Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet Genkloning och PCR av tetracyklinresistensgen från pacyc184 till puc19 Årskull: Laborationsrapport i Molekylärbiologisk laboratoriemetodik, termin 3 Laborationsdatum: Inlämnad: Godkänd: Handledare:
Abstrakt Syftet med laborationen var att klona in en tetracyklinresistensgen från plasmiden pacyc184 till vektorn puc19 som bär en ampicillinresistensgen, samt att amplifiera, selektera och PCRverifiera fragmentet. Detta skulle resultera i en dubbelresistent plasmid. Plasmiderna digererades med restriktionsenzymerna Ava1 och Xba1 och resultatet kontrollerades genom gelelektrofores. puc19- och pacyc184-fragmenten ligerades med T4 DNA-ligas. De rekombinanta DNA-molekylerna transformerades in i kompetenta TOP10 celler. För att selektera fram rätt rekombinant ströks TOP10 cellerna ut på LA-plattor innehållande ampicillin, tetracyklin och X-gal i olika kombinationer. De funna dubbelresistenta plasmiderna skulle amplifieras med hjälp av PCR. Med gelelektrofores skulle det kontrolleras att fragmenten var av rätt storlek. På grund av okända felkällor hittades inga dubbelresistenta bakterier. Laborationen slutfördes med tidigare tet-klonade puc19 stammar. Resultatet från PCR-analysen visade ett band på cirka 1000 bp vilket var förväntat. Nyckelord: Genkloning, restriktionsenzym, plasmid, antibiotikaresistens
Inledning I laborationen används bakteriellt DNA. Till skillnad från eukaryoter saknar prokaryoter cellkärna och DNA finns då fritt i cellen. Bakterier har oftast bara en kromosom. Prokaryoter kan dessutom innehålla betydligt mindre cirkulära, dubbelsträngade DNA-molekyler som kallas plasmider. De bär på från några enstaka gener upp till 200 gener, vilket motsvarar mellan 2000 och 1 miljon baspar (1). Då plasmiderna bär på förhållandevis få gener kan dessa lätt överföras till andra bakterier. Detta utnyttjas vid genkloning, då restriktionsenzymer kan klippa upp plasmiden och ett främmande DNA-fragment kan ligeras in i plasmiden. Plasmiden pacyc184 består av 4245 baspar och har en gen som kodar för tetracyklinresistens. I denna laboration ska tetracyklinresistensgenen klippas ut med restriktionsenzymerna Xba1 och Ava1 för att sedan ligeras till vektorn puc19 som är klippt med samma restriktionsenzymer. Ett restriktionsenzym klyver DNA-kedjan vid en speciell basparssekvens. Till exempel känner Xba1 igen den palindroma sekvensen: 5 T*CTAGA 3 3 AGATC*T 5. Enzymet klipper mellan T och C. Detta skapar ett överhäng på varje ände av den dubbelsträngade DNA-kedjan, så kallade sticky ends. Överhänget kan utnyttjas för att ligera in ett annat fragment med komplementärt överhäng. Xba1 och Ava1 klipper upp plasmiden pacyc184 på var sitt ställe och detta ger två DNA-fragment på 2750 respektive 1495 bp. Tetracyklinresistensgenen återfinns i det mindre fragmentet på 1495 bp (se bilaga 1). Detta fragment ska sedan ligeras till vektorn puc19 som även den är klippt med Xba1 och Ava1. puc19 består av 2686 bp och plasmiden har en polylinker där restriktionssiterna för både Xba1 och Ava1 sitter. De två enzymerna verkar i närheten av varandra och klyvningen resulterar i ett litet fragment med 11 bp samt ett stort fragment med 2675 bp (se bilaga 2). I det stora puc19-fragementet finns en gen som kodar för ampicillinresistens. Fragmentet med tetracyklinresistensgenen från pacyc184 ska sättas in i polylinkerområdet på puc19. Därmed skapas en ny plasmid som då får två resistensgener: en mot tetracyklin och en mot ampicillin.
