmätta biokoncentrationsfaktorer vid de olika reningsverken. Ryaverket Gråbo Spenshult Biokonc.faktor modell Biokonc.faktor uppmätt Biokonc.faktor uppmätt Biokonc.faktor uppmätt Ibuprofen <214 <63 Naproxen <4 <70 Diklofenak <5 <11 Ketoprofen 20 <11 <29 <13 Gemfibrozil <6 2 8 a a Osäker beräkning se tabell

20 Biokoncentrationsfaktorerna för ibiprofen, naproxen och gemfibrozil var mycket lägre vid Gråbo än vid Ryaverket, men p.g.a. detektionsgränsen går det inte att dra någon slutsats om detsamma gällde för Diklofenak och ketoprofen (Tabell 3-3). 3.4 Riskbedömning/prioritering baserad på fisk-plasmamodellen För att bedöma hur stor risken är för en farmakologisk effekt på vattenlevande organismer för de olika läkemedlen/avloppsvattnen så har effekt kvoter ( effect ratios ) beräknats (Tabell 3-4). Diklofenak har lägst ER (=högst risk) följt av gemfibrozil. Man kan notera att ibuprofen har ett mycket lägre uppmätt ER vid Ryaverket jämfört med det teoretiska värdet. Vid Gråbo och Spenshult kunde inte ibuprofen detekteras i blodplasma, vilket ger en mycket högre minsta möjliga ER givet en detektionsgräns på 3 ng/ml i blodplasman. För de flesta läkemedel/avloppsvatten är kvoten mellan uppmätta ER och teoretiska ER (d.v.s. ett mått på hur bra modellen är) ganska nära 1. För diklofenak (alla platser) överskattas risken minst en tiopotens med den teoretiska modellen, och detsamma gäller gemfibrozil i Gråbo och Spenshult (understrukna värden). Modellen underskattar kraftigt risken med ibuprofen vid Ryaverket (mörkt skuggat). Tabell 3-4. Miljöriskbedömning/prioritering av läkemedel i avloppsvatten baserat på kvoten ( effect ratio, ER) mellan terapeutisk blodplasmakoncentration i människa och uppmätt eller beräknad koncentration i fisk exponerad för olika avloppsvatten. Ju lägre ER, desto större är risken för en farmakologisk effekt på akvatiska organismer. För närmare beskrivning se introduktionen samt figur 1-1. ER anges såväl för uppmätta plasmanivåer i fisk som för teoretisk beräknade plasmanivåer. En kvot som indikerar hur väl den teoretiska modellen stämde med uppmätta nivåer anges för varje läkemedel och reningsverk. Human terapeutisk plasmakoncentration (ng/ml) Ryaverket Gråbo Spenshult Ibuprofen Naproxen Diklofenak Ketoprofen Gemfibrozil Uppmätt ER 179 >5 000 >5 000 Teoretisk ER Uppmätt/teoretisk 0,004 >0,4 >1, Uppmätt ER >6 667 >6 667 Teoretisk ER Uppmätt/teoretisk 0,5 >5,5 >0,4 250 Uppmätt ER 21 >83 >83 Teoretisk ER 1,0 3 8 Uppmätt/teoretisk 22 >24 > Uppmätt ER >333 >333 >333 Teoretisk ER Uppmätt/teoretisk >1,9 >0,7 >1, Uppmätt ER 71 > Teoretisk ER Uppmätt/teoretisk 2,1 >76 >53 18

21 4 Diskussion Alla fyra NSAIDs (ibuprofen, naproxen diklofenak och naproxen) samt en fibrat (gemfibrozil) återfanns i avloppsvattnet från alla reningsverken. Skillnaderna i koncentrationer mellan reningsverken kan sannolikt förklaras av en kombination av variation i inkommande koncentrationer och varierande reningseffektivitet. Vi visar vidare att alla de undersökta substanserna kan tas upp av fisk. Ketoprofen biokoncentreras dåligt i akvarieförsök jämfört med de andra läkemedelssubstanserna. I studier med mer realistisk exponering via avloppsvatten visar vi att alla studerade substanser utom ketoprofen biokoncentreras i fisk och kan mätas i fiskens blodplasma. Detta gör det möjligt att utvärdera en modell för biokoncentration som ligger till grund för en initial riskbedömning baserat på jämförelse mellan koncentrationen i fiskens blod och den terapeutiska plasmakoncentrationen hos människa. Alla substanser utom ibuprofen uppvisade ungefär lika hög, lägre eller betydligt lägre biokoncentrering än vad den teoretiska modellen förutspådde. För ett