QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok

januari 2004 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok IVD Σ 50 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit är ett allmänt system som använder QIAamp-teknologi för manuell isolering och rening av genomiskt DNA från humana helblodsprov för in vitro-diagnostiska ändamål. Kitet är inte till för användning med vävnads- eller faecesprov. Kitet är inte heller till för isolering och rening av nukleinsyror från bakterier, svampar eller parasiter och inte heller för isolering och rening av RNA. Kitets prestanda för isolering och rening av viralt DNA har inte utvärderats. Kitprestanda har inte heller utvärderats för buffycoat, odlade eller isolerade celler, prov tagna med provtagningspinne, torkade blodfläckar eller cellfria kroppsvätskor som likvor, plasma och urin. För in vitro-diagnostisk användning REF 61104 H B 1025818 01/2004 QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden, Tel: +49-2103-29-0 WWW.QIAGEN.COM

Varumärken: QIAGEN, QIAamp, QIAvac (QIAGEN-koncernen); BD Vacutainer (Becton, Dickinson & Co); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH); Monovette (Sarstedt AG & Co.); Vacuette (Greiner Bio-One). Registrerade namn, varumärken, etc, som används i detta dokument, även om de inte angetts som sådana, ska inte anses som oskyddade i lag. PCR-processen täcks av de amerikanska patenten 4,683,195 och 4,683,202 och motsvarande utländska som ägs av Hoffmann-La Roche AG. 2004 QIAGEN, alla rättigheter förbehållna. 2 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

Innehåll Kitinnehåll 4 Symboler 5 Förvaring 6 Kvalitetskontroll 6 Avsedd användning 6 Begränsningar för produktanvändning 6 Säkerhetsinformation 7 Inledning 9 Princip och utförande 9 Utrustning och reagenser som tillhandahålls av användaren 14 Viktiga anmärkningar 15 Viktiga moment före start av protokoll 15 Förberedning av reagenser och buffertar 15 Eluering av genomiskt DNA 16 Utbyte av och kvalitet på genomiskt DNA 16 Montering av vakuumsystemet QIAvac 24 Plus 17 Protokoll Isolering och rening av genomiskt DNA från blodprov med ett vakuumsystem 20 Isolering och rening av genomiskt DNA från blodprov med en mikrocentrifug 23 QIAGEN-distributörer 27 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 3

Kitinnehåll QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Katalognr. 61104 Antal provpreparat 50 QIAamp Mini QIAamp Mini Spin Columns COL 50 Spin med Wash Tubes (WT) (2 ml) ET Elution Tubes (1,5 ml) ELU TUBE 50 VC VacConnectors VAC CON 50 LT Lysis Tubes (1,5 ml) LYS TUBE 50 WT Wash Tubes (2 ml) WASH TUBE 3 x 50 AL Lysis Buffer* LYS BUF 12 ml AW1 Wash Buffer 1* (koncentrerad) WASH BUF 1 CONC 19 ml AW2 Wash Buffer 2 (koncentrerad) WASH BUF 2 CONC 13 ml AE Elution Buffer ELU BUF 25 ml PS Protease Solvent QPROT SOLV 2 ml QP QIAGEN Protease QPROT 1 vial CD H B 1 Handbook H B 1 * Innehåller guanidinhydroklorid. Inte kompatibel med desinfektionsmedel med blekmedel. För mer information, se sid. 7. Innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Resuspensionsvolym 1,2 ml. 4 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

Symboler Σ 50 IVD REF LOT MAT COMP VOL i Kitet innehåller reagens för 50 provpreparat Se information i handboken Använd före Medicinsk utrustning för in vitro-diagnostik Katalognummer Lotnummer Materialnummer Komponenter Volym Temperaturbegränsningar Laglig tillverkare Vid ankomst Viktig anmärkning Byt handskar efter protokollsteg med denna markering Öppna vid leverans. Förvara QIAamp Spin Columns vid 2-8 C ADD CONT LYOPH RCNS EtOH GuHCI SUBT Skriv ner aktuellt datum efter tillsats av etanol i flaskan Tillsätta Innehåller Frystorkad Rekonstituera Etanol Guanidinhydroklorid Subtilisin Leder till QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 5