Polylinkern på puc19 ingår i en speciell gen som kallas lacz. Denna gen kan användas för screening om ett genkloningsförsök har lyckats eller inte. LacZ - genen kodar för α-domänen av enzymet betagalaktosidas som bryter ner substratet x-gal till galaktos och en blåfärgad produkt vilket visas som blå kolonier vid odling på agarplattor. Utan betagalaktosidas kan inte x-gal bilda den blå färgen och vita kolonier växer fram istället. Om ett främmande DNAfragment ligeras till polylinkern i lacz -området förlorar genen sin funktion. Därmed uteblir betagalaktosidasproduktionen och x-gal har inget enzym att reagera med. Har genkloningsförsöket lyckats resulterar detta i vitfärgade bakteriekolonier (2). De ligerade plasmiderna överförs till kompetenta E. coli TOP10-celler genom en transformation. Med transformation menas att bakterier tar upp fritt DNA från omgivningen. Detta förutsätter dock att de upptagande bakterierna är kompetenta, det vill säga att de har en genomsläpplig cellvägg genom vilken DNA-fragment kan passera (3). Transformation kan ske naturligt eller på konstgjord väg. Vid konstgjord transformation behandlas bakterier så de blir kompetenta. För att cellerna ska ta upp DNA används i denna laboration heat shockmetoden, då bakterierna först kyls ned och sedan hettas upp till cirka 40 C (4). Efter transformationen genomförs fenotypisk expression då cellerna får chans att reparera sin cellvägg samt börja uttrycka sina resistensgener. De celler som har tagit upp den önskade plasmiden med både tetracyklin- och ampicillinrestistensgener selekteras fram på agarplattor innehållande ampicillin, tetracyklin och x-gal. De bakterier med plasmider med fel resistensegenskaper överlever inte i miljön med båda antibiotikasorterna. Den konstruerade plasmiden analyseras och verifieras med hjälp av PCR, Polymerase Chain Reaction. Detta är en metod som gör det möjligt att mångfaldiga en kortare DNA-sekvens så att denna fås i stora mängder. Med hjälp av enzymet DNA-polymeras syntetiseras nya kopior av den aktuella DNA-sekvensen. Polymeraset som används vid PCR heter Taq-polymeras och är värmetåligt och förstörs inte av det 30-tal cykler med temperaturväxlingar som krävs för att amplifiera DNA t. En cykel innefattar först en upphettning till 94 C då den dubbelsträngade DNA-molekylen denatureras och två enkelsträngade molekyler bildas. Därefter sänks temperaturen till cirka 60 C då korta nukleotidfragment, så kallade primers, får möjlighet att binda till specifika ställen på den enkelsträngade DNA-kedjan. Primrarna fungerar som startsekvenser för kopieringen. Temperaturen höjs till 74 C. Detta är den optimala miljön för
Taq-polymeras. Det fäster till primern och kan nu börja tillverka en komplementär sträng av fria nukleotider. Slutligen har de två enkelsträngade kedjorna blivit fyra strängar, vilket motsvarar två dubbelsträngade DNA-molekyler. Denna cykel upprepas tills över 50 miljoner kopior av det ursprungliga fragmentet har framställts (5). Syftet med laborationen är att klona in en tetracyklinresistensgen från plasmiden pacyc184 till vektorn puc19 som från början bär en ampicillinresistensgen samt att amplifiera, selektera och PCR-verifiera fragmentet. Detta ska resultera i en dubbelresistent plasmid. Material och metod Digerering av pacyc184 och puc19 Plasmiderna digererades genom att 10 µl puc19, 3µl 10x loading buffert (Fermentas), 1µl Ava1 (Fermentas), 1 