Undersökning och utvärdering av mikroorganismers påverkan på näringsämnen i lakvattenrening

STOCKHOLM, SVERIGE 2018 Undersökning och utvärdering av mikroorganismers påverkan på näringsämnen i lakvattenrening ASTRID HELMFRID KTH SKOLAN FÖR KEMI, BIOTEKNOLOGI OCH HÄLSA

Handledare: Maria Carlsson (), Peter Larsson () och Gunaratna Kuttuva Rajarao (KTH) Examinator: Andres Veide (KTH) Stockholm 2017, Industriell och miljöinriktad bioteknologi, Kungliga Tekniska Högskolan (Royal Institute of Technology) Försättsbladsillustration: Bild tagen under projektet av 2

Sammanfattning För att behandla ammoniumrikt lakvatten från två äldre deponietapper med icke farligt avfall på Löt avfallsanläggning byggde en anläggning för kontinuerlig biologisk rening (KBR). Trots god nitrifikation har avskiljning av kväve inte varit fullständig i denitrifikationssteget utom under perioder fosforsyra tillsatts till processen. Under dessa perioder har dock fosforhalten blivit för hög, vilket har lett till problem med gällande utsläppsvillkor. För att utreda om fosforsyratillsatts är nödvändig samt studera det mikrobiella samhället och ge förslag på förbättring har den aktuella reningen och faktorer som kan ha påverkat den undersökts. Detta har gjorts med hjälp av kemisk analysdata från 2015-2017, in vitro odling och mikroskopiakttagelser kombinerat med FISH-analys. De faktorer som beaktades, var temperatur, konkurrens och halten av tungmetaller, nitrat, nitrit, substrat och syrgas. Fokus låg på de faktorer som i dagsläget går att styra i KBR-anläggningen samt förmodas vara mest kritiska. Under projektperioden 2017 var flödet lägre än vad KBR-anläggningen var designad för och uppehållstiden var ca 95 dagar. Vid analys av data från 2015-2017 noterades att reningen tål ned till 10 C men kommer inte igång ordentligt förrän vid ca 16 C efter avstannad drift. Biotillgänglig fosfor var begränsande för denitrifikationen under 2017 samt att halten fosfatfosfor som tas upp i denitrifikationen alltid återkom i efterföljande reningssteg. F.I.S.H-analys gav svårtolkade resultat med få organismer och mycket partiklar. Mikroskopstudier och in vitro odling på agarplattor indikerade en ökning i antal organismer över projekttiden (mars-juni 2017), samt att många protozoer var flagellater och detta indikerar att reningen var under uppstart. Antalet filamentösa bakterier stor, vilket kan bidra till skumning tillsammans med exkreterade sackarider. Fosfatfosforhaltens ökning i reningsstegen efter denitrifikationssteget kan bero på att celler dör då vis näring blir begränsande samt nedbrytning av biomassa blir större än dess uppbyggnad. Det gick inte att fastställa fosforackumulerande bakteriers påverkan på halten fosfatfosfor. I framtiden kan den fosfortillsats som behövs bestämmas utifrån slammängden (VSS, Volatile Suspended Solids). Ett annat förbättringsförslag är att lakvattnet kan ledas in i denitrifikationssteget först, alternativt kan lakvattnet recirkuleras mellan nitrifikationssteget och denitrifikationssteget. 3

Abstract In order to treat the ammonium rich leachate formed in two of the older landfills for nonhazardous waste at Löt avfallsanläggning built a continuous biological treatment plant (KBR). The nitrification has been total except for shorter periods during the startup of the process. However the denitrification was not complete except during periods when phosphoric acid was added to the treatment step. When adding phosphoric acid the phosphorus content in the water became too high and risked to exceed the standards for emitting treated leachate from the facility. To evaluate the need for addition of phosphoric acid in the treatment process, analysis of nutrients, in vitro cultivation of microorganisms, microscopic observations and FISH analysis was conducted from March to May 2017. The factors considered in this report were the temperature, some toxic substances such as heavy metals, nitrates, competition between organisms and phosphate depletion. Extra focus was put on the factors that can be controlled and were thought to be most critical. The composition of the leachate that comes from Löt avfallsanläggning s old landfills is similar to many other leachate. The time it takes to start the biological processes is long but not unusual for similar treatment plants. By 2017, the inlet flow to the KBR was less than what the KBR was designed for, and consequently the residence time for the leakage water in the KBR was approximately 95 days. When analyzing data from previous years it was noted that the treatment worked down to 10 C but would not start properly until the temperature reached about 16 C after a stop in operation during the cold months. It was clear that bioavailable phosphorus was limiting the denitrification in 2017 and that the same level of phosphate taken up in the denitrification always reoccurred in later steps. FISH analysis yielded unclear results with few organisms and many particles. This does not rule out that denitrifying bacteria or phosphor accumulating bacteria exist in the plant but gave no definitive answer. Microscopic studies and in vitro cultivation on nutrient agar plates indicated an increase in the number of organisms over the time of the project (March to May 2017) and presence of many protozoa with flagella suggested that the treatment plant was in a startup stage. A number of filamentous bacteria was also observed, which could contribute to foaming together with storage of polysaccharides. The increase in phosphate concentration in the final treatment steps may be due to lysis of cells and biomass degradation, but the influence of phosphorus accumulating bacteria cannot be ruled out. In the future, to overcome the problem of excess phosphorus in the effluent, the required phosphorus additive can be determined based on the sludge volume (VSS, Volatile Suspended Solids). The leachate can be recirculated back to the denitrification step, alternately; the inlet leachate can be redirected to enter the denitrification step first. 4

Nomenklatur KBR- Kontinuerlig biologisk rening. EBPR Enhanced biological phosphorus removal, biologisk fosforavskiljning. BOD- Biochemical Oxygen Demand, ett mått på syreförbrukning vid fullständig oxidation av biologiskt nedbrytbar substanser. COD Chemical oxygen demand ett mått på den mängd syre som förbrukas vid fullständig kemisk nedbrytning av organiska föreningar. TOC Totalt organiskt kol. TKN Total Kjeldahl Nitrogen, mått på kväve i organiska föreningar samt ammonium och ammoniak. DO Dissolved oxygen, ett mått på löst syrgas i vattnet. VSS - Volatile Suspended Solids, slammängden som utgörs av lättflyktigt suspenderat material. VFA Volatile fatty acids, lättflyktiga fettsyror. HRT Hydrauliska retentionstiden, uppehållstiden Agarplattor Ett fast odlingsmedioum gjort på gelämne från alger. Prokaryoter Encelliga organismer som bland annat saknar cellkärna. Eukaryoter - En eller flera avancerade celler med cellkärna med cellmembran. Heterotrof Organism som är i behov av att konsumera organiska ämnen för att tillförskansa sig energi. Autotrof Självnärande organism som inte behöver organiska ämnen för att få energi. Flagell - trådliknande organeller främst för mobilitet hos organismer. Cilier - små hårliknande utskott med funktion att främst transportera partiklar hos organismer FISH-analys Fluorescent in situ hybridization, metod för att identifiera organismer med genetik och fluorescens. AOB - Ammoniumoxiderande bakterier. NOB Nitritoxiderande bakterier. Anaerob process/organism- Syrefri/ ej i behov av syre. Aerob process/organism - Tillgång till/ i behov av syre. Anoxiska process/organism Låg tillgång till/ behov av syre. PAO Phosphate accumulating organisms, organismer som lagrar stora mängder polyfosfat GAO Glucose accumulating organisms, organismer som tar upp stora mängder glukos. 5

Innehållsförteckning 1. Introduktion... 9 1.1. Syfte... 9 1.1.1. Målsättning... 9 1.2. Avgränsning...10 2. Bakgrund och Teori... 11 2.1. Deponier och biologisk lakvattenrening...11 2.2. Mikroorganismer...12 2.3. Biologisk reningens mekanismer...14 2.3.1. Biologisk kvävereducering... 14 2.3.2. Biologisk fosforavskiljning... 15 2.4. Uppstarts-, & uppehållstid för en biologisk reningsprocess...16 2.5. Utmaningar och påverkande faktorer inom vattenrening...17 2.5.1. Konkurrens... 17 2.5.2. Syrehalt... 17 1.1.1. ph... 17 1.1.2. Temperatur... 18 1.1.3. Nitrater... 18 1.1.4. Övriga inhiberande och toxiska faktorer... 19 1.1.5. Tillgänglig fosfor... 19 1.1.6. Kolkällan... 20 1.2. Bärarmaterial...20 1.3. Analysmetoder av mikroorganismer...20 1.3.1. Fluorescent in situ hybridization (FISH)... 21 1.3.2. Utvärdering av slam & vattenkvalité med mikroskopering... 21 6

1.4. Anläggningsbeskrivning av Löt avfallsanläggning...22 1.4.3. Modifikationer i systemet... 25 2. Metod och material... 27 2.1. Provtagning...27 2.2. Fluorescent in situ hybridization (FISH)...28 2.2.1. Val av prober för FISH... 28 2.2.2. Utförande av FISH... 29 2.3. Mikroskopiering...29 2.4. Odling på agar-plattor...29 3. Resultat... 30 3.1. Analys och utvärdering av data...30 3.1.1. Inflöden till KBR-anläggningen... 30 3.1.2. Inflödeshalter till KBR-anläggningen... 31 3.1.3. Reningen i KBR-anläggningens dammar... 32 3.1.4. Nitrifikationen i L2A... 34 3.1.5. Denitrifikationen i L2B... 36 3.1.6. Nitritkoncentrationen I KBR-anläggningen... 37 3.1.7. BOD och TOC i KBR-anläggningen... 38 3.1.8. Metaller i KBR-anläggningen... 39 3.1.9. Observation av skumbildning... 40 3.1.10. Fältmätning av temperatur och ph i KBR-anläggningen... 40 3.1.11. Beräkning av ammoniak-, och salpetersyrakoncentration i KBR-anläggningen... 42 3.1.12. Massbalans och uppehållstid... 43 3.2. Analys och observation på lab...45 3.2.1. FISH... 45 3.2.2. Mikroskopering... 48 7

3.2.3. Agarodling... 52 4. Diskussion... 54 4.1. Förbättringsförslag...57 5. Slutsats... 58 6. Begränsningar med projektet & framtida rekommendationer... 58 Referenser... 59 Appendix... 63 I. Provtagningsschema...63 II. Bärarmaterial i KBR-anläggningen...64 III. F.I.S.H. buffertinnehåll...64 IV. Väder under provtagningsdag... 65 V. Beskrivning av observationer i mikroskop...66 VI. Kompletterande diagram med analysdata...69 VII. Bilder...69 I. Löt Avfallsanläggning... 69 II. Instrument... 70 III. Bilder från mikroskop... 70 IV. Bilder på agar-plattor... 79 8

1. Introduktion Lakvatten är definierat som det vatten som kommit i kontakt med deponerat avfall, både det som leds ut eller är lagrat inne i en deponi. Lakvatten innehåller näringsämnen som BOD, fosfor men framförallt kväve i form av ammonium. Dessa näringsämnen är syreförbrukande och bidrar till förekomst av eutrofa vattendrag. Lakvatten innehåller även metaller och organiska miljögifter och kan vara skadligt för miljö och hälsa (Naturvårdsverket, 2008). Idag får bara material deponeras om det inte är flytande, brandfarligt, explosivt, innehåller laboratorierester eller är organiskt. Dessutom måste materialet genomgå lämplig förbehandling innan deponering om materialet inte är inert eller är skadligt för hälsa och miljö (SFS, 2001:512). Detta gör att lakvatten från modernare deponier generellt innehåller lägre halter av näringsämnen än äldre deponier gör. Än idag behöver fortfarande lakvattnet från äldre deponier tas om hand och behandlas. För att behandla lakvatten från de två äldre deponin med icke farligt avfall på Löt Avfallsanläggen, byggde en anläggning för kontinuerlig biologisk rening under 2014. I KBR-anläggningen renas det näringsrika lakvattnet med avseende på kväve Trots att en god total rening erhålls finns det potential att uppnå ännu bättre rening genom effektivisering av denitrifikationssteget. Tidigare år har effektiv denitrifikation åstadkommits genom tillsats av fosforsyra som förbättrade reningen från kväve. Detta har dock resulterat i en ökning av totalfosforhalten i efterföljande reningssteg, vilket inte heller är eftertraktat. Detta examensarbete kommer utifrån litteraturstudie, data behandling av kemiska parametrar under perioden 2015-2017 samt analys av KBR-anläggningens mikroorganismer, undersöka orsaken till den mindre effektiva denitrifikationen samt fosforhaltens ökning och ge förslag på åtgärder. Projektägare är och projektet kommer både att utföra vid KTH och. 1.1. Syfte Syftet med projektet är att genom utvärdering av kemisk analys-, samt driftdata och analys av mikroorganismer i anläggningen undersöka möjligheten att få en effektiv reducering av näringsämnen i KBR:en samt att ge förslag på förbättringsåtgärder i reningsprocessen. 1.1.1. Målsättning Fokus kommer vara att undersöka hur nitrifikationen och denitrifikationen kan fås att fungera så effektivt som möjligt, gärna året runt. Den aktuella reningen och statusen ska beskrivas genom att ta reda på vilka delar som inte fungerar optimalt samt anledningen till detta. En utvärdering av skillnaden mellan åren 2015-2017 kommer att genomföras. Reningen ska också undersökas genom att identifiera om det finns faktorer som kan påverka mikroorganismerna negativt, både med hjälp av befintlig litteratur samt kemisk mätdata från KBR-anläggningen. Behovet av att tillsätta fosforsyra till denitrifikationssteget kommer undersökas och ställas i relation till andra faktorer som kan påverka reningen. Orsaken till den högre halten fosfatfosfor i sista reningssteget ska undersökas. 9

Förslag på förbättringar av reniningsprocessen och vidare underökningar ska tas fram. 1.2. Avgränsning Även om det finns kemisk mätdata från tidigare år än 2015 kommer fokus ligga på data från projektperioden under 2017. Efter färdigställandet av KBR-anläggningen 2014 utfördes ett examensarbete (Karlsson, 2014) som syftade till att optimera KBR-anläggningens reningseffekt utifrån faktorer som ph, temperatur och syrehalt. Denna period utvärderas därför inte i denna rapport. Projektet går ut på att observera och mäta kvävereningen under normal drift och inga försök för att effektivisera KBR-anläggningens drift kommer genomföras. För egna analyser av bland annat mikroorganismerna behöver metoderna som väljs vara anpassade efter den tidsram som examensarbetet tillåter, även omfattningen på analyserna måste förhålla sig till den fastställda tidsram som finns. 10

2. Bakgrund och Teori I detta avsnitt beskrivs lakvatten och dess uppkomst, vilka mikroorganismer som kan vara nyttiga vid lakvattenrening samt deras behov. Beskrivning av analysmetoder för att studera mikroorganismer och bakgrund till olika faktorer som kan påverka mikroorganismernas reningsförmåga behandlas även i detta avsnitt. 2.1. Deponier och biologisk lakvattenrening Deponering av avfall har existerat i alla tider, från att ha deponerat alla möjliga avfall deponeras numera bara avfall som har ett lågt organiskt innehåll och som inte går att återvinna eller vidarebehandla. Lakvatten bildas när nederbördsvatten sipprar in genom en deponi och lakar ur ämnen ur materialet som har deponerats samt tar upp restprodukter från nedbrytning. Lakvatten utmärker sig generellt som ett vatten rikt på näringsämnen samt tungmetaller men med en lägre mängd organiska lättnedbrytbara föreningar. Idag deponeras inte material som är brännbart eller går att återvinna men uppkomst av närings-, salt- och metallrikt lakvatten blidas fortfarande, speciellt ifrån de gamla deponierna och avrinning från behandlings-, och sorteringsytor. Mängden lakvatten som uppstår varierar beroende på nederbörden, temperaturen och nedbrytningen men även på hur mycket vatten som tas in från lagrings-, och sorteringsytor samt deponins utformning och läge. Det finns både föreskrifter, förordningar och lagar som beskriver hur deponier och dess vattenrening ska hanteras och analyseras och varje anläggning måste förhålla sig till olika riktvärden på utsläpp. Ett sätt att rena lakvatten är genom att utnyttja nyttiga organismer som kan bryta ned och konsumera näringsämnen (Naturvårdsverket, 2008). Med biologisk lakvattenrening menas den rening som kan åstadkommas genom nedbrytning av vissa näringsämnen med hjälp av mikroorganismer. Det är en vanlig metod inom vattenrening eftersom det är en metod där befintliga resurser kan användas samt att den är naturvänlig. Lakvatten kan renas med biologiska metoder men till skillnad från ett avloppsvatten innehåller lakvatten generellt mindre biotillgängligt kol och fosfor i förhållande till mängden ammonium (Tabell 1). Detta kan bli ett problem i biologisk vattenrening eftersom mikroorganismer behöver mer kol i förhållandet till kväve. Detta kan ses om man utgår från att en generell cells torrvikt där sammansättningen är 50% kol (C ), 12% kväve (N) och 2% fosfor (P) (Tchobanoglous, et al., 2003). Därför tillsätts ofta både kol-, och fosfor till lakvatten. Tabell 1 Jämförelse av lakvatten och avloppsvatten Obehandlat lakvatten & avloppsvatten Löt Avfallsanläggning 2017 (jan-okt) Generellt lakvatten* Avloppsvatten** PARAMETER mg/l (medel) mg/l mg/l KONDUKTIVITET 664 430-2700 - TOTALKVÄVE 487 30-900 15 BOD 7 106 4-110 68 TOTALFOSFOR 1,2 0,16-4 2,1 *11 st anläggningar. (Naturvårdsverket, 2008).** Fornby reningsverk. (Cerne et al., 2007). 11

