Biologisk karakterisering av renat processvatten

Nr U 5686 Augusti 2016 Biologisk karakterisering av renat processvatten Tester med alg, kräftdjur och fisk På uppdrag av Preem AB Ann-Sofie Allard, Eva-Lena Härnwall, Tomas Viktor

Författare: Ann-Sofie Allard, Eva-Lena Härnwall, Tomas Viktor På uppdrag av: Preem AB Rapportnummer U 5686 IVL Svenska Miljöinstitutet 2016 IVL Svenska Miljöinstitutet AB, Box 210 60, 100 31 Stockholm Tel 010-788 65 00 // Fax 010-788 65 90 // www.ivl.se Rapporten har granskats och godkänts i enlighet med IVL:s ledningssystem

Innehållsförteckning Sammanfattning... 4 Inledning... 4 Provvatten... 5 Metoder... 5 Alger... 5 Kräftdjur... 5 Fisk... 5 Resultat... 5 Alg... 5 Kräftdjur... 6 Fisk... 6 Referenser... 7 Bilaga 1... 9 Metoder algtest... 9 Bilaga 2... 10 Metoder kräftdjurstest... 10 Validitetsparametrar... 11 Bilaga 3... 12 Metoder fisktest... 12 Allmänt 12 Lekprocedurer... 12 Embryo/yngel tester... 12 Bilaga 4... 14 Försöksprotokoll alger... 14 Bilaga 5... 15 Försöksprotokoll kräftdjur... 15 Bilaga 6... 16 Försöksprotokoll fisk... 16

Sammanfattning En biologisk karakterisering av renat processvatten från Preemraffs anläggning i Lysekil har gjorts. Tester med alg (Phaeodactylum tricornutum), kräftdjur (Nitocra spinipes) och fisk (Danio rerio) utfördes. Ingen negativ effekt på tillväxten av algen Phaeodactylum tricornutum kunde påvisas ens vid 100 % (v/v) inblandning av processvattnet. Testen för larvutvecklingshastighet med Nitocra spinipes visade en signifikant påverkan på dödligheten (mr) vid 16 % (v/v) inblandning (LOEC, Lowest observed effect concentration). Den högsta koncentrationen där ingen effekt kunde påvisas var 6,4 % (v/v) inblandning (NOEC, No observed effect concentration). Eftersom en ökad dödlighet kunde konstateras från 16 % (v/v) inblandning och endast ett fåtal djur överlevt till försöksslut i de högre koncentrationerna kan medellarvutvecklingshastigheten (LDR) inte beräknas med säkerhet. Vattnets akuta toxicitet mot de tidiga stadierna av djuren var större än dess subletala effekt. Embryo/yngeltest med sebrafisk (Danio rerio) visade ingen signifikant påverkan på kläckningstiden eller antalet kläckta yngel i outspätt processvatten (100 % (v/v) inblandning). Medianöverlevnadstiden för embryo/yngelstadiet påverkades signifikant i två av tre replikat i koncentrationer från 63 % (v/v) och högre. Den högsta koncentrationen där ingen effekt kunde påvisas (NOEC) registrerades vid 50 % inblandning. Ingen signifikant förhöjd frekvens av hyperaktivitet hos utkläckta yngel registrerades i någon av de testade koncentrationerna. En signifikant förhöjd deformationsfrekvens registrerades ned till 50 % (LOEC). Vid 40 % inblandning kan ingen säkerställd signifikant deformationsfrekvens registreras i någon serie (NOEC). Inledning På uppdrag av Preem AB, har IVL Svenska Miljöinstitutet utfört en biologisk karakterisering av renat processvatten från Preemraff i Lysekil. Organismer från tre olika trofinivåer (alg, kräftdjur och fisk) användes enligt handboken Kemisk och biologisk karakterisering av punktutsläpp till vatten (Naturvårdsverket, 2011). Tillväxtförsök med alger utfördes med Phaeodactylum tricornutum. Den marina kiselalgen har länge använts i olika laboratorieförsök och i toxicitetstester för att utvärdera effekterna av industriutsläpp. Test på störningar på tidiga utvecklingsstadier hos kräftdjur utfördes med Nitocra spinipes. Den subkroniska endpointen medellarvutvecklingshastighet (LDR, Larval Development Rate) och dödligheten (mr, mortality rate) bestämdes. Reproduktionsstörningar hos fisk mättes som påverkan på tidiga utvecklingsstadier hos sebrafisk (Danio rerio). Kläckningsförmågan hos befruktade embryon, överlevnad för embryo/yngelstadier samt eventuella beteendeförändringar och deformationer på utkläckta yngel studerades. 4