µl Xba1 (Fermentas) och 15 µl Milli Q vatten blandades i ett rör och 15 µl pacyc184, 3µl 10x loading buffert, 1µl Ava1 och 1 µl Xba1 och 10 µl Milli Q vatten blandades i ett annat rör. Enzymen tillsattes sist. Sterila eppendorfrör och pipettspetsar användes. Digereringarna centrifugerades i 2 sekunder och inkuberades i 37 C termostat över natten. Agaroselektrofores Kanterna tejpades på ett litet geltråg och en kam med 8 brunnar sattes ner. 60 ml 1,5 % agarosgel gjordes genom att 0,9g agaros (Shelton Scientific Inc.) blandades med 0,5x TBE till 60 ml. Gelen kokades i mikrovågsugn cirka 1 minut tills lösningen var genomskinlig och 25 ml hälldes därefter i tråget och läts stelna. Gelen placerades i gelaggregatet och 0,5x TBE buffert hälldes i så att gelen täcktes. Två droppar med 2 µl 6x loading buffert (Promega) pipetterades ut på parafilm och 8µl av vardera digerering blandades med droppen och applicerades i agarosgelen. Molekylviktsstandard (1 µl λ DNAstandard (Fermentas), 8µl Milli Q vatten och 2 µl 6x loading buffer) sattes i en av brunnarna. Spänningsaggregatet ställdes in på 100 V. Elektroforesen pågick cirka 1,5 timme. Gelen färgades in i 0,5 µg/ml EtBr under 4 minuter. Därefter avfärgades den i vatten under 15 minuter. Gelen lades på UV-bord och fotograferades.
Fenolextraktion Digereringarna späddes med Milli Q vatten till 200 µl varefter 200 µl fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1) tillsattes. Blandningarna blandades på vortex i 15 sekunder och centrifugerades i 2 minuter på 13.000 rpm. Vattenfaserna överfördes till två nya rör. Etanolprecipitation Volymen på de två vattenfaserna mättes med pipetten. 1/10 volym 3M NaOAc och 3 volymer iskall 99,5 % EtOH tillsattes varefter lösningarna inkuberades i -80 C i ca 15 minuter. Proverna centrifugerades i 6 C under 15 minuter i 13.000 rpm. Supernatanten sögs bort och 1 ml iskall 70 % EtOH sattes till pelleten. Rören centrifugerades 5 minuter i 6 C på 13.000 rpm. Supernatanten sögs bort och pelleten torkades in i värmeskåp. Pelleten resuspenderades med 20 µl sterilt vatten. Ligering I ett eppendorfrör blandades 4 µl puc19 (Ava1/Xba1), 8 µl pacyc184 (Ava1/Xba1), 2 µl 10x ligeringsbuffert, 5 µl sterilt vatten och 1 µl T4 DNA-ligas (Roche). I ett annat rör gjordes samma blandning men med puc19 och pacyc184 lånat av andra laboranter. Enzymet tillsattes sist och rören hölls på is under blandningen. Rören centrifugerades i 2 sekunder och inkuberades i 16 C vattenbad över natten. Transformation 25 µl TOP10 kompetenta celler (Invitrogen) pipetterades ner i ett märkt eppendorfrör. Även röret med de kvarvarande 25 µl TOP10 cellerna märktes. 10 µl av puc19/pacyc ligeringen (egna) sattes till eppendorfröret och 10 µl av puc19/pacyc ligeringen (lånad) sattes till TOP10-röret. Rören inkuberades på is i 30 minuter varefter de sattes i 42 C vattenbad i 30 sekunder för heatshock. Rörens ställdes återigen på is under 2 minuter. 250 µl rumstemperrerad SOC-medium (Invitrogen) sattes till varje rör. Rören inkuberades vid 37 C med skak (225 rpm) under 60 minuter för fenotypisk expression. 140 µl från respektive rör racklades ut på varsin förvärmd LA-platta med 50 mg/ml ampicillin + 50 µg/ml tetracyklin. De kvarstående 140 µl från respektive rör racklades ut på varsin förvärmd LA-platta med 50 mg/ml ampicillin (amp) + 50 µg/ml tetracyklin (tet) + 50 µg/ml X-gal. Plattorna inkuberades i 37 C över natten.