prioriteringsverktyg är det ofta bättre att överskatta risker med några substanser än att underskatta risker. Om man underskattar risken med en substans brukar det leda till att man inte följer upp denna närmare. För att minska denna risk är det ofta oundvikligt att ett initialt selektionssystem även fångar upp en del falska postiver d.v.s. pekar ut en möjlig risk med substanser som egentligen inte utgör någon större risk. Vid mer fördjupade studier blir det viktigare att kunna peka ut vilka de falska positiverna var. Anledningen till att det fanns en del falska positiver (överskattningar av plasmakoncentrationen i fisk med modellen) tror vi kan förklaras framför allt av följande skäl: För det första så baseras den QSPR (quantitative structure property relationship) som utgör basen för modellen inte på läkemedel. Modellen beräknar biokoncentrationen över gälarna med hjälp av substansernas oktanol-vatten-fördelning, ett mått på substansernas fettlöslighet. Grunden för denna modell är endast två studier av ett begränsat antal substanser med oladdade, hydrofoba industrikemikalier (Bertelsen et al. 1998; Fitzsimmons et al. 2001). I motsats till dessa är läkemedel ofta laddade vid neutralt ph och innehåller ofta två eller flera sura/ basiska funktionella grupper. Alla läkemedelsubstanserna i denna studie har pk a värden under 5, d.v.s. de förekom sannolikt i laddad form vid det ph som exponeringstudierna utfördes vid (ca 7). Joniserade substanser uppvisar vanligen mycket lägre biokoncentration än oladdade, vilket sannolikt är en delförklaring till en överskattning av modellen för några läkemedel. Det skall dock påpekas att om vi hade justerat modellen för substansernas pk a värden hade underskattningen av ibuprofens biokoncentration vid Ryaverket blivit ännu större. För det andra tar modellen inte hänsyn till några aktiva exkretionsmekanismer i fisken. En snabb, aktiv exkretion kan göra att steady-state-nivåerna blir lägre än vad som predikteras via modellen. Vi känner dock inte till hur snabbt fisk metaboliserar och utsöndrar de undersökta substanserna. För det tredje så kan biotillgängligheten vara betydligt lägre i verkligheten än vad modellen (som baseras på substanser lösta i rent vatten) förutspår. Ett mycket slående resultat var att biokoncentrationen skiljde sig markan åt för ibuprofen och gemfibrozil mellan de olika anläggningarna. Inga läkemedel detekterades i fisken exponerad i Gråbo, och endast gemfibrozil kunde mätas i blodplasman från fisk i Spenshult, och då i mycket lägre koncentrationer än vid Ryaverket. En skillnad mellan Spenshult och Gråbo å ena sidan och Ryaverket å andra sidan är att avloppsvattnet var utspätt med ytvatten (ca 50 %) i Gråbo och Spenshult. Vi kan inte utesluta att substanser i ytvattnet kan ha begränsat upptaget. Man vet t.ex. att många läkemedel kan binda till naturliga kolloider och suspenderade sediment i ytvatten (Ternes et al. 2004). Alternativt kanske det finns ämnen i Ryaverkets avloppsvatten som ökar upptaget. Man kan notera att Ryaverket är det enda undersökta reningsverket som också blandar in industriellt avloppsvatten. Försöket i Gråbo utfördes vid mycket lägre vattentemperatur (2 C) än försöken vid Ryaverket (12 C) och Spenshult (13,6 C). Hade vi inte sett att biokoncentrationen av ibuprofen och gemfibrozil också var mycket lägre i Spenshult så hade vi sannolikt dragit slutsatsen att den låga temperaturen i Gråbo hade varit den primära orsaken till en mycket låg biokoncentration. Vid så låga temperaturer filtreras mycket mindre mängder vatten effektivt via gälarna i kombination med ett lägre blodflöde genom gälfilamenten. Den låga temperaturen och därmed en begränsning av upptaget kan 19