Förvaring QIAamp Mini Spin Columns bör förvaras vid 2-8 C vid ankomst. Alla buffertar kan förvaras i rumstemperatur (15-25 C). Frystorkat QIAGEN Protease (QP) kan förvaras i rumstemperatur (15-25 C) i upp till två år utan prestandaförsämring. Rekonstituerat QIAGEN Protease (QP) är stabilt i ett år med förvaring vid 2-8 C. Rekonstituerad Wash Buffer 1 (AW1) och rekonstituerad Wash Buffer 2 (AW2) är stabila i ett år med förvaring i rumstemperatur (15-25 C). Kvalitetskontroll I enlighet med QIAGENs certifierade totala kvalitetshanteringssystem testas varje batch QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit mot förbestämda specifikationer för att garantera konstant produktkvalitet. Avsedd användning QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit är ett allmänt system som använder QIAampteknologi för manuell isolering och rening av genomiskt DNA från humana helblodsprov för in vitro-diagnostiska ändamål. Färskt eller fryst humant helblod behandlat med EDTA eller citrat, men inte heparin, från vanliga blodtagningssystem kan användas som prov. Produkten är avsedd för användning av professionella användare som laboratoriepersonal och läkare utbildade i molekylärbiologiska tekniker. Den är utformad för användning med efterföljande applikation som använder enzymatisk amplifiering eller annan enzymatisk modifiering av DNA följt av signaldetektion eller amplifiering. Ett diagnostiskt resultat genererat med provförberedningsmetoden tillsammans med en efterföljande diagnostisk analys bör tolkas med hänsyn tagen till andra kliniska undersökningar eller laboratorieundersökningar. För att minimera oregelbundenheter i diagnostiska resultat bör lämpliga kontroller användas för efterföljande applikationer. Begränsningar för produktanvändning Kitet är inte till för användning med vävnads- eller faecesprov. Kitet är inte heller till för isolering och rening av nukleinsyror från bakterier, svampar eller parasiter och inte heller för isolering och rening av RNA. Kitets prestanda för isolering och rening av viralt DNA har inte utvärderats. Kitprestanda har inte heller utvärderats för buffycoat, odlade eller isolerade celler, prov tagna med provtagningspinne, torkade blodfläckar eller cellfria kroppsvätskor som likvor, plasma och urin. 6 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

Säkerhetsinformation Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt materialsäkerhetsdatablad (MSDS) för mer information. Dessa finns online i behändigt och kompakt pdf-format på hemsidan www.qiagen.com/ts/msds.asp där man kan hitta, titta på och skriva ut MSDS för varje QIAGEN-kit och kitkomponent. VARNING: Tillsätt INTE blekmedel eller sura lösningar direkt till provprepareringsavfall. Lysis Buffer (AL) och Wash Buffer 1 (AW1) innehåller guanidinhydroklorid som kan bilda mycket reaktiva föreningar i kombination med blekmedel. Om vätska med dessa buffertar spills ut ska den torkas upp med lämpliga laboratorierengöringsmedel och vatten. Om den spillda vätskan innehåller potentiellt smittsamma ämnen ska ytorna först rengöras med laboratorie rengöringsmedel och vatten och därefter med 1 % (v/v) natriumhypoklorit. Om buffertflaskorna är skadade eller läcker ska man använda handskar och skyddsglasögon när flaskorna kastas för att undvika personlig skada eller skada på andra. QIAGEN har inte testat det flytande avfall som genereras av metoderna med QIAamp DSP DNA Blood Mini efter smittsammt restmaterial. Kontamination av det flytande avfallet med smittsammt restmaterial är mycket osannolikt men kan inte fullständigt uteslutas. Därför måste det flytande avfallet anses vara smittsamt och ska hanteras och kastas i enlighet med lokala säkerhetsbestämmelser. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 7

