Cytology FISH Accessory Kit Kodnr. K 5499 2:a utgåvan För fluorescens in situ hybridisering (FISH) på cytologprov. Satsen innehåller tillräckligt med reagenser för 20 tester.
Innehållsförteckning Sida Avsedd användning...3 Introduktion...3 Reagenser...3 Medföljande material...3 Material som behövs men inte medföljer...3 Försiktighetsåtgärder...4 Förvaring...4 BRUKSANVISNING A. Reagenspreparation...5 A.1 Tvättbuffert...5 A.2 3,7 % Formaldehyd...5 A.3 Stringensbuffert...5 A.4 Etanolserier...5 B. Färgningsprocedur...5 B.1 Proceduranteckningar...5 B.2 Färgningsprotokoll...5 Kvalitetskontroll...7 Tolkning av resultaten...7 Referenser...7 Felsökning...8 Appendix 1...9
Avsedd användning För diagnostisk användning in vitro. Cytology FISH Accessory Kit är avsedd för användning i fluorescens in situ hybridiserings- (FISH) teknik på cytologprov. Introduktion Kitet används i en tvådagars procedur. Den första dagen utförs en förbehandling av cytologproverna (levererade av användaren) med 3,7 % formaldehyd i 2 minuter före dehydrering med etanol. Efter förbehandlingen appliceras användarlevererade FISH-prober och proven förseglas med Coverslip Sealant, före denaturering och hybridisering över natten. Den andra dagen utförs en stringenstvätt som garanterar avlägsnande av obunden och ospecificerad bunden FISHprobe före dehydrering med etanol. Slutligen monteras proven med fluorescensmonteringsmedium innehållande en blå fluorescens kontrastfärgning och förses med täckglas. Resultaten tolkas med ett fluorescensmikroskop försett med lämpligt filter (se Appendix 1). Reagenser Medföljande material Substanserna som räknas upp nedan är tillräckligt för 20 tester (en test definieras som en 18 mm x 18 mm målyta). Flaska 1 Wash Buffer (x 20) 500 ml, 20 x koncentrerad Tris/HCl buffert. Flaska 2 Stringency Buffer (x 20) 150 ml, 20 x koncentrerad SSC (saltlösning-natriumcitrat) buffert med ett tvättmedel. Flaska 3 Artikel 4 Fluorescence Mounting Medium 300 µl Bruksfärdigt fluorescensmonteringsmedium med en blå kontrastfärgning. Coverslip Sealant 1 tub Bruksfärdig lösning för borttagbar försegling av täckglaset. OBS: Alla reagenser är specifikt formulerade för användning med denna sats. Material som behövs men inte medföljer Laboratoriereagenser Destillerat eller avjoniserat vatten Etanol, 96 % Formaldehyd, 37 % Laboratorieutrustning Justerbara pipetter Kalibrerad partiell immersionstermometer (område 37-100 C) Kalibrerad yttermometer (område 37-100 C)
Täckglas (18 mm x 18 mm) Pincetter Dragskåp Värmeblock eller hybridiseringsugn för denaturering (82 (±2) C) Fuktig hybridiseringskammare Hybridiseringsugn eller inkubator för hybridisering över natten (45 (±2) C) Objektglas, Dako Silanized Slides, kodnr. S 3003, poly-l-lysin-belagda glas, eller superfrostglas Färgningskärl eller -bad Tidtagarur (som kan mäta 2-15 minuters intervall) Vattenbad med lock (som klarar av att hålla 65 (±2) C to 99 C) Mikroskoputrustning med tillbehör Filter för fluorescensmikroskop: DAPI-filter och lämpliga filter för det använda fluorokromet, t.ex. FITC/Texas Red dubbelfilter, eller FITC och Texas Red monofilter för Dako FISH-prober - se Appendix 1 för detaljer Fluorescensmikroskop med en 100 W kvicksilverlampa rekommenderas för Dako FISH-prober Mikroskopglaslåda (kartong för 20 glas med gångjärnsförsett lock eller liknande) Försiktighetsåtgärder 1. För professionell användning. 