Metallinnehållet på lakvattnet på Löt har även många likheter med andra lakvatten, dock ligger arsenik och krom högre än andra anläggningar samtidigt som järnhalten är lägre (Tabell 2). Tabell 2 Jämförelse av metallhalter 2017 OBEHANDLAT LAKVATTEN Löt Avfallsanläggning 2017 (jan-okt), Allmänt** L11 PARAMETER µg/l Median * µg/l Median ARSENIK 10-46 35 Ej detekterbart-11 1,9 BLY 0,2-2,7 0,26 Ej detekterbart-15 3,8 JÄRN 0,31-2,5 0,82 1600-4300 3100 MANGAN 450-730 535 14000-83000 37000 KADMIUM Ej detekterbart - 0,042 <0,03 Ej detekterbart-1,4 0,2 KROM 43-180 130 4,1-38 9,7 KVICKSILVER Ej detekterbart <0,1 Ej detekterbart-0,1 0,022 ZINK 4,0-51 8,1 16 340 46 *På Löt Avfallsanläggning togs ett prov i månaden förutom under augusti. **Studie utförd på 11 anläggningar. IVL Utveckling av metoder för Karakterisering av lakvatten från avfallsupplag, B 1353, C. Öman et al. 2000. Ref 2.2. Mikroorganismer I näringsrikt vatten förekommer en mängd olika mikroorganismer som både fritt simmande bakterier, flockar av bakterier, protozoer, alger och metazoer (Eikelboom, 2000). Dessa samverkar, tävlar och påverkar reningen och vattnet på olika vis. Bakterier utgör ett mycket stort domän prokaryota organismer (som även arkéer tillhör) och som återfinns nästan överallt, inte minst i näringsrika vatten och deras metaboliska diversitet är enorm. De har en diameter på bara runt 1 5 μm och kan ha flagell, även om den skiljer sig helt från protozoers flageller. Deras rigida cellväggar ger bakterier många olika former, bland annat ovala, sfäriska (kocker), stavformade (bacillus) eller spiralformade (spirilli) (Parker, 2001). Flockformationer av bakterier karakteriseras av bakterier i grupp, döda som levande, även filamentösa, i en nära omgivning av salter, organiska fibrer samt andra partiklar som hålls samman av både en matris av olika polymeriska föreningar samt kemiska bindningar. Bakterieflockar förekommer både i mer eller mindre runda formationer samt irreguljära former. Tätheten på flockar kan även variera, flockar kan både vara kompakta eller mer lösa och öppna (Eikelboom, 2000). Bakterier som är involverade i nitrifikation är ofta dåliga på att bilda flockar men i aktivt slam kan högre stående organismers exkret hjälpa nitrifierande bakterier att bilda flockar (Shahid-ul-Islam, 2017). Vid mycket luftning, där en hög skjuvkraft uppstår, brukar flockarna förekomma i mindre storlekar samt vara mer öppna. Även där många filamentösa bakterier förekommer brukar flockarna bli mindre kompakta. Filamentösa bakterier är bakterier som förblir fästa i varandra vid celldelning (se Figur 1), dessa kan dessutom ha ett slags skal som gör att de inte kan lossa från varandra. Filamentösa bakterier i olika former är vanligt förekommande inom vattenrening. De kan förekomma som långa, korta, filament, vara styva och helt raka eller böjda och vridna, vissa har till och med mobilitet. Variationerna beror på vilken arttillhörighet de har. Filamentösa bakterier kan både ge en bild av 12

hur kvalitén på vattnet är samt påverka hur bra slamflockar sedimenterar. Dessa kan även påverka skumningen i anläggningen. (Eikelboom, 2000). En vanlig typ som syns i vattenreningssammanhang är typ 0092 som är lång och tunn som en nål. Typ 0092 föredrar varmare temperaturer upp mot 25 grader (Kämpfer, 1996). Microthrix Parvicella är en organism som är vanlig i Nederländska avloppsvattenanläggningar (Eikelboom, 2000). M. parvicella bildar långa, icke deformerade, filament vid DO (dissolved oxygen) på runt 0,4mg/l. Vid låga syrekoncentrationer verkar filamentösa bakterier lika M. parvicella gynnas. Höga DO koncentrationer på >0,6 mg/l har rapporterats vara toxiska för M. parvicella. M. parvicella kan omvandla nitrat till nitrit och har sitt tillväxtoptimum på 25 C men kan växa även vid temperaturer på runt 8 C. Filament som Microthrix parvicella och Typ 0092 kan växa i alla zoner och andas både aerobt och anaerobt. De har också förmåga att lagra organiska föreningar inuti cellen, vilket gör dem mycket konkurrenskraftiga. De gynnas i lågbelastade anläggningar med långa uppehållstider. Dessa tros också vara en anledning till skumbildning likt många andra filamentösa bakterier (Rossetti, et al., 2005). Protozoer är en stor grupp eukaryota heterotrofa organismer och som är vanligt förekommande i lakvatten. De är mycket större än bakterier, från 4-500 μm och de största kan nästan ses av blotta ögat. Detta gör att de är lätta att betrakta i mikroskop (se Figur 1). I lakvatten förekommer även alger, dessa kan göra att diverse utrustning växer igen. De använder fotosyntes för celltillväxt (Spellman, 2009). Protozoer kan användas inom vattenrening för att få en uppskattning av vattnets tillstånd. Amöbor förknippas med sämre utloppsvatten, det kan indikera att det är ett högt BOD och mycket suspenderat material i utloppsvattnet. Flagellater (protozoer med flagell) är associerade med dålig behandling av utloppsvattnet, dessa indikerar att det kan förekomma ett högt BOD och mycket suspenderat material. Fritt simmande ciliater (protozoer med cilier) är oftast en indikation på att vattenreningen är måttligt bra, man kan förvänta sig grumligt vatten med mycket suspenderat material i utloppet. När Ciliater med stjälk förekommer kan vattnet vara klart och ha lågt BOD samt lite suspenderat material. Hjuldjur (Rotifera) är små flercelliga djur och är vanligt förekommande i de flesta vattenhabitat. Dessa indikerar ett renare vatten (Spellman, 2008). Generellt kan det sägas att vid uppstart av en anläggning förekommer det mer fritt simmande bakterier och mycket näringsämnen, därför ökar mängden flagelleater samt amöbor. Även fritt simmande ciliater börjar uppstå efter några dagar. Ciliater är den grupp som i störst utsträckning konsumerar andra bakterier. Dessa påverkar hur många fria bakterier, som inte sedimenterar, som förekommer i utloppsvattnet. Om slamåldern är för låg samt BOD halten för hög kan protozoerna övermannas eftersom de växer långsammare. Men om slamåldern blir högre och flockar av bakterier ökar, ökar mängden protozoer som fäster vid dem samt konsumerar dem (Eikelboom, 2000). Nematodes (rundmaskar) och plattmaskar lever i slammet och kan variera i storlek från 0,5-3 mm. Dessa är strikt aeroba och bör inte förekomma i anaeroba processer. Nematodes kan hålla slammet mer poröst vilket hjälper syre att ta sig in och blir färre när temperaturen ökar. Plattmaskar äter alger och kan förekomma i vatten där det är mindre syre så länge det finns mycket näring (Spellman, 2009). 13

Figur 1 Bilder tagna under mikroskopstudier. Filamentösa bakterier (övre höger) samt en protozo (övre vänster) i L2A den 11e april. En högre ordningens organism i L2E den 25e april (nedre höger). 2.3. Biologisk reningens mekanismer I en aerob process använder organismerna molekylärt syre samt näringsämnen så som kväve, kolkälla och fosfor för att växa och bli fler. I anaeroba processer kan fakultativa organismer använda organiskt materia för att bli fler och växa, dessa producerar under tiden lättflyktiga fettsyror, vätesulfid samt andra gaser. Anaeroba bakterier kan därefter använda de producerade korta fettkedjorna för sin tillväxt vilket resulterar i produktion av metangas. I anoxiska processer kan mikroorganismerna använda syret i t.ex. kväveföreningar och omvandlar på så sätt kväveföreningar till kvävgas (Spellman, 2009). 2.3.1. Biologisk kvävereducering Kväve behövs för alla bakteriers tillväxt. 1-3% av cellens torrvikt utgörs av kväve. Dock behöver kvävet fixeras och detta görs av specifika kvävefixerande mikroorganismer (Spellman, 2009). Biologisk kväveavskiljning sker vanligtvis i flera steg och utförs av olika slags mikroorganismer och för att processen ska bli effektiv krävs olika förhållanden under de olika stegen. 2.3.1.1. Nitrifikation Med nitrifikation i akvatiska miljöer menas oftast autotrof oxidation av ammonium till nitrat via nitrit, där processen enligt en förenklad bild vanligtvis kan sägas ske i två steg. Detta görs oftast av två grupper av kemolitotrofa bakterier, ammoniumoxiderande bakterier (AOB) som oxiderar ammonium till nitrit och nitritoxiderande bakterier (NOB) oxiderar nitrit till nitrat (se reaktion 1 och 2). En vanlig AOB är Nitrosomonas och en vanlig NOB är Nitrobacter (Proccer, 1989). Men 14

det finns en mängd andra bakteriegenus, som bland annat Nitrosococcus och nitrossospira som även de kan utföra ammonium oxidation och Nitrococcus och nitrospira som kan omvandla nitrit till nitrat (Tchobanoglous, et al., 2003). Även många metanoxiderande bakterier kan använda ammonium, men är långsammare än AOB (Whittenbury, et al., 1970). Dessa bakterier får sin energi helt och hållet från ammonium och nitrit samt att de fixerar organiskt kol från CO2. Nitrifierande bakterier behöver aerobisk miljö och föredrar mesofila temperaturer samt neutralt till lätt basisk miljö, nitrifikationen sker inte vid surare miljö. Nitrifierande bakterier är mindre effektiva än heterotrofiska bakterier och har en låg specifik tillväxthastighet (Proccer, 1989). AOB: NH 4 + + 1 2 O 2 2H + + H 2 O + NO 2 + energi (1) NOB: NO 2 + 1 2 O 2 NO 3 + energi (2) Sammanslagen totalreaktion: NH 4 + + 2O 2 NO 3 + 2H + + H 2 O + energi (3) I både reaktion 1,2 och 3 blir syrets funktion tydlig. 2.3.1.2. Denitrifikation Denitrifikation kan göras av bakterier som är antingen heterotrofa eller autotrofa. Några vanliga denitrifierande mikroorganismer är Achromobacter, Acinetobacter, pseudomonas, Rhizobium och rhodopseudomonas m.m. (Tchobanoglous, et al., 2003). I allmänhet är det många bakterier som kan använda kväveoxider som elektronacceptor istället för syre och diversiteten bland organismerna är stor (Knowles, 1982) (Shahid-ul-Islam, 2017). För att få en fullständig reducering av totalkväve behövs denitrifikation (Se reaktion 4). Nitrat reduceras, via nitrit, kväveoxid och lustgas till slutprodukten kvävgas vilket avges från vattnet till atmosfären. Även NO och N2O är gaser som kan avges till atmosfären (Christensen & Harremoës, 1977). Nitratreducerande bakterier: NO 3 NO 2 NO N 2 O N 2 (4) 2.3.2. Biologisk fosforavskiljning En viss del biologiskt fosforupptag sker vid celltillväxt men för att få en effektiv fosforavskiljning behövs det, utöver aeroba förhållanden, även anaeroba förhållanden (Barnard, 1982). Vid specifika förhållanden blir nämligen nettoupptaget av fosfor hos organismer större än utsöndringen och i följd med det renas vattnet från fosfor. I biologisk fosforavskiljning används 15

ofta fosforackumulerande organismer (PAOs) som är extra bra på att lagra polyfosfat. Vanliga heterotrofa bakterier i aktivt slam har en sammansättningen på 1,5-2 % fosfor, men PAOs kan bestå av 20-30% fosfor (Tchobanoglous, et al., 2003). PAOs selekteras genom att ha den anaeroba behandlingen först. Organismerna kommer då att konsumera fermentationsprodukter, gärna lättillgängliga kolföreningar så som VFA t.ex. acetat (som lagras som polyhydroxybutyrate, PHB). Upptag och transport över cellmembran krävs energi, vilket kan alstras av syre men i detta steg saknas syret och det är här PAOs har en fördel. PAOs har en större mängd lagrad energi i form av polyfosfat och kommer därför inte svälta till skillnad från många andra av mikroorganismerna. I det här processteget kommer fosfor frigöras ifrån lagrat polyfosfat inifrån cellen i form av ortofosfat (P-PO4). Under den aeroba delen kommer dessa organismer sedan skapa energi ifrån sitt lager av produkter, som oxideras, och samtidigt lyxkonsumeras fosfatet och lagret i cellen fylls återigen upp av polyfosfat. Ju mer fosfor organismerna kan ta upp desto större netto mellan anaeroba och aeroba processen och därmed mer reduktion (Tchobanoglous, et al., 2003). En vanligt förekommande grupp av PAOs i EBPR är Rhodocyclus-relaterade organismer (Zilles et al., 2002). En annan stor grupp bakterier som förekommer i EBPR är Actinobakterier, de ingår i γ-proteobakterier, men det råder ingen konsensus om dessa är PAOs. Men de återfinns i fosforrika vatten tillsammans med betaproteobakterier (Keller et al., 1999)(Crocetti et al., 2000). Det har funnits teorier om att Acinetobakterier varit PAOs men senare studier har visat att detta inte är fallet (Blackall et al., 2002). Alla betaproteobakterier är inte PAOs, t.ex. det ammoniakoxiderande genuset Nitrosomonas (Crocetti et al., 2000). 2.4. Uppstarts-, & uppehållstid för en biologisk reningsprocess Tiden från att en biologisk reningsanläggning startas upp till att nitrifikation och denitrifikation är i full gång kan vara lång. Det som avgör hur lång den tiden är beror dels på de åtråvärda bakteriernas generationstid, dvs. den tid de tar på sig att fördubbla sin population. Generationstiden för Nitrosomonas kan vara 8-36 h och för Nitrobacter 12-59 h (Ahn & Kim, 2004) och för denitrifierande bakterier 20-30 minuter (Gerardi, 2016). Även lagfasen, den tiden som bakterien anpassar sig utan celldelning till de aktuella förhållandena, kan vara lång och den beror starkt på de rådande förhållandena och yttre faktorer. För en biologisk rening att komma igång kan det ta dagar till flera veckor. Tillexempel tog det 75 dagar för att få igång en rening i ett fullskaligt anoxisk/aerob avloppsreningsverk med toxiskt Akrylnitril (Han et al., 2014). Generellt kan det ta upp 80-100 dagar men ett reningsverk lyckades få ned det till bara 30-40 dagar genom att styra efter syreåtgången (Jubany et al., 2008). Uppehållstiden kan uppskattas utifrån volymen i dammen och inflödet, dvs hydrauliska retentionstiden (HRT) (se ekv. 5). Detta anger hur lång tid det tar tills allt vatten i bassängen är utbytt och om man anser att vattnet färdas genom hela KBR-anläggningen så motsvarar detta även uppehållstiden. Från undersökningar 2014 antogs reningen vara tillräcklig när vattnet fått stanna 12 dagar i nitrifikationssteget, det motsvarade ett dagligt inflöde på ca 420 m 3. 16

Hydrauliska retentionstiden = Volym Damm flölde in (5) 2.5. Utmaningar och påverkande faktorer inom vattenrening Mikroorganismer och det mikrobiella samhället anpassar sig efter omkringliggande vatten och förhållanden som råder, detta resulterar i en stor mängd faktorer som både påverkar mikroorganismerna och även reningen av lakvatten. Denitrifierande bakterier påverkas till exempel mest av valet av kolkälla, kolkällans koncentration, nitrathalten, syrehalten, temperatur, ph och toxiska ämnen (Christensen & Harremoës, 1977). Denitrifierande bakterier tolererar förändring i systemet bättre än nitrifierande bakterier så om en faktor är inhiberande borde nitrifikationen hämmas först. (Troubleshooting the Sequencing Batch Reactor) 2.5.1. Konkurrens Nitrifierande bakterier växer långsamt vilket gör att andra mikroorganismer kan ta över om det finns näringsämnen som även passar dem (Okabe et al., 2011). I en anläggning med mycket ammoniumrikt lakvatten kan den ofullständiga nitrifikationen ha berott på överbelastning av substrat och tävling mellan nitrifierande bakterier och heterotrofa bakterier (Yusof et al., 2011). 2.5.2. Syrehalt Syrehalten i lakvattnet har en viktig funktion för både nitrifikationen och denitrifikationen. Syre är essentiellt vid nitrifikation som förstås av reaktion 4 medan det för denitrifikation istället är hämmande och verkar inhiberande även vid låga halter (Knowles, 1982). I suspenderade system bör syrehalten hållas under 0.5 mg/l för att inte hämma denitrifikationen (Christensen & Harremoës, 1977). 1.1.1. ph Olika mikroorganismer har olika optimala ph-intervall där de frodas som mest. Optimum för denitrifierande bakterier varierar inom intervallet ph 7-8 (Knowles, 1982). Och för nitrifierande bakterier nås maximal tillväxthastighet vid ett ph på runt 7,8 (Antoniou et al., 1990). ph påverkar inte bara mikroorganismer direkt utan även halter av olika ämnen i vatten (HVMFS 2013:19), tillexempel kan ammoniak bildas från ammonium vid höga ph. 17