Provvatten Provet bestod av renat processvatten från mätpunkt V8B från Preemraffs anläggning i Lysekil. Stickprover tagna 20, 21, 22, 25, 26 och 27 april 2016 skickades direkt efter provtagningen till IVLs laboratorium i Stockholm där de omedelbart frystes. De frusna delproverna tinades och blandades till ett veckoprov. Veckoprovet delades sedan upp i portioner för de olika testerna och förvarades frysta fram till teststart. Metoder Alger 72 timmar tillväxtinhiberingstest utfördes med kiselalgen Phaeodactylum tricornutum. Testet har utförts med Marine Algaltoxkit (MicroBioTests Inc) enligt tillverkarens manual. Testet följer SS EN ISO 10253:2006. För närmare detaljer se bilaga 1. Kräftdjur Kräftdjuret Nitocra spinipes användes som testorganism. Preliminär test för akut toxicitet mot vuxna djur utfördes enligt SS 02 81 06. Resultatet från denna test utnyttjades för val av testkoncentrationer i LDR-testet. LDR testet utfördes efter ISO/TS 28220:2016 samt Breitholtz och Bengtsson 2001. För närmare detaljer se bilaga 2. Fisk Embryo/yngeltest med sebrafisk (Danio rerio) utfördes enligt SS 28193. För närmare detaljer se bilaga 3. Resultat Alg Ingen negativ effekt på tillväxten av kiselalgen Phaeodactylum tricornutum kunde påvisas ens vid 100 % (v/v) provinblandning. Fullständigt försöksprotokoll visas i bilaga 4. 5

Kräftdjur Resultaten visas i figur 1. 100 80 60 % LDR 40 mr 20 0 Kontroll 2.6% 6.4% 16% 40% 80% 100% Figur 1 Larvutvecklingshastighet LDR uttryckt som procent N. spinipes copepoditer av totala antalet djur vid försöksslut samt dödlighet (mr) i procent. Djuren exponerades i 7 dygn. Felstaplar visar 95 % konfidensintervall. Lägsta koncentrationen där en signifikant ökad dödlighet (mr) kunde observeras var 16 % (v/v) inblandning (LOEC, Lowest observed effect concentration) av processvattnet och en starkt signifikant skillnad påvisades vid 40 %. Högsta koncentrationen där ingen effekt kunde påvisas var 6,4 % inblandning (NOEC, No observed effect concentration eller ej signifikanta skillnader). En signifikant skillnad i LDR (Larval Development Rate) kunde påvisas vid en högre inblandning av processvattnet (80 %). Eftersom en starkt ökad dödlighet kunde konstateras från 40 % inblandning och endast ett fåtal djur överlevt till försöksslut i de högre koncentrationerna kan LDR inte beräknas med säkerhet. Vattnets akuta toxicitet mot de tidiga stadierna av djuren var större än dess subletala effekt. Fullständigt försöksprotokoll visas i bilaga 5. Fisk Resultaten från testet med embryo/yngel redovisas i tabell 1 där gränsvärden för effekt på de olika responsvariablerna rörande toxiska effekter anges. Resultaten baseras på de tre olika replikaten från huvudförsöket samt resultatet från det inledande förförsöket. I tabell 2 anges gränsvärdena för effekter på de subletala variablerna deformationer och beteendeförändringar hos nyligen kläckta yngel. Resultaten anges som LOEC-NOEC värden för processvattnet från Preemraff. 6

