Vitrification in sealed containers: Evaluation of a new technique (Rapid-i ) for cleavage stage embryos and blastocysts.

Examensarbete 15hp Vt. 2009 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Vitrification in sealed containers: Evaluation of a new technique (Rapid-i ) for cleavage stage embryos and blastocysts. Christine Lannsjö Handledare: Julius Hreinsson, Laboratoriechef Fatma Gülen Yaldir, Embryolog Reproduktionscentrum, Akademiska sjukhuset Uppsala

ABSTRACT Ovarian stimulation in assisted reproduction often leads to the production of a high number of oocytes. After fertilization of these oocytes, the resulting embryos can be cryopreserved for later use. Vitrification is a recently introduced method for cryostoring embryos, showing high survival rates for both cleavage stage embryos and blastocysts. Characteristic of vitrification are high concentrations of cryoprotectants and ultra fast freezing which makes the material glassily. A major concern with vitrification has been the direct contact of the cryo-solutions with liquid nitrogen. Therefore, sealed containers have been developed and one of these is the Rapid-i made by Vitrolife Sweden AB. We evaluated this new device using embryos not suitable for embryo transfer or cryopreservation for clinical purposes. Embryos at cleavage stages were first vitrified and then warmed. Outcome parameters were cryosurvival and development to the blastocyst stage. Blastocysts were randomised between the established VitroLOOP and the Rapid-i as carriers. Outcome parameters were cryosurvival and further development. Our results show that Rapid-i gives good survival rates in vitrification for cleavage stage embryos and blastocysts. Keywords: in-vitro fertilization, preservation, propanediol, human, blastocyst development. 2

INLEDNING Att vara drabbad av ofrivillig barnlöshet kan vara förenat med psykisk ohälsa och även medföra sociala konsekvenser. Idag kan man framgångsrikt behandla de flesta former av infertilitet med hjälp av de metoder som går under beteckningen assisterad befruktning, som t ex intrauterin insemination (IUI), in-vitro-fertilisering (IVF) och intra cytoplasmic sperm injection (ICSI). Hos kvinnan väljs varje månad i den naturliga menstruationscykeln normalt endast en follikel ut för utmognad och ägglossning, och därmed också bara en oocyt. Vid in vitro-fertilisering däremot vill man helst få ett utbyte på 7-12 mogna oocyter, vilket åstadkoms genom att patienten ges injektioner av follikelstimulerande hormon (FSH). Om dessa oocyter sedan fertiliseras samt om de vid delning och utveckling visar god kvalitet, kan man genom frysförvaring ta tillvara de embryon som inte återförs till kvinnans livmoder. Vid stimulering inför en IVF-behandling finns en viss risk för ovariellt överstimuleringssyndrom (OHSS) vilket kan göra det nödvändigt att avbryta behandlingen och frysförvara embryon för en senare behandling. Återföring av ett frysförvarat embryo kan göras i kvinnans normala menstruationscykel, vilket gör behandlingen mycket lättare då kvinnan slipper genomgå ny hormonstimulering. Andra fördelar med möjligheten till frysförvaring av embryon är att risken för flerbörd minskar - man lägger numera oftast tillbaka ett embryo per återföring - samt att embryon kan sparas under den tid som en patient genomgår en behandling som kan leda till fertilitetsförlust. Kryopreservering är en process där celler eller vävnad kyls ned till mycket låga temperaturer med bibehållen viabilitet [1]. Detta görs vanligtvis i flytande kväve, som har en temperatur på -196 C. Vid så låga temperaturer avstannar all biologisk aktivitet vilket gör att materialet kan förvaras för lång tid framöver [2]. Kryopreservering av embryon har som metod använts 3

sedan början av 1970-talet, och 1983 föddes det första barnet efter att ett frysförvarat embryo återförts till en kvinnas livmoder [3]. Det finns en viss risk att embryot inte överlever frysnings- och uppvärmningsproceduren. De vanligaste orsakerna till skador på embryot vid nedfrysning är: intracellulär iskristallbildning, cytotoxicitet hos kryoprotektanterna, volymförändringar på grund av osmotiska reaktioner och skador i zona pellucida. För att embryoöverlevnaden vid frysning ska vara optimal är det mycket viktigt att frysmetoderna utförs med stor noggrannhet. Inkuberingstider och den manuella hanteringen är kritiska moment, både vid frysning och vid uppvärmning av embryon. Frysförvaring består av flera steg: dehydrering, nedkylning, förvaring samt uppvärmning och rehydrering. För att skydda cellerna mot isbildning, som kan skada embryot under frysperioden, använder man sig av en kryoprotektant, exempelvis propandiol (PROH), etylen glykol (EG) eller dimetylsulfoxid (DMSO). Kännetecknande för kryoprotektanter är att de passerar passivt genom cellmembranet och ersätter vatten inne i cellerna. I de medier som används vid dehydreringen ingår förutom kryoprotektant även ämnen som inte kan passera cellmembranen. Exempel på sådana ämnen är sockermolekyler, vanligen sukros, proteiner och lipoproteiner samt olika polymerer. Dessa icke permeabla ämnen bidrar till dehydreringen genom att de höjer osmolariteten i lösningen utanför embryot. Det finns två etablerade metoder för nedfrysning av embryon: kontrollerad nedfrysning, som har använts sedan början på 1970-talet, samt vitrifiering, som är en på senare år introducerad metod. Vid kontrollerad nedfrysning sänks temperaturen långsamt, och isbildningen initieras på konstgjord väg genom punktnedkylning för att förhindra cellskador. Vitrifiering däremot är en metod där man kombinerar mycket höga koncentrationer av kryoprotektant med mycket 4