1.1.2. Temperatur Olika mikroorganismer har olika optimala temperaturer för tillväxt, därför växlar bakteriepopulationen med varierande temperatur. Microthrix parvicella är ett bra exempel på en organism som periodvis har en större population under olika delar av året till följd av temperaturen. Den har en stor tillväxt under lägre temperaturer än 14 C och orsakar skumning (Eikelboom, 2000). Temperaturförändringens påverkan på tillväxten är som störst när temperaturen är utanför den optimala temperaturen (Tchobanoglous, et al., 2003). I en airlift reaktor med biofilm för lakvattenbehandling skedde lite nitrifikation vid låga temperaturer (6-10 C) och ingen nitrifikation (under 5 C). Det förekom nitrifierande bakterier men deras effektivitet var mycket låg vid temperaturer under 18 C. (Kim, Lee and Keller, 2006). Enligt (Antoniou et al., 1990) ökar nitrifikationshastigheten inom ett intervall på 15-25 C. När det kommer till denitrifierande bakterier så går meningarna isär när det gäller hur mycket temperaturen påverkar. Vissa källor säger att skillnaden är liten och andra säger att temperaturberoendet hos denitrifierande bakterier är markant och att reaktionshastigheten ändras med en faktor 4 för varje förändring i 10 C (Knowles, 1982). I en studie på ett system där både för-, och efterdenitrifikation används noterades det att när temperaturen sänktes till 17 C började denitrifikationen påvisa inhibering (reduktionshastigheten gick ned 15%) medan nitrifikationen inte visade någon förändring alls. Detta var inte väntat eftersom det är allmänt vedertaget att nitrifikationen är känsligare för temperaturförändringar. Det var först vid 14 C som nitrifikationen påvisade någon form av inhibering och vid 10 C slutade båda processerna att vara effektiva (Ilies and Mavinic, 2001). 1.1.3. Nitrater Nitrater och nitriter påverkar fosforavskiljning. Vid biologiskt fosforupptag behöver det finnas en anaerob zon, och för att den ska hållas anaerob behöver nitraterna förekomma i låg koncentration. Därför är det viktigt att ha ett förhållande COD till TKN på över 8:1 för att både kunna reducera nitraterna samt reducera fosfor (Barnard, 1982). Det har visats i många studier på avloppsvattenrening att när nitratkoncentrationen når en låg nivå utsöndrar organismerna långsamt fosfat igen (Mulkerrins, Dobson and Colleran, 2004). En nitritkoncentration på mer än 5-8 mg/l har visat sig hämma fosfatupptag (Meinhold, Arnold and Isaacs, 1999). Nitrit kan även ha en inhiberande verkan på denitrifikationen när koncentrationen når över 30 mg/l (Christensen and Harremoës, 1977). Dock är nitrathaltens påverkan på denitrifikationsaktiviteten är liten i suspenderade system (Miner, 2006) (Christensen & Harremoës, 1977). 18

1.1.4. Övriga inhiberande och toxiska faktorer Denitrifikationen inhiberas av bland annat svavelföreningar, acetylen, cyanid och pestisider (Knowles, 1982). Tungmetaller och andra metaller kan vara toxiska för mikroorganismer i olika grad, från att bara vara inhiberande eller dödande. Halterna som blir toxiska för organismer varierar både med ämne, men också med vilken organism det rör sig om (Sadler and Trudinger, 1967). Tvåvärt koppar inhiberar t.ex. denitrifierande bakteriers metabolism med 50% vid en koncentration på 0.95 mg/l och vid 26.5mg/l för nitrifierande bakterier (Ochoa-Herrera et al., 2011). Koncentration av krom, kadmium, koppar och nickel har visat sig börja inhibera tillväxt av bakterier i aktiverat slam redan vid låga koncentrationer på ca 10 mg/l, men får först stor effekt när koncentrationerna når över 500 mg/l. Störst inhiberande effekt hade krom (Hartmann, Skrobankova and Drozdova, 2013). Ammonium inhiberar NOB vid 0.1 1.0 mg ammoniak/l och helt vid 14-17 mg/l. AOB inhiberas av ammonium vid 10 150 mg/l och helt vid 78 mg/l (Kim, Lee and Keller, 2006). Salpetersyrlighet (HNO2) är också inhiberande för nitrifikation om koncentrationen blir större än 0, 22-2,8 mg/1 (Anthonisen et al., 1976). Den största inhiberande effekten fås först föst när koncentrationerna chockhöjs. Speciellt när temperaturen är låg kan ammonium påverka nitrifikationen, men många mikroorganismer kan adaptera sig och öka sin tolerans om de inte utsätts för plötslig ökning av tungmetaller (Hartmann, Skrobankova and Drozdova, 2013) (Kim, Lee and Keller, 2006). 1.1.5. Tillgänglig fosfor Fosfor (P) förekommer i flera former, som organiskt och inorganiskt samt finnas löst i vattnet. Orthofosfat är fosfatet som mikroorganismer kan ta upp direkt i sin metabolism (Spellman, 2009). Efter(Post)-denitrifikation, är knepigt i biologisk rening eftersom fosforåtgången i stegen innan kan göra att fosforhalten blir begränsande för bakterier i efterföljande steg. Begränsning av tillväxten hos bakterier skiljer sig åt mellan arter och deras sammansättning kan variera från 3- <0,01% fosfor (Godwin & Cotner, 2015). Under 2014 konstaterades det att 1 mg/l fosfatfosfor var tillräcklig för en tillfredställande nitrifikation och denitrifikation i KBR-anläggningen. Enligt litteratur ska en fosfatfosforhalt på mer än 0,5 mg/l vara mer än tillräcklig och 0,1 g PO4-P/m 3 för denitrifikation (Gerardi, 2010) (Boltz et al., 2012). Mindre än 0,03 g/ m 3 är ytterst begränsande för denitrifikationen och om orthofosfathalten understiger 0,05 mg/l kan inte löst cbod (BOD representerat av kolföreningar) brytas ned och konverteras istället till olösliga polysaccharider som med luften i slammet bildar skum (Sagberg, P.; Ryrfors, P.; Berg, 2006) (Islam, 2017). För att få en optimerad mängd fosfatfosfortillsats kan en tillsats beräknas utifrån VSS. Slammets torrsubstans kan innehålla 1% fosfor till att utgöra 2,4 vikt% (Görfelt, 2008). Teoretiska beräkningar ger dock bara en riktlinje för tillsatsen. 19

1.1.6. Kolkällan Olika mikroorganismer föredrar olika slags kolkällor och förhållandet mellan kolkälla och andra näringsämnen är viktig för att få en bra tillväxt av mikroorganismer. GAOs (glucose accumulating organisms) gynnas av tillexempel av glucose (Satoh, H.; Mino, T.; Matsuo, 1994). Till organiska föreningar tillhör kemiska föreningar som innehåller kol, dessa kan förekomma i mer eller mindre komplicerade strukturer och är i olika grad nedbrytbara av mikroorganismer. (Spellman, 2009). Förhållandet mellan kväve och kol är viktigt i biologisk rening och kan vara mycket olika beroende på anläggning. Exempelvis nåddes en komplett denitrifikation i en SBR för avloppsvatten från en grisfarm när förhållandet mellan kol och kväve låg på 1,7 (då kolkällan var acetat) (Obaja et al., 2003). Olika AOB kan både inhiberas eller gynnas av olika organiska kolkällor. Samma kan inte sägas om NOB som i de flesta fall verkar öka oxidationen av nitrit vid heterotrofisk miljö (Prosser, 1990). Vid halter av COD på 400 ml/l har det visats att en större fosfatutsöndring sker i slutet av den anaeroba delen i EBPR (Enhanced biological phosphorus removal ) (Morgenroth and Wilderer, 1998). 1.2. Bärarmaterial Olika mikroorganismer, däribland nitrifierande och denitrifierande bakterier, kan fästa på ytor och tillsammans bilda biofilm där näringsämnen transporteras via diffusionsgradienter. Reduktionshastigheten av näringsämnena i biofilm avgörs av hastigheten av avloppsvattenflödet, den organiska belastningen (Organic loading rate, OLR), temperaturen och diffusionshastigheten av näringsämnen in biofilmen (Halling-Sorensen, B.; Jorgensen, 1993). I biofilmer som har fått växa länge är inte fästet till bärarmaterialet lika hårt och skjuvkraften från vattnet kan slita loss delar av biofilmen, snabbt därefter växer dock en ny biofilm upp. Ju tjockare biofilmen blir desto mer kan näringsämnen reduceras, upp till en viss gräns. Denna gräns korrelerar till hur långt in näringsämnena kan tränga in i biofilmen. En för låg flödeshastiget kan resultera i att det bildas en vätskefas med diffusionsresistens som gör att koncentrationen av substrat minskar i vätskabiofilmgränsytan som i sin tur hindrar substratupptag (Characklis, 1981) (Cowle et al., 2014). I en studie på rening av industriellt kväverikt vatten med hjälp bärarmaterial och immobiliserade celler i denitrifikationssteget konstaterades det att den ultimata tjockleken på biofilmen för att få en optimal biomassa låg mellan 400-700 µm (Chen and Chen, 2000). System med biofilmsteknologi kan bli robustare och tillväxthastigheten för nitrifierande bakterier kan öka om de är fixerade (Proccer, 1989). BOD mängden måste dock minskas, annars tar heterotrofa bakterier över (Tchobanoglous, George; Burton, Franklin L.; Stensel, 2003).Med stationär tillväxt har denitrifikation dokumenterats ske ända ned till 5 C (Ilies and Mavinic, 2001). En studie där post-denitrifikation med en MBBR reaktor ( moving bed biofilm reactor en process med suspenderade biofilmsbärare) och biologiskt filter används konstaterades det att fosfor blev begränsande när förhållandet mellan fosfor och kväve blev 0,0086 g P/g N. 1.3. Analysmetoder av mikroorganismer För analys och identifiering av mikroorganismer finns det både äldre och nyare metoder. Äldre analysmetoder kan exempelvis vara att observera mikroorganismers utseende i mikroskop, använda olika färgningsmetoder så som gramfärgning, undersöka näringsbehov och den kemiska 20

sammansättningen i cellväggen. Nu mera finns det nya tekniker inom fylogeni där mikroorganismer identifieras med hjälp av genetik (Tchobanoglous, George; Burton, Franklin L.; Stensel, 2003). 1.3.1. Fluorescent in situ hybridization (FISH) FISH är en teknik som använder sig av skillnaden i det genetiskt materialet i cellerna där fluorescerande prober med specifika korta gensekvenser (oligonukleotider) används för att fästa på matchande genetiskt material hos organismer för att det sedan ska kunna visualiseras i mikroskop. De celler som innehåller den sökta genen kommer fluorescera och utmärka sig från resterande bakterier i provet (Moter and Göbel, 2000). Resultat i hur bra en prob kan detektera bakterier varierar mycket med vilken sorts vatten bakterierna befinner sig i. Tillexempel kan detektion av mikroorganismer med hjälp av proben EUB338 variera mellan 1% -100% där den har bäst detektionsgraden erhållits i avloppsvatten medan mer rent vatten som kärr eller dricksvatten hade en lägre detektionsgrad. Antalet bakterier som kan detekteras av en prob kan avgörs också beroende på bakteriens fysiologiska egenskaper. Både koncentrationen formamid samt natriumkloridhalten har en signifikant påverkan på resultatet från analysen, där båda påverkar förhållandena som avgör hur bra annealingen mellan oligonukleotiderna och målgensekvensen blir. Formamiden påverkar vid vilken temperatur hybridiseringen kan utföras och saltet används för att reducera orenheter. Dock varierar koncentrationerna stort mellan olika protokoll för F.I.S.H analys även om det rör sig om samma prob. Mest påverkan på resultatet från hybridiseringen har vattentypen och typ av fluorokrom (Bouvier and Del Giorgio, 2003). 1.3.2. Utvärdering av slam & vattenkvalité med mikroskopering Genom att studera mikroorganismer under mikroskop går det att få en bild av hur statusen i ett vatten ungefär ser ut. Det är en relativt snabb metod där bland annat protozoer kan studeras (se avsnitt 2.2 Mikroorganismer). 21

1.4. Anläggningsbeskrivning av Löt avfallsanläggning På Löt Avfallsanläggning finns det två äldre deponietapper (IFA-1 & 2) med icke farligt avfall som togs i bruk 1995 (Figur 2). För att behandla det lakvatten som uppstår har byggt om en tidigare luftad damm till en biologisk reningsanläggning, en KBR-anläggning. Tanken är att reningen ska ske kontinuerligt med hjälp av nyttiga mikroorganismer (, 2015). Figur 2 Vy över Löt Avfallsanläggning där de två äldre deponierna (1), KBR-anläggningen (2), våtmarken (3) och utsläppspunkten (4) kan ses. Lakvattnet måste uppnå en viss renhet innan det är klarbehandlat och kan släppas ut. Riktvärden som gäller för vattnet som får släppas ut från Löt Avfallsanläggning går att se i Tabell 3. Tabell 3 Riktvärden i utsläppspunkten (L3) from 2016-07-01 PARAMETER ARSENIK, AS BLY, PB KADMIUM, CD KOPPAR, CU KROM, CR KVICKSILVER, HG NICKEL, NI ZINK, ZN AMMONIUMKVÄVE, NH4-N BOD7 (ATU) FOSFOR TOTAL, P KLORID, CL RIKTVÄRDE 12 µg/l 5 µg/l 0,4 µg/l 15 µg/l 30 µg/l 0,1 µg/l 50 µg/l 80 µg/l 10 mg/l 15 mg/l 0,4 mg/l 900 mg/l 22

1.4.1. Dammar och brunnar Nedan följer en förklaring av de dammar och brunnar på Löt Avfallsanläggning vars lakvatten är inkommande eller utgående från KBR-anläggningen (Fel! Hittar inte referenskälla.). Lakvattnet från deponin för icke-farligt avfall (IFA3), liksom vatten från asbestdeponin och de sluttäckta cellerna för aska och elavfall, kan ledas via L4 och L2E till KBR-anläggningen. Men vatten pumpas företrädelsevis direkt in till KBR-anläggningen från IFA1 & 2 via provpunkt L11. Tabell 4 Olika delar av Löt avfallsanläggning och dess funktion ANLÄGGNINGS- FUNKTION NAMN FÖRKLARING DEPONI FA Farligt avfall BRUNN (INLOPPSVATTEN TILL KBR) IFA L12 L11 Icke farligt avfall, 3 st. Två stycken äldre deponier och en modernare. ask+ asbest+ el lagring Vatten från IFA 1 & 2, äldre deponier. Kan pumpas in i KBR-anläggningen. LAGRING L4 Tar emot vatten från den modernare IFAdeponin samt FA-deponier. Även ask+ asbest+el lagring (L12). Kan pumpas till L2E. Kan även lagra vatten från IFA 1 & 2. L2E Får vatten från L4, pumpas till L2A. KBR L2A Luftad damm. Rinner via bottenventil/överfall till L2B. L2B L2C L2D Anaerob damm. Rinner via bottenventil/överfall till L2C. Efterluftning. Rinner via bottenventil/överfall till L2D. Sedimentering. Pumpas till våtmarken och sedan till översilningsyta. VÅTMARK VM Tar emot lakvatten från alla delströmmar på Löt avfallsanläggning inklusive KBR-anläggningen innan vattnet pumpas till en översilningsyta och når L3. UTSLÄPP L3 Mätpunkt innan utsläpp. 23

1.4.2. KBR-anläggningen KBR-anläggningen installerades under våren 2014 följt av ett pilotprojekt i ett examensarbete (Karlsson, 2014). I nuläget är anläggningen dimensionerad att behandla ca 400m 3 vatten per dygn och tar in vatten från de mer näringsrika strömmar som kommer från deponin för icke farligt avfall. Det tidigare examensarbete utfört på KBR-anläggningen (Karlsson, 2014) har konstaterat att reningen under sommarmånaderna under rätt förhållanden är tillräcklig för den mängden vatten som kommer från IFA1 &2. Mängden inpumpat lakvatten till KBR-anläggningen mäts online och om KBR-anläggningen inte är i drift kan lakvattnet ledas till någon av lagringsdammarna istället. Figur 3 Skiss över KBR-anläggningens dammar samt deras specifikationer. Av: KBR-anläggningen utgörs av fyra delar designade så att vattnet spontant ska rinna igenom dammarna via små överfall när en viss nivå uppkommit (Figur 3), varje damm ligger 5 cm lägre än den andra där damm A (L2A) ligger högst upp för att vattnet ska rinna i rätt riktning. Dammarna är också försedda med bottenventiler som är placerade i väggarna mellan dammarna. Under 2017 var bottenventilerna öppna. KBR-anläggningen är upplagd enligt klassisk biologisk rening där nitrifikation sker i det första steget (L2A), följt av denitrifikation i nästa steg (L2B), sedan kommer efterluftningssteg (L2C) för behandling av eventuella rester från kolkällatillsatts och sist ett sedimentationssteg (L2D). Inloppen till KBR-anläggningen utgörs av L11 och även L2E via pumparna P3 respektive P2 som slås samman i P4. 24

I L2A mäts syrehalten online, och ett antal bottenluftare styrs manuellt för att hålla nivån på runt 4 mg/l (Karlsson, 2014). Dessa luftare fungerar också som omrörare. L2B har omrörning men ska ha anoxisk miljö, sådeles används inga luftare. I L2C luftas lakvattnet med en ytluftare i inloppet återigen för att rester av näringsämnen från tidigare steg ska konsumeras av mikroorganismerna. I L2D förekommer varken luftning eller omblandning och bildat slam får sedimenteras innan vatten pumpas upp till våtmarken. Hela KBR-anläggningen ligger utomhus och påverkas därför av de rådande väderförhållandena. För att reglera temperaturen värms lakvattnet upp genom att vatten från L2A pumpas upp till en gaspanna som drivs på gasen från deponin, lakvattnet återförs sedan tillbaka till L2A och sprids genom perforerade slangar som är placerade längs bottnen. 1.4.3. Modifikationer i systemet Genom åren som KBR-anläggningen har varit i drift har förändringar genomförts, både förutsedda och icke förutsedda. 1.4.3.1. 2014 Under våren installerades KBR-anläggningen och den togs i bruk i maj. Från och med maj fram till oktober genomfördes ett pilotprojekt för att optimera KBR-anläggningen (Karlsson, 2014). Då optimerades KBR-anläggningen utifrån ett inflöde på 400m 3 /dygn, ett flöde som sedan dess inte varit lika stort. Kolkällan som tillsätts är Brenntagplus VP1 som innehåller proteiner, sackarider och alkohol med ett högt COD-innehåll. Tillsatsmängden baserat på att COD-halten ska vara 4 gånger så stor som den inströmmande nitrathalten i L2B. Under projektet konstaterades det att en syrehalt på 4 mg/l var tillräcklig för att inte begränsa nitrifikationen samtidigt som syrehalten hölls under 0,2-0,4 mg/l i denitrifikationssteget. En god nitrifikation och denitrifikation uppnåddes vid en temperatur upp mot 14 C och som lägsta temperatur sattes 10 C för nitrifikationssteget. Fosfortillsats i KBR-anläggningen har tidigare gjorts med 75% fosforsyra där tillsatsen beräknats med målet att i nitrifikationssteget ha en halt på 1 mg/l fosfor. 1.4.3.2. 2015 Under 2015 tillsattes ca totalt 687 kg fosforsyra i slutet av april och maj till L2A och i april började lakvattnet värmas upp med hjälp av en deponigasdriven värmepanna så temperaturen kunde hållas över 10 C stora delar av året i L2A. 1.4.3.3. 2016 Under 2016 tillsattes ca 10 liter fosforsyra till KBR-anläggningen vid två tillfällen i maj för att kickstarta processen. Efter den 28e juni, när allt lakvatten i KBR-anläggningen var nitrifierat, begränsades flödet genom KBR-anläggningen till ca 7 m 3 /dygn (Miljörapport 2016 Löt avfallsanläggning Lakvattenbilaga, 2017). Bärarmaterial (Mutag BioChip ) tillsattes i denitrifikationssteget (L2B) under hösten, de förvaras i ca 60 st nätsäckar som är utplacerade längs kanter och mitt i KBR-anläggningen. 25