Tabell 1. Effekter av processvattnet från Preemraff på reproduktionen hos sebrafisk mätt som påverkan på kläckning och överlevnad. Resultaten från huvudförsöket redovisas som LOEC-NOEC värden uttryckta i % (v/v) processvattenkoncentration för replikat a, b och c. En förtestserie redovisas som kompletterande resultat. Prov Kläckningstid Medianöverlevnadstid LOEC NOEC LOEC NOEC Replikat a >100 n.a. 63 50 Replikat b >100 n.a. 63 50 Replikat c - n.a 100 80 Förtest >100 n.a. 82 75 n.a. kan inte beräknas då LOEC >100% (v/v). Kläckningstiden för yngel påverkades inte signifikant i outspätt processvatten (>100 % v/v). Medianöverlevnadstiden för embryo/yngelstadiet påverkades signifikant i koncentrationer ned till 63 % (v/v) inblandning. Ej signifikanta skillnader (NOEC) registrerades för variabeln medianöverlevnadstid vid 50 % inblandning av processvattnet i de olika replikaten. Tabell 2. Effekter av processvattnet från Preemraff på de subletala variablerna deformation och beteendeförändringar hos yngel av sebrafisk. Resultaten redovisas som LOEC-NOEC värden uttryckta i % (v/v) processvattenkoncentration för replikat a, b och c samt en förtestserie. Prov Beteendeförändringar hyperaktivitet Deformationer LOEC NOEC LOEC NOEC Replikat a >100 n.a. 50 40 Replikat b >100 n.a. 80 63 Replikat c >100 n.a. 80 63 Förtest >100 n.a. 82 75 n.a. kan inte beräknas då LOEC >100% (v/v) Ingen signifikant förhöjd frekvens av hyperaktivitet hos utkläckta yngel registrerades i någon undersökt koncentration. En signifikant förhöjd deformationsfrekvens registrerades ned till 50 % (v/v) inblandning av processvatten i replikat a. I de övriga två replikaten och förtesten registrerades en signifikant förhöjd deformationsfrekvens ned till 80 % (v/v) processvattenkoncentration. Den lägsta koncentration där någon signifikant effekt (LOEC) kan säkerställas för denna testomgång med processvatten är 50 % (v/v) inblandning. NOEC för variabeln deformation bestämdes till 40 % (v/v) inblandning av processvatten för serie a och 63 % (v/v) för övriga replikat. Detta innebär att 40 % (v/v) inblandning är den koncentration som anges som NOEC-värdet för denna testomgång med processvatten. Fullständigt försöksprotokoll visas i bilaga 6. Referenser Breitholtz M, Bengtsson B-E. 2001. Oestrogens have no hormonal effect on the development and reproduction of the harpacticoid copepod Nitocra spinipes. Marine Pollution Bulletin 42: 879-886 7

ISO/TS 18220:2016. Water quality -- Larval development test with the harpacticoid copepod Nitocra spinipes ISO 10253:2006 Vattenundersökningar - Bestämning av tillväxthämning på marina alger, Skeletonema costatum och Phaeodactylum tricornutum Naturvårdsverket (2011): Kemisk och biologisk karakterisering av punktutsläpp till vatten. En handbok med vägledning om bestämning av egenskaperna hos utsläpp av avloppsvatten. Handbok 2010:3SS 02 81 06. 1991. Vattenundersökningar- Bestämning av toxicitet hos kemiska produkter och avloppsvatten med kräftdjuret Nitocra spinipes Boek Statisk metod, akut toxicitet. SS 028193. 1988. Determination of embryo-larval toxicity to freshwater fish - Semistatic procedure 8

Bilaga 1 Metoder algtest En 72 timmars tillväxthämningstest utfördes med den marina kiselalgen Phaeodactylum tricornutum. Testen utfördes med Marine Algaltoxkit (MicroBioTests Inc) och följer SS-ENISO 10253:2006 Water Quality - Marine Algal Growth Inhibition Tests with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum. Då provvattnet innehöll partiklar som kan störa testet filtrerades det genom 0,45µm membranfilter innan teststart. Akvariesalt (Instant Ocean Sea Salt Mix, Aquarium Systems, Frankrike) tillsattes för att uppnå samma salthalt som mediet och provvattnet ph-justerades till ph 8. Medium för odling, spädning samt koncentrerad algsuspension bereddes enligt tillverkarens anvisningar. Följande koncentrationer (inblandningar) bereddes: kontroll (endast medium), 6,25 %, 12,5 %, 25 %, 50 % och 100 % inblandning av testvattnet (v/v). Koncentrerad algsuspension tillsattes till samtliga koncentrationer så att algdensiteten blev 1x10 4 /ml. 25 ml av de olika koncentrationerna tillsattes till 10 cm långa testkyvetter (3 replikat per koncentration). Den optiska densiteten lästes sedan av med spektrofotometer (Jenway 6300, Bibby Scientific Ltd) vid 670 nm (tid 0). Testkyvetterna placerades sedan i plasttråg i inkubator och inkuberades enligt anvisningar vid 20 ±2 o C och ca 10000 lux. Densiteten lästes av enligt ovan efter 24, 48 och 72 timmar. Resultaten beräknades enligt standard och tillverkarens anvisningar. 9