2. Flaska 1 Wash Buffer (20x), Vial 1, Wash Buffer (20x), innehåller 10-<25% natriumklorid och 10-<20% trometamol. Flaska 1 är märkt: Fara H319 H315 P280 P264 P302 + P352 + P362-2 + P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Orsakar allvarlig ögonirritation. Irriterar huden. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID HUDKONTAKT: Tvätta med mycket tvål och vatten. Ta av nedstänkta kläder. Nedstänkta kläder ska tvättas innan de används igen. Vid hudirritation: Sök läkarhjälp. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. 3. Flaska 2, Stringent tvättbuffert (20x), innehåller 10-<25% natriumklorid och 10-<20% 2- amino-2-(hydroximetyl) propan-1, 3-diolhydroklorid. Flaska 2 är märkt: Fara H319 H315 P280 P264 P302 + P352 + P362-2 + P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Irriterar huden. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID HUDKONTAKT: Tvätta med mycket tvål och vatten. Ta av nedstänkta kläder. Nedstänkta kläder ska tvättas innan de används igen. Vid hudirritation: Sök läkarhjälp. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt
med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. P337 + P313 Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. 4. Artikelt 4, Coverslip Sealant, innehåller 100 % nafta (petroleum), vätebehandlad lätt, och är märkt Fara H225 H304 H411 P280 P210 P241 P242 P243 P233 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P405 P403 P235 P501 Mycket brandfarlig vätska och ånga. Kan vara dödligt vid förtäring om det kommer ner i luftvägarna. Giftigt för vattenlevande organismer med långtidseffekter. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd explosionssäker el-, ventilations-, belysnings- och materialhanteringsutrustning. Använd endast verktyg som inte ger upphov till gnistor. Vidta åtgärder mot statisk elektricitet. Behållaren ska vara väl tillsluten. Undvik utsläpp till miljön. VID FÖRTÄRING: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller dusch. Förvaras inlåst. Förvaras på väl ventilerad plats. Förvaras svalt. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 5. Andra inkubationstider och temperaturer eller metoder än de som specificeras, kan ge felaktiga resultat. 6. Reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan försämra resultatet. Förvaring Flaska 1, Wash Buffer, förvaras vid 2-8 C. Flaska 2, Stringency Buffer, förvaras vid 2-8 C. Flaska 3, Fluorescence Mounting Medium, förvaras mörkt vid 2-8 C. Artikel 4, Coverslip Sealant, förvaras vid 2-8 C. Fluorescensmonteringsmedium (flaska 3) kan påverkas negativt om det exponeras för alltför höga ljusnivåer. Förvara inte denna komponent och utför inte färgningen i starkt ljus, t.ex. direkt solljus. Använd inte satsen efter det utgångsdatum som är tryckt på kartongen till satsen. Om reagenserna förvaras under andra förhållanden än de som specificerats i detta produktblad måste användaren validera reagensresultatet (1). Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför är det viktigt att utvärdera normala celler i de analyserade proven. Om ett oväntat fluorescensmönster observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och något problem med Cytology FISH Accessory Kit misstänks, kontakta vår tekniska service.