Följande risk- och säkerhetsfraser tillämpas på komponenterna i QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit: Lysis Buffer (AL) och Wash Buffer 1 (AW1) Innehåller guanidinhydroklorid: hälsoskadlig, irriterande. Risk- och säkerhetsfraser:* R22-36/38, S13-26-36-46 QIAGEN Protease (QP) Innehåller subtilisin: sensibiliserande, irriterande. Risk- och säkerhetsfraser:* R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46 24-timmars nödsituationsinformation Medicinsk nödsituationsinformation på engelska, franska och tyska kan erhållas 24 timmar om dygnet från: Giftinformationscentral Mainz, Tyskland Tel: +49-6131-19240 * R22: Hälsoskadlig vid förtäring, R36/38: Irriterande för ögon och hud, R37/38: Irriterande för andningssystem och hud, R41: Risk för allvarlig ögonskada, R42: Kan orsaka sensibilisering vid inandning, S13: Förvara ej i närheten av livsmedel, dryckesvaror och djurfoder, S22: Andas inte in damm, S24: Undvik hudkontakt, S26: I fall av ögonkontakt, spola omedelbart med mycket vatten och uppsök läkare, S36: Använd lämplig skyddsklädsel, S36/37/39: Använd lämplig skyddsklädsel, handskar och ögon/ansiktsskydd, S46: Vid förtäring, uppsök läkare omedelbart och visa denna behållare eller etikett. 8 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

Inledning QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit använder väletablerad teknologi för att ge ett snabbt och lätt sätt att isolera och rena genomiskt DNA från 200 µl helblodsprov. Renat DNA fungerar pålitligt i efterföljande applikationer som PCR. De enkla metoderna med QIAamp DSP DNA Blood Mini, som är avsedda för simultan bearbetning av flera blodprov, ger bruksfärdigt rent DNA. Metoderna är lämpliga för användning med färskt eller fryst helblod och blod som behandlats med citrat eller EDTA. Förseparation av leukocyter är inte nödvändigt. Metoderna kräver varken extraktion med fenol/kloroform eller fällning med alkohol och kräver minimal interaktion av användaren, vilket ger säker hantering av potentiellt smittsamma prov. Metoderna är utformade för att undvika korskontamination från prov till prov. Renat DNA är bruksfärdigt för PCR eller andra applikationer eller alternativt förvaring vid -20 C för senare användning. Princip och utförande Varje metod med QIAamp DSP DNA Blood Mini utgör fyra steg: Lysering av celler i blodprovet Bindning av genomiskt DNA i cellysatet till membranet i en QIAamp Mini Spin Column Tvättning av membranet Eluering av genomiskt DNA från membranet Denna handbok innehåller protokoll för två alternativa metoder med QIAamp DSP DNA Blood Mini: spinnmetoden som kräver en centrifug och vakuummetoden som kräver en centrifug och ett vakuumsystem (se flödesschema, sida 13). Prov Efter provtagning kan blodproven förvaras i rumstemperatur (15-25 C) i upp till sex timmar eller vid 2-8 C i upp till 24 timmar. För långtidsförvaring rekommenderas nedfrysning av prov vid -20 C eller -80 C. Kryofällningar som bildas vid upptining av frysta prov kommer att täppa till membranet i QIAamp Mini Spin Column. Om kryofällningar är synliga undvik att aspirera dem vid aspiration av provet. Effekterna av nedfrysning och upptining av blodprov på DNA-rening med QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit har fastställts (figur 1). QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 9