1.4.3.4. Aktuell projektperiod, 2017 Ingen fosforsyra tillsattes till KBR-anläggningen under 2017 för att kickstarta den biologiska processen som tidigare år, dock har kolkälla fortsats att tillsättas till L2B. Det nya året har präglats av torka och en mycket liten mängd lakvatten har bildats vilket har resulterat i lägre inflöden än vad KBR-anläggningen dimensionerades för. Våtmarken, som är det efterföljande reningssteget till KBR-anläggningen, har vid flertal tillfällen varit torrlagd under en lång period för lagning av en av vallarna, detta har medfört att inget vatten pumpats upp till våtmarken under en lång period. Ett blixtnedslag i slutet av juni slog ut flödesmätning och annan utrustning samt att luftningen och pannan periodvis haft driftstopp. 26

2. Metod och material En omfattande litteraturstudie kommer utföras samt en större dataanalys med data från 2015-2017 i syfte att ta reda på jämförelsevärden för lakvattenrening och den aktuella reningen på Löt. Därefter kommer labbförsök att utföras. För att avgöra KBR-anläggningens reningsgrad kommer även en massbalans ställas upp. Eftersom en stor del av projektet har gått ut på att undersöka vad som kan förbättras i KBR-anläggningen valdes först ett par analysmetoder utifrån litteraturstudie och utefter projektets fortskridande anpassades metod-, och vägval efter projektet. Nedan följer metodval samt beskrivning av utföranden. 2.1. Provtagning För kemiska analyser av vatten i anläggningen skickar vattenprover till ett ackrediterat laboratorium, ALcontrol Laboratories. Det tas prover på KBR-anläggningen varannan vecka (se Appendix I Provtagningsschema), där även fältmätning utförs. En av provtagningstillfällena ingår i den större månadsprovtagningen för hela Löts anläggning och då analyseras en större mängd ämnen i KBR-anläggningen. Alla prover analyseras ofiltrerat. De parametrar som analyseras av ALcontrol Laboratories är näringsämnen i from av kvävefäreningar och fosforföreningar, organiskt innehåll samt en del tungmetaller. Under projektet togs prover i alla KBR-anläggningens dammar samt på bärarmaterialet från L2B (se Figur 4). Vid varje provtagningstillfälle togs vattnet upp från ca 0,5 m djup med en bägare fäst på en stav och plastflaskor fylldes och förseglades. Samtidigt togs fältmätningar av ph, temperatur och konduktivitet samt att syremängden i L2A avlästes. Proverna transporterades till labb på KTH och fixerades samma dag utom vid ett fåtal tillfällen då fixeringen skedde med en dags fördröjning, resterande prov förvarades i kyl. Driften av KBR-anläggningen kan se olika ut från vecka till vecka och beslutas efter en lägesrapportering under veckovisa möten av. Figur 4 KBR:en med siffror som visar ordningen som vattnet strömmar. 1 nitrifikation, 2 denitrifikation, 3 efterluftning och 4 sedimentering. 27

2.2. Fluorescent in situ hybridization (FISH) Ett mål med projektet var att utvärdera mikroorganismerna i KBR-anläggningen och därför valdes mikroskopering för att analysera det mikrobiella samhällets förändring under projektperioden och FISH-analys valdes för att identifiera om det förekommer eftertraktade arter av mikroorganismer. 2.2.1. Val av prober för FISH Eftersom det inte gjorts några tidigare analyser av vilka organismer som finns i anläggningen, samt att det är en ny anläggning, så studerades mikroorganismerna mer generellt i stället för att gå in på enskilda organismer. Dessutom förväntades en bred artrikedom vilket gör det ännu omständligare att undersöka enskilda organismer och den större bilden av vattnet skulle bli svåruppnåelig (Huang et al., 2004).) Alla valda prober och deras gensekvenser finns listade i Tabell 5. För att påvisa fosforackumuleraden bakterier, PAOs, kom först en mer generell prob att användas, BTWO23a (röd fluorokrom), som är relativt ospecifik och indikerar förekomsten av beta-2- proteobacterier. Inom den gruppen förekommer de Rhodocyclus-relaterade organismerna som kan inneha förmågan att ta upp stora mängder fosfor. Om en signal erhålls med BTWO23a kan en lite mindre generell prob användas för att se om det är PAOs (PAO846 med röd fluorokrom) (Crocetti et al., 2000). För att avgöra om hybridiseringen varit lyckad och det existerar bakterier i provet valdes en generell prob som fäster på de flesta bakterier, EUB338 (med grön fluorokrom). För att avgöra om ineffektiviteten i denitrifikationssteget kommer av att det saknas tillräckligt många denitrifierande bakterier kommer en prob som använts vid tidigare studier på KTH användas, COM1424 (med röd fluorokrom) som signalerar förekomsten av Comamonas (Andersson and Dalhammar, 2007) (Amann et al., 1996). Tabell 5 Använda pober för F.I.S.H. analys. Formamid-procenten som angivs nedan är den som rekommenderas för proben, i det här projektet användes dock 25% för alla prober. PROB BAKTERIE FORMAMID % TEMP. HYBRIDI -SERING PARAFORM- ALDEHYD SEKVENS PAO846 EUB338 Eubakterier 30 46 4% GCTGCCTCCCGT AGGAGT COM1424 Comamonas 25 46 4% ACCTACTTCTGG CGAGA BTWO23A beta-2- proteobacterier 35 - - GAATTCCACCCC CCTCT Rhodocyclusrelated PAO, Accumulibacter 35 - - GTTAGCTACGGC ACTAAAAGG 28

2.2.2. Utförande av FISH För att kunna göra en FISH-analys behöver prover från de olika delarna av anläggningarna först fixeras eftersom de inte analyseras på en gång, sedan kan provet hybridiseras och undersökas under mikroskop. Buffertar för de olika stegen förbereddes i inledningen av projektet och vid behov tillreddes mer av buffertar som tagit slut (se Tabell 15 i Appendix). Som utgång för protokollet utgicks det från ett protokoll som använts i tidigare studier på KTH (Andersson and Dalhammar, 2007) och som baseras på ett protokoll som tagits fram av Amann md.f. (Amann, 1995) eftersom de protokollen applicerats på liknande prober. Eftersom vattnet från KBRanläggningen innehöll relativt liten koncentration mikroorganismer behövdes rätt stora volymer centrifugeras för att få en tillräckligt stor pellet av bakterier, mellan 20-50 ml ofiltrerat lakvatten användes. Mer lakvatten hade kunnat användas men med många centrifugeringar riskerades dock provet att kontamineras av celler som gått sönder. Samma dag som prover samlats in fixerades proverna i 4% paraformaldehyd, tvättades och förvarades i 95% etanol-pbs-lösning i frys för senare bruk. Hybridiseringen gjordes genom att droppa 3µg prov på glasplattor med brunnar, hybridiseringsbuffert samt lösning med 25 ng/µl prob adderades till brunnarna och plattorna läts hybridisera i mörkt vattenbad i 46 C under 2 h. FISH-analys utfördes tre gånger var av en av gångerna var en testomgång. Prob COM1424 och EUB338 användes vid testomgången och kombinerades i samma brunnar för både prov från L2A och L2B. Innan FISH-analys utfördes studerades de fixerade proven under ljusmikroskop för att se om det fanns tillräckligt mycket organismer i provet. Vid sista analystillfället användes både prov från L2A och L2B och dubbletter av glasplattorna gjordes, en platta med 2 µl prob och en med 1 µl prob för varje. Denna gång kombinerades inte olika prober i varje brunn men alla olika prober testades för både L2A och L2B. 2.3. Mikroskopiering Prover från anläggningen studerades under mikroskop och anteckningar fördes över utseende och innehåll på varje prov som tagits. Både en uppskattning av antalet, samt utseende på mikroorganismerna, noterades. I början gjordes uppskattningen av antalet med en mindre noggrannhet och mot slutet med en större noggrannhet, anledning till detta var att en uppskattning av antalet först var tänkt att fås på annan väg. 2.4. Odling på agar-plattor Under projektets gång gjordes även odlingar på näringsagarplattor för att få en bild av koloniernas förändring under projektets gång och olika förhållanden. Ingen ytterligare identifieringsanalys gjordes på kolonierna, detta på grund av den begränsade tidsperioden på projektet. För odling användes dels färdiggjorda näringsagar från labbet på KTH samt egengjutna plattor på L11-vatten. Att L11-vatten användes för att gjuta plattorna var för att efterlikna vattnet i KBRanläggningen så organismer som lever där ska ha en större chans att kunna odlas. För att tillverka plattor av L11-vatten gjordes först en koncentrerad lösning av agar och avjoniserat vatten som autoklaverades. Denna lösning blandades sedan med filtrerat L11-vatten för att få 1,5 % agarlösning. 29

3. Resultat Nedan presenteras resultat från egna analyser, fältmätningar, observationer, beräkningar och dataanalys. 3.1. Analys och utvärdering av data I detta avsnitt presenteras data från mätningar under projektperioden, våren 2017, samt data från tidigare år 2015 och 2016 och även en del data från efter projektperioden egentliga slut i maj. Under vissa perioder saknas mätdata, tydligast är under 2016 då tekniska problem hos ALcontrol resulterade i felaktiga mätresultat. Avdunstningens samt nederbördens påverkan på KBRanläggningen har försummats och återfinns inte i någon data. 3.1.1. Inflöden till KBR-anläggningen Som tidigare nämnt är kapaciteten för KBR-anläggningen dimensionerad att behandla ca 400 m 3 vatten per dygn under ej för kalla månader. I dagsläget behandlas inte fullt så mycket vatten och strömmarna kan se olika ut från dag till dag. Lakvatten kan ledas in i KBR-anläggningen antingen från IFA-deponin (provpunkt L11) via pump P3 eller från lagringsdammen L2E via pump P2. Den sammanslagna vattenmängden leds in via pump P4. För att höja vattennivån i KBR-anläggningen i början av året leddes näringsfattigt vatten in från L2E (P2), efter detta leddes bara vatten in från L2E vid ett tillfälle till. Av näringsrikt vatten (P3) pumpades det in som mest under mars då volymen uppgick till ca 5000 m 3 (Tabell 6). Tabell 6 Pumpad vattenmängd januari till juni 2017 från IFA-deponin INPUMPADE KUBIK FRÅN L11 MÅNAD m 3 % av maximala teoretiska flödet JANUARI 183 1,4 FEBRUARI 2980 27 MARS 5209 42 APRIL 2867 24 MAJ 2547 21 JUNI 1473 12 Flödet i P3 har legat på ca 3,4 m 3 /h, vilket motsvarar ca 81 m 3 /dygn, från februari till mitten av mars. I slutet av mars till mitten av april låg medelflödet på runt ca 5,5 m 3 /h och motsvarande 131 m 3 /dygn. Efter det låg flödet på 3,55 m 3 /h och efter ett uppehåll på grund av underhåll 5-7 maj har flödet legat på 3,2 m 3 /h (Figur 5). 30

inflöde [m3/h] Stockholm 2018 25 20 15 10 5 0 Medelflöden in i KBRen P4 P2 P3 datum Figur 5 medelflöden in i KBR-anläggningen januari- november 2017 där den lila linjen motsvarar vatten från L2E och den ljusblå linjen motsvarar vatten från L11. 3.1.2. Inflödeshalter till KBR-anläggningen Totalkvävehalten i inflödespunkten L11 utgörs näst intill enbart av ammonium och totalkvävehalten understiger sällan 400 mg/l och varierar sällan kraftigt (Figur 6). Fosfor-, och fosfatfosforhalten varierar inte heller kraftigt och under våren 2017 har halterna varit mycket stabila. Medel för BOD under 2015-2017 har legat på 121 mg/l och varierar lite, och motsvarande medel för TOC har varit 426 mg/l. Ibland leds vatten in från L2E-dammen som är mer näringsfattigt men kan innehålla en hel del metaller. Under 2017 leddes bara ytterst lite L2Evatten in i KBR-anläggningen. Tabell 7 Medelhalter för L11 och L2E 2015-2017 ÄMNE MEDEL L11 MEDEL L2E JÄRN, FE mg/l 0,71 0,38 ARSENIK, AS µg/l 35 9,5 BLY, PB µg/l 0,55 0,79 KADMIUM, CD µg/l 0,05 0,06 KOPPAR, CU µg/l 1,56 5,43 KROM, CR µg/l 141 16 MANGAN, MN µg/l 554 453 NICKEL, NI µg/l 23 9,7 ZINK, ZN µg/l 21 31 KVICKSILVER, HG µg/l <0,1 <0,1 BOD mg/l 121 - TOC mg/l 425 - COD mg/l 404-31

PO4-P [mg/l] 2015-04-09 2015-06-09 2015-08-09 2015-10-09 2015-12-09 2016-02-09 2016-04-09 2016-06-09 2016-08-09 2016-10-09 2016-12-09 2017-02-09 2017-04-09 2017-06-09 2017-08-09 2017-10-09 NH4-N, Tot N [mg/l] PO4-P, Tot P [mg/l] Stockholm 2018 L11 2015-2017 700 600 500 400 300 200 100 0 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 NH4-N Tot N PO4-P Tot P Figur 6 Ammonium, totalkvävehalter, fosfatfosfor och totalfosfor i L11 2015-2017 Fosfatfosforhalten och totalfosforhalten har en relativt lik kvot genomgående under hela 2017, den varierar lite under både 2015 och 2016 men följer ett liknande mönster. Under 2017 utgjorde fosfatfosforhalten ca 74% av totalfosforhalten, under 2016 och 2015 låg samma procent på 71% respektive 65% (Figur 6). 3.1.3. Reningen i KBR-anläggningens dammar Översiktsdiagram med data för fosfor, fosfatfosfor och totalkväve visar på hur den övergripande reningen i KBR-anläggningen varit (Figur 7). 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Fosfatfosfor i L2A, L2B och L2D 2015-2017 L2D L2B L2A Figur 7 Fosforsyra tillsattes två gånger i slutet av april och maj 2015 och två gånger i maj 2016 (röda pilar). En panna sattes in för att värma upp L2A 2015 i april (blå pil). Mellan 2016-04-07 och 2016-01-11 saknas mätresultat, detta pga tekniska problem hos ALcontrol I L2A har en del fosfat tagits upp från L11, i nästa damm, L2B togs ännu en del fosfat upp. L2C har utlämnats eftersom det i allmänhet tagit färre prover där. Men mellan L2B och i L2D frigjordes återigen fosfatfosforet och detta var genomgående för alla år. I årens början syntes det 32

2015-04-02 2015-06-02 2015-08-02 2015-10-02 2015-12-02 2016-02-02 2016-04-02 2016-06-02 2016-08-02 2016-10-02 2016-12-02 2017-02-02 2017-04-02 2017-06-02 2017-08-02 2017-10-02 P [mg/l] Stockholm 2018 att alla halter i dammarna var lika, men när den biologiska aktiviteten ökade minskade fosfatfosforhalten i L2B. Innan 2017 hade bara fosfatfosforhalten varit nära noll i L2B vid ett fåtal gånger. Under 2016 när fosforsyra tillsattes L2A kom inte halten tillbaka i senare steg och i början av 2016 var det bara i L2A som upptaget skedde. I början av juli minskade även halten fosfatfosfor i L2B och då uppstod samma halt i L2C och L2D igen. Topparna från fosforsyratillsats under 2015 syntes tydligt i diagrammet. Samtidigt följde inte fosfatfosforhalten samma mönster i L2B som i L2A efter första toppen och en stor mängd fosfat hade antagligen konsumerats efter första toppen vilket gjort att celltillväxten kommit igång. 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 Totalfosfor i L2A, L2B och L2D 2015-2017 L2A L2B L2D Figur 8 Mellan 2016-04-07 och 2016-01-11 saknas mätresultat, detta pga tekniska problem hos ALcontrol. Fosforsyra tillsatts markeras av röda pilar. Totalfosforhalten var relativt konstant i KBR-anläggningen och påverkades nästan enbart av inloppets koncentration (Figur 8). Förhållandet av i totalfosforhalt och fosfatfosforhalt var även det relativt konstant i inloppsvattnet. Därför gick det att anta att om inte fosfoatfosfor konsumeras eller frigörs i KBR-anläggningen så skulle det följa totalfosforhaltens kurva. Det var tydligt att fosfatfosforet stundtals inte följde totalfosforhaltens mönster och under dessa perioder pågick generellt även reduktion av övriga näringsämnen. Det var bara under 2017 som totalfosforhalten var så pass låg i KBR-anläggningen att vattnet hade kunnat släppas ut direkt, dock finns två hela reningssteg till, våtmarken och översilning, så en något högre halt hade varit acceptabel. Under 2015 låg totalfosforhalten i L2A lågt medan totalhalten låg mycket högre i de andra stegen. 33

