Ing. Valentina FLORAN REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT. Analize genetice spaţiale în populaţii naturale de pin silvestru (Pinus sylvestris L.

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE HORTICULTURĂ Ing. Valentina FLORAN REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Analize genetice spaţiale în populaţii naturale de pin silvestru (Pinus sylvestris L.) Conducător ştiinţific: Prof. univ. dr. Radu SESTRAȘ Cluj-Napoca 2011 1

CUPRINS INTRODUCERE.. 3 CAPITOLUL I 5 CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND PINUL SILVESTRU 1.1 Distribuţia pinului silvestru... 6 1.2. Importanţa pinului silvestru... 6 CAPITOLUL II 8 STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII PRIVIND DISTRIBUŢIA POSTGLACIALĂ A SPECIEI PINUS SYLVESTRIS... 2.1. Consecinţe genetice ale schimbărilor climatice din timpul cuaternarului... 8 2.2. Scopul şi obiectivele cercetării... 9 2.1.2. Obiectivele cercetării... 10 CAPITOLUL III 11 MATERIALUL ŞI METODELE DE CERCETARE... 3.1. Materialul de cercetare... 11 3.2. Metodele de analiză utilizate în laborator 12 CAPITOLUL IV 13 REZULTATE OBŢINUTE... 4.1. Diversitatea genetică a pinului silvestru din românia, ungaria şi suedia la nivelul 13 ADN-ului mitochondrial... 4.2. Diversitatea genetică a pinului silvestru din românia, ungaria şi suedia la nivelul 16 ADN-ului cloroplastic... 4.3. Structura genetică spaţială în populaţii naturale de pin silvestru... 25 4.3.1. Interpolarea genetică a populaţiilor de pin silvestru din România, Ungaria şi 25 Suedia... 4.3.1.1. Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial 25 pentru populaţiile din România şi Ungaria. 4.3.1.2. Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial a 26 populaţiilor din Suedia.... CAPITOLUL V 31 DISCUŢII ŞI CONCLUZII PRIVIND EVOLUŢIA POSTGLACIARA A PINULUI SILVESTRU ŞI TENDINŢELE ACTUALE DE MIGRARE 5.1.Contribuţii personale... 34 Rezumatul în limba engleză... 35 Bibliografie selectivă... 45 2

INTRODUCERE Gestionarea durabilă a pădurilor trebuie să aibă în vedere atât măsurile silviculturale specifice, în acord cu cerințele ecologice ale speciilor, cât și considerentele de ordin genetic legate de cunoașterea și gestionarea diversității genetice existente în arboretele naturale și cele artificiale. Faptul că pădurile naturale dispun de o diversitate genetică mare, face ca acestea să se preteze foarte bine programelor de ameliorare şi conservare a germoplasmei, în comparaţie cu arboretele artificiale, acestea din urmă prezentând adesea un nivel mai redus al diversităţii genetice. Schimbările climatice survenite în timpul Cuaternarului şi-au lăsat amprenta puternic asupra structurii neutre a diversităţii genetice în cadrul populaţiilor aparţinând diferitelor specii de arbori. În Europa şi America de Nord, repetatele cicluri glaciare şi interglaciare au forţat speciile din zonele temperate să se retragă în refugii, de-a lungul perioadelor de creştere a gheţii şi permafrostului fiind posibilă apoi migrarea lor în perioadele de încălzire interglaciare spre regiuni unde condiţiile climatice le-au permis să supravieţuiască (IBRAHIM şi colab., 1996; TABERLET şi colab., 1998; HUNTLEY, 1983; BENNETT şi colab., 1991; CHEDDADI şi colab., 2005). Istoria recolonizării arborilor forestieri ajută la înţelegerea condiţiilor climatice şi de habitat ale acestora în diferite regiuni din Eurasia în perioada Erei Glaciale. Deşi cele mai multe dintre specii au avut ca refugiu aceeaşi regiune, dinamica şi căile de recolonizare diferă de la o specie la alta, astfel încât speciile cu o toleranţă mare la temperaturi scăzute, cum sunt Picea, Pinus, Betula, sunt considerate a fi originare din zone vestice şi nordice (LAGERCRANTZ şi RYMAN, 1990; PALME şi colab., 2003). Pinul silvestru sau pinul de pădure (Pinus sylvestris) este considerat a fi un relict glaciar, datând din Terţiar (MIROV, 1967) şi având o istorie foarte complexă din punct de vedere al posibilelor zone de refugiu răspândite pe întreg teritoriul Europei (BIRKS, 1989; TANTĂU şi colab., 2006; WILLIS şi van ANDEL, 2004). Studiul polenului, macro-şi mega-fosilelor, a profilelor sedimentare, precum şi datele istorice dovedesc că distribuţia pinului silvestru în sudul 3

Europei a început cu aproximativ 16000 de ani în urmă, ajungând în nordul Scandinaviei cu aproximativ 7800 de ani în urmă (TANTĂU şi colab., 2006; WILLIS, 1998; CRITCHFIELD şi LITTLE, 1966; GODWIN, 1956). Odată cu schimbările climatice survenite acum 500 de ani, limita nordică a distribuţiei pinului s-a retras spre sud (WILLIS şi colab., 1998). Istoria acestor specii, refugiile glaciare, rata de supravieţuire, precum şi distribuţia lor după era glaciară, poate fi urmărită atât prin analiza fosilelor, cât şi cu ajutorul markerilor moleculari (ECKERT 2006, WILLYARD şi colab., 2007). Astfel, WILLYARD şi colab. (2007) au putut evidenţia fosile de P. belgica vechi de aproximativ 130 de milioane de ani. Studiile filogeografice ale dinamicii populaţiilor în timp şi spaţiu, precum şi ale structurii speciilor la nivel molecular folosind markerii organelari, au arătat că cele mai mari refugii de pin silvestru au fost localizate în Munţii Balcani, Munţii Alpi şi Peninsula Iberică (BENNETT şi colab., 1991; HUNTLEY şi BIRKS, 1983). Analiza polenului fosil indică faptul că abundenţa genului Pinus în Europa a fluctuat de-a lungul sutelor de ani, în funcţie de ciclurile climatice care au avut loc (CHEDDADI şi colab., 2005; MUELLER şi colab., 2003). În perioada apogeului erei glaciare (37000-16000 de ani în urmă), Fennoscandia (Norvegia, Suedia, Finlanda, Peninsula Kola şi Karelia), precum şi părţile vestice din nordul Rusiei au fost acoperite cu gheaţă, însă odată cu retragerea acesteia, pe parcursul ultimilor 10000 de ani, regiunea a fost colonizată de P. sylvestris. Pe baza evidenţelor paleoecologice şi genetice au fost făcute numeroase sugestii despre istoria filogeografică a pinului silvestru în timpul şi după Era Glaciară. În cadrul cercetărilor aferente acestei teze de doctorat s-a urmărit analiza genetică a pinului silvestru cu ajutorul markerilor moleculari (ADN mitocondrial şi cloroplastic), cu scopul de a identifica zonele în care acesta a supravieţuit perioadei glaciare şi de a reconstitui căile de recolonizare în areale cum ar fi România, Ungaria şi Suedia, urmărind bineînţeles şi diversitatea genetică din cadrul acestor populații considerate resurse genetice în domeniul forestier. 4

CAPITOLUL I CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND PINUL SILVESTRU 1.1.DISTRIBUŢIA PINULUI SILVESTRU Pădurea de conifere reprezintă cel mai întins habitat terestru din lume, în emisfera nordică ea ocupând o fâşie lată de aproximativ 1300 km. La nivel global, din suprafaţa totală ocupată cu păduri, un procent de 37% este reprezentat de pădurile de pin, în timp ce în emisfera nordică acestea ocupă 70% (MIROV, 1967). Dintre toate speciile de pin, pinul silvestru sau pinul de pădure (P. sylvestris L.) are cea mai largă distribuţie geografică, care se întinde din nordul Scandinaviei până în sudul Spaniei, şi din vestul Scoţiei până în Estul Siberiei, la Marea Okhotsk. În cadrul acestui areal, populaţiile de pin silvestru pot fi întânite la diferite altitudini, în nord fiind prezent de la nivelul mării până la 1000 m, în timp ce limita cea mai sudică este cuprinsă între 1200-2600m altitudine (Sierra Nevada, Spania). Pinul silvestru este cel mai răspândit conifer de pe Glob, ocupând circa 143 milioane ha (37% din suprafaţa împădurită a globului). În România este pinul silvestru puţin răspândit în comparaţie cu alte ţări, vegetând spontan, în masiv, la altitudini cuprinse între 310m, Dofteana- Baciu, şi 1600 m, în Munţii Retezat, insular, în lungul Carpaţilor şi în Munţii Apuseni, pe stâncării aride, turbării etc. Astăzi, bazinul râului Trotuş reprezintă cea mai mare zonă în care pinul este menţinut sub formă de pădure pură sau în amestec cu molid, brad, stejar. Standuri naturale, unele fiind de mare productivitate, se găsesc în iazuri ca: Buzău, Râmnic, Putna, Oituz. În general, limitele sale de răspândire sunt cuprinse între 300 m altitudine în Subcarpaţii Moldovei şi Valea Oltului şi aproximativ 1900 m în Retezat, izolat în bazinul Gemenele. Distribuţia generală a 5

vegetaţiei forestiere de pe teritoriul României este, pe de o parte, rezultatul evoluţiei generale a vegetaţiei din Europa, după perioada Postglaciarului, fiind determinată climatic, iar pe de altă parte, a intervenţiei antropice manifestată atât prin reducerea suprafeţelor deţinute de pădure, cât şi prin transferul de seminţe şi puieţi. Fig. 1.1. Arealul pinului silvestru (după DUCUSSO A., Euforgen 2009) Fig. 1.1. Scots pine distribution range (DUCUSSO, A., Euforgen 2009) 1.2. IMPORTANŢA PINULUI SILVESTRU Pinul silvestru este o specie foarte importantă din punct de vedere comercial. Lemnul cu duramen roşcat, cu proprietăţi mecanice bune este uşor de prelucrat fiind folosit în diferite industrii (lemn de cherestea, lemn de construcţii, lemn de celuloză, lemn de mină etc.). Cheresteaua este numită în limbaj industrial afacere roşie (lemn cu duramen roşu), fiind clasificată drept "lemn moale" şi utilizată pentru o gamă largă de produse, de la construcţii de case şi bărci, la traverse de cale ferată, mobilier, jucării. Multe hectare de pădure de pin sunt plantate în fiecare an pentru a furniza industriei lemnul necesar (PRAVDIN, 1969). 6

Calităţile tehnologice ale lemnului depind în mare măsură de bonitatea staţiunii. Rusticitatea remarcabilă de care dă dovadă pinul silvestru l-a impus ca specie de primă importanţă în culturile forestiere din staţiuni de bonitate inferioară, în scopul fixării solului, asigurând totodată şi o producţie apreciabilă de masă lemnoasă. După anul 1960, pinul silvestru a fost utilizat frecvent pentru substituirea arboretelor slab productive de fag, gorun, gârniţă, cer etc., cultivându-se anual pe circa 6000-7000 de hectare (TURNOCK, 2002). Duşmanii pinului sunt nematodele care provoacă ofilirea, cel mai des întâlnită la puieţii tineri, de până la 10 ani, provocând moartea acestora în doar câteva săptămâni (LOWE, 2011). Cu un conţinut de răşină foarte mare, pinul silvestru se pretează la rezinaj, fiind derulate programe de selecţie a fenotipurilor valoroase, preconizându-se instalarea de culturi cu o astfel de destinaţie. Pinul silvestru este de asemenea utilizat cu mult succes şi la împădurirea terenurilor degradate, mai ales în Transilvania. În Finlanda şi ţările scandinave, pinul a fost utilizat pentru producerea gudronului în epoca pre-industrială. Şi acum mai există producători activi de gudron, dar ca şi industrie aceasta a încetat să mai existe. Din punct de vedere medicinal, produsele din pin sunt utilizate ca diuretice şi iritante, fiind şi un remediu valoros în tratarea problemelor de rinichi, boli reumatice şi infecţii ale mucoasei respiratorii. Din ace, crengi şi scoarţă, care conţin o răşină lipicioasă cu miros plăcut, sunt extrase substanţe cum ar fi: colofoniu, terebentină şi uleiuri esenţiale. Terebentina nu este altceva decât esenţa distilată a răşinii brute de pin. Uleiul de terebentină este folosit pentru uz extern ca stimulent pentru umflături reumatice, pentru entorse, echimoze şi împotriva paraziţilor. Gudronul este folosit în medicină, în special în practica veterinară, ca şi stimulent antiseptic, cu acţiune diuretică şi diaforetic. Colofoniul a fost folosit pentru acoperirea plăcilor de zinc sau cupru, în tipărirea imaginilor gravate şi pentru arcurile de vioară. Uleiul esenţial de pin nu se distilează direct din răşină brută, ci cu abur, din ramurile şi acele proaspete, la fel ca şi terebentina. 7

CAPITOLUL II STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII PRIVIND DISTRIBUŢIA POSTGLACIALĂ A SPECIEI PINUS SYLVESTRIS 2.1. CONSECINŢE GENETICE ALE SCHIMBĂRILOR CLIMATICE DIN TIMPUL CUATERNARULUI Efectele schimbărilor climatice asupra speciilor de plante sunt cel mai bine cunoscute în urma analizelor polenului fosil găsit în decursul ultimilor 20000 de ani în Europa şi America de Nord (HUNTLEY şi BIRKS, 1983; HUNTLEY şi WEBB, 1988; HUNTLEY, 1990). Studiul polenului, macro-şi mega-fosilelor, a profilelor sedimentare, precum şi datele istorice dovedesc că distribuţia pinului silvestru în sudul Europei a început cu aproximativ 16000 de ani în urmă, ajungând în nordul Scandinaviei cu aproximativ 7800 de ani în urmă (TANTĂU şi colab., 2006; WILLIS, 1998; CRITCHFIELD şi LITTLE, 1966; GODWIN, 1956). Istoria acestor specii, refugiile glaciare, rata de supravieţuire şi distribuţia lor după era glaciară, poate fi urmărită prin analiza fosilelor şi cu ajutorul markerilor moleculari. Răspândirea postglaciară a speciilor a fost influenţată şi de topografia fiecărei regiuni. Studiile filogeografice ale dinamicii populaţiilor în timp şi spaţiu, ale structurii speciilor la nivel molecular folosind markerii organelari, au arătat că cele mai mari refugii de pin silvestru au fost localizate în Munţii Balcani, Munţii Alpi şi Peninsula Iberică (BENNETT şi colab., 1991; HUNTLEY şi BIRKS, 1983). Analiza polenului fosil a indicat faptul că, abundenţa genului Pinus în Europa a fluctuat de-a lungul sutelor de ani în funcţie de ciclurile climatice. În perioada apogeului erei glaciare (37000-16000 de ani în urmă), Fennoscandia (Norvegia, 8

Suedia, Finlanda, Peninsula Kola şi Karelia), precum şi părţile vestice din nordul Rusiei au fost acoperite cu gheaţă, însă odată cu topirea acesteia, pe parcursul ultimilor 10000 de ani, regiunea a fost colonizată de P. sylvestris. Numeroase studii pe aloenzime şi un număr tot mai mare de analize de ADN din organite celulare (ADNcp şi ADNmt) demonstrează că populaţiile de plante care au fost izolate în anumite areale prezintă o diversitate genetică mai ridicată decât celor dezvoltate ulterior şi provenite din acestea. Reducerea diversităţii genetice, în rândul populaţiilor, odată cu creşterea distanţei faţă de refugiu prin expansiunea postglacială, în general înspre nord, este un fenomen general datorat constrângerilor genetice repetate. Populaţiile considerate refugii glaciare (cum sunt cele din sudul Europei) este posibil să fi menţinut o mare parte a variaţiei genetice existente şi, prin urmare, este indicat a fi folosite cu precădere în programele de conservare genetică. 2.2. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII Scopul principal al temei de cercetare este studiul structurii genetice spaţiale a pinului silvestru (Pinus sylvestris L.), de un interes major în procesul de adaptabilitate climatică, producţie şi conservare a resurselor genetice forestiere a acestei specii. Acest studiu a urmărit, de asemenea, cuantificarea diversităţii genetice intra şi interpopulaționale a speciei, în populaţii provenite din trei ţări diferite altitudinal şi latitudinal: Suedia, România şi Ungaria, în vederea caracterizării structurii lor genetice şi a modului lor de adaptare, precum şi cu scopul identificării posibilelor rute ale colonizării în perioada postglacială. Datele obținute vor fi folosite pentru a face recomandări privind modul de adaptare al pinului silvestru la viitoarele schimbări climatice produse de încălzirea globală; la alegerea şi utilizarea haplotipurilor valoroase ca material de reproducere în diferite zone geografice. 9

2.2.1. Obiectivele cercetării Pentru atingerea scopului cercetărilor s-au stabilit următoarele obiective de cercetare: - evaluarea diversităţii intra- şi interpopulaţionale a unor populaţii naturale de pin silvestru din România, Ungaria şi Suedia; - evidenţierea haplotipurilor existente la nivelul ADN-ului mitocondrial şi ADN-ului cloroplastic atât prin tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction), cât şi prin metoda electroforezei capilare (Capilary electrophoresis -Sequencing Analysis); - identificarea refugiilor glaciare din care provin populaţiile de pin silvestru din România, prin verificarea ipotezei conform căreia Ungaria este zonă de refugiu a pinului silvestru în perioada glaciară (revizuit de WILLIS şi van ANDEL 2004), precum şi căile de recolonizare postglaciară pe teritoriul ţării; - evaluarea diversităţii genetice şi identificarea căilor de recolonizare a populaţiilor de pin silvestru pe teritoriul Suediei, în zona de nord a distribuţiei acestuia; - elaborarea de concluzii privind influenţa schimbărilor climatice asupra diversităţii genetice, evoluţiei şi migraţiei populaţiilor de pin silvestru; - formularea de recomandări privind alegerea haplotipurilor cu capacitate mare de adaptare viitoarelor schimbări climatice (de exemplu încălzirea globală preconizată) în funcţie de zona de interes. 10

CAPITOLUL III MATERIAL ŞI METODE DE CERCETARE 3.1. MATERIALUL DE CERCETARE În cercetările aferente prezentei teze de doctorat s-au analizat 13 populaţii naturale de pin silvestru din România, 2 populaţii din Ungaria şi 53 populaţii din Suedia. Recoltarea materialului vegetal, respectiv muguri (România, Ungaria şi Suedia) şi ace (Suedia) s-a desfăşurat în două perioade diferite ale anului II de studiu 2010, respectiv anul III 2011. Pentru a putea lua în studiu întreaga distribuţie a pinului silvestru de pe teritoriul României, au fost recoltate populaţiile din zona centrală, respectiv interiorul lanţului Munţilor Carpaţi (etapa I a recoltării), dar şi partea nord-estică, respectiv, exteriorul lanţului Carpatic (etapa II a recoltării). Alegerea populaţiilor a fost făcută pe baza Catalogului Rezervaţiilor de Seminţe, catalog întocmit la nivelul Regiei Naţionale a Pădurilor şi care cuprinde întreaga suprafaţă a ţării. Populaţiile din Suedia luate în studiu au provenit din două loturi de experimente cu provenienţă diferită. Prima serie de provenienţe se află în Sävar, lângă Umeå, la 63 53'N 20 32'E, iar materialul a fost furnizat de către Institutul de Cercetări Silvice, Skogforsk. A doua serie a fost în Remmingstorp, lângă Skövde, la 58 27'N 13 40'E şi au fost furnizate de către Skogssällskapet AB. 11

3.2. METODE DE ANALIZĂ UTILIZATE ÎN LABORATOR Procesul de izolare al ADN-ului la toate variantele de studiu din România s-a realizat utilizând protocolul de extracţie ADN creat de LODHI (1994) şi îmbunătăţit de către POP (2003). În cadrul populaţiilor din Suedia, extracţia ADN s-a ralizat după protocolul CTAB (DOLYE & DOLYE 1987). Cantităţile de ADN obţinute au variat între 1000 ng/µl şi 6500 ng/µl. Toate probele au avut puritate destul de ridicată, raportul celor două citiri (A260- A280) s-a încadrat între valori de 1,7 şi 1,9 Primerii folosiţi pentru amplificarea ADN-ului mitocondrial au fost aleşi pe baza studiilor similare (PYHÄJÄRVI şi colab., 2008; NAYDENOV şi colab., 2007; CHEDDADI şi colab., 2006); astfel, au fost folosite 2 seturi de primeri, şi anume nad1 intron B/C creat de SORANZO şi colab. (2000) şi nad7 intron1 creat de JARAMILLO-CORREA (2003). Nivelul variaţiei genetice intra şi interpopulaţionale a fost urmărit la nivelul secvenţelor microsatelit din cloroplaste în toate cele 68 populaţii naturale de pin silvestru. Pentru amplificarea ADN-ului cloroplastic s-au folosit 18 primeri microsateliţi (cpssr). Aceştia au fost concepuţi şi testaţi pentru prima dată pe 6 specii diferite de pin printre care şi P. thunbergii, de către POWELL şi colab. (1995); VENDRAMIN şi colab. (1996). În urma optimizării condiţiilor PCR de amplificare, pentru a continua analizele au fost aleşi 14 primeri (PCP26106, PCP30277, PCP36567, PCP41131, PCP45071, PCP1289, PCP48256, PCP63771, PCP71987, PCP87314, după PROVAN şi colab. (1998), Pt87268, Pt1254, Pt71936, Pt15169 după VENDRAMIN şi colab. (1996). În vederea evidențierii diversității genetice la nivelul markerilor mitocondriali şi cloroplastici, datele rezultate în urma interpretării gelurilor de agaroză (cazul primerilor mitocondriali) şi a cromatrogramelor (cazul primerilor cloroplastici) au fost prelucrate cu ajutorul diferitelor programe de analiză genetică: CONTRIB, FSTAT, ARLEQUIN, BAPS şi AIS, fiind determinați diferiţi parametrii. 12

CAPITOLUL IV REZULTATE OBŢINUTE 4.1. DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA, UNGARIA Şi SUEDIA LA NIVELUL ADN-ULUI MITOCONDRIAL Din punct de vedere al diversităţii genetice a pinului silvestru au fost identificate două haplotipuri distincte de ADNmt, din care cel mai reprezentativ este haplotipul AA, întâlnit în toate cele 15 populaţii analizate, urmat de haplotipul AB comun în partea centrală a ţării şi în proporţie redusă în cele 2 populaţii din Ungaria. O importanţă deosebită este atribuită acestui studiu datorită faptului că nici un alt studiu anterior cu privire la rutele de colonizare a pinului silvestru în Europa nu au cuprins şi populaţii din România, cu excepţia lui NAYDENOV şi colab. (2007), care au studiat o singură populaţie din Cugir (rezervaţie de seminţe), observând prezenţa unui singur hapotip, haplotipul AA. Prezenţa haplotipului BA într-o singură populaţie din România este corelată cu prezenţa aceluiaşi haplotip în Peninsula Iberică şi Munţii Balcani (NAYDENOV şi colab., 2007), fiind posibilă migrarea acestuia de-a lungul timpului spre România, datorită topografiei şi poziţiei izolate a Peninsulei Iberice. Probabilitatea unei deplasări ale seminţelor pe distanţe aşa lungi ar fi mai mare în cazul populaţiilor mai nordice şi estice ale distribuţiei pinului silvestru datorită lipsei barierelor majore (munţi). O altă explicaţie plauzibilă pentru prezenţa atât de rară a acestui haplotip (datorită alelei B a locusului nad1) în populaţia din România şi în câteva populaţii din Balcani, ar fi aceea conform căreia alela B este o alelă veche care a fost prezentă în era glaciară în mai multe refugii din zona de sud a 13

Europei. Frecvenţa ridicată sau scăzută a acestei alele este datorată variaţiei stochastice, în special în cazul în care refugiile din sud au trecut prin puternice fenomene de bottleneck, sau datorită intervenţiilor umane. Prezenţa alelei B a locusului nad7 în proporţie de aproximativ 50% în majoritatea populaţiilor din România nu poate fi explicată ca fiind o mutaţie din timpul Holocenului, deoarece ea este foarte răspândită în populaţii din nord - estul Europei (NAYDENOV şi colab., 2007), făcând de asemenea parte din populaţii nordice considerate zone de refugiu (SINCLAIR şi colab., 1999). Rezultatele obţinute sunt în concordanţă cu ipoteza conform căreia Ungaria şi Cehia sunt considerate refugii ale pinului silvestru în era glaciară, după cum arată studii ale polenului fosil (revizuit de WILLIS şi van ANDEL 2004). Se pot urmări două căi de migrare din refugiu şi colonizare a României, astfel, prima rută de colonizare cel mai probabil s-a realizat din populaţia Fenyőfő din partea de sud-vest a Ungariei, populaţie considerată relict, urmând fluviul Dunărea ce străbate Ungaria şi Romania, fiind astfel posibil transportul seminţelor pe această cale spre populaţiile din exteriorul arcului Carpatic: Vâlcea, Vrancea şi Suceava. Cea de-a doua rută de colonizare s-a realizat prin transportul seminţelor cu ajutorul vântului sau a apei din partea de nord - vest a Ungariei, respectiv din populaţia Velemer considerată de asemenea relict, prin partea central - nordică a României, colonizând zonele din interiorul Munţilor Carpaţi. De asemenea, pentru Picea abies, conifer foarte comun în Europa şi rezistent la temperaturi scăzute, Munţii Carpaţi au fost consideraţi zonă de refugiu în timpul glaciaţiunii (GUGERLI şi colab., 2001). 14

Fig. 4.6. Distribuţia haplotipurilor mitocondriale în populaţiile analizate din România şi Ungaria Fig. 4.6. Distribution of mitochondrial haplotypes in populations from Romania and Hungary Populaţiile din Suedia au evidenţiat prezenţa haplotipului AA la 80% dintre indivizii analizaţi, iar a haplotipul AB întâlnit la doar 20% dintre indivizi. De asemenea haplotipul BA a fost nesemnificativ reprezentat datorită prezenţei într-o sigură populaţie din cele 54 populaţii analizate. Din analizele realizate în cadrul acestei teze de doctorat se poate concluziona, de asemenea, faptul că pinul silvestru a colonizat Suedia urmând două rute principale care se întâlnesc în centrul ţării, ipoteză susţinută şi de TABERLET şi colab. (1998), SINCLAIR şi colab. (1999). O rută a colonizării porneşte din partea de nord-est a Europei şi iar cea de-a doua, din sudul Europei, întâlnindu-se în centrul Suediei, fapt ce poate fi observat din figurile prezente în teză (Figura 4.6., Figura 4.7.). 15

Fig. 4.7. Distribuţia haplotipurilor mitocondriale în populaţiile analizate din Suedia Fig. 4.7. Mitochondrial haplotypes distribution in populations from Sweden 4.2. DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA, UNGARIA Şi SUEDIA LA NIVELUL ADN-ULUI CLOROPLASTIC În analizele ADN-ului cloroplastic fiecare locus analizat a fost polimorf, prezentând în medie 2 până la 6 alele. Pe baza acestei frecvenţe a alelelor se observă o distribuţie 16

unimodală la nivelul fiecărui locus, cu alele ce se diferenţiază prin una sau două perechi de baze. Aceasta sugerează faptul că cea mai mare parte a variaţiei observate poate fi explicată datorită erorilor care apar în timpul replicării ADN-ului prezent în markerii microsatelit (VALDES şi colab., 1993; DIRIENZO şi colab., 1994, FREIMER şi SLATKIN 1996). Datorită faptului că genomul cloroplastic nu este supus procesului de recombinare, variabilitatea observată la nivel de ADN nu poate fi explicată prin crossing-over. În urma analizei frecvenţelor microsatelit din ADN-ul cloroplastic, obţinute prin amplificarea cu 14 primeri, s-a evidenţiat un nivel foarte ridicat al variaţiei. Astfel, în 288 de indivizi analizaţi, din România şi Ungaria, s-au identificat 235 de haplotipuri diferite, din care 182 (77%) sunt haplotipuri unice, ele aparţinând câte unui singur individ. Aceasta înseamnă că 63% (182 din 288) din indivizii analizaţi au avut un profil unic la nivelul locilor microsatelit analizaţi; la nivelul întregului studiu 82% dintre indivizii analizaţi au prezentat haplotip caracteristic. În vederea grupării populaţiilor pe baza relaţiilor genetice s-a folosit programul BAPS. Utilizând opţiunea de grupare a populaţiilor (clustering of populations) s-a presupus un număr K=15 sau K=3 de populaţii, rezultând o grupare a populaţiilor în 2 mari clustere reprezentate în figura de mai jos. Considerând modul de transmitere a ADN-ului cloroplastic pe cale paternă prin polen, fluxul de gene este mult mai mare, răspândirea polenului fiind posibilă pe distanţe foarte mari de zeci şi chiar sute de kilometri. Astfel se poate observa o diversitate ridicată în cadrul populaţiilor analizate. Cele 15 populaţii au fost astfel grupate în două clutere cu o proporţie de 50:50 în fiecare cluster reprezentate pe hartă prin culoarea galben şi maro. Populaţiile din ambele ţării au fost analizate împreună pentru a evidenţia legătura genetică dintre acestea, fapt ce poate susţine ipoteza lui WILLIS van ANDEL 2004, Ungaria fiind considerată refugiu glaciar pentru această specie. 17

Fig. 4.11. Distribuţia clusterelor cloroplastice rezultate în urma analizei bayesiene Fig. 4.11. Distribution of the chloroplast clusters given by BAPS program Prin analiza ADN-ului cloroplastic al celor 54 de populaţii, cu ajutorul celor 14 primeri microsatelit, s-a evidenţiat un număr de 230 haplotiuri unice fiecărui individ din totalul de 317 indivizi analizaţi (Figura 4.13.). Un nivel ridicat al diversităţii intra şi interpopulaţionale poate fi observat şi comparativ cu analizele ADN-ului mitocondrial, datorită modului de transmitere a ADN-ului cloroplastic, şi anume pe cale paternă cu ajutorul polenului, caz în care fluxul de gene este mult mai mare. Astfel, utilizând varianta de calcul clustering individuals sau populaţii clustering groups of populations s-a observat o grupare a populaţiilor în 4 clustere. Aceste clustere prezintă o distribuţie aproximativ egală de-a lungul întregii ţării, subliniind astfel gradul ridicat de diversitate la nivelul populaţiilor analizate. Diferenţierea genetică între populaţiile din România şi cele din Ungaria, la nivelul ADN-ului cloroplastic, a înregistrat o valoare de Gst= 0,0549 ceea ce indică o diferenţiere destul de ridicată a populaţiilor comparativ cu valorile înregistrate în cazul ADN-ului mitocondrial. Nivelul diversităţii genetice totale (H TCP ) se situează în jurul valorii de 52%. 18

Valoarea cea mai ridicată a diversităţii genetice a fost găsită în populaţia Caraş Severin (H SCP = 0,496) (Tabelul 4.23.), urmată de populaţia Gurghiu (H SCP =0.491), iar valoarea cea mai scăzută a fost înregistrată în populaţia Timişoara (H SCP =0.4256) şi Reghin (H SCP = 0.4348). Fig. 4.13. Reprezentarea geografică a clusterelor ADN-ului cloroplastic rezultate în urma analizei bayesiene Fig. 4.13. Geographical distribution of the chloroplast clusters resulted from BAPS analy 19

Tabelul 4.23. Table 4.23. Parametrii diversittăţii genetice intrapopulaţionale pentru populaţiile de pin silvestru analizate în România şi Ungaria; N-mărimea eşantionului, H SMT/SCP -diversitatea genetică medie în ADN-uli mitochondrial,cloroplastic A SMT/SCP -diversitatea alelelor mitocondriale, cloroplastice, Gst, Nst- diferenţierea genetică interpopulaţională Genetic diversity parameters for scots pine analyzed population from Romania and Hungary; N-sample size, H SMT/SCP - mitochondria/chloroplast mean genetic diversity, A SMT/SCP - mitochondrial/chloroplast allelich richness, Gst, Nst- genetic differentiation within populations Ţara Judeţul Locaţia Longitudine Latitudine Marimea eşantionului H SMT A SMT BA PS H SCP A SCP G-W Country County Location Longitude Latitude Sample size Mitocondria Cloroplast Romania Alba Baia de Aries 23 20 00 46 24 33 20 0.218 0.433 2,3 0.465 0.996 1.038 Romania Alba Sebes 23 30 09 45 53 32 20 0.505 0.505 2 0.448 0.996 1.196 Romania Mures Gurghiu 24 51 16 46 46 28 20 0.478 0.456 2 0.491 0.995 0.914 Romania Mures Reghin 24 31 42 46 53 02 20 0.442 0.456 2 0.434 0.996 0.989 Romania Sibiu Agnita 24 45 47 46 00 53 20 0.514 0.515 2 0.477 0.995 1.043 Romania Harghita Toplita 25 20 35 46 54 40 20 0.505 0.505 2 0.449 0.996 0.988 Romania Brasov Zarnesti 25 19 31 45 33 59 17 0.400 0.382 2 0.486 1.000 1.027 Romania Caras Anina 21 51 41 45 05 60 20 0.521 0.521 2 0.496 0.993 1.009 Romania Hunedoara Pui 23 06 05 45 31 24 19 0.514 0.503 2 0.470 1.000 1.076 Romania Suceava Candreni 21 51 12 47 20 59 20 0.000 0.000 1 0.483 0.991 0.982 Romania Timisoara Nadragu 21 11 00 45 39 00 19 0.424 0.456 2 0.425 0.990 1.003 Romania Valcea Voineasa 23 52 01 45 28 12 16 0.000 0.000 1 0.465 0.183 1.061 Romania Vrancea Tulnici 26 38 57 45 55 18 20 0.000 0.000 1 0.450 0.996 0.950 Ungaria Győr Moson Sopron Fenyőfő 17 45 47 47 5 20 20 0.100 0.100 1 0.458 0.994 0.832 Ungaria Vas Velemer 16 22 35 46 44 04 18 0.522 0.523 2 0.489 1.000 0.964 Total Gst= 0.184 Nst =0.184 20

Tabelul 4.24. Table 4.24. Parametrii diversittăţii genetice intrapopulaţionale pentru populaţiile de pin silvestru analizate în Suedia N-mărimea eşantionului, H SMT/SCP -diversitatea genetică medie în ADN-uli mitochondrial,cloroplastic A SMT/SCP - diversitatea alelelor mitocondriale, cloroplastice, Gst, Nst- diferenţierea genetică interpopulaţională Genentic diversity parameters for scots pine analyzed population from Sweden N-sample size, H SMT/SCP - mitochondria/chloroplast mean genetic diversity, A SMT/SCP - mitochondrial/chloroplast allelich richness, Gst, Nst- genetic differentiation within populations Ţara Judeţul Locaţia Marimea BAP Latitudine Longitude H Id.Tag eşantionului SMT A SMT H SCP A SCP G-W S Country County Location Latitude Longitudine Sample size Mitocondria Cloroplast Sweden Sävar Rönnbäck AC 493 63 55 20 03 7 0.400 0.333 0.414 1.000 1.154 1 Sweden Sävar Hjoggböle AC 494 64 30 21 00 6 0.333 0.333 0.442 1.000 1.230 2 Sweden Sävar Krångfors AC 495 64 46 20 29 6 0.000 0.000 0.400 1.000 1.580 5 Sweden Sävar Tallsjö AC 496 64 10 17 56 7 0.000 0.476 0.377 1.000 1.431 1 Sweden Sävar Segersjökullen AC 497 64 03 18 33 6 0.000 0.000 0.533 1.000 1.211 1 Sweden Sävar Fjällbränna, Ormsjö AC 498 64 30 16 03 5 0.000 0.000 0.471 1.000 1.295 1 Sweden Sävar Innanbäck AC 499 65 00 21 03 5 0.000 0.000 0.242 1.000 3.200 1 Sweden Sävar Tallunda AC 501 65 18 18 49 6 0.000 0.000 0.392 1.000 1.407 1 Sweden Sävar Plantage 18+20, Brån AC 560 63 52 19 52 7 0.285 0.286 0.458 1.000 1.230 1 Sweden Sävar Lindviken 2/68 BD401 65 50 20 53 5 0.000 0.000 0.540 1.000 1.333 1 Sweden Sävar Ö. Nykåtatjärn BD403 65 50 18 53 7 0.285 0.286 0.522 1.000 1.003 1 Sweden Sävar Pasainen BD 405 66 30 23 03 6 0.000 0.000 0.328 0.933 1.600 1 Sweden Sävar Korro BD 406 66 31 19 53 7 0.400 0.333 0.473 1.000 1.251 1 Sweden Sävar Abtaur BD 407 66 00 18 53 7 0.285 0.286 0.328 0.964 1.501 1 Sweden Sävar Krp. Ö. Uddjaur BD 408 66 01 18 03 6 0.333 0.333 0.328 1.000 1.401 1 Sweden Sävar Suopikåive BD 409 66 20 20 00 7 0.000 0.000 0.560 1.000 1.119 1 Sweden Sävar Suopikåive BD 410 66 20 20 00 4 0.000 0.000 0.559 1.000 1.148 1 Sweden Sävar Uijatievat BD 411 67 48 21 53 7 0.571 0.333 0.386 0.964 1.347 1 Sweden Sävar Äijänrova BD 412 67 38 21 22 6 0.400 0.333 0.538 1.000 1.230 1 21

Ţara Judeţul Locaţia Marimea BAP Latitudine Longitude H Id.Tag eşantionului SMT A SMT H SCP A SCP G-W S Country County Location Latitude Longitudine Sample size Mitocondria Cloroplast Sweden Sävar Selsberget BD 424 66 00 21 03 6 0.533 0.333 0.419 1.000 1.260 2 Sweden Sävar Selsberget BD 425 66 00 21 03 8 0.000 0.000 0.685 1.000 1.095 1 Sweden Sävar Krp. Flinsberget Bg 419 60 00 16 00 6 0.000 0.000 0.516 1.000 1.541 1 Sweden Sävar Stempen, Särna Bg 420 61 30 13 03 6 0.533 0.000 0.466 1.000 1.251 2 Sweden Sävar Granåsen Bg 422 61 40 13 00 4 0.333 0.500 0.504 1.000 1.250 2 Sweden Sävar Nora, Nyland Y 824 62 52 17 55 4 0.000 0.000 0.500 1.000 1.375 4 Sweden Sävar Nordanede Y 825 62 35 16 18 7 0.000 0.000 0.580 1.000 0.917 3 Sweden Sävar Finnbäcken Y 826 62 20 16 28 7 0.000 0.000 0.421 0.952 1.238 3 Sweden Sävar Dalstjärn Y 827 63 30 19 03 6 0.000 0.000 0.492 1.000 1.057 1 Sweden Sävar Viken Y 828 63 30 16 31 5 0.000 0.000 0.454 1.000 1.371 1 Sweden Sävar Bergetjärn Y 829 64 10 16 03 5 0.000 0.000 0.509 1.000 1.138 4 Sweden Sävar Fudan Z 423 62 40 14 33 5 0.000 0.000 0.521 1.000 1.242 4 Sweden Sävar Bodbacksbränn Z 424 62 30 14 33 6 0.000 0.000 0.430 1.000 1.500 4 Sweden Sävar Vävelsberget Z 425 62 40 13 03 7 0.476 0.476 0.521 1.000 1.076 4 Sweden Sävar Kittelsjön, Lillhärdal Z 426 62 00 13 33 6 0.000 0.000 0.421 0.933 1.219 4 Sweden Sävar Medskogen Z 427 62 26 13 02 7 0.333 0.476 0.525 1.000 0.976 4 Sweden Sävar Kvitsle, Mattmar Z 428 63 17 13 49 6 0.000 0.000 0.488 1.000 1.118 4 Sweden Sävar Borön, Lockne Z 429 63 15 14 53 6 0.000 0.000 0.490 1.000 0.968 4 Sweden Sävar Gransjölandet Z 430 63 03 15 38 7 0.000 0.000 0.447 1.000 1.272 5 Sweden Sävar Krp. Golhammar Z 431 63 00 14 00 5 0.000 0.000 0.534 1.000 1.032 5 Sweden Sävar Brämön, Sanna 40S 62 12 17 42 2 0.000 0.000 0.428 1.000 2.122 5 Sweden Sävar Kilafors, Hemstanäs 48H 61 08 16 31 6 0.333 0.333 0.500 1.000 1.076 5 Sweden Remmi ngstorp Orsa, Högståsen 49H 61 05 14 58 10 0.000 0.000 0.543 0.978 0.922 5 Sweden Remmi ngstorp Sandhamn 61S 59 17 18 55 2 0.000 0.000 0.428 1.000 2.277 5 Sweden Remmi Varnhem,Billing 69B 58 22 13 41 9 0.000 0.476 0.472 0.972 1.129 5 22

ngstorp en Ţara Judeţul Locaţia Marimea BAP Latitudine Longitude H Id.Tag eşantionului SMT A SMT H SCP A SCP G-W S Country County Location Latitude Longitudine Sample size Mitocondria Cloroplast Sweden Remmi ngstorp Västervik 70V 57 46 16 39 2 0.000 0.000 0.500 1.000 2.000 5 Sweden Remmi ngstorp Eckersholm 74E 57 36 14 13 2 1.000 1.000 0.571 1.000 1.708 5 Sweden Remmi ngstorp Färingtofta 80F 56 03 13 23 9 0.200 0.429 0.524 0.978 0.932 5 Sweden Remmi ngstorp Granna G 58 01 14 28 4 0.000 0.000 0.404 1.000 1.614 1 Sweden Remmi ngstorp Hornso H 57 00 16 12 7 0.476 0.476 0.512 1.000 1.125 1 Sweden Remmi ngstorp Kohult K7V 57 48 13 47 5 0.600 0.000 0.452 1.000 1.380 4 Sweden Remmi ngstorp Timmer Nabben TN 56 41 12 55 8 0.600 0.667 0.414 1.000 1.400 4 Sweden Remmi ngstorp Torup&Halland TH 56 54 12 29 5 0.000 0.600 0.433 1.000 1.166 1 Total GST= 0.194, NST= 0.197 23

În ceea ce priveşte situaţia populaţiilor din Suedia, diversitatea genetică totală (H TCP ) la nivelul ADN-ului cloroplastic se situează în jurul valorii de 99%. Valoarea cea mai mică a diversităţii genetice medii la nivelul fiecărei populaţii a fost înregistrată în populaţia din Innanbäck, notată în tabel prescurtat AC 499 (H SCP =0,24286), urmată de populaţiile Pasainen (BD 405), Abtaur (BD407), Uddjaur (BD408), care au înregistrat o valoare egală (H SCP =0,32857). Valoarea cea mai ridicată a diversităţii genetice s-a observat în populaţia Selsberget (BD 425) (H SCP =0,68537), populaţii situată printre cele mai nordice analizate. Din punct de vedere latitudinal populaţiile cele mai nordice au prezentat o diversitate genetică mai pronunţată la nivelul locuşilor analizaţi, comparativ cu populaţiile aflate la latitudini mai joase, înspre sud. Pentru a testa dacă populaţiile au suferit o constrângere (fenomenul de bottleneck) dea lungul anilor, dar şi în timpul procesului de recolonizare, indicele Garza - Williamson a fost calculat cu valori cuprinse între 0,832 în populaţia Fenyőfő Ungaria şi 1,196 în populaţia Sebeş, Romania. Se constată astfel că populaţia Fenyőfő a suferit mici modificări datorită fenomenului de bottleneck, în timp ce restul populaţiilor au avut o valoare a indicelui G-W 1, ce indică o stabilitate/staţionare a mărimii populaţiei efective. Această situaţie se poate explica prin faptul că s-au analizat exemplare bătrâne de pin silvestru, care reprezintă rezultatul unor încrucişări realizate cu mult timp în urmă. În populaţiile din Suedia indicele G-W a avut valori cuprinse între 0,922 în populaţia Orsa, Högståsen, cu urme uşoare de constrângere a mărimii populaţiei efective, şi 3,22 în populaţia Innanbäck, urmată de restul de 52 de populaţii toate înregistrând valori mai mari sau egale cu 1 ceea ce indică faptul că nu au fost detectate efecte ale derivei genetice de tip bottleneck. Analize spaţiale au fost realizat cu programele BAPS şi AIS. În urma analizei bayesiene a ADN-ului mitocondrial, populaţiile au fost grupate în două clustere principale şi unul secundar. 1. Primul cluster cuprinde populaţiile din exteriorul arcului Carpatic, respectiv Suceava, Vrancea şi Vâlcea, de pe teritoriul României şi populaţia din sud - vestul Ungariei, Fenyőfő. 24

2.Cel de-al doilea cluster cuprinde restul populaţiilor de pe teritoriul României situate în interiorul arcului Carpatic şi cea de-a doua populaţie din nord - vestul Ungariei, Velemer. Considerând modul de transmitere a ADN-ului cloroplastic pe cale paternă prin polen, fluxul de gene este mult mai mare, răspândirea polenului fiind astfel posibilă pe distanţe foarte mari, de zeci şi chiar sute de kilometri. Astfel, se poate observa existenţa unei diversităţi ridicate în cadrul populaţiilor analizate. Astfel, cele 15 populaţii au fost grupate în două clustere, în proporţie de 50:50 în fiecare cluster, fiind reprezentate pe hartă prin culoarea galben şi maro. Populaţiile din ambele ţări au fost analizate împreună pentru a evidenţia legătura genetică dintre acestea, fapt ce poate susţine ipoteza lui WILLIS van ANDEL (2004), Ungaria fiind considerată refugiu glaciar pentru această specie. 4.3. STRUCTURA GENETICĂ SPAŢIALĂ ÎN POPULAŢII NATURALE DE PIN SILVESTRU şi Suedia 4.3.1. Interpolarea genetică a populaţiilor de pin silvestru din România, Ungaria 4..3.1.1 Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial pentru populaţiile din România şi Ungaria Metoda interpolării a fost folosită pentru vizualizarea modelelor diversităţii genetice în conformitate cu terenul/relieful zonei analizate. Interpolarea realizată prin metoda Delanuay Triagulation sau teselaţia (WATSON PHILIPS, 1985; WATSON, 1992) a fost utilizată pentru a deduce distanţele genetice între locaţii pe o grilă suprapusă uniform pe întreaga zonă recoltată (Figura 4.14.). Urmărind procedeul interpolarii, a fost generată o figură 3D reprezentând distanţele genetice interpolate, unde X şi Y corespund coordonatelor geografice ale populaţiilor analizate, iar Z -distanţele genetice. 25

Cu alte cuvinte, s-a utilizat această metodă pentru a întării /confirma rezultatele obţinute cu ajutorul programului BAPS, ambele metode fiind bazate pe acelaşi principiu, şi anume de a grupa indivizii în funcţie de distanţa genetică dintre ei, dar şi de distanţa geografică. Metoda de interpolare folosită în acest program a fost metoda teselaţiei, luând la întâmplare indivizi ce se aseamănă din punct de vedere genetic şi poartă aproximativ aceleaşi alele, urmând ca ulterior sa fie grupaţi în clustere. Poate fi observată o grupare a populaţiilor aflate în exteriorul arcului Carpatic (Suceava, Vrancea, Vâlcea) cu populaţia din partea de sud - vest a Ungariei, Fenyőfő. De asemenea, populaţiile situate în interiorul arcului Carpatic au fost grupate cu populaţia din nord - vestul Ungariei, Velemer. Culoarea vârfurilor indică cât de asemănători respectiv cât de diferiţi sunt indivizii/populaţiile între ele (exemplu, populaţiile în culoarea albastru închis sunt asemănătoare din punct de vedere genetic, au alele comune; populaţiile în gri se aseamănă între ele însă sunt diferite de cele în albastru la nivelul alelelor) (Figura 4.14.). 4.3.1.2. Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial a populaţiilor din Suedia În mod aşteptat, rezultatele interpolării populaţiilor din Suedia după datele ADN-ului mitochondrial sunt în perfectă concordanţă cu rezultatele obţinute în programul BAPS, evidenţiind astfel faptul că populaţiile din nordul şi sudul ţării prezintă o diversitate mult mai ridicată şi o frecvenţă a alelelor mult mai mare în comparaţie cu populaţiile situate în partea centrală a ţării acestea fiind mult mai sărace din punct de vedere al diversităţii genetice şi frecvenţei alelice; rezultă o evidenţă clară a colonizării pinului silvestru în Suedia urmând două rute principale: una din refugii situate în partea de nord a Europei (cel mai probabil Rusia, PYHAJARVI şi colab., 2008, NAYDENOV şi colab.,2007) şi cea de-a doua rută colonizând partea de sud a ţării din refugii sud-estice cum ar fi: Balcani, Peninsula Italică, Ungaria, Cehia (CHEDDADI şi colab., 2006, ROBLEDO-ARNUNCIO şi colab., 2005). 26

Fig. 4.14. Interpolarea genetică a 15 populaţii de Pinus sylvestris din Romania şi Ungaria calculate pe baza variaţiei genetice la nivelul ADN-ului mitocondrial. Axele X şi Y reprezintă locaţia geografică a populaţiilor în interiorul reţelei de triangulaţie Delaunay (WATSON, 1992, BROUNS şi colab., 2003), iar înălţimile suprafeţei (axele Z) reprezintă media distanţelor genetice dintre indivizi. Fig. 4.14. Genetic Landscape Shape Interpolation analysis for 15 scots pine populations based on mitochondrial DNA variation. The X and Y axes show the geographic locations within a Delaunay triangulation network constructed among the sampled stands. Surface plots heights reflect average between interindividual genetic distances. Atât populaţiile din partea de nord a distribuţiei sunt corelate cu distanţa geografică, cât şi cele din partea de sud (Figura 4.15.), rezultând în vârfuri proeminente şi de aceeaşi culoare, în timp ce pentru populaţiile din zona centrală a ţării se observă o mai slabă interpolare prin lipsa diversităţii genetice. 27

Fig. 4.15. Interpolarea genetică a 54 populaţii de Pinus sylvestris din Ungaria calculate pe baza variaţiei genetice la nivelul ADN-ului mitochondrial. Axele X şi Y reprezintă locaţia geografică a populaţiilor în interiorul reţelei de triangulaţie Delaunay (WATSON 1992, BROUNS şi colab., 2003) iar înălţimile suprafeţei (axele Z) reprezintă media distanţelor genetice dintre indivizi. Fig. 4.15. Genetic Landscape Shape Interpolation analysis for 54 scots pine populations from Sweden based on mitochondrial DNA variation. The X and Y axes show the geographic locations within a Delaunay triangulation network constructed among the sampled stands. Surface plots heights reflect average between interindividual genetic distances. Rezultatele analizei bayesiene (Figura 4.12. din teză) confirmă ipoteza celor două rute de colonizare (tratate în Capitolul IV) din refugii situate în nord - estul Europei şi din refugii din zona de sud a Europei, acestea întâlnindu-se în partea centrală a Suediei. Rezultatele analizei bayesiene au fost susţinute şi de rezultatele analizei interpolării genetice şi autocorelaţiei spaţiale. Rezultatele testului Mantel indică o valoare negativă a coeficientului de corelaţie (r) între distanţa genetică şi distanţa geografică de - 0,0286 nesemnificativ statistic (Figura 28

4.18.a din teză), cum de altfel se aştepta luând în calcul aşezarea geografică şi orografia României. În mod asemănător, valoarea coeficientului de regresie (r) pentru datele ADNului cloroplastic, este de 0,09813, ceea ce indică o corelaţie redusă, nesemnificativă din punct de vedere statistic (Figura 4.18.b din teză). Se poate concluziona astfel faptul că diferenţierea genetică a populaţiilor de pe teritoriul României nu se datorează distanţei geografice dintre acestea, ci mai degrabă datorită orografiei - munţilor. În acest sens Carpaţii României au funcţionat ca o barieră naturală în faţa diversităţii genetice a populaţiilor de pin silvestru, respectiv în procesul de reproducere, (diseminare a seminţelor, polenului) şi a schimbului de gene între populaţii. Fig. 4.18.a. Corelaţia dintre distanţa genetică la nivelul ADNmt şi distanţa geografică (Testul Mantel) reprezentând populaţiile din România şi Ungaria Fig. 4.18.a.Correlation of genetic and geographical distances (Mantel test) showing Romanian and Hungarian scots pine populations Pentru populaţiile din Suedia, testul Mantel a prezentat un coeficient de corelaţie pozitivă între distanţa genetică şi distanţa geografică, r =0,1078, şi o probabilitate de a observa această corelaţie de P = 1,0000, în graficul de mai jos observându-se o uşoară creştere a diversităţii genetice odată cu creşterea distanţei geografice. O posibilă explicaţie 29

pentru această corelaţie este suprafaţa mare (în lungime) de pe care populaţiile au fost recoltate şi lipsa barierelor naturale, a munţilor, diversitatea genetică fiind astfel influenţată de un model geografic şi nu orografic (cazul României şi Ungariei). Deasemenea, indivizii aflaţi la o distanţă mai mare sunt mai diferiţi, (exemplu, indivizii din nord cu cei din sud) prezintă o diversitate genetică mai mare datorită celor două rute de colonizare, provenind din două refugii diferite, respectiv Nordul Europei (Rusia, Finlanda) şi una din sudul Europei (partea central-vestică, Balcani, Peninsula Italică). Fig. 4.19.a. Corelaţia dintre distanţa genetică, ADNmt, şi distanţa geografică (Testul Mantel) reprezentând popuaţiile din Suedia Fig. 4.19.a. Correlation of genetic and geographical distances (Mantel test)showing Swedishscots pine populations. În cazul analizei datelor ADN-ului cloroplastic, testul Mantel a fost nesemnificativ (Figura 4.19.b din teză), coeficientul de corelaţie înregistrând o valoare de r=,0118. Acest rezultat a fost estimat datorită transmiterii paternale a cloroplastelor printr-un flux mare de gene, respectiv de polen. 30

CAPITOLUL V DISCUŢII ŞI CONCLUZII PRIVIND EVOLUŢIA POSTGLACIARA A PINULUI SILVESTRU ŞI TENDINŢELE ACTUALE DE MIGRARE După cum indică rezultatele obţinute, structura genetică a populaţiilor analizate nu a fost afectată de translocările masive de materiale forestiere de reproducere de origine necunoscută de la începutul secolului al XIX-lea. Spre deosebire de arboretele regenerate artificial, arboretele naturale prezintă o structură genetică uniformă, formată din unul, maxim două haplotipuri (populaţii naturale posibile sunt considerate populaţiile Suceava, Vrancea şi Vâlcea). Apariţia a două haplotipuri este rezultatul migraţiei postglaciare a pinului în procesul de recolonizare, acestea întâlnindu-se de regulă în zonele de contact dintre două regiuni/subregiuni. Analiza distribuţiei haplotipurilor la nivel naţional se observă o structurare bine definită a populaţiilor, atât în ceea ce priveşte diversitatea genetică intrapopulaţională, cât şi specificitatea haplotipurilor din zonele geografice analizate. Valorile coeficientului de diferenţiere GST, fiind egale cu valorile coeficientului NST şi mai mari decât 0, evidenţiază de asemenea faptul că există o structură a populaţiilor analizate, însă fără influenţe filogeografice; este vorba aici mai mult de un model orografic care a dus la o structurare a populaţiilor de astăzi. Studierea evoluţiei postglaciare a pinului silvestru şi modalităţile de migrare a acestuia au evidenţiat originea diferită a populaţiilor din Bazinul Carpatic faţă de cea a populaţiilor din zona extracarpatică. Pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial, care au arătat o origine filogenetică diferită pentru arboretele situate în diferite areale (exteriorul şi interiorul arcului Carpatic), se poate recomanda acţiunea de conservare in situ, care trebuie să includă cel puţin o 31

populaţie pentru fiecare haplotip de ADN mitocondrial. Astfel, unităţile de conservare in situ nu trebuie să lipsească din următoarele populaţii: Suceava, care pe lângă haplotip prezintă şi condiţii speciale de adaptare-supravieţuire, creştere şi dezvoltare (pe sol tip turbă), urmată de populaţiile Vrancea şi Baia de Arieş (pe sol tip calcaros), şi populaţiile din interiorul arcului Carpatic spre exemplu: Topliţa, Hunedoara, Agnita, Caraş ce poartă ambele haplotipuri evidenţiate la nivelul ADN-ului mitocondrial. Metodele de genetică moleculară pot constitui un instrument de control al transferului de material genetic în practica silvică, acestea fiind utilizate cu succes pentru speciile de răşinoase în ţările vest europene; astfel, prin analize la nivelul ADN-ului mitocondrial se poate identifica dacă seminţele au fost într-adevăr recoltate din populaţiile Suceava, Vrancea sau Vâlcea, deoarece acestea trebuie să prezinte un singur haplotip, AA. Nu se poate afirma cu tărie că problema transferului de material genetic este direct corelată cu instabilitatea ecologică şi că exemplarele care prezintă haplotipurile străine prezintă şi o vitalitate redusă, este importantă însă menţinerea diversităţii naturale prin regenerarea naturală sau transfer de puieţi din populaţiile analizate în acest studiu. De asemenea faptul că nu au fost detectate efecte ale derivei genetice de tip bottleneck constituie un bun argument pentru alegerea unor entităţi de conservare in situ în care se găsesc câteva mii de exemplare din specia în cauză, pentru a diminua riscul pierderii unor variante genetice valoroase sub aspectul capacităţilor de adaptare şi supravieţuire. Aceste rezultate nu au putut fi comparate cu alte studii datorită faptului că până în prezent, în România, nici un alt studiu nu a fost condus pe această temă în populaţii de pin silvestru. În Suedia, situaţia se prezintă în felul următor: distribuţia haplotipului AA a fost aproximativ uniformă pe toată suprafaţa analizată, ceea ce indică faptul ca ar fi fost prima alelă care a colonizat Suedia (alela părinte). Pe de altă parte, distribuţia alelei AB a fost observată în cele mai multe exemplare din populaţiile din sudul Suediei şi mai puţin întâlnită sau chiar lipsind din partea de nord a ţării. Se poate astfel afirma că, în Suedia, colonizarea pinului silvestru a urmat două rute: una fiind partea de sud a Europei, a doua rută de 32