Protein prediktion, homologi och protein engineering

Protein prediktion, homologi och protein engineering

Alignment

Alignment D-E-A-L-V-S-V-A-F-T-S-I-V-G-G D-E-A---------------F-T-S-I-V-G-G D-E-A-F-T-S-I-V-G-G-M-D-D-P-G

Prediktion Prediktion av tertiärstruktur kräver kunskap om sekundärstrukturen Många olika sekvenser samma 3D struktur Prediktion av 3D strukturen från aminosyrasekvens ett (ännu!) olöst problem

Förutsäga 3D strukturen (CASP, Critical assessment of structure prediction, blindtester för utveckling av metoder) Inverse folding Vilka veckningssekvenser är kompatibla med känd veckningsstruktur (fold) Threading Vilka kända folds är kompatibla med specifik sekvens t.ex Eisenbergs metod

Eisenbergs metod Bygger på att man har ett bibliotek med kända 3D strukturer med olika folds Strukturerna karakteriseras på följande sätt: Area av sidokedja som göms av andra proteiner Andel (fraction) som göms av polära atomer Sekundärstruktur Indelas i sex olika klasser och totalt 18 olika klasser. Varje aa har olika poäng för dessa 18 klasser Normering av 3D info till 1D info

Design av Zink finger Modellstruktur Zink finger design

Paracelsus Challenge Pristävling instiftad 1994 Ändra protein fold men bibehålla 50% av sekvenshomologin. Tidigare ansett att mer än 30% sekvenshomologi medför att man har samma fold

Paracelsus Challenge Domän B1 från protein G 56 aa Dimer av Rop, 63 aa

Prediktion av loop strukturer

Reducera scaffold storlek Protein A Z-domäN reduceras i storlek från 59 till 33 aminosyror Agonister till epo receptor reducerades från 160 till 20 aa, ingen känd sekvenshomologi Slutsats: Många lösningar på problemet

Konstruktion av trunkerad Z-domän

Agonist till epo receptor, EMP1 dimer

Bindning av EMP1 till epo receptor

Varför stabilisera proteiner? Förhindra enzymer från nedbrytning Förhindra uppveckning i närvaro av detergent Öka termostabiliteten

Exempel på stabiliserade proteiner Enzymer i bakning Enzymer i tvättmedel

Riktad mutagenes

Vad menas med ett proteins stabilitet? Uppveckat protein Veckat protein

Hur mäter man protein stabiliteten? T m eller C m

Faktorer som påverkar den nativa strukturen Termodynamisk förklaring G = Η Τ Τ S G = - RT ln K K = [veckat protein] / [ uppveckat protein] För stabilisering krävs: H blir mindre eller S större

Strategier för att förändra proteinstabiliten Riktad mutagenes (rationell design) Slumpartad mutagenes (random design)

Modellproteiner T4 Lysozym Cold-shock protein

Ett av de mest välstuderade proteinerna om protein stabilitet T4 Lysozym Över 2000 mutanter och 400 kristallstrukturer Erhållit klara samband mellan struktur och funktion (stabilitet)

T4 Lysozym Förbättra helixpropensitet, t.ex mutant V131A Minska entropin i det uppveckade tillståndet, t.ex mutant A82P Optimera hydrofobinteraktion t.ex mutant I3L Stabilisering av positiva laddningar i helix, t.ex mutant S38D

Design av disulfidbrygga

Stabilisering av helix dipol

Design av stabilt protein Jämförelse mellan protein från mesofil och termofil organism Bs-Csp mesofil Bc-Csp termofil

Hur stabilisera mesofila Bs-Csp? Bs-Csp, mesofil, Tm=53.6 Bc-Csp, termofil, Tm=76.9 10 20 30 40 50 60 MLEGKVKWFNSEKGFGFIEVEGQDDVFVHFSAIQGEGFKTLEEGQAVSFEIVEGNRGPQAANVTKEA MQRGKVKWFNNEKGYGFIEVEGGSDVFVHFTAIQGEGFKTLEEGQEVSFEIVQGNRGPQAANVVK-L Ref: D.Perl & F.X Schmid, J.Mol.Biol. (2001), 313, 343-357

Resultat av rationell design E66L E3R Ref: D.Perl & F.X Schmid, J.Mol.Biol. (2001), 313, 343-357

Slumpartad design Förändra genen helt slumpartat Leta efter den gen som ger ett protein med hög stabilitet Selektionsproblem

DNA shuffling

Modelling av Cephalosporinase

(Error-prone) PCR 5 3 5 95 C 3 5 3 3 50-65 C 5 5 3 5 3 3 72 C 5 3 5 5 3 5 5 3 5

Fagdisplay teknik Varianterna klonas in i virusvektor Genen uttrycks som fusionsprotein på ytan av viruset Selektera efter bindningsegenskaper vid olika [denaturant] Direkt koppling genotyp-fenotyp Ref: Introduction to protein structure, Bränden & Tooze

Fagdisplay av Kunitz domän

Fag display Cold shock protein Startsekvens Bs-Csp 10 20 30 40 50 60 MLEGKVKWFNSEKGFGFIEVEGQDDVFVHFSAIQGEGFKTLEEGQAVSFEIVEGNRGPQAANVTKEA Mutera till alla 20 olika aminosyrorna i 6 positioner som skiljer, selektera fram den stabilaste varianten

Resultat av fag display Selekterad variant, Tm 82,2 0 C MRVGKVKWFNSEKGFGFIEVEGQDDVFVHFSAIQGEGFKTLEEGQLVSFEIVEGNRGPQAANVRKVG LG A T EA Jämför med Bc-Csp, Tm 76,9 0 C, Alla 6 positionerna skiljer sig åt MQRGKVKWFNNEKGYGFIEVEGGSDVFVHFTAIQGEGFKTLEEGQEVSFEIVQGNRGPQAANVVK-L Tm-Csp, Tm 82,0 0 C, 5 av 6 positioner skiljer sig åt MRGKVKWFDSKKGYGFITKDEGGDVFVHWSAIEMEGFKTLKEGQVVEFEIQEGKKGPQAAHVKVVE Slutsats: Proteiner kan stabiliseras med många olika kombinationer av mutationer