BRUKSANVISNING A. Reagensberedning Det är praktiskt att preparera följande reagenser före färgningen: A.1 Tvättbuffert Späd en tillräcklig mängd från flaska 1 (Wash Buffer x 20) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd utspädd buffert kan förvaras vid 2-8 C i en månad. Kasta bort utspädd buffert om den inte ser klar ut. A.2 3,7 % Formaldehyd Bered en tillräcklig mängd 3,7 % formaldehyd genom att späda 37 % formaldehyd 1:10 i utspädd Wash Buffer (Tvättbuffert) (se BRUKSANVISNINGEN, Avsnitt A.1) Förvara i täckta skålar vid rumstemperatur och använd för högst 100 glas. Kasta bort utspädd lösning om den inte ser klar ut. A.3 Etanolserier Preparera tre burkar med respektive 70 %, 85 % och 96 % etanol från 96 % etanollösning. Förvara täckta burkar vid rumstemperatur eller vid 2-8 C o ch använd lösningarna för högst 200 glas. Kasta bort lösningarna om de inte ser klara ut. A.4 Stringensbuffert Späd en tillräcklig mängd från flaska 2 (Stringency Buffer x 20) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd utspädd buffert kan förvaras vid 2-8 C i en månad. Kasta bort utspädd buffert om den inte ser klar ut. B. Färgningsprocedur B.1 Anm. om proceduren Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med alla komponenter innan de används (se Anvisningar och försiktighetsåtgärder). Alla reagenser måste få temperaturjämvikt vid relevant temperatur före användning. Flaska 1: Utspädd Wash Buffer skall uppnå temperaturjämvikt vid rumstemperatur 20-25 C. Flaska 2: Utspädd Stringency Buffer; en burk skall nå jämvikt vid rumstemperatur, en annan burk vid 65 (±2) C före användning. Flaska 3: Fluorescence Mounting Medium kan appliceras vid vilken som helst temperatur från 2-25 C. Artikel 4: Coverslip Sealant kan appliceras vid rumstemperatur. Alla steg måste utföras vid den angivna temperaturen. Proceduren inkluderar dehydreringar följda av torkning av proven. Se till att proven är helt torra innan du går vidare till nästa steg. Låt inte proven torka under de övriga procedurstegen. B.2 Färgningsprotokoll DAG 1 Steg 1: Förbered objektglasen Låt cytologprovglasen uppnå jämvikt vid rumstemperatur. Inkubera glasen i 3,7 % formaldehyd (se BRUKSANVISNINGEN, Avsnitt A.2) i 2 minuter vid rumstemperatur. Ta bort glasen från den 3,7 %-iga formaldehyden och sänk ner dem i utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVINSNINGEN, Avsnitt A.1) i 5 minuter vid rumstemperatur. Byt ut den utspädda Wash Buffer och låt glasen ligga i blöt i ytterligare 5 minuter. Dehydrera cytologprovglasen genom en graderad serie etanol: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol, och 2 minuter i 96 % etanol (se BRUKSANVISNINGEN, Avsnitt A.3).
Låt glasen lufttorka helt. Steg 2: FISH-probe (levererad av användaren) Följande steg skall utföras i ett dragskåp. Applicera en lämplig mängd fluorokrommärkt prob, t.ex. 10 µl av en Dako FISH probe i mitten av provet. Placera omedelbart ett 18 mm x 18 mm täckglas över proben och låt det sprida sig jämnt under täckglaset. Undvik luftbubblor. Om du ser några luftbubblor, slå varsamt bort dem med pincetten. Försegla täckglaset med Coverslip Sealant genom att klämma ut Sealant runt täckglasets kanter. Låt Coverslip Sealant överlappa täckglas och objektglas så att en försegling bildas runt täckglaset. Försäkra dig om att Coverslip Sealant täcker alla kanterna på täckglaset. Placera glaset på en flat metall- eller stenyta (värmeblock eller på ett block i en hybridiseringsugn) föruppvärmd till 82 (±2) C. Denaturera i 5 minuter och kontrollera att temperaturen hos blocket inte sjunker under 80 C någon gång. Placera glasen i en föruppvärmd fuktad hybridiseringskammare. Täck kammaren med ett lock och inkubera över natten (14-20 timmar) vid 45 (±2) C när Dako FISH-prober används. Instrumentering som t.ex. Dako Hybridizer (kodnr. S 2450 och S 2451), som tillåter förhållanden liknande de ovan beskrivna kan användas för denaturering och hybridisering. DAG 2 Steg 3: Stringent Wash Fyll två