Bilaga 2 Metoder kräftdjurstest Nitocra spinipes har flera utvecklingsstadier uppdelade på flera nauplie- och copepoditstadier. Det sista nauplie- och första copepoditstadiet utgör två morfologiskt tydligt urskiljbara stadier. Efter 6-8 dagars exponering har ca 50 % av djuren i kontrollvattnet övergått till det första copepoditstadiet. Kvoten mellan antalet copepoditer och det totala antalet djur i varje replikat beräknas. Denna subkroniska endpoint kallas medellarvutvecklingshastighet (LDR Larval Development Rate). LDR presenteras alltid tillsammans med dödligheten (mr mortality rate) vid tidpunkten för avläsning. Detta görs för att se om effekterna är subletala eller inte. Preliminär test för akut toxicitet mot vuxna djur utfördes enligt SS 02 81 06. Ingen negativ effekt kunde påvisas vid 100 % inblandning av testvattnet. Resultatet från denna test utnyttjades för val av testkoncentrationer i LDR-testerna. LDR testet utfördes efter ISO/TS 28220:2016 samt Breitholtz och Bengtsson 2001. Innan teststart plockades ca 300 honor med välutvecklade äggsäckar till odlingsskålar för att få tillräckligt många nykläckta nauplier till försöket. Som mat användes algen Rhodomonas salina med en celltäthet i odlingsskålarna på 2,5 x 10 5 /ml. Som kontrollvatten och spädvatten användes ett naturligt brackvatten från en oförorenad lokal med saliniteten 6. Då provvattnet innehöll partiklar som stör testet filtrerades det genom GF/A glasfiberfilter innan det blandades med akvariesalt (Instant Ocean Sea Salt Mix, Aquarium Systems, Frankrike) till samma salthalt som spädvattnet. Både provvattnen och spädvattnet ph-justerades till 8,0 (+ 0,2). Följande koncentrationer (inblandningar) användes: kontroll (endast spädvatten), 2,6 %, 6,4 %, 16 %, 40 %, 80 %, och 100 % inblandning av testvattnet (v/v). Vid teststart plockades nyfödda djur (kläckta inom 36 timmar) och fördelades slumpmässigt i de olika testkoncentrationerna. Som testkärl användes Multiwellplattor (Nunc) med 12 brunnar per platta. Ca 10 djur per replikat och 8 replikat per koncentration användes (ca 80 djur sammanlagt per testkoncentration). Testvolymen var 4 ml/brunn. Antalet nauplier per brunn kontrollräknades med hjälp av stereolupp. Djuren matades med algen Rhodomonas salina (celltäthet i brunnarna 2,5 x10 5 /ml). Varannan dag byttes 70 % av provvattnet och ny mat tillsattes. All exponering skedde i mörker i klimatskåp i 21 + 1 C. Från dag 6 kontrollerades förhållandet mellan antalet nauplier och copepoditer varje dag. Då cirka 50 % av djuren i kontrollbrunnarna blivit copepoditer avbröts försöket. Alla de olika koncentrationerna räknades med hjälp av stereolupp, med avseende på antal nauplier och copepoditer. LDR beräknas genom att jämföra antalet copepoditer i förhållande till det totala antalet djur i varje testkoncentration och denna kvot jämförs med kontrollen. Antalet döda/saknade djur noterades för bestämning av mr (mortality rate). 10

Resultaten behandlades statistiskt med one-way ANOVA följt av Dunnett s post-test (GraphPad Prism for Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com) Validitetsparametrar ph-värdena för de olika koncentrationerna låg inom för testen godkänt intervall under hela försöksperioden. Vattnens syremättnad var minst 90 % av kontrollens syremättnad under hela försöksperioden. Temperaturen låg mellan 20 och 21 o C under hela försöksperioden. Medeltalet av copepoditfraktionerna i konrollbrunnarna låg inom godkänt intervall. Medeltalet döda djur i kontrollbrunnarna översteg inte 20 % vid tidpunkten för avläsning av LDR. 11

