Den virtuella katten -ett simulerat experiment på en nedsövd katt Rapport I 2011-09-15 Författare: E Receptarieprogrammet ht-2011 Handledare: Xxx Karlstads Universitet Fakulteten för teknik- och naturvetenskap 651 88 KARLSTAD
Sammanfattning Forskning och framställning av nya läkemedel är processer som båda kräver mycket tid och som kostar mycket pengar. En del i läkemedelsforskningen handlar om att testa läkemedel på djur, alltså djurförsök. Idag är djurförsök ett mycket omdebatterat ämne och många står på djurens sida och är emot försöken. Forskningen på läkemedel har tagit detta till sig och gör nu mera många av sina försök på virtuella djur i simulerade datorprogram. Detta sparar både tid och många djurliv. I denna laboration har en virtuell katt i ett simulerat datorprogram använts för att ta reda på effekten av olika läkemedelssubstanser. Två kända substanser, Neostigmin och Mepyramin, har testats innan den okända substansen Q. Efter alla tester visade sig Q vara en nikotinreceptorantagonist. Kliniskt används dessa då kortvarig muskelavslappning är önskvärd. 2
Introduktion Forskning och framställning av nya läkemedel är processer som båda kräver mycket tid och som kostar mycket pengar. En del i läkemedelsforskningen handlar om att testa läkemedel på djur, alltså djurförsök. Idag är djurförsök ett mycket omdebatterat ämne och många står på djurens sida och är emot försöken. Forskningen på läkemedel har tagit detta till sig och gör nu mera många av sina försök på virtuella djur i simulerade datorprogram. Detta sparar både tid och många djurliv. I denna laboration har en virtuell katt i ett simulerat datorprogram använts för att ta reda på effekten av olika läkemedelssubstanser. Kända läkemedelssubstanser har testats på katten och deras effekter har studerats och sedan jämförts med en okänd substans, för att kunna avgöra vilken substans det okända ämnet var. De kända substanser som användes var Neostigmig och Mepyramin. Neostigmin är en reversibel acetylkolinesterashämmare, som kliniskt används vid behandling av muskelsjukdomen Myasthenia gravis för att förlänge acetylkolinets verkan på nikotinreceptorerna. Mepyramin är en selektiv histaminreceptor antagonist som binder till histaminreceptorer och hindrar histaminet från att binda dit. Idag finns inget läkemedel med Mepyramin registrerat i Sverige 1. Parametrar som studerades hos katten var; blodtryck, hjärtfrekvens, kontraktion av skelettmuskler och kontraktion av the nictitating membrane (kattens tredje ögonlock ). Syftet med laborationen var alltså att lista ut vilken den okända substansen var genom att studera de kända substansernas effekter på katten. 3
Metod För att utföra laborationen användes datorprogrammet The Virtual Cat. Programmet är gratis för studenter och kan laddas ner från The University of Strathclyde s hemsida 2. The Virtual Cat är ett simulerat datorprogram med en nedsövd katt. Olika läkemedelssubstanser kan testas på katten för att se vilka effekter de har 3. Den simulerade katten är nedsövd och läkemedel tillsätts via en kanyl som sitter i den vänstra brachiala venen. De fyra parametrar som kan mätas på katten är; blodtryck, hjärtfrekvens, kontraktion av skelettmuskler och kontraktion av the nictitating membrane (kattens tredje ögonlock ) (se Fig 1) 3. Fig 1. Nedsövd katt med kanyl i vänster brachialven för tillförsel av läkemedel och instrument kopplade för att kunna mäta blodtryck, hjärtfrekvens, kontraktion av skelettmuskler och kontraktion av the nictitating membrane (kattens tredje ögonlock ). För att kunna studera och räkna ut vilken den okända substansen var behövde man veta vilka receptorer som fanns i respektive vävnad och vilka nerver och signalmolekyler som var involverade vid stimulering. 4