Omstryk av transformanter Ett stryk från amp + x-gal-plattan togs och stöks ut på en LA-platta med tet. PCR reaktion Resultatet från omstrykningsplattorna lästes av. Två transformanter, resistenta mot amp och tet, valdes ut och plockades med en tandpetare. Kolonierna resuspenderades i 20 µl Milli Q vatten i eppendorfrör. Rören ställdes i värmeblock 95 C under 5 minuter och sedan på is. En mastermix för 20 reaktioner tillreddes. För varje reaktion blandades 18 µl Milli Q vatten, 2,5 µl 10x buffert (Finnzymes), 0,5 µl 10 mm dntp, 1,0 µl primer F (10pmol, Tet F), 1,0 µl primer R (10 pmol, Tet R) och 1,0 µl II DNA polymeras (1:5, Finnzymes). 24 µl av mastermixen sattes till 0,5 ml PCR-rör och 1 µl templat tillsattes. En positiv kontroll med pacyc184, och en negativ kontroll med Milli Q vatten, istället för templat blandades. Rören kördes i PCR-apparaten (SDS-Mini Cycler, Mj Research) cirka 1,5 timme. Efter körningen ställdes rören i kyl över natt. Analys av PCR produkt Fem µl från respektive PCR-rör blandades med 1 µl 6x loading buffer (Fermentas). Proverna applicerades i en 1% agarosgel tillsammans med molekylviktsstandard (1 µl λ DNA standard (Fermentas), 8 µl Milli Q vatten och 2 µl 6x loading buffer). Gelelektroforesen kördes och gelen behandlades enlig tidigare beskrivning. Reslutat Resultatet från den första gelelektroforesen visade inga band vare sig från puc-digeringen eller från pacyc-digeringen (figur 1). Vattenfasvolymerna vid etanolprecipitationen uppmättes till 170 µl puc19 och 145 µl pacyc184.
Vid avläsningen av LA-plattorna hittades miljoner vita kolonier på plattorna med amp och x- gal. Inga kolonier alls hittades på plattorna med amp, tet och x-gal. Inte heller efter omstrykningen på nya tet-plattor växte några kolonier. Gelen med PCR-proverna visade band på ca 1000 bp i både prov 1 och 2 (figur 2). Även den positiva och negativa kontrollen visade förväntade resultat. Diskussion Eftersom vi inte såg några band på gelen var osäkerheten stor om vi hade något DNA över huvudtaget. Trots detta fortsatte vi laborationen med vår puc19/pacyc184-digerering. För att vara säkra på att få ett resultat till slut lånade vi också puc19/pacyc184-digerering av andra laboranter som erhöll tydliga band på gelen. Parallella försök kördes med eget och lånat DNA. Gelen såg konstig ut över lag. Standarden var ihoptryckt och bara i en del av brunnarna återfanns band. Att gelen inte visade några band har vi ingen förklaring till. Vi hade förväntat oss att få både vita och blåa kolonier på plattorna med amp och x-gal. Att vi överhuvudtaget fick kolonier på plattan struken med vårt eget DNA var oväntat eftersom det visar att det fanns DNA i provet trots att det inte syntes något band i gelen. Bakterierna i de vita kolonierna har fått ett fragment inklonat i lacz men vi kan inte veta om det är rätt fragment. För att ta reda på detta skulle 10 vita kolonier från plattan med amp och x-gal patchas på samma position på en platta med amp och en platta med tet. På detta vis hade vi fått reda på vilka kolonier som fått rätt fragment (tetracyklinresistensgenen) inklonat. Nu fick vi istället stryka om en del av de vita kolonierna från amp + x-gal-plattan på en tet platta. Därmed får vi reda på om någon koloni fått rätt fragment inklonat. De blåa kolonierna (som uteblev) hade visat de bakterier som inte fått något fragment inklonat och skulle därför ha haft en intakt lacz -gen. Att dessa helt uteblev är mycket märkligt. Lika märkligt är det att vi inte erhöll några kolonier alls på plattorna med amp, x-gal och tet. Här hade vi förväntat oss vita kolonier. Att vi inte fick några kolonier här skulle betyda att inte en enda bakterie har tagit upp en plasmid med tetracyklinresistensgenen inklonad. Det ser vi som högst osannolikt.