Bilaga 3 Metoder fisktest Allmänt Blivande föräldrafiskar för försöken togs ur fisk uppfödd i egen regi. Alla fiskar var acklimatiserades till de förhållanden som råder på laboratoriet. Förhållandena görs så optimala för arten som möjligt avseende vatten, föda och ljus. Allt spädvatten som används vid försöken tillverkas på laboratoriet enligt standardföreskrifter redovisade i SS 28193. Spädvattnet bereds genom att kranvatten behandlas med omvänd osmos. Det behandlade vattnet innehåller endast spår av metaller, organiska ämnen och en konduktivitet < 5 ms cm -1. Salter tillsätts och spädvattnet luftas över natten för att ph skall stabiliseras och vattnet erhålla en O2-halt överstigande 95 %. Försöken utfördes i tempererade konstantrum med en ljusperiod på 12 timmar. Lekprocedurer Före den planerade leken separerades föräldradjuren könsvis under 4 dygn. 40 hannar och 20 honor separerades i fyra olika akvarier. På kvällen den 4:e dagen överflyttades 20 hannar och 10 honor till var sin lektratt. Lektrattarna är konstruerade av polyeten med ett nät i botten för att förhindra att de fiskar som inte leker skall äta upp rommen som läggs. Rommen som läggs faller ned genom nätet och samlas upp i E-kolvar för vidare examinering. Leken initieras genom att temperaturen höjs från 25 C till 27 C samt att en gryningssimulering utförs under de dygn som fiskarna befinner sig i lektrattarna. Embryo/yngel tester Undersökningarna av effekten på utvecklingen hos embryo/yngel stadier hos sebrafisk av processvattnet genomfördes enligt standardmetoden OECD TG 212 likalydande med SS 028193. En förtestserie utfördes för att gaffla in rätt koncentrationsintervall för huvudförsöket. Slumpmässigt valdes befruktade ägg ut från den totala äggproduktionen som lagts på morgonen. Exponeringen av ägg/yngel skedde sedan i petriskålar av glas. 30 st befruktade ägg överfördes till skålarna innehållande 100 ml spädvatten alternativt olika spädningar av testsvatten. Detta gjordes i två replikat. Efter 24 h räknades de levande embryona och 20 st överfördes för vidare examinering av kläckningsfrekvens/tid samt överlevnad. När alla yngel kläckts i respektive koncentration skapades ett tredje replikat (c). Replikat c består av de kläckta yngel från replikat a och b som överstiger de 20 stycken. Användning av tre replikat ger ökad säkerhet vid beräkning av deformationer och medianöverlevnad hos yngelstadiet. Testlösningarna vid embryo/yngel testerna förnyades dagligen i samband med att avläsning av antalet döda embryo/yngel skedde. Alla levande embryon och yngel flyttades över med flampolerad Pasteurpipett till nyberedda lösningar. Testlösningarna bereds genom att tempererat, ph-justerat med 1M HCl till 7,0 ± 0,1 och svagt genomluftad testvatten blandades med spädvatten. Responsparametrarna som ligger till grund för bedömningen av det undersökta testvattnets effekt är: kläckningsfrekvens hos embryon, mediankläckningstid, medianöverlevnad för embryo/yngelstadier och deformationsfrekvens hos utkläckta yngel. Vidare noterades i denna test 12

även avvikande beteende som hyperaktivitet eller orörlighet hos utkläckta yngel. De statistiska utvärderingarna görs med probitanalys enligt Finney (1992). Kläckningsfrekvensen skall understiga 90 % för att det skall anses som en signifikant påverkan. För parametrarna mediankläckningstid och överlevnad skall de 95 % konfidensintervallen skilja sig jämfört med rent vatten för att anges som en signifikant skillnad. Deformationsfrekvensen skall minst registreras hos två individer/replikat samtidigt under försöket för att en säkerställd signifikant skillnad skall anses föreligga. 13