färgningsskålar, t.ex. Coplinskålar med utspädd Stringency Buffer (se BRUKSANVISNING, Avsnitt A.4). För 1-6 glas i en skål behövs en minsta volym på 100 ml utspädd Stringency Buffer. Använd minst 15 ml buffert per glas för mer än 6 glas. Placera en av färgningsskålarna med utspädd Stringency Buffer vid rumstemperatur i ett dragskåp och den andra i ett vattenbad. Hetta upp vattenbadet och den utspädda Stringency Buffer till 65 (±2) C. Kontrollera att temperaturen har stabiliserat sig. Täck skålen med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Mät temperaturen inuti vattenbadets skål med en kalibrerad termometer för att vara säker på att temperaturen är korrekt. Använd pincetter eller handskar och ta bort glasen från hybridiseringskammaren och ta försiktigt bort Coverslip Sealant och täckglaset och placera glasen i den rumstempererade skålen med Stringent Wash Buffer ett i taget. Så snart alla täckglas har avlägsnats flyttar du glasen från pre-washskålen vid rumstemperatur till skålen i vattenbadet med temperaturen 65 (±2) C. Utför stringent tvätt i exakt 10 minuter vid 65 (±2) C. Ta bort glasen från den utspädda Stringency Buffer och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20-25 C). Byt ut den utspädda Wash Buffer och låt glasen ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Dehydrera glasen i en serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol, och 2 minuter i 96 % etanol (se BRUKSANVISNINGEN, Avsnitt A.3). Låt glasen lufttorka helt. Steg 4: Montering Applicera 15 µl Fluorescence Mounting Medium innehållande blå fluorescenskontrastfärgning (flaska 3) till glasets målområde och lägg på ett täckglas. OBS! Glasen kan avläses efter 15 minuter eller inom 7 dagar efter monteringen. Om glasen utsätts för ljus eller höga temperaturer bleknar de dock. Förvara glasen i mörker vid 2-8 C för att minimera blekning. Kvalitetskontroll 1. Signalerna måste vara ljusa, distinkta och lätta att bedöma. 2. Normala vävnadsceller ger möjlighet till intern kontroll av analyskörningen.
3. Normala celler skall ha klart synliga fluorescenssignaler som är tecken på att FISH-proberna framgångsrikt har hybridiserats till målregionerna. 4. Om inga signaler hittas i normala celler är det ett tecken på att analysen gått fel och resultaten skall anses ogiltiga. 5. Nukleär morfologi måste vara intakt vid utvärdering med ett DAPI filter. Många spöklika celler och en allmänt dålig nukleär morfologi tyder på överdenaturering av provet vilket resulterar i förlust eller fragmentering av signaler. Sådana prov skall anses ogiltiga. Tolkning av resultat Skanna flera områden med celler för att ta hänsyn till eventuell heterogenitet. Välj ett område med god fördelning av kärnor. Börja analysen i den övre vänstra kvadranten i det valda området och medan du skannar från vänster till höger räknar du antalet signaler inom kärngränserna för varje bedömd kärna enligt riktlinjerna nedan. Fokusera upp och ner för att hitta alla signaler i de individuella kärnorna. Räkna två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än två gånger signalens diameter som bara en signal. Räkna inte kärnor utan signaler. Antalet kärnor som skall räknas för varje probe måste bestämmas av användaren. Referenser 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR 7163, February 28, 1992. Felsökning Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd
Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Inga signaler eller svaga signaler 1a. Mikroskopet fungerar inte tillfredsställande - olämpligt filter insatt - inte rätt lampa - kvicksilverlampan för gammal - Smutsiga och/eller spruckna kollektorlinser - Olämplig immersionsolja 1b. Blekta signaler 1c. Avdunstning av proben under hybridiseringen 1d. Denatureringsförhållanden inkorrekta 1e. Stringenttvättförhållandena inkorrekta 1a. Kontrollera mikroskopet och att de använda filtren är lämpliga för användning med fluorokromerna och att kvicksilverlampan är riktig och inte har använts bortom sin förväntade livslängd. (se Appendix 1). Om du tvekar, kontakta mikroskopförsäljaren. 