Det finns många felkällor som kunnat leda till ovanstående resultat. Exempelvis skulle ligaset kunna vara dåligt. Är ligaset dåligt klistrar det inte ihop fragmenten och ingen plasmid får in tetracyklinresistensgenen. Detta skulle också kunna förklara varför de laboranter som strukit ut ren puc-digerering på amp-x-gal plattor inte fick några blåa kolonier utan bara vita. Ligaset har inte kunnat sätta tillbaka det lilla fragmentet som restriktionsenzymerna klippt ut vilket medför en skadad LacZ gen med vita kolonier som följd istället för blåa. I den här laborationen hade det räckt att selektera puc19/pacyc184-ligeringen på en platta med amp och tet för att hitta de transformanter med rätt fragment, det vill säga tetracyklinrestistensgenen, inklonad. Andra felkällor kan vara att det är något fel på LA-plattorna. Är det till exempel för mycket tet kan även de bakterier med tet-genen ha dött. Har det varit för lite ampicillin i plattorna kan rena TOP10 celler utan upptagen plasmid växa på amp + x-gal-plattorna. Detta förklarar dock inte varför inga blåa kolonier alls erhölls. Mest troligt är att en kombination av flera felkällor gett oss detta resultat. Att vi inte heller fick några kolonier på de omstrukna tet-plattorna beror troligtvis på de ovan diskuterade felkällorna. I och med detta resultat har vårt syfte fallerat. Det är i och för sig möjligt att vi fått fram dubbelresisteta bakterier, men vi kan av någon anledning inte hitta dem. På gelen med PCR-produkterna återfinns band i både prov 1 och prov 2. Vid jämförelse med DNA-standarden uppskattas fragmentens storlek till cirka 1000 bp. Tittar man på den första gelen hos de laboranter som fick ett bra resultat ser man att det minsta fragmentet i pacyc är cirka 1500 bp. Att vi fick ett kortare fragment på gelen med PCR-produkterna var förväntat eftersom primrarna tet F och tet R binder inne i själva tetracyklinresistensgenen och ett kortare fragment än det som Ava1 och Xba1 klippte ut amplifieras. För att räkna ut det förväntade resultatet har vi använt oss av en restriktionskarta över puc19 och tetracyklinresistensgenens nukleinsyrassekvens. Med hjälp av primrarnas sekvenser kan vi då se att PCR-fragmentet borde vara 1044 baspar. Detta eftersom tet F binder vid bas nummer 1593 och tet R vid bas nummer 2637.
Referenser: 1. http://www.ne.se/jsp/search/article.jsp?i_art_id=284173&i_word=plasmid. (080910) 2. http://www.escience.ws/b572/l11/l11.htm. (080910) 3. Tortora, G. J., Funke, B. R. & Case, C. L. (1995). Microbiology an introduction. Redwood City: Benjamin/Cummings 4. http://sv.wikipedia.org/wiki/transformation_(molekyl%c3%a4rbiologi). (080910) 5. Brown, T. A. (2006). Gene cloning and DNA analysis an introduction. Oxford: Blackwell Samt laborationsanvisningar:genkloning och PCR av tetracyklinresistensgen från pacyc184.
1 2 3 4 5 6 7 Figur 1. Den erhållna gelen från den första gelelektroforesen där digeringar från pacyc184 och puc19 analyserades. Brunn 6 ska innehålla pacyc184 och brunn 7 ska innehålla puc19 men inga band kan ses i gelen. En deformerad λ-standard ses i brunn 5. Brunn 1, 2, 3 samt 4 innehåller prov från andra laboranter. 1 2 3 4 5 8453 7242 6369 5687 4822 4324 3675 2323 1929 1371 1264 702 Figur 2. Den erhållna gelen från den andra gelelektroforesen där PCR-produkter analyserades. Brunn 1 innehåller prov 1 med PCR-amplifierade fragment från en koloni med dubbelresistenta bakterier och brunn 3 innehåller prov 2 med PCR-amplifierade fragment från en annan koloni med dubbelresistenta bakterier. λ-standarden ses i brunn 2. Brunn 4 innehåller en negativ kontroll medan den positiva kontrollen ses i brunn 5. I marginalen till vänster ses bandstorlekarna i antal baspar för λ-standarden analyserad i 1 % agaros.