snabb nedkylning. Vid vitrifiering går temperaturen på mindre än 1sek från 37 C till -196 C. Fördelarna med vitrifiering är att embryoöverlevnaden är högre efter uppvärmning, både för tidiga embryon och blastocyster [4]. Vitrifiering har hittills haft nackdelen att nedfrysningen oftast sker i ett öppet system, det vill säga embryot nedfryses i direktkontakt med flytande kväve. Det innebär att det finns en viss risk för kontamination av viruspartiklar [5] därför håller nya metoder för vitrifiering i slutna system på att utarbetas. Vid vitrifiering är det viktigt att inkuberingstiderna är korrekta på grund av att metoden kräver höga koncentrationer av kryoprotektant. Risken är annars stor att kryoprotektanten får en cytotoxisk effekt på embryot. Vid vitrifiering bildas inga iskristaller, allt material blir glasartat, inte kristallint som vid kontrollerad nedfrysning. Detta beror dels på att den höga koncentrationen av kryoprotektant ökar viskositeten och sänker fryspunkten inne i cellen samt på den snabba nedfrysningen. Oavsett vilken metod man använder, är det viktigt att minimera riskerna för skador på embryot vid nedfrysningen, vilket görs genom att man använder optimal koncentration av kryoprotektanten samt optimal hastighet vid nedfrysning och uppvärmning [2]. Embryon kan kryopreserveras i olika utvecklingsstadier, som oocyter, tidiga embryon (2-8- cellsstadiet) och blastocyster (dag 5-6). Nedfrysta embryon förvaras i flytande kväve tills paret önskar dem för ny behandling. Enligt svensk lag får embryon frysförvaras i max 5 år. Paret kan därefter välja att ta embryot för återföring, kassera det eller donera det till embryonal- eller stamcellsforskning. Syftet med det här arbetet har varit att utvärdera en ny teknik, Rapid-i, för vitrifiering i slutet system (förseglade behållare) av embryon i delningsstadiet och blastocyster. Detta har gjorts genom analyser av överlevnad och vidareutveckling hos embryon i delningsstadiet efter vitrifiering och värmning, samt även på re-expansion inom 4tim efter värmning hos 5

blastocyster. Även användarvänligheten hos Rapid-i har studerats och jämförts med den för VitroLOOP. Studien är del i en större preklinisk utvärdering, där flera IVF-laboratorier deltar. Arbetet har utförts på Reproduktionscentrum, Akademiska sjukhuset, Uppsala, i samarbete med bioteknikföretaget Vitrolife, Sweden AB. MATERIAL OCH METOD Utvärdering av metoder på embryolaboratoriet är en viktig del av arbetet för att säkerställa kvalitet och säkerhet för patienten. Nya metoder prövas först med djurförsök, men dessa resultat är inte alltid direkt överförbara till människa. Därefter testas metoden på ägg, som inte kan användas för behandling av patienter. Denna studie innefattar enbart befruktade ägg i delningsstadiet samt blastocyster som inte kunde användas för patienter på grund av dålig morfologi. För studien fanns etiktillstånd. Rapid-i och VitroLOOP Rapid-i Rapid-i är en produkt avsedd att användas för att vitrifiera, förvara och bevara oocyter och/eller embryon i ett förslutet system vid kryopreservering. Rapid-i består av två delar, en 80mm PMMA-sticka (Rapid-i ) och ett 165mm PVC-strå som i botten är försett med en rostfri stålvikt. Efter det att strået förslutits med en svetsfog kan oocyten/embryot förvaras utan direktkontakt med flytande kväve (figur 1). 6