Nedfrysnings-/upptiningscyklers påverkan på DNA-utbyte från blod behandlat med EDTA 125 Utbyte normaliserat till färskt prov (%) 100 75 50 25 0 Färskt 1 2 3 Antal nedfrysnings-/upptiningscykler Figur 1 Blod behandlat med EDTA frystes och tinades upp till tre gånger och genomgick därefter rening av DNA med QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Det beräknade DNA-utbytet är normaliserat till utbytet av färskt prov (100 %). Varje stapel i grafen representerar resultat från 32 replikat (medelvärde ± standardavvikelse). Mängden renat DNA i metoderna med QIAamp DSP DNA Blood Mini beror på innehållet av vita blodkroppar i varje blodprov. Med spinn- eller vakuummetoden renas genomiskt DNA från 200 µl blodprov från friska givare. Flera olika primärrör och antikoagulanter kan användas för att ta blodprov för metoderna med QIAamp DSP DNA Blood Mini (tabell 1). Tabell 1. Relativa medelutbyten av DNA från blodprov tagna med olika primärrör och antikoagulanter Nominell Medelut- Primärrör Tillverkare Art. nr volym byte* BD Vacutainer 9NC BD 366007 9 ml 6,4 µg BD Vacutainer K3E BD 368457 10 ml 6,6 µg BD Vacutainer K2E BD 367864 6 ml 6,4 µg S-Monovette EDTA Sarstedt 02.1066.001 9 ml 6,5 µg S-Monovette CPDA1 Sarstedt 01.1610.001 8.5 ml 6,3 µg Vacuette K3E Greiner 455036 9 ml 6,5 µg Bio-One Vacuette 9NC Greiner 454382 2 ml 6,3 µg Bio-One * För varje primärrör bestäms medelutbytet från 11 triplikatprov. 10 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

Det linjära intervallet för DNA-utbyte med QIAamp DSP DNA Blood Minis vakuummetod har fastställts för blod från friska givare med vita blodkroppar på 3,8 x 106-1,34 x 107 celler/ml (figur 2). Det linjära intervallet för DNA-utbyte med QIAamp DSP DNA Blood Minis vakuummetod vid 200 µl elueringsvolym Utbyte (µg/sample) Figur 2 Antalet vita blodkroppar från friska givare fastställdes i intervallet 3,8 x 106-1,34 x 107 celler/ml. DNA renades från blodprov med vakuummetoden för QIAamp DSP DNA Blood Mini med 200 µl elueringsvolym. 87 triplikatprov bearbetades. Lysering av blodkroppar Prov lyseras under denatureringsförhållanden vid förhöjda temperaturer. Lysering utförs i närvaro av QIAGEN Protease (QP) och Lysis Buffer (AL). Bindning av genomiskt DNA till membranet i QIAamp Mini Spin Column För att optimera bindningen av genomiskt DNA till membranet i QIAamp Mini Spin Column tillsätts först etanol till lysatet. Varje lysat appliceras därefter till en QIAamp Mini Spin Column och genomiskt DNA adsorberas på kiselgelmembranet när lysatet transporteras igenom med vakuumtryck eller centrifugalkraft. Avlägsnande av restkontaminanter Medan genomiskt DNA kvarstår som bundet till membranet i QIAamp Mini Spin Column tvättas kontaminanter effektivt bort med hjälp av först Wash Buffer 1 (AW1) och därefter Wash Buffer 2 (AW2). QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 11