Hjärtat och dess receptorer Fig 2. Hjärtat och dess receptorer Som fig 2 visar har hjärtat många olika receptorer. I ganglierna innan hjärtat finns nikotinreceptorer (nachr). På hjärtat finns sedan my-opioidreceptorer ( -OpR), adenosinreceptorer (A1), muskarinreceptorer (machr) och beta-receptorer ( Adr). Vagusnerven frisätter vid stimulering acetylkolin som verkar på machr vilken innebär sänkt hjärtfrekvens. Den accelerenta nerven verkar genom att frisätta noradrenalin som binder till beta-receptorer och därmed ökar hjärtfrekvensen. Både vagusnerven och den accelerenta nerven verkar indirekt vid ganglion där nachr finns. Cirkulerande adenosin kan binda in till A1, vilket leder till minskad hjärtfrekvens 3. 5
Cirkulationen och dess receptorer Fig 3. Cirkulationen och dess receptorer Cirkulationens, alltså kärlens receptorer består av -receptorer ( AdR), histaminreceptorer (H1) och A1-receptorer. I ganglierna innan kärlen sitter nachr. Vid sympatikusstimulering frisätts noradrenalin som verkar på -receptorer vilket leder till vasokonstriktion och förhöjt blodtryck. Cirkulerande adenosin och histamin kan binda in till A1 respektive H1 och orsaka vasodilatation, vilket leder till sänkt blodtryck 3. The nictitating membrane och dess receptorer Fig 4. The nicitating membrane och dess receptorer The nictitating membrane fungerar som ett skyddande membran som kan läggas över kattens öga. Membranet innehåller glatta muskler och innerveras av superior cervical nerve. Stimulering leder till kontraktion av membranet. Den glatta muskulaturen har - receptorer och stimuleras av noradrenalin som frisätts av nerven. I det superior cervical ganglion finns nachrs 3. 6
Skelettmusklerna och dess receptorer Fig 5. En skelettmuskel och dess receptorer och innervering. På skelettmuskeln finns nachrs som stimuleras av acetylkolin som frisätts av nerven. Detta leder till muskelkontraktion. I denna simulering finns en depolariserande blockad på skelettmuskeln, vilket innebär att den inte reagerar på cirkulerande acetylkolin med kontraktion 3. I labbhandledningen fanns även en läkemedelslista bifogad som kunde vara till hjälp vid analysen av den okända substansen. Acetylcholine: A cholinoceptor agonist Adenosine: An adenosine receptor agonist Atropine: A muscarinic cholinoceptor antagonist Carbachol: A cholinoceptor agonist (not hydrolysed by cholinesterase) Gallamine: A cholinoceptor antagonist (muscarinic & nicotinic) Histamine: A histamine receptor agonist Hexamethonium: A ganglionic nicotinic cholinoceptor antagonist Mepyramine: A histamine receptor antagonist Morphine: A mu-opioid receptor agonist Naloxone: A mu-opioid receptor antagonist Neostigmine: A cholinesterase inhibitor Noradrenaline: An α/β-agonist Tubocurarine: A nicotinic cholinoceptor antagonist Verapamil: A calcium ion channel blocking drug 8-SPT (8-parasulphophenyltheophylline): An adenosine receptor antagonist 3. För att komma igång med programmet och tänkandet fick varje student tilldelat sig två kända läkemedelssubstanser som först testades på katten innan den okända substansen testades. Den här rapporten kommer redovisa effekterna för Neostigmin och Mepyramin. Neostigmin är en acetylkolinesterashämmare medan Mepyramin är en histaminreceptor antagonist 1. 7
Resultat och Diskussion Försök 1 Analys av kända läkemedelssubstanser Laborationen började med försök 1 där kända läkemedelssubstansers effekter på katten analyserades och noterades i tabell 1 och 2. Olika doser och olika administreringsvägar testades för varje substans. Man mätte även durationstiden. Vid en durationstid på 1000 sekunder avbröts försöken, så 1000 sekunder kan alltså vara 1000 sekunder eller mer. Först noterades kattens normala värden för de olika parametrarna för att ha som referenser vid de olika försöken. Neostigmin Tab 1. Neostigmins effekter på de olika parametrarna. Administrationsväg och durationsid redovisas också. Normal 0,5 mg/kg 5 mg/kg 20 mg/kg 0,5 mg/kg 5 mg/kg 20 mg/kg Blodtryck 133/75 100/32 93/33 83/22 99/38 93/33 84/23 Hjärtfrekv. 110 72 66 40 71 65 45 Nic.membr 49-51 gms 49 51 49-51 49-51 49-51 49-51 Skelettmusk 53-55 gms 78 81 80-85 79 84 83 Adm.väg Venöst Venöst Venöst Artär Artär Artär Duration >1000 s >1000 s >1000 s >1000 s >1000 s >1000 s Effekterna av Neostigmin (Tab 1) förstärker att det är en ACh-esteras-hämmare. Acetylkolin får stanna kvar längre i synapsklyftan och verka på sina receptorer. Detta leder till att blodtrycket och hjärtfrekvensen sjunker. Eftersom det finns en depolariserande blockad på skelettmuskeln reagerar den inte med kontraktion på acetylkolin. Detta ser vi i försöken med Neostigmin, i stort sett ingen effekt på skelettmuskeln. Varför inte the nictitating membrane kontraheras förstår jag inte eftersom ökad acetylkolinkoncentration borde leda till kontraktion. Administreringsvägen spelar ingen roll vad gäller Neostigmin. Jämför man de faktiska effekterna av Neostigmin med min prediktion (Bilaga 1) som jag skrev innan laborationen hade jag rätt vad gäller alla effekter utom den på the nictitating membrane. Jag trodde att det skulle kontraheras men ingenting hände ju vid simuleringen och jag kan inte förklara detta. 8
Mepyramin Tab 2. Mepyramins effekter på de olika parametrarna. Administrationsväg och durationsid redovisas också. Normal 0,5 mg/kg 5 mg/kg 20 mg/kg 0,5 mg/kg 5 mg/kg 20 mg/kg Blodtryck 133/75 133/75 132/74 133/75 133/75 131/75 133/75 Hjärtfrekv. 110 110 111 110 110 110 110 Nic.membr 49-51 gms 48-51 49 49-51 49-51 49-51 49-51 Skelettmusk 53-55 gms 53-55 53-55 54-56 54 55 54-56 Adm.väg Venöst Venöst Venöst Artär Artär Artär Duration - - - - - - Mepyramin är en histaminreceptor-antagonist och visar sig i försöken inte ha så stor effekt på någon av parametrarna (tab 2). Detta beror på att det inte finns så mycket cirkulerande histamin, därför ger en blockad av receptorerna ingen effekt. Durationstiden var svår att mäta eftersom man inte såg någon effekt av Mepyramin. Då jag skrev prediktionen (bilaga 1) om Mepyramin tänkte jag inte på att histamin inte normalt cirkulerar i kroppen och därför är slutsatserna jag dragit angående blodtryck och hjärtfrekvens helt fel. Vad gäller skelettmusklerna och the nictitating membrane har de ju faktiskt inga histaminreceptorer vilken innebär att det inte skulle blivit någon effekt där ändå även om det funnits cirkulerande histamin i kroppen. Försök 2 Analys av okänd substans Q Tab 3. Okänd substans Q s effekter på de olika parametrarna vid venös administration. Normal 0,1 mg/kg 0,2 mg/kg 2 mg/kg 5 mg/kg 10 mg/kg 50 mg/kg Blodtryck 133/75 118/60 123/68 103/40 98/38 94/37 99/36 Hjärtfrekv. 110 110 110 108 114 114 117 Nic.membr 49-51 gms 49-51 49-51 36 27 22 9 Skelettmusk 53-55 gms 49 29 1 0 0 0 Adm.väg Venöst Venöst Venöst Venöst Venöst Venöst Duration 300 s 900 s >1000 s >1000 s >1000 s >1000 s Tab 4. Okänd substans Q s effekter på de olika parametrarna vid arteriell administration. Normal 0,1 mg/kg 0,2 mg/kg 2 mg/kg 5 mg/kg 10 mg/kg 50 mg/kg Blodtryck 133/75 124/65 118/58 100/38 95/38 94/34 99/37 Hjärtfrekv. 110 110 110 110 115 115 121 Nic.membr 49-51 gms 50 50 34 30 30 4 Skelettmusk 53-55 gms 53 46 0 0 0 0 Adm.väg Artär Artär Artär Artär Artär Artär Duration 300 s 900 s >1000 s >1000 s >1000 s >1000 s Man kan konstatera att de olika administrationsvägarna inte skiljer sig någonting när man jämför effekterna av venös administration (tab 3) och arteriell administration (tab 4). 9
Man ser också att effekterna följer doseringen fram till 5 mg/kg, där planar kurvan ut för blodtryck, hjärtfrekvens och kontraktion av skelettmuskulatur. Det kan vara så att alla receptorer är upptagna, att det inte hjälper att höja dosen, effekten är fortfarande densamma. The nictitating membrane fortsätter dock att relaxera mer och mer ju högre dosen blir. Kanske finns fler receptorer för den okända substansen Q på membranet än vad det finns på övriga mätparametrar. 1. Blodtryck Blodtrycket sjunker mer ju högre dosen blir ända fram till 50 mg/kg, där går blodtrycket snarare upp något. Det kan bero på att alla receptorer är inbundna så att ökad dos inte ger någon effekt. Genom att bara titta på den första parametern, blodtrycket, kan man dra slutsatsen att den okända substansen Q kan vara en: - -receptor-antagonist: noradrenalin kan inte binda in vasodilatation sänkt blodtryck - nikotinreceptor-antagonist: hindrar frisättning av noradrenalin vasodilatation sänkt blodtryck - histminreceptor-agonist: stimulering vasodilatation sänkt blodtryck - adenosinreceptor-agonist: stimulering vasodilatation sänkt blodtryck 2. Hjärtfrekvens Hjärtfrekvensen är i stort sett konstant genom hela försöket. Den ökar någon vid doseringen 50 mg/kg annars ligger den runt det normala 110 slag/min hela tiden. Genom att titta på parameter 2, hjärtfrekvens, kan man dra slutsatsen att den okända substansen Q kan vara en: - nikotinreceptor-antagonist: minskad frisättning av acetylkolin ökad hjärtfrekvens - beta-adrenoceptor-agonist: stimulering ökad hjärtfrekvens - adenosinreceptor-antagonist: blockerar adenosin från at binda in ökad hjärtfrekvens 3. The nictitating membrane Effekterna på the nictitating membrane följer doseringen, ju högre dosering desto större relaxerande effekt på den glatta muskulaturen i the nictitating membrane. Genom att titta på parameter 3, the nictitating membrane, kan man dra slutsatsen att den okända substansen Q kan vara en: - nikotinreceptor-antagonist: blockering ingen frisättning av noradrenalin ingen kontraktion - -receptor-antagonist: noradrenalin kan inte binda in ingen kontraktion - my-opioidreceptor-agonist: stimulering minskad frisättning av noradrenalin - adenosinreceptor-agonist: stimulering minskade frisättning av noradrenalin 4. Skelettmuskeln Den relaxerande effekten på skelettmuskeln syns tydligt, redan vid dosen 2 mg/kg är skelettmuskeln totalt relaxerad. På skelettmuskeln finns endast nikotinreceptorer som stimuleras av acetylkolin kontraktion. 10
Genom att titta på parameter 4, kontraktion av skelettmuskeln, kan man dra slutsatser att den okända substansen Q MÅSTE vara en: - nikotinreceptor-antagonist: acetylkolin kan ej binda in muskelrelaxation Då det visat sig att den okända substansen Q måste vara en nikotinreceptor-antagonist analyserades effekterna på katten vid administrering av en känd nikotinreceptorantagonist; Tubokurarin. Resultaten ses i tabell 5. Tab 5. Tubokurarins effekter på de olika parametrarna vid arteriell administration. Normal 0,1 mg/kg 0,2 mg/kg 2 mg/kg 5 mg/kg 10 mg/kg 50 mg/kg Blodtryck 133/75 122/60 118/51 102/39 91/37 92/33 99/36 Hjärtfrekv. 110 110 108 110 112 110 116 Nic.membr 49-51 gms 49 50 39 27 22 9 Skelettmusk 53-55 gms 49 37 1 0 0 0 Adm.väg Venös Venös Venös Venös Venös Venös Duration >1000 s >1000 s >1000 s >1000 s >1000 s >1000 s Effekterna av Tubokurarin på de fyra parametrarna (tab 5) är väldigt jämförbara med effekterna av den okända substansen Q (tab 3 och 4). Blodtrycket sjunker, hjärtfrekvensen är oförändrat om inte något förhöjd vid högre dos, the nictitating membrane och skelettmuskeln är relaxerade. Slutsatsen är alltså att den okända substansen Q är en nikotinreceptor-antagonist. Nikotinreceptor-antagonister används idag för att blockera signalöverföringen från somatiska nerver till skelettmuskler. Dessa läkemedel delas in i; - icke-depolariserande blockerare - depolariserande blockerare 4. Icke-depolariserande blockerare ex. atrakurium, pankuronium De så kallade icke-depolariserande blockerarna binder till nikotinreceptorer vid nervmuskelkopplingar, vilket förhindrar depolarisation av det post-synaptiska membranet, vilken leder till muskelförlamning 4. Dessa läkemedel används vid operation för att åstadkomma muskelrelaxation 4. Depolariserande blockerare ex. Suxameton. De depolariserande blockerarna fungerar egentligen som nikotinreceptoragonister men när de binder in till nikotinreceptorn på post-synaptiska membranet utlöser de ett så stort svar att muskelcellerna först kontraheras för att sedan bli paralyserade och förlamade. Detta beror på att suxameton inte bryts ner av acetylkolinesteras i synapsklyftan och därför stannar längre på nikotinreceptorerna. Membranet får inte 11
chans att repolarisera sig och blir därmed inte mottagligt för nya nervimpulser och nya depolarisationer. Detta leder till att muskelcellerna blir paralyserade 4. Suxameton används generellt då kortvarig muskelavslappning önskas ex. vid tracheal intubation, vid reposition av frakturer och vid röntgenundersökningar 4. Främsta biverkningen av nikotinreceptorantagonisterna är blodtrycksfall p.g.a. att autonoma ganglier blockeras 4. 12
Referenser 1. Dale M.M, Flower R.J, Rang H.P, Ritter J.M., (2007) Rang and Dale s Pharmacology, (s. 165-166, 213-214) (6 th edition) Churchill Livingstone. 2. University of Strathclyde, Strathclyde Pharmacology Simulations, 2011, Tillgänglig på: http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/page.php?page=software_sims besökt: 2011-09-15 3. Labbmanual The Virtual Cat (2011) Karlstads Universitet 4. Lindström E och Norlén P., (2009) Farmakologi (andra upplagan) (s. 91-92) Liber 13
Bilaga 1 Prediktion Den virtuella katten Neostigmin: Neosigmin är en reversibel acetylkolinesterashämmare, vilket innebär att neostigmin binder till och blockerar active site hos enzymet acetylkolinesteras. Acetylkolinesteras är ett enzym som finns i den kolinerga synapsklyftan där det har som uppgift att bryta ner acetylkolin som frisätts från presynapsen. Genom att hämma acetylkolinesteras får acetylkolin längre tid att verka på de postsynaptiska receptorerna och den kolinerga signaleringen förstärks. Man kan säga att neostigmin indirekt stimulerar både nikotinoch muskarinreceptorer eftersom de båda är acetylkolinreceptorer. Neostigmin är polär och passerar därför inte blodhjärnbarriären. Neostigmin används vid behandling av myestenia gravis, en sjukdom där acetylkolinreceptorerna degraderas. Neostigmin gör så att det acetylkolin som frisätts får verka längre på de få acetylkolinreceptorer som finns kvar. Blodtryck: sjunker (vasodilatation) Hjärtfrekvens: sjunker Skelettmuskelkontraktion: Skelettmuskeln svarar inte på cirkulerande ACh med kontraktion eftersom det föreligger en depolariserande blockad på neuronet. Muskeln kommer alltså inte att kontraheras som svar på ACh. Nictating membrane: kommer kontraheras, därför att The superior cervical ganglion har neuronala nikotionreceptorer. Mepyramin: Selektiv histaminreceptor-antagonist. Binder till H1- och H3-receptorer. Det finns idag inget läkemedel med mepyramin registrerat i Sverige. Blodtryck: stiger (vasokonstriktion). Då histamin binder till H1-receptorn sker en vasodilatation av blodkärlen. Mepyramin är en antagonist vasokonstriktion Hjärtfrekvens: oförändrad (Histamin binder till hjärtats H2-receptorer ökad hjärtfrekvens. Mepyramin binder inte till H2-receptorer därför bör hjärtfrekvensen bli oförändrad). Skelettmuskelkontraktion: oförändrad, på skelettmusklerna finns inga histaminreceptorer. Nictating membrane: här finns ingen histaminreceptor så här sker ses ingen effekt av mepyramin. 14