Bilaga 4 Försöksprotokoll alger Algtest (marin alg Phaeodactylum tricornutum ) Preem Utgående vatten (Preems anläggning i Lysekil) filtrerat 0.45µm 72h E r C 50 Optical Density (OD) Concentration Time Replicate Mean % h 1 2 3 t0 0.009 0.008 0.010 0.009 Control t24 0.0450 0.0300 0.0270 0.0340 ph t48 0.2160 0.1950 0.2080 0.2063 t72 0.5970 0.5330 0.7230 0.6177 9.9 t0 0.012 0.020 0.010 0.014 6.25 t24 0.0310 0.0310 0.0270 0.0297 t48 0.2180 0.2230 0.2180 0.2197 t72 0.6900 0.7230 0.7580 0.7237 10.1 t0 0.016 0.015 0.011 0.014 12.5 t24 0.0380 0.0390 0.0440 0.0403 t48 0.2540 0.2330 0.2430 0.2433 t72 0.8330 0.7910 0.8000 0.8080 10.2 t0 0.017 0.013 0.014 0.015 25.0 t24 0.0430 0.0470 0.0450 0.0450 t48 0.2390 0.2460 0.2460 0.2437 t72 0.8340 0.8630 0.8050 0.8340 10.2 t0 0.012 0.011 0.011 0.011 50.0 t24 0.0500 0.0630 0.0660 0.0597 t48 0.2780 0.2590 0.2730 0.2700 t72 0.8300 0.8930 0.8110 0.8447 10.2 t0 0.011 0.010 0.012 0.011 100 t24 0.0730 0.0610 0.0780 0.0707 t48 0.2580 0.2690 0.2470 0.2580 t72 0.6810 0.6980 0.7540 0.7110 10.1 14

Bilaga 5 Försöksprotokoll kräftdjur B491 Utgående vatten Preem Nitocra spinipes LDR Start 2016-06-09 slut 2016-06-16 Testvattnet uppsaltat till ca 5 promille Spädvatten: Östersjövatten ca 6 promille Kontroll 2.6% CopepoditeNauplier Totalt Dag 0 mr LDR CopepoditeNauplier Totalt Dag 0 mr LDR A1 4 4 8 10 20 50 A1 4 5 9 10 10 44 A2 6 3 9 10 10 67 A2 4 3 7 10 30 57 A3 3 5 8 10 20 38 A3 3 6 9 10 10 33 A4 6 3 9 10 10 67 A4 4 5 9 10 10 44 C1 3 6 9 10 10 33 C1 6 2 8 10 20 75 C2 5 5 10 10 0 50 C2 4 2 6 10 40 67 C3 6 3 9 10 10 67 C3 5 3 8 10 20 63 C4 4 6 10 10 0 40 C4* 4 1 5 10 50 80 Summa 37 35 72 80 80 Summa 30 26 56 70 140 Medel 10.0 51 Medel 20 55 Stdev 7.6 13.9 Stdev 12 15 *Fel volym i brunnen bortagen från beräkningarna 6.4% 16% CopepoditeNauplier Totalt Dag 0 mr LDR CopepoditeNauplier Totalt Dag 0 mr LDR A1 6 1 7 10 30 86 A1 3 3 6 10 40 50 A2 6 2 8 10 20 75 A2 5 4 9 10 10 56 A3 3 6 9 10 10 33 A3 3 6 9 10 10 33 A4 7 2 9 10 10 78 A4 2 6 8 10 20 25 C1 5 3 8 10 20 63 C1 4 2 6 10 40 67 C2 2 6 8 10 20 25 C2 2 5 7 10 30 29 C3 6 2 8 10 20 75 C3 7 0 7 10 30 100 C4 2 6 8 10 20 25 C4 2 3 5 10 50 40 Summa 37 28 65 80 150 Summa 28 29 57 80 230 Medel 19 57 Medel 29 50 Stdev 6.4 25 Stdev 15 25 40% 80% CopepoditeNauplier Totalt Dag 0 mr LDR CopepoditeNauplier Totalt Dag 0 mr LDR A1 3 3 6 10 40 50 A1 0 5 5 10 50 0 A2 4 3 7 10 30 57 A2 0 4 4 10 60 0 A3 3 4 7 10 30 43 A3 1 3 4 10 60 25 A4 0 6 6 10 40 0 A4 1 3 4 10 60 25 C1 0 3 3 10 70 0 C1 0 2 2 10 80 0 C2 0 3 3 10 70 0 C2 1 4 5 10 50 20 C3 2 1 3 10 70 67 C3 0 3 3 10 70 0 C4 5 3 8 10 20 62.5 C4 0 3 3 10 70 0 Summa 17 5 43 80 370.0 Summa 3 27 30 80 500 Medel 46 35 Medel 63 8.8 Stdev 21 30 Stdev 10 12 100% CopepoditeNauplier Totalt Dag 0 mr LDR A1 0 0 0 10 100 0 A2 0 5 5 10 50 0 LDR mr A3 0 4 4 10 60 0 0 vs. 2,6 No ns 0 vs. 2,6 No ns A4 0 3 3 10 70 0 0 vs. 6,4 No ns 0 vs. 6,4 No ns C1 0 2 2 10 80 0 0 vs. 16 No ns 0 vs. 16 Yes * C2 0 2 2 10 80 0 0 vs. 40 No ns 0 vs. 40 Yes **** C3 1 0 1 10 90 100 0 vs. 80 Yes ** 0 vs. 80 Yes **** C4 1 3 4 10 60 25 0 vs. 100 Yes * 0 vs. 100 Yes **** Summa 2 19 21 80 590 Medel 74 16 Stdev 17 35 15