N [mg/l] Stockholm 2018 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Totalkväve i L2A, L2B och L2D 2015-2017 L2A L2B L2D Figur 9 Mellan 2016-04-07 och 2016-01-11 saknas mätresultat, detta pga tekniska problem hos ALcontrol Reduktionen av totalkväve har existerat nästan hela tiden sedan KBR-anläggningens togs i drift (Figur 9). Dock har reduktionen inte varit lika stor under 2017. Som störst var den under de perioder då det funnits gått om fosfatfosfor i både L2A och L2B. Om man tittade på totalkvävet mellan de olika dammarna under 2017 sågs totalkvävet minska mellan L2A och L2B, detta kunde bero på denitrifikation eller att annan kvävekonsumtion förekommer. Dock var kvävehalten högre i L2D än i L2B under 2017. Ökningen kunde bero på både att vattenflödet inte varit stort mellan dammarna samt att det inte pumpats upp till VM, eller så kan det varit mätfel eftersom inte samma fenomen funnits de tidigare åren. 3.1.4. Nitrifikationen i L2A Under 2017 fram till oktober har nitrifikationen varit igång och ammonium har reducerats näst intill fullständigt. Totalkvävehalten utgjordes nästan helt av nitratkväve (Figur 11). Till skillnad från både 2015 och 2016 har ammoniumhalten i 2017 varit låg redan från årsstarten (Figur 10). Detta berodde antagligen på att inflödet till KBR-anläggningen stoppades innan nitrifikationen avstannade och att uppvärmningen av KBR-anläggningen pågick även under vintern och resulterade i att nitrifikationen fick en snabb uppstart när vatten återigen pumpades in. Fosfatfosforhalten var låg men är inte begränsande för det flöde som varit under 2017. I början av juli ökade halten markant. 34

N [mg/l] PO4-P [mg/l] jan, 03 jan, 24 mar, 21 apr, 07 apr, 23 maj, 04 maj, 15 maj, 25 jun, 02 jun, 13 jun, 23 jul, 02 jul, 13 jul, 23 aug, 03 aug, 11 aug, 22 sep, 01 sep, 10 sep, 21 okt, 01 okt, 10 okt, 20 nov, 02 nov, 12 nov, 24 dec, 06 dec, 17 [mg/l] Stockholm 2018 Ammonium L2A 2015, 2016 & 2017 350 300 250 200 150 100 50 0 2015 2016 2017 Figur 10 Ammoniumhalten i L2A 2015-2017 Totalkväve och Nitrat 2017, L2A 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 N NO3-N PO4-P Figur 11 Totalkväve, fosfatfosfor och nitrat i L2A 2017 35

03, jan 31, jan 04, apr 30, apr 11, maj 20, maj 30, maj 09, jun 17, jun 29, jun 09, jul 20, jul 28, jul 08, aug 18, aug 27, aug 07, sep 17, sep 28, sep 06, okt 15, okt 27, okt 09, nov 19, nov 01, dec 13, dec 28, dec [mg/l] Stockholm 2018 3.1.5. Denitrifikationen i L2B Under 2017 kunde kväve-, samt nitratkvävehalten ses börja sjunka i slutet av juni och början av juli men avbröts igen i slutet av september (Figur 9 och Figur 12). Samma mönster gick att se i L2A (Figur 9). Det gick att notera att under 2017 hade nitrathalten varit som högst och att ingen av de tidigare åren hade kommit i närheten av samma halter utom i slutat av året 2016. Nitrathalten var dels ett resultat av både en fungerande nitrifikation samt en underpresterande denitrifikation (Figur 12 och Figur 7). Nitrathalten i L2B 2015-2017 350 300 250 200 150 100 50 0 Nitrat 2015 Nitrat 2016 Nitrat 2017 Figur 12 Nitrathalten i L2B 2015-2017 där åren representeras av varsin linje. I början av 2017 låg fosfatfosforhalten under den gräns på 0,4 mg/l som ALcontrol rapporterar, senare under året uppdateras analysmetoden och en lägre halt kunde rapporteras (Figur 7 och även Figur 40 i appendix). Ökningen i fosfatfosfor under 2017 i L2B skedde samtidigt som nitrifikationen i L2A avstannade. Detta resulterade i att denitrifikationen i L2B även kom igång på allvar (Figur 12). Trenden i hur totalfosforhalten rörde sig liknande trenden i hur totalkvävehalten rörde sig (Figur 9 och Figur 8). Däremot steg totalfosforhalten tidigare än totalkvävehalten började stiga igen. Både halten fosfatfosfor, totalfosfor och totalkväve ökade i början av augusti igen. Vad detta berodde på är oklart. Fosfatfosforhalten 2016 minskade drastiskt den 9/6 och föll under detektionsgränsen den 6/7, halten återhämtade sig lite igen den 18/8. Fosfatfosforhalten följde tydligt samma trend som kvävehalten och ökade och minskar på samma sätt (Figur 7 och Figur 9). Under 2015 ökade halten totalfosfor från och med den 15/6 medan halten fosfatfosfor låg kvar på relativt konstant nivå (Figur 7 och Figur 8). Fosfatfosforhalten nådde bara under rapportgränsen i början av november och från och med den 21/9 kunde fosfatfosforhalten ses stiga igen. Trenden i reduktionen av fosfatfosfor följde samma trend som när totalkvävet minskar. Vid samma tidpunkt som fosfatfosfor hamnade under rapportgränsen ökade kvävehalten igen. Det gick att konstatera att denitrifiaktionen bara var fullständig under 2015. 36

konc. [mg/l] Stockholm 2018 3.1.6. Nitritkoncentrationen I KBR-anläggningen Nitritkvävehalten har stundtals varit relativt hög i L2A och L2B, detta tydde på en icke fullständig nitrifikation. Nitrithalten var större i L2B än i L2A (Figur 13). 60 50 40 30 20 10 0 Nitritkvävehalt, NO2-N 2017 L2A L2B L2C Figur 13 Nitrithalten i KBR-anläggningen 2017 37

03, jan 24, jan 21, feb 21, mar 18, apr 02, maj 12, maj 20, maj 30, maj 08, jun 15, jun 25, jun 02, jul 11, jul 21, jul 28, jul 08, aug 17, aug 24, aug 03, sep 10, sep 20, sep 29, sep 06, okt 13, okt 26, okt mg/l jan, 03 jan, 24 mar, 21 apr, 07 apr, 23 maj, 04 maj, 15 maj, 25 jun, 02 jun, 13 jun, 23 jul, 02 jul, 13 jul, 23 aug, 03 aug, 11 aug, 22 sep, 01 sep, 10 sep, 21 okt, 01 okt, 10 okt, 20 nov, 02 nov, 12 nov, 24 dec, 06 dec, 17 mg/l Stockholm 2018 3.1.7. BOD och TOC i KBR-anläggningen BOD slutade mätas i slutet av april 2017. Det har förekommit mycket lite skillnad mellan L2A och L2B när det kom till koncentration BOD, detta var antagligen på grund av tillsats av kolkälla i L2B (Figur 14 och Figur 15). Dock gick det att urskilja en liten skillnad i BOD i mitten av mars då BOD i L2B inte följde samma trend som i L2A. BOD7 L2A 2015, 2016 & 2017 350 300 250 200 150 100 50 0 2015 2016 2017 Figur 14 BOD i L2A 2015-2017 I L2B förväntades BOD7-koncentrationen att minska, samtidigt tillsattes kolkälla externt baserat på koncentration nitrat/nitrit och därför minskade inte BOD7 som det annars hade gjort. BOD7 L2B 2015, 2016 & 2017 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 2015 2016 2017 Figur 15 BOD i L2B 2015-2017 Under 2015 och 2016 har halterna BOD varit liknande de halter som förekom under 2017. I juli 2016 hade BOD en topp samtidigt som nitrat under samma datum inte följde totalkvävets trend (Figur 9). Detta betydde antagligen att denitrifikationen inte fungerade vid detta tillfälle. 38

Mn, Cr [µg/l], Cl [mg/l] As, Ni, zn [µg/l] Pb, Cu [µg/l] Cd [µg/l], Fe [mg/l] Stockholm 2018 3.1.8. Metaller i KBR-anläggningen Metallhalter mättes vid ett tillfälle under 2017 i L2A, L2B och L2D (Figur 16 & Figur 17). Det förekom enbart små skillnader mellan dammarna. Det noterades även att trots att de olika dammarna i KBR-anläggningen står i anslutning till varandra så var uppehållstiden så pass lång att det tar lakvattnet flera månader att ta sig mellan dammarna. Metallhater i KBR 2017-05-02 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 L2A L2B L2D Järn, Fe mg/l 0,79 0,83 0,72 Bly, Pb µg/l 2,10 2,60 2,50 Koppar, Cu µg/l 3,70 4,70 4,80 Kadmium, Cd µg/l 0,04 0,04 0,08 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 Figur 16 Metallhalter 2017, järn, bly, kadmium och koppar 700 Metallhater i KBR 2017-05-02 60 600 500 400 300 200 100 50 40 30 20 10 0 L2A L2B L2D Klorid, Cl mg/l 480 450 490 Krom, Cr µg/l 110 95 100 Mangan, Mn µg/l 480 520 550 Arsenik, As µg/l 24 25 26 Nickel, Ni µg/l 17 19 19 Zink, Zn µg/l 34 41 46 0 Figur 17 Metallhalter 2017 klorid, krom, mangan, arsenik, nickel och zink I allmänhet låg halterna i de olika delarna i KBR-anläggningen nära inloppshalterna (L11) vilket gjorde att det gick att anta att det var liknande halter resten av året också. 39

C grad Stockholm 2018 3.1.9. Observation av skumbildning Under projektperioden mars-maj förekom det skumbildning i de aeroba delarna av KBRanläggningen, främst i L2A. Detta noterades, samtidigt med väder och andra förhållanden (Figur 18). För att få en uppskattning av skummängden infördes en skala som skulle motsvara mängden skum. Väldigt mycket, mycket, mellan, lite och inget graderades från 5 till 1 och ses i tabellen nedan (Tabell 8), där väldigt mycket innebär att det var så mycket skum att det blåste iväg flak av skum och lite var om ytterst lite skum kan ses vid kanterna av dammen. Tabell 8 Skum-gradering MÄNGD SKUM GRAD INGET 1 LITE 2 MELLAN 3 MYCKET 4 VÄLDIGT MYCKET 5 Skummängden kunde ses följa temperaturen i KBR-anläggningen och påverkades inte lika fullt ut av lufttemperaturen. När värmen steg i KBR-anläggningen ökade även skummängden. Skumbildning på L2A 2017 15 10 5 0 4 4 5 3 3 3 2 2 1 1 4 6 5 4 3 2 1 0 Temperatur L2A [ C] Temperatur luft [ C] Grad av skum Figur 18 Skumbildningen samt temperatur i vattnet och temperaturen i luften. 3.1.10. Fältmätning av temperatur och ph i KBR-anläggningen Under 2017 har ph i L2A legat på 7,8 i medel från januari till oktober, med högsta värdet på 8,7 vid ett mättillfälle den 10e januari och lägst, ph 7, vid ett mättillfälle i 30e maj. Medel-pH i L2B har även det legat på 7,8 under samma period och växlat mellan ph 7,2-8,5. Generellt har inte ph växlat mycket utan legat relativt stabilt i hela KBR-anläggningen alla år. Temperaturen kunde ses växla med utomhustemperaturen i L2B medan den i L2A styrdes genom värmepannans uppvärmning Figur 19 och Figur 20. 40

Konc. [mg/l] 03, jan 31, jan 04, apr 30, apr 11, maj 20, maj 30, maj 09, jun 17, jun 29, jun 09, jul 20, jul 28, jul 08, aug 18, aug 27, aug 07, sep 17, sep 28, sep 06, okt 15, okt 27, okt 09, nov 19, nov 01, dec 13, dec 28, dec C jan, 03 jan, 24 mar, 21 apr, 07 apr, 23 maj, 04 maj, 15 maj, 25 jun, 02 jun, 13 jun, 23 jul, 02 jul, 13 jul, 23 aug, 03 aug, 11 aug, 22 sep, 01 sep, 10 sep, 21 okt, 01 okt, 10 okt, 20 nov, 02 nov, 12 nov, 24 dec, 06 dec, 17 C Stockholm 2018 Temperatur L2A 2015, 2016 & 2017 30 25 20 15 10 5 2015 2016 2017 0 Figur 19 Temperatur i L2A 2015-2017 25 20 Temperatur L2B 2015, 2016 & 2017 15 10 5 2015 2016 2017 0 Figur 20 Temperatur i L2B 2015-2017 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Temperatur och fosfatfosfor L2B, 2015 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Temperatur PO4-P Figur 21 Temperatur och fosfatfosfor L2B 2015 41

Under 2015 var nästan aldrig fosfatfosforhalten begränsande. Ökningen i fosfatfosforhalten korrelerade med temperaturens minskning. Enligt Figur 21 verkar en temperatur under ca 16 C inhibera denitrifikationen. 3.1.11. Beräkning av ammoniak-, och salpetersyrakoncentration i KBR-anläggningen För att avgöra om det förekom toxiska halter av ammoniak och salpetersyra (HNO2) gjordes följande beräkningar (se ekv. 9, 10, 11 och 12). Beräkning av ammoniak (NH3): Ammoniak = 17 Ammonium ( mg L ) 10pH K 14 b (9) Kw +10pH K b K w = e (6334/(273+ ) (10) Där Kb är joniseringskonstanten i jämviktsekvationen för ammonium och Kw är joniseringskonstanten för vatten. Halten ammoniak blir som störst vid höga temperaturer kombinerat med höga ph. I KBRanläggningen blir ph sällan större än 8,9. Tabell 9 Exempel på beräkning av ammoniak från prov den 8/8, L2B Ammonium 1,3 mg/l ph 8,5 temperatur 21 Ammoniak: 0,19 mg/l Beräkning av HNO2 : HNO 2 = 46 NO mg 2 N ( L ) 14 K a 10 ph (11) K a = e ( 2300/(273+ ) (12) Där Ka står för joniseringskonstanten för jämviktsekvationen för HNO2. HNO2 blir som störst vid låga ph och låga temperaturer (Anthonisen et al., 1976). Tabell 10 Exempel på beräkning av salpetersyra från prov den 10/10, L2B Nitrit 250 mg/l ph 7,2 temperatur 11 HNO 2 0,17 mg/l 42

3.1.12. Massbalans och uppehållstid En massbalans ställdes upp över L2A och L2B samt över hela KBR-anläggningen för att få en bild av de reducerade mängderna, se Figur 22. L11 (in) L2A L2B L2B (ut) Figur 22 Uppställning av massbalans Ut L2A/In L2B IN Reducerat = UT + Ackumelerat i dammen (6) Kg L11 (in) Kg Red. = Kg L2A (ut) + Kg Ack.(I L2A) (7) Kg L2A (in) Kg Red. = Kg L2B (ut) + Kg Ack.(I L2B) (8) Månadsmedel av koncentrationerna för fosfatfosfor samt ammonium användes vid beräkning av mängder. Mängderna beräknades utifrån respektive damms volym samt in/utflöden. Invattenflödet från L11 antogs var det flöde som uppstod mellan varje dam samt utflödet. Kondensation och nederbörd har ignorerats. Vid beräkning av fosfatfosforhalten i L2B har halten varit lägre än detektionsgränsen (<0,4 mg/l) under april och maj och därför har de uteslutits i beräkningen. Även januari har uteslutits där vatten från L2E pumpades in i KBR-anläggningen samt knappt någon aktivitet skedde. Juni är inte inkluderad eftersom det saknas flödesdata. Tabell 11 Mängd ammonium och fosfatfosfor som reducerats februari till maj respektive februari till mars MÅNAD KG AMMONIUM KG FOSFATFOSFOR L2A L2B L2A FEBRUARI 1107 56 1,9 MARS 2271 6,4 4,2 APRIL 1289-2,7 MAJ 1170-1,9 Även en modulerad halt togs fram för att jämföra den faktiska koncentrationen som inflödet skulle ge upphov till varje månad om reduktionen plötsligt skulle upphöra i början av den månaden (se Figur 23 och Figur 24). 43

mg/l mg/l Stockholm 2018 300 Ammoniumhalt L2A, Uppmätt & modellerad halt 2017 250 200 150 100 50 Uppmätt månadsmedel [NH4-N] Modellerat månadsmedel [NH4-N] 0 januari februari mars april maj juni Figur 23 Ammoniumhalt L2A, uppmätt samt modulerad 2017 Skillnaden mellan kurvorna var den ammoniumhalt som mikroorganismerna reducerar varje månad (Figur 23) och ligger runt 180 mg/l i medel. Den modulerade halten var modulerad efter L11-lakvattnets (inloppet) koncentration. I L2A hade fosfatfosforhalten blivit relativt hög om nitrifikationen slutade (Figur 24). Detta visade att en hel del nitrifikation pågått även om månadshalten utgörs av en resthalt av ammonium, vilket var tydligt i februari. 0,80 0,72 0,76 0,75 Fosfatfosfor L2A, Uppmätt & modellerad halt 2017 0,60 0,47 0,40 0,40 0,20 0,14 0,08 0,09 0,02 0,02 0,00 januari februari mars april maj 0,29 Uppmätt månadsmedel [PO4-P] Modellerat månadsmedel [PO4-P] Figur 24 Den modulerade halten fosfatfosfor är modulerad efter L11lakvattnets (inloppet) koncentration. Under projektperioden, våren 2017, låg medelflödet på ca 3,5 m 3 /h. Detta motsvarar en uppehållstid på ca 60 dagar bara i L2A, och i hela KBR-anläggningen blir det 95 dagar (se ekv. 5). 44

3.2. Analys och observation på lab Vattnets mikrobiella sammansättning studerades på lab på KTH genom in vitro koloniodling på agarmedium, FISH-analys samt observationer med mikroskop. 3.2.1. FISH En testomgång visade att det var mycket lite bakterier i proven samt att en viss del kristallbildning hade skett. Men främst var inställningen på mikroskopet satt på så vis att det var svårt att tyda någon signal. Detta justerades till de andra analyserna. Andra omgången, med prover från den 13/6, förekom det mycket ytfärgning av slam och det gick inte att urskilja om det förekom färgade bakterier. Från F.I.S.H-analysen av prover från den 23/5 kunde mest protozoer och filamentösa bakterier ses, det förekom en hel del slam som gjorde det svårt att se om det existerade några bakterier. Nedan följer en närmare redogörelse för resultatet den 23/5. Figur 25 COM1424 prob i L2A I alla brunnar med L2Aprov med 1 µl prob syntes ingen fluorescens, det enda som gav någon fluorescens var kristaller och svaga indikatorer på protozoer. I L2Aprovet med 2µl prob EUB338 syntes inga fluorescerande bakterier, även när provet studerades utan UV-lampa såg det inte ut att vara några bakterier. Det enda som noterades var några kristaller. Det går därför inte att utesluta att bakterier saknas i alla prover. 45