, Figur 1. Rapid-i, vitrifieringsbehållare samt placering av sticka i förvaringsstrå. Med tillstånd från Vitrolife. VitroLOOP VitroLOOP är även den en produkt avsedd att användas för att vitrifiera, förvara och bevara oocyter och/eller embryon vid kryopreservering. VitroLOOP består av en nylonögla, 0,5-0,7mm i diameter och en behållare i vilken öglan (loopen) skruvas fast. I behållaren finns ett antal hål genom vilka flytande kväve kan cirkulera. Detta gör att oocyten/embryot har direktkontakt med flytande kväve under vitrifiering och förvaring, (figur 2). Nylonögla 0,5-0,7mm Ø Figur 2. VitroLoop, behållare och ögla (loop). Med tillstånd från Vitrolife. 7

Embryon som ingick i studien I studien ingick 60 färska embryon och av dessa vitrifierades 37 stycken på dag 2 eller 3 efter insemination, medan 23 embryon vitrifierades som blastocyster på dag 6 eller 7 efter insemination. Dessutom undersöktes 15 embryon som frysförvarats i 5 år efter kontrollerad nedfrysning. Dessa tinades, vidareodlades 1 dygn och vitrifierades därefter. Vitrifieringen av blastocyster randomiserades mellan Rapid-i och VitroLOOP (figur 3). 75 embryon ingick i studien 23 blastocyster vitrifierades på dag 6 och 7 15 embryon tinades efter kontrollerad nedfrysning, och vidareodlades 1 dygn 37 färska embryon vitrifierades på dag 2 och 3 med Rapid-i 12 blastocyster vitrifierades med Rapid-i 11 blastocyster vitrifierades med VitroLOOP 8 embryon vitrifierades på dag 3 med Rapid-i 32 embryon återfanns efter värmning 9 blastocyster re-expanderade inom 4tim efter värmning 8 blastocyster re-expanderade inom 4tim efter värmning 7 embryon återfanns efter värmning 8 embryon utvecklades till blastocyststadiet efter odling till dag 6 9 blastocyster visade på fortsatt utveckling 24tim efter värmning 8 blastocyster visade på fortsatt utveckling 24tim efter värmning 1 embryo utvecklades till blastocyststadiet efter odling till dag 6 Figur 3. Flödesschema över fördelningen av embryon och blastocyster som ingick i studien. 8

Färska embryon. Bedömning av utvecklingsstatus hos embryon i delningsstadiet inför vitrifiering. I den del av studien som innefattade vitrifiering av embryon i delningsstadiet ingick 37 embryon. Inför vitrifieringen följdes utvecklingen av embryona morfologiskt från ovum pick up (OPU) och befruktningskontroll på dag 1 efter insemination till dagen för vitrifiering. De parametrar som studerades var antalet pronuklei (PN) 16-20tim efter insemination, antalet blastomerer samt graden av fragmentering hos embryot. Den morfologiska bedömningen gjordes under mikroskop i en LAF-bänk med en temperaturkontrollerad arbetsyta (37 C). Fram till dagen för vitrifiering vidareodlades embryona i odlingsskålar i inkubator (6 % CO 2, 37 C) i 20µl droppar av odlingsmedie täckta med olja. Tabell 1. Lösningar och inkuberingstider. MEDIE Lösningar och inkuberingstider RapidVit Cleave Vitri 1 Cleave Vitri 2 Cleave Vitri 3 Cleave Vitrolife 5-20min 2min 30sek RapidVit Blast Vitri 1 Blast Vitri 2 Blast Vitri 3 Blast Vitrolife 5-20min 2min 45sek RapidWarm Cleave Warm 1 Cleave Warm 2 Cleave Warm 3 Cleave Warm 4 Cleave Vitrolife 10-30sek 1min 2min 5min RapidWarm Blast Warm 1 Blast Warm 2 Blast Warm 3 blast Vitrolife 2min 3min 5-10min Thawing kit Solution 1 Solution 2 Solution 3 Solution 4 COOK 5min 5min 5min 10min Dehydrerings-, rehydrerings- och tiningslösningarnas innehåll. RapidVit Cleave och RapidVit Blast (Vitrolife) innehöll MOPS-buffrat medium, humant serum albumin (HSA) och som kryoprotektanter PROH, EG och sukros av stigande 9

koncentrationer. RapidVit Blast innehöll även Ficoll. RapidWarm Cleave och RapidWarm Blast (Vitrolife) innehöll MOPS-buffrat medium och HSA, kryoprotektanter var PROH, EG samt sukros av sjunkande koncentrationer. Thawing kit (COOK ) innehöll HEPES-buffrat medium, HSA och som kryoprotektant PROH och sukros av sjunkande koncentrationer. Dehydrering och vitrifiering av embryon i delningsstadiet med Rapid-i. Till en steril fyrbrunnsskål pipetterades 500µl av varje vitrifieringslösning. Lösningarna lämnades i 30min på en temperaturkontrollerad arbetsyta (37 C) i en LAF-bänk. Embryot inkuberades därefter i varje vitrifieringsslösning enligt varje lösnings tidsschema, (tabell 1). Under tiden som embryot inkuberades i Vitri 2 gjordes efter 1min och 30sek en 20µl droppe av Vitri 3 i en steril odlingsskål. Efter 2min flyttades embryot med flyttpipett till droppen med Vitri 3. Strået till Rapid-i placerades i vitrifieringssbehållaren med flytande kväve, fortfarande med stålpinnen placerad i strået. Embryot, som låg i droppen med Vitri 3, pipetterades upp i en flyttpipett med embryot nära mynningen på pipetten. Försiktigt, men snabbt, placerades embryot i hålet på Rapid-i stickan (figur 4). Figur 4. Placering av embryo i hålet på Rapid-i -stickan. Med tillstånd från Vitrolife. 10