Eluering av rent genomiskt DNA Genomiskt DNA elueras från membranet i QIAamp Mini Spin Column med 50-200 µl Elution Buffer (AE). Eluerat DNA är bruksfärdigt för olika efterföljande analyser. Effekterna av elueringsvolym och eluatvolym som används i PCR på PCR-prestanda har fastställts (tabell 2). Tabell 2. Effekterna av elueringsvolym och eluatvolym som används i PCR på PCRprestanda Eluatvolym per 50 µl PCR* Elueringsvolym 2 µl 5 µl 10 µl 50 µl 100 % 100 % 100 % 100 µl 100 % 100 % 97 % 200 µl 100 % 100 % 100 % * Värdena visar andelen PCR-träffar och representerar medelvärdet av 48 prov. I förvaringstest med eluat som genererats med QIAamp DNA Blood Mini Kit, ett kit för allmän laboratorieanvändning och med identisk teknologi, visades att DNA som eluerats från QIAamp Mini Spin Columns i buffert AE var stabila i åtta år med förvaring vid antingen 5 C eller -20 C (figur 3). Emellertid pågår långtidsundersökningar om stabiliteten för eluat som erhållits med QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Långtidsstabilitet för DNA isolerat och renat med QIAamp Mini Spin Columns M 2 8 C 20 C M Figur 3 DNA renades med QIAamp DNA Blood Mini Kit, eluerat i 200 µl buffert AE och förvarat vid antingen 2-8 C eller -20 C i åtta år. DNA-prov analyserades på en etidiumbromid-färgad agarosgel. M: markör. 12 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

QIAamp DSP DNA Blood Mini-metoder Läs protokollen (sidan 20 och 23) noggrant före start Tillsätt 20 µl QP, 200 µl prov och 200 µl AL i LT Vortexblanda i 15 s Inkubera i 10 min (± 1 min) vid 56 C (± 1 C) Tillsätt 200 µl etanol Vortexblanda i 15 s Överför lysat till QIAamp Mini Spin Column Spinnmetod: centrifugera 1 min vid cirka 6000 x g Vakuummetod: applicera vakuum Spinnmetod: placera QIAamp Mini Spin Column i ny WT, tillsätt 500 µl AW1 och centrifugera 1 min vid cirka 6 000 x g Vakuummetod: tillsätt 750 µl AW1 och applicera vakuum Spinnmetod: placera QIAamp Mini Spin Column i ny WT, tillsätt 500 µl AW2 och centrifugera 1 min vid cirka 20 000 x g Vakuummetod: tillsätt 750 µl AW2 och applicera vakuum Placera QIAamp Mini Spin Column i WT Centrifugera 3 min vid cirka 20 000 x g Placera QIAamp Mini Spin Column i ET Tillsätt 50-200 µl AE och inkubera 1 min Centrifugera 1 min vid cirka 6 000 x g QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 13

Utrustning och reagenser som ska tillhandahållas av användaren Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt materialsäkerhetsdatablad (MSDS) tillgängligt från produktleverantören för mer information. För spinn- och vakuummetoderna Etanol (96-100 %) Pipetter* och pipettspetsar (det rekommenderas att pipettspetsar med aerosolbarriärer används för att undvika korskontamination) Engångshandskar Värmeblock* för lysering av prov vid 56 C (Eppendorf Thermomixer med termoblock för mikroprovrör på 1,5 ml rekommenderas) Mikrocentrifug* Mätcylinder (50 ml) Vortexblandare Endast för vakuummetod QIAvac 24 Plus-vakuumsystem (QIAvac 24 Plus, kat.nr 19413, QIAvac Connecting System, kat.nr 19419 och Vacuum Pump, kat.nr 84020) eller motsvarande allmänt laboratorievakuumsystem * För att garantera att prover bearbetas korrekt i QIAamp DSP DNA Blood Mini-metoderna rekommenderas att instrument (t.ex. pipetter och värmeblock) kalibreras i enlighet med tillverkarnas. Detta är ingen fullständig lista över leverantörer och inkluderar därför inte alla viktiga tillverkare av biologiprodukter. 14 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