Figur 26 Prov med BTWO23a där ingen signal syns, en högre ordnings organism avger autofluorescens (uppe höger och vänster). Prov med BTWO23a, en mycket svag röd punkt kan ses i högra delen av bilden (nedre höger vänster). I (Figur 25) ses en bild med COM1424 prob där två röda fläckar kan noteras. Den större är med största sannolikhet en protozo eller en kristall som missfärgats. Den mindre signalen går inte helt att avgöra vad den är. När det kommer till provhybridisering med BTWO23aprob verkade det återigen vara en del protozoer som avgav autofluorescens, även del från större organismer (Figur 26). Även i provet med PAO-proben var det mycket svårt att urskilja något. Någon enstaka röd fluorescens syntes men om det faktiskt gällde en organism eller inte var inte helt självklart (Figur 27). 46

Figur 27 PAO-prob: En tydlig röd prick kan ses i höger halva av bilden, den är relativt stor för att vara en bakterie (uppe, höger och vänster), antagligen autofluorescens från protozoer. En lätt rödfärgad fläck går att antyda. Det går dock inte att avgöra om det är en protozo eller en missfärgning (nedre, höger och vänster). Tyvärr var alla resultat från L2Bprovet mycket svårtydda eftersom rester från proben inte riktigt sköljts bort ordentligt (Figur 28). Figur 28 Ett exempel från prov med EUB338. 47

3.2.2. Mikroskopering Mikroskopstudier genomfördes som ett komplement till F.I.S.H-analysen och resultaten kan inte agera som ett ordentligt vetenskapligt underlag på exakt antal mikroorganismer utan ska behandlas som en illustrering av trenden i antalet mikroorganismer. Tidvis har det varit liten till knappt noterbar skillnad i organismantal och diversitet mellan de olika delarna i KBR-anläggningen. Antalet organismer ökade generell från mars till slutet av april, men under maj minskade antalet igen. KBR-anläggningen hade ett stort antal organismer relativt de andra dammarna. Våtmarken led av torka och de små vattenmängderna som ibland uppstod innehöll nästintill ingen synlig aktivitet. L2E hade stor diversitet bland organismerna men antalet mycket var lågt samt att det förekom få bakterier, de flesta organismer var protozoer. L11 hade ett mycket högt antal svarta små sfäriska partiklar som först antogs bara vara partiklar, däremot påvisade de senare ett rörelsemönster som gjorde att organismer inte kunde uteslutas. L11provflaskorna skulle senare visa sig få en explosionsartad tillväxt i kylskåpet. Mikroskopering i maj av tre gamla prover från mars visade på tillväxt av suspenderade bakterier även när proverna förvarats i kylskåp. Däremot syntes näst intill inga filamentösa bakterier eller protozoer. Ökningen var stor i alla prover utom i det tidigaste provet från den 13/3 då antalet organismer bara gjorde en liten ökning. Högre ordningens organismer samt eukaryota organismer så som kräftdjur (Crustacea) och rundmaskar (Nematoder) observerades mot slutet av projektet (Figur 29). Figur 29 Högre ordningens organismer i L2D 28e juni (eventuell nematod vänster, crustacea höger). 3.2.2.1. Bakterier Bakterierna har generellt ökat från och med mars fram till april. Lakvattnet påvisar en stor diversitet där både relativt små sfäriska (kockerformade) och stavformiga bakterier varit vanliga. Även några i skruvade stavar (spirillformad) noterades, dock sällan. Få sfäriska bakterier i rad noterades men ett antal stavformiga diploida par observerades mot slutet av april. En bakterie som observerades frekvent var en sfärisk bakterie som antingen förekom som ensamma eller som diploida par och som hade fyra stycken spröt eller styva trådliknande organeller utplacerade jämnt över sfären. Mängden fria bakterier i förhållande till filamentösa bakterier har skiftat under hela projektperioden och flockformationer har uppstått först mot slutet av projektet. 48

3.2.2.2. Filamentösa bakterier De filamentösa bakterier hade en tydlig ökning från och med mars fram till april. De förekom antingen, som styva och smala eller tjocka samt krokiga och antingen förankrade i slamklumpar eller var suspenderade i lakvattnet. Inga av de filamentösa bakterierna verkar haft någon förgrening och de flesta hade inga tydliga cellväggar. De filamentösa bakterierna i L2A utgjordes i stor utsträckning av de mer styva sorterna. När antalet filamentösa bakterier blev som störst i mitten av april var de relativt kortare än de var innan de blev många och de krokiga blev vanligare. L2B hade generellt mer blandat av både styva och krokiga filamentösa bakterier. Men i mitten av april och mot slutet av maj var antalet mycket stort och de flesta var krokiga och relativt kortare än innan, även färre förankrade i slamklumpar observerades. Både L2C och L2D hade liknande organismer som i L2A och L2B, bara i ett mindre antal. Inga filamentösa bakterier noterades i skumprovet (Figur 30). Se Appendix, III Bilder från mikroskop för fler bilder. Figur 30 (Vänster) Mikroskopbild i 40x av slam filamentösa bakterier i L2Bprov. (Höger) Mikroskopbild av skum. 3.2.2.3. Protozoer I allmänhet såg beståndet av protozoer likt ut i varje damm men vissa skillnader noterades. I L2A var det under mars och tidiga april några stora protozoer, några med klorofyll. En del flagellater förekom även, stora och små. Under mitten av april förekom en mängd olika arter, nu syntes även protozoer med cilia. Dock förekom inte lika många stora arter. Mot slutet av aprilförekom många olika sorter men inga med cilia syntes till. L2B liknade L2A. Under mars var det många olika arter, mest större med flagell. Sedan börjar protozoerna bli mindre i storlek. I början av maj förekom återigen relativt större protozoer, både ciliater och flagellater. Mot mitten av maj minskade antalet drastiskt och det verkade bara vara två arter som förekom, båda protozor med flageller. I L2C syntes mycket få i slutet av mars och början av april och de flesta var relativt små. Mot mitten av april var det stor avsaknad av protozoer. I maj återkommer protozoerna men de verkade vara av samma sorts art, liten rund med två flageller. Mot slutet av maj minskade antalet protozoer igen. Generellt liknade L2Ds prover L2Bs och L2Cs prover från och till, i vissa fall var det lite färre organismer än i de andra två dammarna. 49

Figur 31 Skiss gjord i labbanteckningar av vanliga protozoer/organismer som syntes i prov från KBRanläggningen under 2017. Av: 3.2.2.4. Trend i organismers antal En uppskattning av antalet mikroorganismer gjordes genom okulär och visuell uppskattning av antal bakterier under mikroskop och utifrån de observationerna gjordes en uppskattning av antalet. En skala infördes för att motsvara uppskattat antal (Tabell 12). Resultaten ska ses som mer av en trend än direkt antal. När antalet var mycket litet uppskattades antalet bakterier genom att genomsöka hela provet, när sedan antalet blev större räknades antalet bakterier inom varje vy (på 1-3 stycken ställen i provet) och medel av detta användes. Tabell 12 Gradering av antal organismer BESKRIVNING SKALA ANTAL (UPPSKATTAT) OBEFINTLIGT 0 Dött i hela provet EXTREMT LÅG 1 1-2 i hela provet MYCKET LÅG 2 3-5 st i hela provet LÅG 3 6-10 st i hela provet LÄGRE MEDEL 4 1-5 st/mikroskop vy MEDEL 5 6-10 st/mikroskop vy HÖGRE MEDEL 6 11-20 st/mikroskop vy HÖG 7 21-30 st/mikroskop vy MYCKET HÖG 8 31-50 st/mikroskop vy EXTREMT 9 5 1-80 st/mikroskop vy MÅNGA MÅTTLÖST 10 81-100 st/mikroskop vy 50

Antal (skalat) Antal (skalat) Antal (skalat) Stockholm 2018 8 6 4 2 0 Uppskattat antal organismer L2A 2017 Protozoer Fritt simmande bakterier Filamentösa bakterier Slamkluster Flockar Figur 32 Organismer i L2A 2017 10 8 6 4 2 0 Uppskattat antal organismer L2B 2017 Protozoa Fritt simmande bakterier Filamentösa bakterier Slamkluster Flockar Figur 33 Organismer i L2B 2017 10 8 6 4 2 0 Uppskattat antal organismer L2C 2017 Protozoa Fritt simmande bakterier Filamentösa bakterier Slamkluster Flockar Figur 34 Organismer i L2C 2017 51

10 8 6 4 2 0 Uppskattat antal organismer L2D 2017 Protozoa Fritt simmande bakterier Filamentösa bakterier Slamkluster Flockar Figur 35 Organismer i L2D 2017 Mängden organismer i de olika dammarna var liknande. Och vad som också var gemensamt för dammarna var att antalet var som störst i mitten av maj. L2A utgjordes av mest fritt simmande bakterier och de andra var i mindre mängd. I L2B var de fritt simmande i samma antal som i L2A, dock var även filamentösa bakteriers och andra organismers anal påtagligt (Figur 32 Figur 33 Figur 34 och Figur 35). 3.2.3. Agarodling Organismerna studerades även in vitro i petriskålar med nutrient agar medium. Övergripande kunde det noteras att det förekom god tillväxt på näringsagar. Mindre god tillväxt noterades på L11lakvattenagar. Dock verkar olika delar av KBR:en organismer ha olika preferenser för de olika matriserna. Bilder går att se i Appendix (IV Bilder på agar-plattor). 3.2.3.1. Odling av L2A och L2Bs lakvatten Tillväxt av L2A och L2B-vatten har skett på både L11agar och näringsagar, dock verkar de olika mediumen ha olika slags kolonier. Odling gjordes även anaerobt och aerobt och i båda fallen skedde tillväxt och av olika sorters organismer. Ytterligare utstrykning av några kolonier gjordes från prov som ströks ut på L11-agar, dessa utstrykningar studerades i mikroskop. Ingen dessa observerade organismer påvisade i det skedet någon filamentös tillväxt eller hade spröt/flageller, de var stavformade samt sfäriska. Ingen ytterligare analys gjordes av dessa kolonier. Koloniantalet ökade ju senare provet var taget och den mest vanligen förekommande kolonin var en gulaktig, lätt mjölkig rund välvd och medelstor koloni, den var vanligast på närings-agar. Vid några tillfällen noterades rosa och lila kolonier som skulle kunna tillhöra fototropiska sulfatreducerande bakterier (Frigaard and Dahl, 2008) baserat på färgen. Vid isolering av kolonier från agarplattor syntes en mer filamentös form på kolonierna som kan indikera filamentösa bakterier (Loosdrecht, Martins and Ekama, 2008). Som ses i Figur 36 verkade beståndet gå från mer diverse till mer specifik. 52

Figur 36 Odlingar på näringsagar med L2A vatten från olika datum. Från vänster: 1. 29/5 utan spädning och ovan en isolering från den plattan. 2. 29/5 med 1/10 spädning. 3. 25/4 1/100 spädning. 4. 13/6 1/100 spädning. Figur 37 Odling på L11-agar med L2Aprov. Från vänster: 1. 23/5 1/100 spädning. 2. 13/6 1/100 spädning. 3. 25/4 1/100 spädning. Figur 38 L2B prov på näringsagar med 1/10 spädning och ingen spädning 53

3.2.3.2. Odling på inloppslakvatten (L11) Något hade vuxit mycket i L11vattnet som förvarats i kyl och det visade sig röra sig om filamentösa bakterier. Bäst tillväxt verkade kolonierna få när de odlats på näringsagar och först fått stå i rumstemperatur för att sedan placeras i kyl. De utstrykningar av L11vatten på L11agar i rumstemperatur hade inte gett någon tillväxt alls. Figur 39 Utstrykning från L11 prov på ny närings-agar 4. Diskussion I dagsläget hjälper KBR-anläggningen att avlägsna ammonium och har en fungerande nitrifikation större delen av året. Dock är denitrifikationssteget inte effektivt och frågan är om det bara beror på fosfatfosforbegränsning eller om andra faktorer spelar in. Den icke fullständiga reningen kan ha många andra orsaker än enbart en eventuell fosforbegränsning. Uppstartstiden för KBR-anläggningen har varit mellan 1-5 månader, likt andra anläggningar. Den kortaste uppstartstiden för nitrifikationen skedde under 2017 när KBRanläggningen inte belastades för mycket med lakvatten och var uppvärmd hela vintern (Figur 10). Metallhalterna varierade inte så mycket mellan dammarna (Figur 16 och Figur 17) samt verkar inte skilja sig stort från generella lakvatten (Tabell 2). Eftersom nitrifikationen har fungerat är det mindre troligt att det skulle vara de halterna som hindrar en effektiv denitrifikation, speciellt eftersom nitrifikation anses vara mer känslig och fungerar väl. Metallhalterna skulle dock kunna bidra till en längre lagfas för bakterierna. ph varierar inte särskilt kraftigt i KBR-anläggningen och hamnar sällan utanför det intervall som är gynnsamma för bakterierna enligt litteratur, därför utesluts ph som en anledning till ofullständig rening. Teoretiskt riskerar koncentrationen av ammoniak och salpetersyrlighet (HNO2) att göra processen mindre effektiv, dock varierar inte temperatur och ph så mycket i KBR-anläggningen att halterna skulle kunna chockhöjas, och med en så pass långsam process bör organismerna kunna anpassa sig. Nitrithalten är tidvis rätt hög i L2B vilket skulle kunna medföra inhibition av denitrifikationen dock är det även i detta fall troligt att bakterierna kan anpassa sig samt att om halten påverkar är det svårt att göra något åt det. Temperaturen har en stor effekt på reningen i KBR-anläggningen vilket kan ses i data från åren, speciellt 2015 då fosfatfosfor inte förekom i underskott, då verkar temperaturen var den största 54

begränsande faktorn för denitrifikationen (Figur 21). Nitrifikationen har fungerat ned till 10 C men när KBR-anläggningen varit ur drift, har inte nitrifikationen kommit igång förrän runt 16-18 C. Denitrifikationen verkar inhiberas vid temperaturer under 16 C, dock verkar den återhämta sig direkt när temperaturen ökas igen. KBR-anläggningen hade en mängd olika organismer, och en stor andel filamentösa bakterier som verkade ta över en hel del i dammarna. Dessa bakterier är inte alltid nyttiga för processen även om ett samspel mellan organismer kan vara gynnsamt så är dessa nödvändigtvis inte effektiva denitrifierare. Vid vissa förhållanden kan dessa samt andra heterotrofa bakterier selekteras, t.ex. om syrehalten blir för hög och kolkällan överdoseras samtidigt som temperaturen är låg. Även låga halter av fosfatfosfor verkar gynna vissa av dessa filamentösa bakterier. Även i L2A kan en stor grad heterotrofa bakterier förekomma på grund av att det låga inflödet (Figur 5) gör att ammoniumhalten, som är näringsämnet som är till nitrifierande bakteriers fördel, inte är så stor. Det mikrobiella samhället verkade ställa in sig under projektets gång och diversiteten smalnar lite i samband med att mer och mer lakvatten under rätt förhållanden pumpades in i KBRanläggningen, vilket skulle kunna betyda att mer eftertraktade bakterier selekteras långsamt. Detta talar för att även det mikrobiella samhället var i uppstartsfasen. Resultatet från FISH-analysen gav inga definitiva svar på om det förekom denitrifierande bakterier. Det allmänna organismbeståndet var visserligen lågt under den här perioden men reduktion av kväve bör ha noterats i större grad om denitrifierande bakterier hade varit närvarande i stor utsträckning. Det går därför att anta att denitrifierande bakterier, som är långsamväxande, till stor del konkurrerades ut av andra arter i början. Det förekom skumning på dammarna under hela projektperioden, den kan antingen bero på filamentösa bakteriers närvaro eller på brist av fosfor som gör att bakterier lagrar sackarider i slammet. Inga filamentösa bakterier noterades vid analys av skummet under mikroskop (Figur 30) och därför skulle skumningen kunna bero på avsaknad av fosfor. Skumningen ökade dessutom när vattnet var varmare vilket är det tillfälle då konsumtion kan gå upp och följdaktningsvis blir fosforhalten minskad. Det kan även röra sig om en samverkan av bakteriell exkretion samt förekoms av filamentösa bakterier. Skumningen har antagligen inte i sig en negativ effekt på reningen och utgör inte ett så stort problem i en utomhusanläggning som detta är. Dock kan det vara ett symtom på att stor del ineffektiva organismer frodas, alternativt att fosfatbrist förekommer. Resultaten från FISH-analysen visade lite fluorescens, men troligtvis rör det sig om kristaller eller missfärgningar av större organismer. Det är inte uteslutet att det existerar både PAOs och denitrifierande bakterier, det är mycket möjligt att analysen i sig inte fungerade. Enligt en studie påverkar mängden partiklar i ett prov mycket hur bra ett resultat från FISH-analys blir, detta oberoende av mängden bakterier i provet. Enligt studien beror detta antagligen på att det blir svårt att skilja mellan partiklar och bakterier. Mer snabbväxande bakterier får en tydligare flourescens vilket också påverkar hur bra det går att läsa av en FISH-analys (Bouvier and Del Giorgio, 2003). Alla fixerade prover från L2A och L2B led av stor andel partiklar relativt bakterier och många av de eftersökta bakterierna i KBR-anläggningen är långsamväxande och deras signaler kan därför vara svaga och svåra att se bland partiklar och slam. Temperaturen gick ned under hybridiseringen i ett av försöken, detta kan ha haft en inverkan på resultatet men samtidigt visar en jämförelse 55