Stålpinnen avlägsnades ur strået och Rapid-i stickan med embryot sänktes ner i strået. Tiden från det att embryot flyttades till droppen med Vitri 3 till dess att Rapid-i stickan placerades i strået i flytande kväve var 30sek. Strået förslöts därefter med en svetsfog (UltraSEAL 21). Förflyttning av embryot mellan de olika lösningarna gjordes försiktigt med hjälp av flyttpipett (Vitrolife) Ø 0,156-0,190mm, och allt arbete vid dehydreringen utfördes under mikroskop på en 37 C arbetsyta i en LAF-bänk Värmning och rehydrering av embryon i delningsstadiet. Inför värmning av embryon i delningsstadiet förbereddes en fyrbrunnsskål med värmningslösning RapidWarm Cleave. De olika värmningslösningarna pipetterades upp i respektive brunn och lämnades i 30min på en 37 C arbetsyta i en LAF-bänk. Vitrifieringssbehållaren fylldes med flytande kväve och visituben med Rapid-i strån flyttades från kanistern i förvaringstanken till vitrifieringsbehållaren. Stråna flyttades ett och ett - utan att de lämnade det flytande kvävet - från visituben till skårorna i vitrifieringsbehållarens lock. Rapid-i strået klipptes av så nära den övre delen av Rapid-i stickan som möjligt. Stickan lyftes sedan upp med en spetsig pincett bara så mycket att det gick att ta tag i den med fingertopparna. Därefter togs Rapid-i stickan snabbt men försiktigt ut ur strået och den ände på stickan som innehöll det vitrifierade embryot doppades i den första brunnen med Warm 1 Cleave. Efter 5-10sek avlägsnades stickan från lösningen och det kontrollerades under mikroskop att embryot släppt och låg fritt i lösningen. Därefter inkuberades embryot i de olika värmningslösningarna (tabell 1). Förflyttning av embryot mellan brunnarna gjordes med flyttpipett och allt arbete vid värmning och rehydrering utfördes under mikroskop på en 37 C arbetsyta i en LAF-bänk. Under tiden som embryot rehydrerades i Warm 4 Cleave gjordes en bedömning av antalet intakta blastomerer hos embryot. När värmning och rehydrering av embryot var klara flyttades embryot över till en 11

20µl droppe med ekvilibrerat odlingsmedie, täckt med olja i en odlingsskål. Embryot vidareodlades i inkubator (6 % CO 2, 37 C) fram till dag 6 efter insemination. Vidareodling av embryon i delningsstadiet. De embryon som visade tecken på viabilitet efter vitrifiering och värmning odlades fram till dag 6 i en 20µl droppe av odlingsmedium. Varje dag under vidareodlingen gjordes en morfologisk bedömning av utvecklingen hos embryot. På dag 3 bedömdes antalet blastomerer hos embryot och på dag 4 bedömdes embryots utvecklingsstadie (cleavage/compacting). Dag 5 och 6 bedömdes embryot efter blastocyststatus (1, 2, 3, 4, 5 eller 6), trofektodermgradering (A, B eller C), ICM (A, B eller C) samt övrig status som degenerering eller arrested (avstannad) [6]. All morfologisk bedömning av utvecklingen hos embryot/blastocysten gjordes under mikroskop på en 37 C arbetsyta i en LAF-bänk. Blastocyster Bedömning av utvecklingsstatus hos blastocyster inför vitrifiering. I den del av studien som innefattade vitrifiering av blastocyster ingick 23 embryon. Dessa embryon vidareodlades till blastocyster och flyttades på dag 3 över till 20µl droppar av odlingsmedium i steril odlingsskål. Dropparna täcktes med olja. Fram till dagen för vitrifiering odlades embryona i inkubator (6 % CO 2, 37 C). Utvecklingen hos embryot/blastocysten bedömdes varje dag av vidareodlingen under mikroskop i en LAF-bänk med temperaturkontrollerad arbetsyta (37 C). Inför vitrifiering av embryon i blastocyststadiet dokumenterades odlingsdag då blastocysten vitrifierades samt blastocyststatus, trofektodermgradering och gradering av den inre cellmassan (ICM). Den morfologiska bedömningen av blastocyststatus, trofektodermgradering samt gradering av ICM gjordes efter etablerade kriterier [6]. 12