Bilaga 1.
Bilaga 2.
Bilaga 3. Riskbedömning Etdiumbromid Kan ge ärftliga genetiska skador. Irriterar ögonen, andningsorganen och huden Giftig att sväljas och inhaleras (extremt farlig om den inhaleras i pulverform). Använd handskar och rock och arbeta i dragskåp. Avfall slängs i behållare för farligt avfall. Första hjälpen Vid inandning: Flytta genast den skadade till frisk luft. Ge konstgjord andning om andningen har stoppat. Håll den skadade varm och i vila. Kontakta läkare. Vid förtäring: Skölj munnen ordentligt och ge rikligt med mjölk/vatten förutsatt att den skadade inte är medvetslös. Kontakta läkare. Vid hudkontakt: Tvätta huden noggrant med tvål och vatten i flera minuter. Kontakta läkare om irritation kvarstår efter tvättning. Vid stänk i ögonen: Skölj genast ögonen med mycket vatten. Fortsätt skölja i minst 15 minuter. Kontakta läkare om irritation kvarstår. Fenol Kan ge ärftliga genetiska skador. Giftigt vid inandning, hudkontakt och förtäring. Risk för allvarliga hälsoskador vid långvarig exponering genom inandning, hudkontakt och förtäring. Använd handskar och rock. Förhindra utsläpp i avlopp, brunnar och vattendrag. Avfall vallas in med inert material (sand, vermikulit etc.) och samlas in i lämplig behållare för vidare transport till avfallsanläggning. Första hjälpen Vid inandning: Frisk luft och vila. Ge eventuellt andningshjälp med syrgas. Kontakta läkare. Vid hudkontakt: Ta omedelbart av förorenade kläder. Tvätta huden noga med tvål och vatten. Skölj med Polyetylenglykol 400. Kontakta läkare omedelbart. Vid stänk i ögonen: Skölj omedelbart med mycket vatten i minst 10 minuter. Håll ögonlocken brett isär. Uppsök omedelbart ögonläkare. Vid förtäring: Drick mycket vatten (vid behov flera liter), framkalla kräkning. Omedelbart till läkare. Ge därefter aktivt kol (20-40g i 10 % slurry). Kloroform Farligt vid förtäring. Risk för allvarliga hälsoskador vid långvarig exponering genom inandning och förtäring. Irriterar huden. Misstänks kunna ge cancer. Ta genast av nedstänkta kläder. Använd handskar, rock och arbeta i dragskåp. Spola inte ut avfall i vasken. Första hjälpen Vid inandning: Flytta ut i friska luften. Kontakta läkare. Vid hudkontakt: Tvätta omedelbart med tvål och mycket vatten. Om hudirritation kvarstår, kontakta läkare. Vid ögonkontakt: Skölj grundligt med mycket vatten i minst 15 minuter och kontakta läkare. Vid förtäring: Framkalla INTE kräkning. Kontakta läkare.
70% etanol Uttorkande för huden. Mycket brandfarlig. Ångorna kan bilda explosiva blandningar med luft. Kläder som blivit förorenade av ämnet utgör brandrisk. Förhindra utsläpp till avlopp, mark och vatten. Första hjälpen Vid inandning: Frisk luft och vila. Kontakta läkare vid besvär. Vid ögonkontakt: Skölj med mycket vatten i 10-15 minuter. Håll ögonlocken brett isär. Kontakta läkare vid kvarstående besvär. Vid hudkontakt: Tag av nedstänkta kläder. Skölj med mycket vatten. Återfukta ev. huden med hudkräm. Vid förtäring: Drick ett par glas vatten eller mjölk. För den skadade till läkare/sjukhus om en större mängd förtärts. Släckmedel: Koldioxid, pulver, skum eller vattendimma.