Viktiga anmärkningar Viktiga moment före start av protokoll Kontrollera kitkomponenterna för möjlig skada efter mottagande av kitet. Om blisterförpackningar eller buffertflaskor är skadade, kontakta QIAGENs tekniska service eller den lokala distributören. I händelse av vätskespill, se Säkerhetsinformation (sida 7). Använd inte skadade kitkomponenter eftersom det kan leda till dålig kitprestanda. Byt alltid pipettspetsar mellan vätskeöverföringar. Användning av pipettspetsar med aerosolbarriärer rekommenderas för att undvika korskontamination. Alla centrifugeringssteg utförs i rumstemperatur (15-25 C). Använd alltid engångshandskar och kontrollera regelbundet att de inte kontaminerats av provmaterial. Kasta handskar om de blir kontaminerade. Öppna endast ett rör åt gången för att undvika korskontamination. Använd inte kitkomponenter från andra kit med kitet som för närvarande används såvida inte batchnumren är identiska. Undvik mikrobiell kontamination av kitreagenser. Arbete under laminära luftflödesförhållanden rekommenderas tills proverna har lyserats för att undvika kontamination från potentiellt smittsamma material. Detta kit bör endast användas av personal utbildad i in vitro-diagnostisk laboratoriepraxis. Förberedning av reagenser och buffertar Förberedning av QIAGEN Protease Tillsätt 1,2 ml Protease Solvent (PS) till vialen med frystorkat QIAGEN Protease (QP) och blanda noggrant. För att undvika bubblor blanda genom att vända vialen upp och ned flera gånger. Se till att QIAGEN Protease (QP) är fullständigt upplöst. i Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till Lysis Buffer (AL). Förberedning av Wash Buffer 1 Använd en mätcylinder och tillsätt 25 ml etanol (96-100 %) till flaskan med 19 ml koncentrat av Wash Buffer 1 (AW1). Förvara den rekonstituerade Wash Buffer 1 (AW1) i rumstemperatur (15-25 C). i Blanda alltid den rekonstituerade Wash Buffer 1 (AW1) genom att vända upp och ned på flaskan flera gånger innan proceduren startas. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 15

Förberedning av Wash Buffer 2 Använd en mätcylinder och tillsätt 30 ml etanol (96-100 %) till flaskan med 13 ml koncentrat av Wash Buffer 2 (AW2). Förvara den rekonstituerade Wash Buffer 2 (AW2) i rumstemperatur (15-25 C). i Blanda alltid den rekonstituerade Wash Buffer 2 (AW2) genom att vända upp och ned på flaskan flera gånger innan proceduren startas. Förberedning av Elution Buffer En flaska Elution Buffer (AE) tillhandahålls med kitet. Det rekommenderas att pipettspetsar med aerosolbarriärer används när Elution Buffer (AE) pipetteras från flaskan och att locket på flaskan omedelbart sätts på igen för att undvika kontamination. Förvara vid 2-8 C efter att en flaska Elution Buffer (AE) använts för första gången. Låt Elution Buffer (AE) anta rumstemperatur (15-25 C) före varje användning. i Elution Buffer (AE) innehåller konserveringsmedlet natriumazid som visar absorbans vid 260 nm. Därför ska man se till att blankprovet innehåller samma koncentration av natriumazid som eluatet när man kvantifierar DNA i eluatet med absorbansmätningar vid 260 nm, när man bestämmer renheten av DNA i eluatet med absorbansmätningar vid 260 nm och 280 nm eller när absorbans skannas i intervallet 220-250 nm. Om till exempel eluatet förbereds för absorbansmätningar med spädning av 50 µl eluat med 100 µl vatten, bör man förbereda blankprovet genom att späda 50 µl Elution Buffer (AE) med 100 µl vatten. Använd färskt destillerat vatten för spädningar. Eluering av genomiskt DNA Volymen av DNA eluerat från en QIAamp Mini Spin Column kan vara upp till 20 µl mindre än volymen av Elution Buffer (AE) som applicerats till kolonnen. Utbytesvolymen av eluatet beror på provets natur. Elution Buffer (AE) bör komma i jämvikt till rumstemperatur (15-25 C) innan den appliceras till kolonnen. Eluerat DNA samlas in i Elution Tubes (ET). Om DNA förvaras i upp till fyra veckor rekommenderas förvaring vid 2-8 C. För långtidsförvaring rekommenderas förvaring vid -20 C. Utbyte av och kvalitet på genomiskt DNA Utbytet av och kvalitet på isolerat genomiskt DNA är lämpligt för alla typer av efterföljande detektionsmetoder i molekylär diagnostik. Diagnostiska analyser bör utföras i enlighet med tillverkarnas anvisningar. 16 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