Punktering av blastocyster. För att kryoprotektanten ska kunna diffundera in i blastocysten och för att optimal dehydrering ska kunna ske, måste blastocysten punkteras. Punktering utfördes i ett inverterat mikroskop med utrustning för mikromanipulation med en temperaturkontrollerad värmeplatta (37 o C). Med hjälp av en holdingpipett hölls blastocysten fast med ICM på klockan 6 eller 12. Punkteringen utfördes med hjälp av en PDZ-mikropipett (Vitrolife). Pipetten fick penetrera trofektodermet och blastocoelekaviteten tills blastocysten visade tecken på att börja sjunka ihop. Dehydrering av blastocyster. Genast efter att blastocysten punkterats, inom 30sek, dehydrerades den inför vitrifieringen. Proceduren för dehydrering av blastocyster var densamma som för embryon i delningsstadiet vid vitrifiering med Rapid-i. Tidsschemat avvek vid inkubationen i tredje vitrifieringsslösningen, Vitri 3 Blast, där tiden var 45sek för dehydrering av blastocyster (tabell 1). Vitrifiering av blastocyster med Rapid-i, och VitroLOOP Proceduren vid vitrifiering av blastocyster med Rapid-i var densamma som vid vitrifiering av embryon i delningsstadiet med Rapid-i. Vid vitrifiering med VitroLOOP gjordes vid inkubering i Vitri 2 Blast efter 1min och 30sek två 20µl droppar av Vitri 3 Blast i en steril odlingsskål. Den ena droppen användes för inkubering av blastocysten och den andra droppen för coatning av nylonöglan. Blastocysten placerades med hjälp av flyttpipett på den coatade öglan varefter öglan direkt sänktes ner i flytande kväve i vitrifieringsbehållaren (figur 5). Skyddsbehållaren sänktes ner i kvävet och öglan skruvades fast. Allt monteringsarbete med VitroLOOP efter nedkylningen utfördes under flytande kväve. 13

Figur 5. Coatad nylonögla (loop) med embryo. Med tillstånd från Vitrolife. Förvaring av vitrifierade embryon i delningsstadiet och blastocyster i flytande kväve. Varje Rapid-i strå och VitroLOOP behållare märktes med löpnummer inför förvaring i tank (HC 35 Taylor-Wharton) med flytande kväve. Tiden för frysförvaring varierade från 4 dagar till 7 veckor. Värmning och rehydrering av blastocyster Vid värmning och rehydrering av blastocyster användes RapidWarm Blast värmningslösning. Arbetsproceduren för värmning och rehydrering av blastocyster vitrifierade med Rapid-i var densamma som vid värmning och rehydrering av embryon i delningsstadiet vitrifierade med Rapid-i. Tiderna för inkubering i de olika lösningarna följde tillverkarens föreskrifter (tabell 1). Vid värmning av blastocyster vitrifierade med VitroLOOP användes samma värmningslösningar och inkuberingstider som vid värmning av blastocyster vitrifierade med Rapid-i. Även arbetsproceduren var densamma. Öglan doppades försiktigt i Warm 1 Blast så att blastocysten sågs flyta ut i värmningslösningen. Därefter flyttades blastocysten mellan brunnarna efter samma schema som vid värmning med Rapid-i. 14

Vidareodling av blastocyster De blastocyster som visade tecken på viabilitet efter vitrifiering och värmning vidareodlades i odlingsmedie, i inkubator (6 % CO 2, 37 C). Ett tecken på att blastocysten klarat vitrifiering och värmning är att den re-expanderar, därför gjordes en morfologisk bedömning av reexpansion hos blastocysten inom 4tim efter värmning. Efter vidareodling i 24tim bedömdes utvecklingsstadiet hos blastocysten. De parametrar som bedömdes var blastocyststatus (1, 2, 3, 4, 5 eller 6), trofektodermgradering (A, B eller C), ICM (A, B eller C) samt övrig status som degenerering, arrested (avstannad) eller hatching (kläckt) [6]. All morfologisk bedömning av utvecklingen hos blastocysten gjordes under mikroskop på en 37 C arbetsyta i en LAF-bänk. Frysta embryon. Tinande av embryon i delningsstadiet som frysförvarats i 5 år. Femton embryon som frysförvarats i 5 år och som paret därefter donerat till forskning tinades. Dessa embryon hade frysts på dag 2 efter insemination enligt kontrollerad nedfrysning och hade innan nedfrysningen bedömts vara av god kvalitet. Embryona tinades enligt protokoll för värmning av embryon nedfrysta efter kontrollerad nedfrysning. Tiningslösning (COOK ), innehållande PROH och sukros som kryoprotektanter, pipetterades upp i steril fyrbrunnsskål för ekvilibrering i rumstemperatur. Strået med det nedfrysta embryot togs upp ur förvaringstanken med flytande kväve och tinades i rumstemperatur i 40sek, och därefter i 30sek i vattenbad (30ºC). Pluggen klipptes av och strået anslöts till en uppdragen spruta. Den nedre delen av strået klipptes bort och lösningen med embryot fick rinna ut mellan brunnarna i botten på fyrbrunnsskålen. Därefter flyttades embryot med så liten mängd fryslösning som möjligt till brunn 1. Tiderna för inkubering i de olika tiningslösningarna följde tillverkarens föreskrifter (tabell 1). Direkt efter att embryot tinats, gjordes en morfologisk bedömning med avseende på antalet viabla blastomerer. Varje embryo flyttades till varsin droppe med 15

odlingsmedie, täckt med olja, i odlingsskål för vidareodling till dag 3 i inkubator (6 % CO 2, 37 C). På dag tre vitrifierades embryona med den nya tekniken Rapid-i enligt tidigare beskriven metod för vitrifiering av embryon i delningsstadiet. Efter frysförvaring i 4 dygn i tank med flytande kväve värmdes embryona. Värmningsprocessen följde tidigare beskriven metod för värmning av embryon i delningsstadiet. Direkt efter värmning gjordes en morfologisk bedömning av embryot med avseende på antalet viabla blastomerer. Varje embryo flyttades återigen till varsin droppe med odlingsmedie täckt med olja, i odlingsskål för vidareodling till dag 6 i inkubator, (6 % CO 2, 37 C). En gång per dag under vidareodlingen gjordes en morfologisk bedömning av utvecklingen hos varje embryo. All morfologisk bedömning utfördes under mikroskop i en LAF-bänk på en temperaturkontrollerad arbetsyta (37 C). RESULTAT Färska embryon i delningsstadiet vitrifierade med Rapid-i Av de 37 färska embryon i delningsstadiet som ingick i studien och som vitrifierades på dag 2 eller 3 efter insemination kunde 32 återfinnas efter värmning. Hos 5 av de värmda embryona hade en blastomer/embryo degenererat, övriga embryon var intakta efter vitrifiering och värmning. Efter odling till dag 6 efter insemination hade 8 embryon utvecklats till blastocyststadiet, varav 3 delvis eller helt hade kläckts (hatching) (tabell 2). Utbytet för överlevnad och vidare utveckling efter vitrifiering och värmning var 25%. Övriga embryon degenererades eller avstannade i sin utveckling (arrested) under odling till dag 6. Tabell 2. Resultat för embryon i delningsstadiet efter vitrifiering med Rapid-i Vitrifierade Viabla efter värmning Utvecklade t. blastocyststadiet 37 30 8 16

Blastocyster vitrifierade med Rapid-i eller VitroLOOP Av de 23 färska embryon i blastocyststadiet som ingick i studien vitrifierades 12 med Rapidi och 11 med VitroLOOP. Inom 4tim efter värmning hade 9/12 (75%) blastocyster vitrifierade med Rapid-i re-expanderat och efter odling i 24tim visade 8/12 på vidareutveckling mot hatching. Av de blastocyster som vitrifierades med VitroLOOP hade 8/11 (73%) re-expanderat inom 4tim efter värmning och efter odling i 24tim visade 7/11 på vidareutveckling mot kläckning (hatching) (tabell 3). Resultatet visar att det inte förekom någon skillnad i re-expansion eller överlevnad hos blastocyster kryopreserverade med Rapidi och VitroLOOP. Tabell 3. Resultat för blastocyster efter vitrifiering med Rapid-i eller VitroLOOP Vitrifierade Re-expanderade Vidare utveckling Rapid-i 12 9 8 VitroLOOP 11 8 7 Frysta embryon i delningsstadiet vitrifierade med Rapid-i. Av de 15 embryon i delningsstadiet som frysförvarats i 5 år efter kontrollerad nedfrysning visade 11 embryon tecken på viabilitet efter att de tinats. Hos övriga embryon hade 50% eller fler av blastomererna degenererat. Efter vidareodling i ett dygn vitrifierades 8 embryon, övriga hade degenererat eller avstannat i utveckling (arrested). Efter värmning visade 5 av de vitrifierade embryona tecken på viabilitet. Endast 1 embryo visade på utveckling till blastocyststadiet som expanderad blastocyst efter odling till dag 6 efter insemination (tabell 4). Övriga embryon hade degenererats eller avstannat i sin utveckling (arrested). 17

Tabell 4. Resultat för embryon i delningsstadiet som före vitrifiering varit frysförvarade i 5 år efter kontrollerad nedfrysning. Tinade Vitrifierade Viabla efter värmning Utvecklade t. blastocyststadiet 15 8 5 1 A B C D E F 18

Figur 6. A: Embryo i delningsstadiet med 4 blastomerer dag 2 efter insemination före vitrifiering. B: Embryo i delningsstadiet med 6 blastomerer efter vitrifiering och värmning. C: Expanderad blastocyst före vitrifiering. D: Blastocyst som börjat kläckas efter vitrifiering, värmning och vidareodling. E: Blastocyst som håller på att kläckas efter vitrifiering, värmning och vidareodling. Halva blastocysten har krupit ut ur zona pellucida. F: Kläckt blastocyst efter vitrifiering, värmning och vidareodling. Hela blastocysten har krupit ut ur zona pellucida. DISKUSSION Av de två vedertagna metoderna för kryopreservering som tillämpas kliniskt - kontrollerad nedfrysning och vitrifiering - har den senare metoden visat på en högre andel viabla och intakta embryon efter vitrifiering och värmning [4,7,8]. Nackdelen med metoden har varit att det inte funnits bra teknik för vitrifiering i förslutet system utan oocyt/embryo har vitrifierats med direktkontakt med flytande kväve, vilket medfört en risk för kontamination [5]. I den här studien har en ny teknik, Rapid-i, för vitrifiering i förslutna behållare utvärderats med goda resultat. Tekniken är utarbetad och framtagen av bioteknikföretaget Vitrolife, och den här studien har utförts i samarbete med det företaget. Prestandan hos tekniken har bedömts genom att vi har undersökt överlevnad och vidareutveckling hos embryon i delningsstadiet efter vitrifiering och värmning, samt även re-expansion inom 4tim efter värmning hos blastocyster. De olika delarna i studien visar på bra resultat för överlevnad både för embryon i delningsstadiet och blastocyster efter vitrifiering med Rapid-i. I den första delen av studien ingick 37 färska embryon i delningsstadiet som vitrifierades på dag 2 eller 3 efter insemination. Av dessa utvecklades 8 till blastocyststadiet efter värmning och odling till dag 6 efter insemination. Detta resultat är jämförbart med vidareutveckling utan vitrifiering. Den andra delen av studien innefattade vitrifiering av 23 färska embryon i blastocyststadiet. Här randomiserades antalet blastocyster mellan vitrifiering med Rapid-i 19

och VitroLOOP. I studien ingick bedömning av re-expansion av blastocysten inom 4tim efter värmning. Av 20 intakta/erhållna blastocyster efter värmning re-expanderade 17 stycken, vilket innebär 85% för överlevnad efter vitrifiering och värmning. Detta visar också att punktering inför dehydrering inte skadar blastocysten, utan är nödvändigt för att optimal dehydrering och rehydrering ska ske [9,10]. Även andelen blastocyster som utvecklades vidare efter odling i 24tim efter värmning var stor, 85%. Överlevnaden hos embryon som tinas efter kontrollerad nedfrysning har tidigare rapporterats vara lägre än för embryon som värms efter vitrifiering [4]. Det syntes tydligt i resultatet från den del av studien som innehöll embryon i delningsstadiet som frysts ner enligt kontrollerad nedfrysning, och som nu tinades efter att ha frysförvarats i flytande kväve i 5 år. Av dessa 15 tinade embryon var 3 embryon (20%) helt intakta, 7 (47%) hade 75-50% av blastomererna intakta och 5 (33%) bedömdes som degenererade. Endast 1 embryo utvecklades till blastocyststadiet efter vitrifiering, värmning och odling till dag 6 efter insemination. Nyare och bättre medier för frysning och rehydrering har dock arbetats fram under de 5 år som gått sedan dessa embryon frystes ned. Vid några tillfällen återfanns inte embryot vid värmningen. Orsaken till detta kan vara att embryot deponerades i en alltför stor droppe och att det sedan flöt ut på Rapid-i stickan. Embryot kan då ha fryst fast på stickan vid vitrifieringen och därför inte släppt och flutit ut i rehydreringslösningen. Vid vitrifiering med VitroLOOP kan det vid momentet med montering av öglan i behållaren under flytande kväve vara svårt att se att öglan placeras precist och rakt i behållaren. Om öglan kommer i kontakt med insidan av väggen till behållaren släpper droppen från öglan och embryot går förlorat. Det kan vara orsaken till att embryon inte återfanns vid några tillfällen vid värmning av blastocyster vitrifierade med VitroLOOP. 20

Vid jämförelse mellan vitrifiering med Rapid-i och med VitroLOOP sågs ingen direkt skillnad. Resultaten visar att dessa två metoder kan sägas vara likvärdiga utifrån överlevnad och vidareutveckling hos de vitrifierade och värmda blastocysterna. Vid vitrifiering med Rapid-i finns en luftspalt mellan embryot i vitrifieringslösningen och strået som är placerat i flytande kväve. Teoretiskt sett skulle det kunna leda till en fördröjning av nedfrysningen jämfört med vid vitrifiering med VitroLOOP där oocyten/embryot sänks ner direkt i det flytande kvävet. Men resultaten från den här studien visar inte på att detta skulle ha någon betydelse för överlevnaden hos oocyter/embryot. Den stora fördelen med Rapid-i är att tekniken bygger på vitrifiering i förslutet system, och därmed minskar risken för kontamination från eventuella viruspartiklar i det flytande kvävet. Någon löpande rutin för viruskontroll av flytande kväve i frystankarna är inte i bruk på laboratoriet. Däremot lämnar alla patienter som ska genomgå behandling på IVF-kliniken ett blodprov för screening av vissa virus före behandlingsstart, just för att minimera risken för smittspridning och kontamination Möjligheten att genom kryopreservering kunna ta till vara oocyter och embryon vid en IVFbehandling har många fördelar. För kvinnan betyder det att en upprepad embryoåterföring kan göras i en normal menstruationscykel utan ny hormonbehandling. Återföring av endast ett embryo per behandling gör också att risken för en tvillinggraviditet minskar. Att drabbas av svår sjukdom kan i sig vara en ansträngande process att gå igenom och att då även ställas inför det faktum att förmågan och möjligheten att få egna biologiska barn minskar på grund av den medicinering och/eller behandling man behöver genomgå försvårar situationen för den drabbade. Utifrån dessa aspekter är möjligheten till frysförvaring en stor tillgång [11]. För IVF-laboratoriet betyder det också att man spar tid, vilket i sin tur medför att fler patienter ges möjlighet till behandling. Därför är behovet av optimala laboratoriemetoder av stor vikt. Jag ser därför den nya tekniken, Rapid-i, som utarbetats för vitrifiering i förslutet system, som 21

ett tillskott bland de metoder som redan finns för kryopreservering genom vitrifiering. Och även om metoden i sitt nuvarande utförande eventuellt kan behöva några justeringar, är den lättarbetad och användarvänlig. ACKNOWLEDGEMENT Jag vill rikta ett stort tack till mina handledare, Julius Hreinsson och Fatma Gülen Yaldir, Reproduktionscentrum, Akademiska Sjukhuset Uppsala, som väglett mig teoretiskt och visat mig de metoder jag behövde för att praktiskt kunna genomföra den här studien. Jag vill även tacka övriga embryologer på Reproduktionscentrum som funnits till hands med sina kunskaper. Tack till Sofia Blad, Vitrolife Sweden, som bidragit med material och medier, och för hjälp med produktbilder. REFERENSER [1] Woods EJ. Benson JD. Agca Y. Critser JK. Fundamental cryobiology of reproductive cells and tissues. Cryobiology. (2004) Apr;48(2):146-56. [2] Fuller B. Paynter S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Medicine Online. (2004) Dec;9(6):680-91. [3] Zeilmaker GH. et.al. Two pregnancies following transfer of intact frozen-thawed embryos. Fertility and Sterility. (1984) Aug;42(2):293-6. [4] Balaban A. et.al. A randomized controlled study of human day 3 embryo cryopreservation by slow freezing or vitrifikation: vitrifikation is associated with higher survival, metabolism and blastocyst formation. Human Reproduction. (2008) Sep;23(9):1976-82. [5] Bielanski A. Nadin-Davies S. Sapp T. Lutze-Wallace C. Viral contamination of embryos cryopreserved in liquid nitrogen. Cryobiology (2000) Mar;40(2):110-6. 22

[6] Gardner DK. Lane M. Sckoolcraft WB. Journal of Reproductive Immunology. (2002) May-jun;55(1-2):85-100. [7] Loutrade KE. et.al. Cryopreservation of human embryos by vitrifikation or slow freezing: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Sterility. (2008) Jul;90(1):186-93. Epub (2007) Nov 5. [8] Balaban B. et.al. A randomized controlled study of human Day 3 embryo cryopreservation by slow freezing or vitrifikation: vitrifikation is associated with higher survival, metabolism and blastocyst formation. Human Reproduction. (2008) Sep;23(9):1976-82. Epub (2008) Jun 10. [9] Mukaida T. Oka C. Goto T. Takahashi K. Artificial shrinkage of blastocoels using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrifikation improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts. Human Reproduction. (2006)Aug;12(21):3246-3252. [10] Vanderzwalmen P. et.al. Birth after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. (2002)Mar;17(3):744-51. [11] Tao T. Del Valle A. Human oocyte and ovarian tissue cryopreservation and its application. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. (2008) Jul;25(5);:287-96. Epub. (2008) Aug 1. 23