Bilaga 6 Försöksprotokoll fisk Datum (dag 0): 3/6 2016 Provningsansvarig(a): Tomas Viktor Provets beteckning: Kemisk beteckning och hantering: Föräldrafiskar (ursprung, antal, hantering): Uppmätta intervall (min-max) under provningen för: Oxygenhalt, % av luftmättnad: 92-102 ph: 7,1-7,5 Temperatur, o C: 25,0± 1,0 Utgående avloppsvatten från Preem Kyltransporterat vid ankomst; I kylrum vid 4 o C under testernas genomförande. 40 hannar och 20 honor från egen avel Provad e konc. Vol% Initial (24h) dödlighet Antal av totala antalet Kläcknings frekvens Antal yngel % n Kläckning Dygn (95% konfidensintervall) Mediantid Överlevnad Dygn (95% konfidensintervall) Deformationer 100a 2/30 96 20 3,6 ( - )* 14,4 (15,1-13,7)** 10 100b 0/30 90 20 3,8 ( - )* 13,6 (14,2-13,8)** 10 100c*** 18 13,7 (14,2-13,1)** 14 80a 3/30 100 20 3,8 ( - )* 14,7 (16,2-13,5) 5 80b 5/30 100 20 3,7 ( - )* 13,7 (14,5-13,7)** 8 80c*** 12 13,8 (14,4-13,3) 9 63a 6/30 100 20 3,5 ( - )* 13,9 (14,4-13,4)** 8 63b 4/30 100 20 3,8 ( - )* 14,2 (15,3-13,1)** 4 63c*** 10 15,0 (15,4-14,5) 0 50a 5/30 100 20 3,4 ( - )* 15,0 (15,7-14,3) 9 50b 6/30 100 20 3,5 ( - )* 15,1 (15,7-14,5) 4 50c*** 9 14,9 (15,8-14,0) 0 40a 3/30 100 20 3,5 ( - )* 15,2 (15,3-15,1) 4 40b 3/30 100 20 3,7 ( - )* 15,4 (17,8-13,7) 4 40c*** 14 15,0 (17,7-12,4) 7 32a 7/30 100 20 3,5 ( - )* 15,3 (15,4-15,2) 0 32b 3/30 100 20 3,8 ( - )* 15,8 (16,2-15,3) 0 32c*** 10 14,8 ( - ) 0 0a 3/30 100 20 3,5 ( - )* 15,5 (16,1-15,1) 0 0b 0/30 100 20 3,7 ( - )* 15,5 (15,6-15,4) 0 0c*** 17 15,4 (16,6-14,2) 0 % 16

* otillräcklig partiell kläckning för beräkning av konfidensintervall ** signifikant skild överlevnad *** replikat c består av de kläckta yngel från replikat a och b som överstiger de 20 stycken som studeras vidare i varje replikat Kommentarer: Datum: 2016-07-20. Provningsansvarig: Tomas Viktor 17

IVL Svenska Miljöinstitutet AB // Box 210 60 // 100 31 Stockholm Tel 010-788 65 00 // Fax 010-788 65 90 // www.ivl.se