1b. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starka ljuskällor. 1c. Se till att det är tillräckligt fuktigt i hybridiseringskammaren 1d. Försäkra dig om att denatureringstemperature n är 82 (±2) C 1e. Kontrollera att den rekommenderade stringenttvättemperaturen används och att täckglasen tas bort innan stringenttvätten utförs 2. Områden utan signal 3. Överdriven bakgrundsfärgning 4. Dålig kärnmorfologi eller svag kärnfärgning 2a. Probevolymen alltför liten 2b. Luftbubblor infångade under probeappliceringen eller monteringen 3a. Stringenttvättemperaturen för låg 3b. Långvarig exponering av hybridiserat snitt för starkt ljus 4a. Denatureringstemperaturen alltför hög 2a. Se till att probevolymen är tillräckligt stor för att täcka området under täckglaset 2b. Undvik luftbubblor. Om du ser luftbubblor slå försiktigt bort dem med en pincett 3a. Se till att stringenttvättemperaturen är 65 (±2) C 3b. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starkt ljus. 4a. Försäkra dig om att denatureringstemperature n är 82 (±2) C OBS! Om problemet inte kan hänföras till någon av ovanstående orsaker eller om de föreslagna åtgärderna inte löser problemet, kontakta vår tekniska service för ytterligare hjälp.
Appendix 1 Cytology FISH Accessory Kit, kodnr. K 5499 Specifikationer för fluorescensmikroskop Dako rekommenderar användning av följande utrustning tillsammans med Cytology FISH Accessory Kit, vid användning av Dako FISH-prober: 1. Mikroskoptyp 2. Lampa Epifluorescensmikroskop. 100 watt kvicksilverlampa (håll reda på brinntiden). 3. Objektiv För screening av vävnaden kan fluorescens torr 10X eller fluorescens oljeimmersion 16X objektiv användas. För högre förstoring och räkning av signaler rekommenderas endast fluorescens oljeimmersionsobjektiv, t.ex. 100X 4. Filter Filter är individuellt utvecklade för specifika fluorokromer och måste väljas därefter. Dako rekommenderar användning av ett specifikt DAPI filter i kombination med ett högkvalitets Texas Red/FITC dubbelfilter vid användning av Dako FISH DNA-prober. DAPI filter, t.ex. Chroma filter # 31000. Texas Red/FITC dubbelfilter, t.ex. Chroma filter # 51006. Texas Red och FITC enkla filter kan användas för bekräftelse. Fluorokrom Excitationsvåglängd Emissionsvåglängd FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter är specifika för varje mikroskoptyp och användning av rätta filter är utomordentligt viktigt för tolkningen. Om du vill ha detaljerad information kontakta din mikroskopleverantör eller din Dakorepresentant. 5. Olja Icke-fluorescerande olja. Försiktighetsåtgärder Specifika fluorokromer kräver olika utrustning och måste väljas med hänsyn därtill. För Dako FISHprober rekommenderas inte en 50 W kvicksilverlampa, Rhodaminfilter kan inte användas och trippelfilter rekommenderas inte. Ett icke-optimerat mikroskop kan ge problem vid avläsning av fluorescenssignalerna. Det är viktigt att ljuskällan inte har passerat utgångsdatum och att den är riktigt inriktad och fokuserad. Kunden skall övervaka och följa tillverkarens rekommendationer för kvicksilverlampan. Mikroskopet skall underhållas och kvicksilverlampan skall vara rätt inriktad innan du försöker tolka resultaten. Man skall sträva efter att exponera provet så lite som möjligt för excitationsljudet för att minimera att fluorescensen bleknar. Vi rekommenderar att du diskuterar uppställningen av ditt särskilda mikroskop med tillverkaren innan du börjar med fluorescens in situ hybridisering, eller tittar i litteraturen.
Producerad av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel: +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 Förklaring av symboler Katalognummer Temperaturbegränsning Batchkod In vitro diagnostisk medicinsk apparat Skydda från solljus (se förvaringsavsnittet) Använd före Läs bruksanvisningen Innehållet räcker till <n> tester Tillverkare Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder)