PNA ISH Detection Kit Code No. K5201

PNA ISH Detection Kit Code No. K5201 Utgåva 9 För in situ-hybridisering med fluorescein-konjugerade PNA-prober. Kitet innehåller reagenser för minst 40 tester*. * Antalet tester baseras på användning av 25 µl prober och 150 µl andra reagenser per objektglas. (128765-001) P04101SE_01_K520111-2/2015.08 s. 1/7

Innehållsförteckning Sida Avsedd användning... 2 Princip... 2 Reagenser A. Tillhandahållet material... 3 B. Nödvändigt material som inte ingår... 3 C. Förberedning av reagenser... 4 Försiktighetsåtgärder... 4 Förvaring... 5 Endags in situ-hybridisering för RNA-detektering med PNA-prober Rehydrering... 6 Förbehandling... 6 Hybridisering... 6 Stringent tvätt... 6 Detektering... 6 Kontrastfärgning och montering... 6 Anm. om proceduren... 7 Avsedd användning Endast för diagnostisk användning in vitro. PNA ISH Detection Kit är avsett för detektering av fluorescein-konjugerade peptidnukleinsyra (PNA)-prober hybridiserade till sitt mål-rna i cell- eller vävnadspreparat. Princip Det här kitet ger användaren alla reagenser som behövs för att utföra in situ-hybridisering för detektering av cellulärt RNA, förutom den specifika fluorescein-konjugerade PNA-proben. På ett vävnadssnitt eller cellutstryk (tillhandahållet av användaren) hybridiseras en fluoresceinkonjugerad peptidnukleinsyra (PNA)-prob till sitt mål-rna i enlighet med proceduren nedan. Hybridiseringen följs av en post-hybridiseringstvätt med en Stringent Wash Solution vid 55 C i 25 minuter. Alkaliskt fosfatas-konjugerat kanin-f(ab )-anti-fitc tillsätts därefter och provet inkuberas i rumstemperatur i 30 minuter följt av en tvätt. Användningen av antikropp-f(ab )-fragment garanterar att icke-specifik bindning till provet hålls på en minimal nivå. Substrat (enzymsubstrat, BCIP/NBT) tillsätts och provet inkuberas i rumstemperatur i 30-60 minuter följt av en tvätt. En lätt kontrastfärgning med hematoxylin är valfri. Slutligen monteras provet. Positiv färgning påvisas med mikroskop som en mörkblå/svart färg på stället för hybridisering. (128765-001) P04101SE_01_K520111-2/2015.08 s. 2/7

Reagenser A. Tillhandahållet material Vial 1 (2 ml) Vial 2 (0,5 ml) Vial 3 (0,5 ml) Vial 4 (25 ml) Vial 5 (6 ml) Vial 6 (6 ml) Proteinas K (x 10) 10 x koncentrerat proteinas K i 50 mmol/l Tris/HCl, 15 mmol/l natriumazid, ph 7,5. Det är mycket viktigt att vial 1 förvaras vid 2-8 C eftersom proteinas är självnedbrytbart. Negativ kontroll PNA-prob/FITC (färdig för användning) Slumpmässiga fluorescein-konjugerade PNA-prober i hybridiseringslösning. Innehåller 30 % formamid. Positiv kontroll PNA-prob/FITC (färdig för användning) Fluorescein-konjugerad PNA-prob riktad mot glyceraldehyd 3- fosfatdehydrogenas i hybridiseringslösning. Innehåller 30% formamid. Stringent Wash Solution (x 60) Stringent Wash Solution koncentrerad 60 x. Anti-FITC/AP (färdig att använda) Alkaliskt fosfatas-konjugerad antikropp mot fluorescein (affinitetsisolerad kanin-f(ab )). I 50 mmol/l Tris-buffert, 5 mmol/l MgCl 2, 0,25 mmol/l ZnCl 2, 3% BSA, stabilisator, konserveringsmedel, ph 7,5. Substrat (färdigt att använda) 5-bromo-4-kloro-3-indolylfosfat (BCIP) och tetrazoliumnitroblått (NBT). I 100 mmol/l Tris, 100 mmol/l NaCl, 50 mmol/l MgCl 2, konserveringsmedel, ph 9,0. Innehåller 1,7% N,N-dimetylformamid. TBS (Tris-buffrad koksaltlösning, ph 7,5) 3 folieförpackningar för vardera 1 l buffert, ph 7,5. Varje förpackning innehåller Tris-bas 1,4 g ± 4%, Tris/HCl 6,0 g ± 4%. 8,75 g NaCl ± 4%. Lös upp innehållet i varje folieförpackning i 1 l rent vatten. B. Nödvändigt material som inte ingår 1. Allmän laboratorieutrustning för histologiska procedurer. 2. Utrustning och specifik fluorescein-konjugerad PNA-prob som behövs för hybridiseringssteget. 3. Vattenbad justerat till 55 C. Skakningsmöjligheter behövs för stringent tvätt. 4. Dako Silanized Slides, kodnr. S3003. (128765-001) P04101SE_01_K520111-2/2015.08 s. 3/7

5. Dako Pen, kodnr. S2002 (valfri). 6. Rent vatten (t.ex. Milli-Q-vatten eller destillerat vatten). 7. Monteringsmedium, Dako Faramount, kodnr. S3025 eller Dako Glycergel, kodnr. C0563. C. Förberedning av reagenser TBS-buffert Lös upp innehållet i en TBS-folieförpackning i 1 L rent vatten. Stringent Wash Solution (brukslösning) Späd ut den volym som behövs av Stringent Wash Solution, vial 4, 60 gånger i rent vatten och förvärm till 55 C i ett vattenbad. Proteinas K (brukslösning) Späd ut den mängd som behövs av proteinas K, vial 1, 1:10 i TBS precis före användning. Förvara vialen åter vid 2-8 C omedelbart efter användning. (Se Anm. om proceduren, 3). Försiktighetsåtgärder 1. För professionella användare. 2. Vialer 2 och 3, de positiva och negativa kontroll PNA-proberna, innehåller 25-<50% formamid och 1-<3% natriumklorid. Vialer 2 och 3 är märkta: Fara H319 H360 P201 P202 P281 P280 P264 P308 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 P405 P501 Orsakar allvarlig ögonirritation. Kan skada fertiliteten eller det ofödda barnet. Inhämta särskilda instruktioner före användning. Använd inte produkten innan du har läst och förstått säkerhetsanvisningarna. Använd föreskriven personlig skyddsutrustning. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. Tvätta händerna grundligt efter användning. Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarhjälp. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 3. Vial 6, substratet, innehåller 1-<3% N,N-dimetylformamid och 1-<3% trometamol. Vial 6 är märkt: H360 H373 P201 P202 Fara Kan skada fertiliteten eller det ofödda barnet. Pode afectar os órgãos após exposição prolongada ou repetida. Inhämta särskilda instruktioner före användning. Använd inte produkten innan du har läst och förstått (128765-001) P04101SE_01_K520111-2/2015.08 s. 4/7

P280 P260 P314 P308 + P313 P405 P501 säkerhetsanvisningarna. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. Inandas inte ångor. Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarhjälp. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 4. Folieförpackningar med TBS (Tris-buffrad koksaltlösning, ph 7,5) innehåller 25-<50% trometamol och 25-<50% 2-amino-2-(hydroxymetyl)propan-1,3-diol hydroklorid. Folieförpackningar med TBS är märkt: Varning H319 H315 H335 P280 P271 P261 P264 P304 + P340 + P312 P302 + P352 + P362-2 + P363 P337 + P313 P405 P501 Orsakar allvarlig ögonirritation. Irriterar huden. Kan orsaka irritation i luftvägarna. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Används endast utomhus eller i väl ventilerade utrymmen. Undvik att inandas ångor. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. Vid obehag, kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. VID HUDKONTAKT: Tvätta med mycket tvål och vatten. Ta av nedstänkta kläder. Nedstänkta kläder ska tvättas innan de används igen. Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 5. Vial 4, Stringent Wash Solution, innehåller 3,6% trometamol. Vid produktkoncentrationer behövs ingen varningsetikett på trometamol. Säkerhetsdatablad (MSDS) finns tillgängligt för professionella användare på begäran. 6. Vialer 1 och 5, proteinas K och anti-fitc/ap, innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Natriumazid (NaN 3 ) är en mycket giftig kemikalie i ren form. Vid produktkoncentrationer, även om de inte klassificeras som farliga, kan natriumazid reagera med bly- och kopparrör och bilda ackumulerade högexplosiva metallazider. Vid kassering, spola med stora mängder vatten för att undvika att metallazider ackumuleras i rören. 7. Vial 5, anti-fitc/ap, innehåller material av animaliskt ursprung. Korrekt hantering bör iakttas, på samma sätt som för alla produkter från biologiska källor. Förvaring Reagenserna i kitet bör förvaras vid 2-8 C. Vialer 2 och 3 bör förvaras i mörker. Använd inte efter utgångsdatumet stämplat på vialen. Om reagenser förvaras under andra förhållanden än vad som angivits, måste användaren kontrollera förhållandena. Det finns inga självklara tecken som visar instabilitet i den här produkten. Därför bör positiva och negativa kontroller köras simultant med patientprover. Om oförväntad färgning upptäcks som inte kan förklaras av variationer i laboratorieutföranden och ett problem med produkten misstänks, kontakta vår serviceavdelning. (128765-001) P04101SE_01_K520111-2/2015.08 s. 5/7

Det är mycket viktigt att vial 1 förvaras vid 2-8 C och att exponering för rumstemperatur minimeras eftersom proteinas K är självnedbrytbart. Endags in situ-hybridisering för RNA-detektering med PNA-prober Proceduren har utvecklats för formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt. Reagenser i det här kitet, liksom hybridiserings- och tvättförhållanden, har justerats för att ge optimala resultat med Dakos fluorescein-konjugerade PNA-prober. En positiv vävnadskontroll bör köras simultant med prover. OBS: Alla inkubationer är i rumstemperatur om inte annat anges. Rehydrering Förbehandling Hybridisering Stringent tvätt Detektering Kontrastfärgning och montering Sänk ner objektglas med vävnadssnitt i xylen Sänk ner i 99% etanol Sänk ner i 96% etanol Sänk ner i rent vatten. Kärlet måste vara RNas-fritt (se Anm. om proceduren, 1) Ringa in prov med Dako Pen, kodnr. S2002 Sänk ner i rent vatten Placera objektglas i en fuktighetskammare (använd rena handskar) Späd nödvändig mängd proteinas K precis före användning, vial 1, 1:10 i TBS, t. ex. med 11 droppar från vial 1 (eller 500 µl) i 4,5 ml TBS (se Anm. om proceduren, 2) Tillsätt 150 µl spätt proteinas K till varje snitt (se Anm. om proceduren, 3). Förvara vial 1 åter vid 2-8 C omedelbart efter användning. Inkubera Sänk ner i rent vatten Sänk ner i 96% etanol Lufttorka objektglas Tillsätt 1-2 droppar fluorescein-konjugerad PNA-prob till vävnadssnittet. Tillsätt kontrollprober, vialer 2 och 3, till enskilda snitt Täck snitten med täckglas Placera objektglas i en fuktighetskammare (för att undvika uttorkning av snitten) Placera fuktighetskammaren i en inkubator (se Anm. om proceduren, 4) Förvärm Stringent Wash-brukslösning (vial 4 spädd 1:60) till 55 C i ett vattenbad Ta bort täckglas Sänk ner objektglas i den förvärmda Stringent Washbrukslösningen Justera objektglas till rumstemperatur genom en snabb nedsänkning i TBS Placera objektglas i en fuktighetskammare Tillsätt 2-3 droppar anti-fitc/ap, vial 5, till varje snitt Inkubera Ta bort antikroppen Sänk ner objektglas i TBS Sänk ner objektglas i rent vatten Placera objektglas i en fuktighetskammare Tillsätt 2-5 droppar substrat, vial 6, till varje snitt (se Anm. om proceduren, 5) Inkubera Ta bort substratet Sänk ner objektglas i kranvatten Kontrastfärga med haematoxylin om så önskas Montera med Dako Faramount, kodnr. S3025 eller Glycergel, kodnr. C0563 2 x 5 min 3 min 20-30 min ~ 10 s ~ 5 min 1½ tim. vid 55 C 25 min vid 55 C med skakning 10 s 30 min 2 x 1 min 30-60 min 5 min 5-10 s (128765-001) P04101SE_01_K520111-2/2015.08 s. 6/7

Anm. om proceduren 1. Från det här momentet i utförandet och fram till att hybridiseringen har utförts är det viktigt att undvika kontamination av snitten med RNaser och objektglasen bör endast vidröras med rena engångshandskar. Glasprodukter kan göras RNas-fria med en inkubation över natten vid 200 C. Andra metoder för inaktivering av RNas i lösningar beskrivs i Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (se också under Försiktighetsåtgärder). 2. Lös upp innehållet i en TBS-folieförpackning i 1 l rent vatten (RNas-fritt). 3. Det är mycket viktigt att vial 1 förvaras vid 2-8 C och att exponering för rumstemperatur minimeras eftersom proteinas K är självnedbrytbart. Optimal proteolytisk nedbrytning kan variera mellan olika vävnadsblock. För frusna snitt och cytospiner bör proteinas K spädas mer än 1:10. Som en riktlinje, späd 1:100-1:1000 beroende på fixering. 4. Vi har funnit att en inkubationstid på 1 ½ timme ger optimal sensitivitet. Emellertid kan tillfredsställande resultat erhållas genom att inkubationstiden minskas till 15-30 minuter beroende på mängden målanalyt i provet. 5. Vi har funnit att substratet (BCIP/NBT), som ingår i PNA ISH Detection Kit, ger den högsta sensitiviteten men också Dako New Fuchsin (kodnr. K0625) ger mycket tillfredsställande resultat. 6. Skaka inte vial 6 före användning. Substratet bildar ibland en fällning som kan påverka färgningsresultat om lösningen skakas. Tillverkad av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 Förk laring av symboler Katalognu mmer Temp eraturbegränsning Batchkod Tillve rkare In vitro diagnostisk medicinsk apparat Skydda från solljus (se förvaringsavsnittet) Tillsä tt vatten Fa ropikto gram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) L äs in stru ktioner na för a nvändning Innehållet räcker till <n > tester Använd före Fa ropikto gram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) (128765-001) P04101SE_01_K520111-2/2015.08 s. 7/7