mellan flera studiers resultat från FISH analys att variation i val av hybridiseringstemperatur inte har haft en signifikant påverkan på resultaten (Bouvier and Del Giorgio, 2003). Det är oklart om bärarmaterialet har haft någon inverkan på reningen i L2B och det går inte att utläsa från dataanalysen även om bärare kan ha en god effekt på rening enligt litteratur. Vid inspektion av bärarna hade de ytterst lite biofilm. Att ha i åtanke är dock att projektperioden låg då det inte var stor aktivitet i dammen i allmänhet och säckarna med bärare placerades kort inpå vintern. I KBR-anläggningen förhindras antagligen biofilmbildning av att de inte nyttjas fullt ut och förvaras i säckar längs kanterna. Den slamansamling som bildas på säckarna gör antagligen penetration av näringsämnen svårt och kan vara en bidragande faktor till varför biofilmen var mycket outvecklad så pass länge. Kolkällan tillsätts i L2B och halten i inflödet till L2A bör inte vara begränsande. I L2A är fosfatfosforhalten även den heller sällan begränsande eftersom inloppshalten i dammen ligger runt 1 mg/l och så fort nitrifikationen eventuellt skulle avstanna ökar koncentrationen relativt snabbt igen till nivåer som verkar tillräckligt för en fullständig nitrifikation. Eftersom temperaturen var tillräckligt hög under slutet av projektperioden men denitrifikationen fortfarande inte var fullständig antas fosfatfosforhalten vara största begränsande faktorn. Detta syntes extra tydligt under 2017 då ingen fosforsyra tillsattes och fosfatfosforhalten antagligen låg runt 0 mg/l (dock bara inrapporterat som <0,4 mg/l) stora delar av året. Dock verkar inte mycket fosfatfosfor krävas för att processen ska komma igång. Den 13/6 började kvävet reduceras, inte långt efter det var nitrifikationen inte fullständig vilket resulterar i att mer fosfat blev tillgängligt för denitrifikationen (Figur 12). Att nitrifikationen plötsligt inte var fullständig berodde antagligen på att efter blixtnedslaget slog ut styrningen av syretillförseln samt flödeskontrollen. Men med mindre nitrifikation ökade tillgängligt fosfor för denitrifikationen. Det går att avläsa från Figur 40 att denitrifikationen kom igång ordentligt när halten närmade sig 0,1 mg/l. Fosfatfosfor har tagits upp av organismerna i L2B, men under alla år återkommer fosfatfosfor i sista steget, egentligen redan i näst sista steget, i L2C. Och halterna i L2A, L2C och L2D var näst intill identiska. Vad detta berodde på skulle kunna haft flera förklaringar så som utfällning, mätfel, lysering av celler, nedbrytning av biomassa eller cellers exkretion av fosfor. Att utfällning av fosfor skulle varit den största anledningen till den varierande tillgängligheten var mindre troligt med tanke på att detta bara verkade drabba det biotillgängliga fosforet. Då det tidigare har använts en fosfortillsats för att få igång processen så var det intressant att kolla om det kunde finnas PAOs i någon av processtegen. Dock kunde inte närvaro av PAOs fastställas från FISH-analyser. Om det hade förekommit PAOs i systemet skulle fosfatfosfor tagits upp i de syrerika delarna och frigjorts i de syrefattiga delarna, vilket dock inte verkar vara fallet i KBR-anläggningen där upptaget sker i L2B och återkommer i den luftade dammen L2C. Ingen del av KBR-anläggningen var riktigt anaerob, det handlar snarare om anoxiska delar, dels för att det fortfarande existerade löst syrgas men även nitrater i vattnet. Enligt litteratur selekteras inte PAOs om nitratkoncentrationen är hög och vid en låg nitrathalt exkreteras fosfatfosfor. Detta talade även det emot att PAOs eventuellt skulle vara hela anledningen till att fosfatfosforhalten återkom i L2C. Trenden i antalet bakterier i dammarna (Figur 32-Figur 35) visar att det var en mindre mängd fritt simmande bakterier i L2C 56

än i L2B. Koncentrationen av näringsämnen var även mycket lägre i L2C och därför kan nettot av nyproducerade bakterier ha varit lägre an den andel döda bakterier som bildats. Mellan L2B och L2C minskade även filamentösa bakterier. Dessa ökade tydligt från L2A till L2B vilket betydde att de stod för en stor andel av upptaget av näringsämnen så som fosfatfosfor i L2B. Kombinationen av minskningen i fritt simmande bakterier samt filamentösa bakterier skulle kunnat stå för den ökande fosfatfosforhalten i L2C. 4.1. Förbättringsförslag För att förlänga reningssäsongen bör KBR-anläggningen värmas måttligt under vintern och driftstopp bör undvikas, dock kan inflödet stängas eller minskas när det är som kallast. Så fort det är möjligt att höja temperaturen bör temperaturen snabbt tas upp till runt 14-16 C för att kickstarta KBR-anläggningen. För att selektera bra denitrifierande bakterier samt spara på resurser bör inte kolkälla doseras innan temperaturen gått upp över minst 10 C och en tillräckligt stor mängd nitrat är tillgänglig i L2B. Recirkulering av vatten inom KBR-anläggningen är lämpligt, både under tider då inget vatten pumps in och ut KBR-anläggningen och under resten av året för att återbruka de näringsämnen som uppkommit. Bärare kan vara en bra lösning men då måste antalet ökas samt en bättre exponering för färskt lakvatten erhållas, vilket kan vara krångligt i praktiken i ett så öppet system som KBR-anläggningen är. Om en effektiv kväveavskiljning ska garanteras varje år finns det tekniker som kan appliceras på liknande system. Bioagumentation av nitrifierande bakterier kan tillsättas, odlade i en separat tank, för att undvika utspolningseffekt av nitrifierande bakterier. Även att använda grovkorningt aktiverat slam som fått acklimatisera vid kallare temperaturer kan även det hjälpa processen. Det går även att utöka KBR-anläggningen genom att bygga om sedimentationssteget och införa en membranbioreaktor (MBR), dvs. använda ultra-, lr mikrofiltration för att separera bort slam och därför förhindra att mikroorganismer sköljs ut. När tekniker som dessa använts har hela processen fungerat effektivt ned till 8-14C enligt (Okabe et al., 2011). Dock medför det kalla klimatet under vinterhalvåret att även lakvattenbildningen blir liten och därför kan behovet av att köra KBR-anläggningen, och ha en fullständigt fungerande nitrifikation och denitrifikation, under vinterhalvåret vara mindre aktuellt. KBR-anläggningen är inte utformad för att kunna avskilja fosfor biologiskt men för att få bukt med de höga halterna av fosfatfosfor i slutsteget kan vattnet låtas recirkulera mellan dammarna. På så vis återanvänds fosformängden i systemet. Ett klassiskt vis att ha en biologisk reningsanläggning kan vara att ha fördenitrifikation, dvs. leda in vatten i det anoxiska reningssteget först och sedan recirkulera vattnet. I det fallet kan även detta minska behovet av tillsats av kolkälla eftersom en del kommer med inloppsvattnet. Om inte fosfatfosforhalten kan minskas tillräckligt innan vattnet når recipienten kan kemisk fosforavskiljning brukas, detta kräver installation samt utbyggnad av ett till reningssteg och behöver utvärderas vidare. 57

5. Slutsats En tillsats av fosfat i L2B är nödvändigt, även om andra faktorer kan optimeras i KBRanläggningen för att effektivisera reningen, men mängden tillsatt fosfat behöver nödvändigtvis inte vara stor. Problemet med den ökade fosforhalten i slutsteget kvarstår dock och verkar vara bestående så länge inte större driftändringar genomförs. Den återkommande halten fosfat i slutreningsstegen beror troligast på att döda celler och nedbrytning av bildad biomassa blir större än dess uppbyggnad men det går inte att utesluta om det beror på PAOs eller utfällning eftersom FISH-analysen inte gav något tillfredställande svar. Temperaturen verkar även den ha en stor inverkan på reningen och redan en temperatur på runt 16 C kan hämma processerna. Observationen av protozoer visade att processen låg i uppstart mycket länge och organismantalet var mycket lågt under hela projektperioden. Uppstartstiden blir lång om KBR-anläggningen inte varit i drift under vintern, därför lönar det sig att ha uppvärmning även på vintern trots att lite rening sker då. 6. Begränsningar med projektet & framtida rekommendationer Den största begränsningen i detta projekt var tidsperioden som projektet utfördes på. Eftersom det var vinter- och vårmånader hade inte reningen och mikrofloran kommit igång ordentligt i KBRanläggningen. Även uppehållstiden i KBR-anläggningen var mycket lång och flödena in låga, detta gjorde det mycket svårt att göra en relevant jämförelse av prover tagna samma dag i olika dammar. I ett så långsamt system som KBR-anläggningen, där små kortvariga driftändringar skett ofta, blev det även svårt att utvärdera effekter samt tolka analysdata. Bärarmaterialets utformning gjorde en utvärdering av biofilmen blev svår då porerna var så små att varken sonikation eller skrapning var ett alternativ eftersom det skulle skada biofilmen. Inte heller färgning med hjälp av crystal violet och löst crystal violet med etanol var ett alternativ. Dessutom led även biofilmen av att projektet låg så tidigt på våren och ingen synlig biofilm hade formats. FISH-analysen behöver också mer optimering för det befintliga lakvattnet och utföras vid en period när fler organismer förekommer i vattnet. För framtida projekt rekommenderas det att projektperioden läggs under sommarmånaderna och tidig höst, även att få driftändringar görs spontant och att de dokumenteras väl. Förslag på vidare utredningar om en undersökning av existerande organismer är eftertraktad är att göra ett mer ingående FISH-analysförsök med grundligare optimering. Andra undersökningar som rekommenderas är att göra en mätning av den faktiska mängden VSS samt fraktionen fosfor i slammet för att avgöra en lämplig fosforsyratillsats. Även bärare i L2B och i L2A kan utvärderas efter att antalet ökats. En närmare underökning av att eventuella följder av att leda in lakvatten till denitrifikationssteget först kan vara intressant ur en resurssynpunkt. 58

Referenser Ahn, Y. H. & Kim, H. C., 2004. Nutrient removal and microbial granulation in an anaerobic process treating inorganic and organic nitrogenous wastewater. Water Science and Technology, Volym 50, pp. 207-215. Amann, R. et al. (1996) rrna-targeted Oligonucleotide Probes for the Identification of Genuine and Former Pseudomonads, Systematic and Applied Microbiology. Gustav Fischer Verlag Stuttgart Jena New York, 19(4), pp. 501 509. doi: 10.1016/S0723-2020(96)80023-3. Amann, R. I. (1995) In situ identification of micro-organisms by whole cell hybridization with rrna-targeted nucleic acid probes, Molecular Microbial Ecology Manual, 4(iv), pp. 331 345. doi: 10.1007/978-94-011-0351-0_23. Andersson, S. and Dalhammar, G. (2007) Bioaugmentation for enhanced denitrification in a labscale treatment system, Proceedings of the Second IASTED International Conference on Advanced Technology in the Environmental Field, ATEF 2006. Anthonisen, A. et al. (1976) Inhibition of Nitrification by Ammonia and Nitrous Acid, Journal of the Water Pollution Control Federation, 48(5), pp. 835 852. doi: 10.1017/CBO9781107415324.004. Antoniou, P. et al. (1990) Effect of temperature and ph on the effective maximum specific growth rate of nitrifying bacteria, Water Research, 24(1), pp. 97 101. doi: 10.1016/0043-1354(90)90070-M. Barnard, J. L. (1982) The influence of nitrogen on phosphorus removal in activated sludge plants, Water Science and Technology, 14, pp. 31 45. Boltz, J. P. et al. (2012) Method to identify potential phosphorus rate-limiting conditions in postdenitrification biofilm reactors within systems designed for simultaneous low-level effluent nitrogen and phosphorus concentrations, Water Research. Elsevier Ltd, 46(19), pp. 6228 6238. doi: 10.1016/j.watres.2012.08.020. Bouvier, T. and Del Giorgio, P. A. (2003) Factors influencing the detection of bacterial cells using fluorescence in situ hybridization (FISH): A quantitative review of published reports, FEMS Microbiology Ecology, 44(1), pp. 3 15. doi: 10.1016/S0168-6496(02)00461-0. Cerne, O. et al. (2007) Utvärdering av behandlingsmetoder för lakvatten från deponier, IVL Svenska miljöinstitutet, (November). Available at: https://naturvardsverket.se/upload/stod-imiljoarbetet/vagledning/avfall/deponering/deponi-ivl-utvardering-lakvatten.pdf. Characklis, W. G. (1981) Bioengineering report: Fouling biofilm development: A process analysis, Biotechnology and Bioengineering, 23(9), pp. 1923 1960. doi: 10.1002/bit.260230902. Chen, C. Y. and Chen, S. D. (2000) Biofilm characteristics in biological denitrification biofilm reactors, Water Science and Technology, 41(4 5), pp. 147 154. Christensen, M. H. and Harremoës, P. (1977) Biological Denitrification of Sewage: a Literature Review, Water Science & Technology, 8, pp. 509 555. doi: 10.1016/B978-1-4832-1344- 59

6.50039-3. Cowle, M. W. et al. (2014) Biofilm development in water distribution and drainage systems: dynamics and implications for hydraulic efficiency, Environmental Technology Reviews, 3(1), pp. 31 47. doi: 10.1080/09593330.2014.923517. Crocetti, G. R. et al. (2000) Identification of polyphosphate-accumulating organisms and design of 16SrRNA-directed probes for their detection and quantitation, Applied and Environmental Microbiology, 66(3), pp. 1175 1182. doi: 10.1128/AEM.66.3.1175-1182.2000.Updated. Eikelboom, D. H. (2000) Process control of activated sludge plants by microscopic investigation, p. 156. Available at: http://books.google.com/books?id=we8c7svysbmc. Frigaard, N. U. and Dahl, C. (2008) Sulfur Metabolism in Phototrophic Sulfur Bacteria, in Advances in Microbial Physiology. Elsevier Masson SAS, pp. 103 200. doi: 10.1016/S0065-2911(08)00002-7. Gerardi, M. H. (2010) Troubleshooting Nitrification, in Troubleshooting the Sequencing Batch Reactor. John Wiley & Sons, Inc, pp. 51 59. Gerardi, M. H. (2016) Operator s Guide to Biological Nutrient Removal (BNR) in the Activated Sludge Process. Chemical Publishing Company. Görfelt, K. (2008) Optimering av lakvattenrening i pilotskala på Spillepengs avfallsanläggning. Halling-Sorensen, B.; Jorgensen, S. E. (ed.) (1993) 5. Attached Growth Reactors, in Studies in Environmental Science, pp. 153 234. doi: http://dx.doi.org/10.1016/s0166-1116(08)70527-2. Han, Y. et al. (2014) Successful startup of a full-scale acrylonitrile wastewater biological treatment plant (ACN-WWTP) by eliminating the inhibitory effects of toxic compounds on nitrification, Water Science and Technology, 69(3), p. 553 LP-559. Available at: http://wst.iwaponline.com/content/69/3/553.abstract. Hartmann, S., Skrobankova, H. and Drozdova, J. (2013) Inhibition of activated sludge respiration by heavy metals, pp. 231 235. Huang, L. N. et al. (2004) Phylogenetic diversity of bacteria in the leachate of a full-scale recirculating landfill, FEMS Microbiology Ecology, 50(3), pp. 175 183. doi: 10.1016/j.femsec.2004.06.008. Ilies, P. and Mavinic, D. S. (2001) The effect of decreased ambient temperature on the biological nitrification and denitrification of a high ammonia landfill leachate, Water Research, 35(8), pp. 2065 2072. doi: 10.1016/S0043-1354(00)00477-2. Islam, S. ul (ed.) (2017) Advanced Materials for Wastewater Treatment. Hoboken: John Wiley & Sons, Inc and Scrivener Publishing LLC. Jubany, I. et al. (2008) Start-up of a nitrification system with automatic control to treat highly concentrated ammonium wastewater: Experimental results and modeling, Chemical Engineering Journal, 144(3), pp. 407 419. doi: 10.1016/j.cej.2008.02.010. Karlsson, L. (2014) Kontinuerlig biologisk rening. 60

Kim, D. J., Lee, D. I. and Keller, J. (2006) Effect of temperature and free ammonia on nitrification and nitrite accumulation in landfill leachate and analysis of its nitrifying bacterial community by FISH, Bioresource Technology, 97(3), pp. 459 468. doi: 10.1016/j.biortech.2005.03.032. Knowles, R. (1982) Denitrification, Microbiological Reviews, 46(1), pp. 43 70. doi: 10.1128/CMR.5.4.356.Updated. Loosdrecht, M. C. M. Van, Martins, A. M. and Ekama, G. A. (2008) Bulking Sludge, in Biological Wastewater Treatment: Principles, Modelling and Design. London: IWA Publishing. Meinhold, J., Arnold, E. and Isaacs, S. (1999) Effect of nitrite on anoxic phosphate uptake in biological phosphorus removal activated sludge, Water Research, 33(8), pp. 1871 1883. doi: 10.1016/S0043-1354(98)00411-4. Miljörapport 2016 Löt avfallsanläggning Lakvattenbilaga (2017). Morgenroth, E. and Wilderer, P. A. (1998) Modeling of enhanced biological phosphorus removal in a sequencing batch biofilm reactor, Water Science and Technology. International Association on Water Quality, 37(4 5), pp. 583 587. doi: 10.1016/S0273-1223(98)00169-3. Moter, A. and Göbel, U. B. (2000) Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms, Journal of Microbiological Methods, 41(2), pp. 85 112. doi: 10.1016/S0167-7012(00)00152-4. Mulkerrins, D., Dobson, A. D. W. and Colleran, E. (2004) Parameters affecting biological phosphate removal from wastewaters, Environment International, 30(2), pp. 249 259. doi: 10.1016/S0160-4120(03)00177-6. Obaja, D. et al. (2003) Nitrification, denitrification and biological phosphorus removal in piggery wastewater using a sequencing batch reactor, Bioresource Technology, 87(1), pp. 103 111. doi: Pii s0960-8524(02)00229-8\r10.1016/s0960-8524(02)00229-8. Ochoa-Herrera, V. et al. (2011) Toxicity of copper(ii) ions to microorganisms in biological wastewater treatment systems, Science of the Total Environment. Elsevier B.V., 412 413, pp. 380 385. doi: 10.1016/j.scitotenv.2011.09.072. Okabe, S. et al. (2011) Nitrification in wastewater treatment, Nitrification, pp. 405 418. doi: 10.1128/9781555817145. Prosser, J. I. (1990) Autotrophic Nitrification in Bacteria, Advances in Microbial Physiology. doi: 10.1016/S0065-2911(08)60112-5. Sadler, W. R. and Trudinger, P. A. (1967) The inhibition of microorganisms by heavy metals, Mineralium Deposita, 2(3), pp. 158 168. doi: 10.1007/BF00201912. Sagberg, P.; Ryrfors, P.; Berg, K. G. (2006) 10 years of operation of an integrated nutrient removal treatment plant: ups and downs. Background and water treatment, Water Science & Technology, 53(12), pp. 83 90. Satoh, H.; Mino, T.; Matsuo, T. (1994) Deterioration of enhanced biological phosphorus removal by the domination of microorganisms without polyphosphate accumulation, Water Science & Technology, 30(6), pp. 203 211. 61

Spellman, F. R. (2008) Handbook of Water and Wastewater Treatment Plant Operation. Second. CRC press Taylor & francis group. (2015) Miljörapport 2015 Löt avfallsanläggning Lakvattenbilaga. Tchobanoglous, George; Burton, Franklin L.; Stensel, H. D. (2003) Wastewater Engineering Treatment and Reuse. 4th edn, Metcalf & Eddy, Inc. 4th edn. doi: 10.1016/0191-2615(91)90038- K. Vattenmyndigheten, H. (2013) Havs- och vattenmyndighetens föreskrifter om klassificering och miljökvalitetsnormer avseende ytvatten. Havs- och vattenmyndighetens författningssamling. Yusof, N. et al. (2011) Nitrification of high-strength ammonium landfill leachate with microbial community analysis using fluorescence in situ hybridization (FISH), Waste Management & Research, 29(6), pp. 602 611. doi: 10.1177/0734242X10397581. 62

Appendix I. Provtagningsschema Tabell 13 provtagningschema för projektet 2017 SCHEMA: PROVTAGNINGS & ANALYS 2017-03-13 2017-03-14 2017-03-15 2017-03-16 2017-03-17 2017-03-18 2017-03-19 p f Helg Helg 2017-03-20 2017-03-21 2017-03-22 2017-03-23 2017-03-24 2017-03-25 2017-03-26 pf Helg Helg 2017-03-27 2017-03-28 2017-03-29 2017-03-30 2017-03-31 2017-04-01 2017-04-02 pfm Helg Helg 2017-04-03 2017-04-04 2017-04-05 2017-04-06 2017-04-07 2017-04-08 2017-04-09 pfm Helg Helg 2017-04-10 2017-04-11 2017-04-12 2017-04-13 2017-04-14 2017-04-15 2017-04-16 pfm Helg Helg 2017-04-17 2017-04-18 2017-04-19 2017-04-20 2017-04-21 2017-04-22 2017-04-23 pfm Helg Helg 2017-04-24 2017-04-25 2017-04-26 2017-04-27 2017-04-28 2017-04-29 2017-04-30 pfm Helg Helg 2017-05-01 2017-05-02 2017-05-03 2017-05-04 2017-05-05 2017-05-06 2017-05-07 pfm Helg Helg 2017-05-08 2017-05-09 2017-05-10 2017-05-11 2017-05-12 2017-05-13 2017-05-14 pfm Helg Helg 2017-05-15 2017-05-16 2017-05-17 2017-05-18 2017-05-19 2017-05-20 2017-05-21 pfmk hm Helg Helg 2017-05-22 2017-05-23 2017-05-24 2017-05-25 2017-05-26 2017-05-27 2017-05-28 a pfmk Helg Helg 2017-05-29 2017-05-30 2017-05-31 2017-06-01 2017-06-02 2017-06-03 2017-06-04 mk m Helg Helg 2017-06-05 2017-06-06 2017-06-07 2017-06-08 2017-06-09 2017-06-10 2017-06-11 m Helg Helg 2017-06-12 2017-06-13 2017-06-14 2017-06-15 2017-06-16 2017-06-17 2017-06-18 mp p fk Helg Helg 2017-06-19 2017-06-20 2017-06-21 2017-06-22 2017-06-23 2017-06-24 2017-06-25 m Helg Helg 2017-06-26 2017-06-27 2017-06-28 2017-06-29 2017-06-30 2017-07-01 2017-07-02 mk m Helg Helg 2017-07-03 2017-07-04 2017-07-05 2017-07-06 2017-07-07 2017-07-08 2017-07-09 Helg Helg 2017-07-10 2017-07-11 2017-07-12 2017-07-13 2017-07-14 2017-07-15 2017-07-16 mh mh Helg Helg 2017-09-12 2017-09-13 2017-09-14 2017-09-15 2017-09-16 2017-09-17 hm Helg Helg p-provtagning, m-mikroskopiering, f-fixering, k-kultivering, h-hybridisering, a-agarplattortillverkning 63

II. Bärarmaterial i KBR-anläggningen Mutag BioChip är en liten cirkulär bärare med mycket små porer gjord i polyeten av det tyska företaget Multi Umwelttechnologie AG. Tabell 14 Bärarnas specifikationer SPECIFIKATIONER DIAMETER Ø TJOCKLEK AKTIV YTA 25 mm 1.1 mm >4,500 m²/m³ III. F.I.S.H. buffertinnehåll För F.I.S.H-utförandet tillreddes ett antal buffrar som presenteras nedan. Även alla stamlösningar tillreddes från grunden. Tabell 15 Buffertlösningars innehåll BUFFERTAR OCH LÖSNINGAR INNEHÅLL HYBRIDIZERINGSLÖSNING (4 SLIDES) 5M NaCl 1,8ml 10% SDS 10μl 1M Tris-Cl ph 7,4 Formamid 200μl 2,5ml MQ-vatten fylls på till 10ml TVÄTT BUFFERT (FÖR 3 SLIDES) 1M Tris-Cl ph 7,4 3,6ml 0,5M EDTA 1,8ml 5M NaCl 5,724ml 4% PARA FORMALDEHYD LÖSNING I PBS 10% SDS 180μl Adderat MQ-vatten upp till 180ml ETHANOL LÖSNINGAR 96%, 80% och 50% PBS, PHOSHATE BUFFER SALINE ph 7,2 10mM 64

IV. Väder under provtagningsdag Väder noterades i anteckningar vid varje provtagning. Tabell 16 Provtagningsdagarnas väder angett vid ca kl: 9 på Löt med övriga kommentarer. Temperatur: 8 C 2017-03-21 2017-03-28 2017-04-04 2017-04-11 Temperatur: 12 C. Soligt och 17 grader dagen innan. Temperatur: 5 C. Soligt väder. Temperatur: 6 C. Det var -2 på natten 2017-04-18 2017-04-25 2017-05-02 2017-05-09 Temperatur: 2 C. Temperatur: 1 C. Det har snöat på natten Temperatur: 12 C. Soligt men ca 2-5 grader på nätterna. Temperatur: 2 C. Dagarna innan var det upp till 17 grader, nu är det minusgrader på nätterna samt snö. L2C hade en matta av skum 2017-05-16 2017-05-23 2017-06-13 Temperatur: 11 C. Soligt och dagarna innan var det upp till 16 C. Temperatur: 11 C. Upp till 25 grader dagarna innan. Ingen nederbörd. Matta av skum på L2C. Temperatur: 16 C. regnat mycket de senaste dagarna. 65

V. Beskrivning av observationer i mikroskop Tabell 17 Beskrivning av mikroskopobservationer mars-april L2A L2B 2017-03-21 2017-03-28 2017-04-04 2017-04-11 7 dagar innan analys. L2A och L2B studerades i 10X medan resterande prover studerats med 40X. 1 st stor sfärisk protozoa med klorofyll. Några fritt simmande stavformade bakterier. 1 st liten rundoval protozoa med eventuell flagell. Protozoer med flageller. Några fritt simmande bakterier, 1 filamentös samt ett slamkluster. Protozoer med flageller. Många diplokockliknande bakterier med 4 eller fler strån. Annars runda kocker och någon enstaka stav (bacillus). Även skruvade stavar (spirillum). L2C 40X förstoring. Antagligen döda organismer. Små runda protozoa med flagell. Någon styv, rak filamentös bakterie. L2D Någon spiralformad bakteria, men mest Protozoa med flagell samt kocker och kocker, några i diploid form med strån. 1 st diplokock med flera strån. filamentös bakterie, styv, rak och smal. Våtmark 1 st stor protozoa med klorofyll. Kluster av klorofyllfyllda protozoa samt några kocker och tjocka styva och raka filamentösa bakterier. Även streptokockliknande filamentösa bakterier. Många protezoa, mest flagellater, mycket större sorter men även små. Någon hade klorofyll. Många bakterier, flerst ensamma men några förekom i diploida par. Filamentöa bakterier som är långa och styva, någon mer i form av staflykocker. Även bakterier i ett slamkluster noterades. Färre protozoer än i L2A men även här kan protozoer med cilia/ flagell ses. Flest med flageller. Stor mängd bakterier. Relativt många diplokocker med 4 st stån samt fler stavformade än förut. Korta, både styva och krokiga, filamentösa bakterier noterades.. Kluster med filamentösa bakterier i slamklumpar. Några protozoa med cilia/flagell och fler av sorten kocker än i L2B. Liknande sorters organismer som i de andra dammarna. Samma diploida kocker med strån/spröt kan ses här. Liknande sorters organismer som i de andra dammarna. Mer diversitet bland protoza, förutom de med cilia och flagell förekom även platta sorter. I övrigt liknar organismerna de som setts tidigare. Det förekom inga av de större protoza som noterats tidigare, bara relativt små sorter med flagell. Kocker, bacillus samt diplokocker med strån. Filamentösa bakterier med tydliga septum/cellväggar och både ej styva och styva, streptokockformationer. Även slamkluster med filamentösa bakterier påträffades. Inga protezoer. I övrigt liknande organismer som i L2B Liknande organismer som i L2B Några slamkluster men ej långa och mer styva o tjocka. L11 - - Många relativt små bakterier, oklart om det - rör sig om bakterier eller partiklar. Bärare - - - Ej noterbar biofilm med blotta ögat, möjligtvis i de små porerna. Samma slags organismer som i L2B men med större koncentration, speciellt av slamkluster och filamentösa bakterier. 66

Tabell 18 Beskrivning av mikroskopobservationer april - maj L2A L2B 2017-04-18 2017-04-25 2017-05-02 2017-05-09 Stor diversitet i sorters protozoa men flest av Många olika protozoer påträffades. Några Protezoerna utgjordes mest av de med flagell, Få protozoa, de som noterades hade flagell. de relativt små, även få med cilia påträffades, med synlig flagell (flest) men inga med synlig även någon med klorofyll påträffades. Det noterades någon par-formation med flest hade flagell. Liknande bakterier som cilia. Några förekom förankrade i varandra. Bakterierna förekom mest i kockimorfologi. spröt/strån bland bakterierna. Få filamentösa tidigare påträffats, nu även stavformade i par. De filamentösa bakterierna förekom i mycket Många filamentösa var tjocka och styva, bakterier noterades. Filamentösa bakterier förekom, många långa korta filament. några var även mindre styv och krokiga. smala med icke tydlig cellvägg. Många flockar påträffades utan tydligt slam Protozoerna utgjordes mest av en liten rund med flagell. Bakteriesorterna ser liknande ut som tidigare, många relativt små. De filamentösa bakterierna är kortare än i L2A och verkar vara många olika sorters. Liknande som i L2A. Bland bakterierna var det många som hade spröt. L2C Hade liknande organismer som i L2A. Protozoerna utgjordes mest av de små med flagell. L2D Protozoerna utgjordes mest av de små med flagell. Det förekom mer kocker än stavformade bakterier, några med spröt/flagell. Stor diversitet i olika filamentösa bakterier med olika längder. Mycket hög aktivitet med liknande organismer som i L2B runt. Få protozoa på träffades, en relativt liten rund med flagell och en relativt stor sfärisk med cilia och klorofyll. Bland bakterierna finns både kocker och stavformade, de med spröt har ökat sedan sist. De filamentösa bakterierna är många och korta och inte styva utan krokiga. En minskning av de bakterier i parformation med spröt. De filamentösa bakterierna förekommer i korta filament, både raka och krokiga. Liknande vatten som i L2C Våtmark - - Tomt Tomt L2E - Stor diversitet på protozoerna, många sorter som inte noterats innan, flest har flagell och vissa verkar ha klorofyll. Även nematoder påträffades. L11 Provet ser exakt lika dant ut som provet från den 4/4. Bärare - Ingen tydlig biofilm kan ses med blotta ögat. Mycket hög aktivitet med liknande organismer som i L2B Antalet filamentösa bakterier är oerhört många och svåra att räkna. Många protozoa av en och samma sort, en som är rätt liten och har 1-2 flageller och är lite oval. Även 3 st stora protozoer med både cilia och flagell. Bland bakterierna syntes ingen av de små bakterier som ofta förekom i par och hade spröt. Antalet protozoer med flagell har ökat och är liknade de som fanns i L2C. De filamentösa bakterierna likande de i L2B - Nya sorters protozoa, många med klorofyll, noterades. Några bakterier noterades men få. - - Samma som innan men nu förekom någon enstaka stav samt ett par flockar. - - 67

Tabell 19 Beskrivning av mikroskopobservationer maj-juni L2A L2B 2017-05-16 2017-05-23 2017-06-14 Analyserades en dag senare. Analyserades 5 dagar senare. Protozoerna utgörs av de små med flagell och Enbart en protozoa noterades, en hade flagell. Det förekom få fritt simmande bakterier men verkar vara av samma sort. De filamentösa Verkar förekomma mer homogena bakterier de som påträffades hade stor diversitet. Några bakterierna utgörs enbart av de styva och när det kommer till morfologi, enbart en få styva filamentösa bakterier påträffades. En tunna sorterna. diploid bakterie med flagell sågs. Var bara få mycket stor flock bakterier påträffades med filamentösa bakterier och dessa var styva. upp mot vad det verkade som 40st bakterier Liknande organismer som innan. Dock påträffas inga protozoer, bara en död. Noterades bara protozoer av vad som verkar vara två slag, båda med flagell. Många olika sorters bakterier noterades som i tidigare prov. Även de filamentösa bakterierna utgjordes av vad som verkar vara olika sorter. Flockar som förekom var homogena och utgjordes av kocker. L2C Likande organismer som innan De flesta protozoer hade flagell. Många diploida bakterier med spröt/ flagell, även andra stavar och runda. Filamentösa bakterier förekom både som styva och krokiga. Det förekom flockar som både var tätare samt några som hade en lite lösare formation. L2D Likande organismer som innan Liknande vatten som i L2C men med fler slamklumpar och färre protozoer. Våtmark - - - L2E - - - L11 Liknande organismer som innan men inga flockar. Små partiklar som rör sig samt någon enstaka stav samt några små som rör sig i olika riktningar. - - av samma morfologi. Enbart två protozoer noterades där alla hade flagell, var små och runda. Stor diversitet i morfologi, samma sorter som tidigare prov. Mycket dött i provet enbart relativt små kocker i provet noterades. En protozoa förekom i hela provet som både hade flagell och cilia. Enbart små runda bakterier. Enbart en bastantare och styv sorts filamentös bakterie noterades. Däremot noterades ett antal streptokockliknande bakterier i kedjor. 68

03, jan 06, feb 18, apr 04, maj 18, maj 30, maj 11, jun 23, jun 06, jul 16, jul 28, jul 10, aug 22, aug 03, sep 14, sep 28, sep 08, okt 20, okt 03, nov 17, nov 01, dec 14, dec P [mg/l] PO4-P [mg/l] Stockholm 2018 VI. Kompletterande diagram med analysdata Nedan följer diagram med analysdata över totalfosfor-, och fosfoatfosforhalter i L2B för varje år. Totalfosfor och fosfatfosfor L2B 2015-2017 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Tot-P 2015 Tot-P 2016 Tot-P 2017 PO4-P 2015 PO4-P 2016 PO4-P 2017 Figur 40 Fosfatfosfor och totalfosfor i L2B 2015-2017 VII. Bilder Nedan följer en samling av bilder, både från undersökningar från lab och bilder på anläggning och instrument. I. Löt Avfallsanläggning Figur 41 L2C med ett tunt lager skum 69

II. Instrument Figur 42 Konduktivitetsmätare och ph-mätare med temperaturmätare som använts under provtagning i fält. III. Bilder från mikroskop Nedan följer bilder från mikroskopstudier. De flesta bilderna är tagna vid 40x förstoring. I. 11e april Figur 43 Protozoer och slamkluster och filmanetösa bakterier från KBR-anläggningen 70

II. 18e april Figur 44 Slamkluster i L2B III. 25e april Figur 45 L2E 71

Figur 46 L2A och L2B Figur 47 L2A och L2B 72

IV. 16e maj Figur 48 L2B Figur 49 L2D V. 23 maj 73

Figur 50 L2A 74

VI. 29e maj Figur 51 L2A och L2B VII. 14e juni 75

Figur 52 L2A 76

Figur 53 L2B Figur 54 L2D 77

Figur 55 L2D Figur 56 L2C VIII. 26e juni Figur 57 Protozoer och stora slamkluster 78

IX. 13e juli Figur 58 Fixerat L2Aprov IV. Bilder på agar-plattor De flesta bilderna är tagna mellan den 14-16/6. I. L11-prov odlat vid olika temperatur Figur 59 Prov från L11 satta samma tid men förvarade vid olika temperatur. Från vänster: 1. I kylskåp. 2. I värmeskåp (37 grader). 3. I rumstemperatur 79

II. L2A-prov på närings-agar Figur 60 L2Aprover på näringsagar III. L2A-prov på L11-agar Figur 61 L2A på L11-agar med ingen spädning. 80

Figur 62 (Vänster) 1/10 spädning L2A 13/6 L11-agar. (höger) L2A 1/100 spädning på L11agar IV. L2B-prov på närings-agar (anaerob odling) Figur 63 L2B prov anaerobt 81

Figur 64 L2Bprov på näringsagar ej anaerobt V. L2B-prov på L11-agar Figur 65 (Uppe höger och vänster samt nedre vänster) L2B på L11agar vid olika spädning (anaerobt). (Nedre höger) L2B prov på L11-agar med spädning 1/10 från den 13/6 82

VI. Skum Figur 66 Skumprov på L11agar samt näringsagar 83