Montering av vakuumsystemet QIAvac 24 Plus Se till att QIAamp Mini Spin Column, VacConnector (VC) och VacValve ställs in korrekt (se figur 4). Figur 4 Montering av komponenterna i QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit för vakuumbearbetning av prov: 1: VacValve (tillhandahålls med vakuumsystemet) 3: QIAamp Mini Spin Column 2: VacConnector (VC) Om vakuummetoden används med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus rekommenderas märkning av Lysis Tubes (LT), Elution Tubes (ET) och QIAamp Mini Spin Columns i enlighet med schemat i figur 5 för att undvika sammanblandning av prov. Detta schema kan kopieras och märkas med provnamn. Användning av ett liknande schema rekommenderas om andra vakuumsystem eller spinnmetoden används. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 17

01 02 03 04 05 06 13 14 15 16 17 18 18 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

Datum: Operatör: Kör-ID: 07 08 09 10 11 12 19 20 21 22 23 24 Figur 5 Märkningsschema för Lysis Tubes (LT), Elution Tubes (ET) och QIAamp Mini Spin Columns för användning med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 19

Vakuumprotokoll Protokoll: Isolering och rening av genomiskt DNA från blodprov med ett vakuumsystem För isolering och rening av genomiskt DNA från 200 µl helblodsprov behandlade med EDTA eller citrat med ett vakuumsystem som QIAvac 24 Plus. Viktigt moment före start Metoden nedan ger anvisningar för bearbetning av ett enskilt blodprov. Upp till 24 prov kan emellertid bearbetas åt gången med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus. Saker som ska utföras före start Låt blodprov anta rumstemperatur (15-25 C) och se till att de är väl blandade. Om en fällning bildas i Lysis Buffer (AL) kan den lösas upp genom inkubering vid 56 C. Se till att Wash Buffer 1 (AW1), Wash Buffer 2 (AW2) och QIAGEN Protease (QP) har förberetts i enlighet med anvisningarna i Viktiga anmärkningar på sidan 15. Låt Elution Buffer (AE) anta rumstemperatur (15-25 C) för användning i steg 14. Ställ in ett värmeblock på 56 C för användning i steg 4. För in en VacConnector (VC) i varje lueradapter i vakuumsystemet för att undvika korskontamination. Se till att avfallsflaskan för vakuumsystemet är tom och att alla anslutningar är korrekta. Se den medföljande handboken för detaljer om vakuumsystemets funktion, särskilt underhåll. Utförande 1. Pipettera 20 µl QIAGEN Protease (QP) i Lysis Tubes (LT). i Kontrollera utgångsdatumet för det rekonstituerade proteaset före användning. 2. Tillsätt 200 µl blodprov till Lysis Tubes (LT). 3. Tillsätt 200 µl Lysis Buffer (AL) till Lysis Tubes (LT), stäng locket och blanda med pulserande vortexblandning i 15 s. För att garantera effektiv lysering är det viktigt att provet och Lysis Buffer (AL) blandas noggrant för att ge en homogen lösning. i Se till att korrekt volym av Lysis Buffer (AL) tillsätts genom försiktig pipettering eller genom användning av en lämplig pipett som Eppendorfs flerstegspipett eller motsvarande eftersom Lysis Buffer (AL) har hög viskositet. i Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till Lysis Buffer (AL). 20 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

4. Inkubera vid 56 C (± 1 C) i 10 min (± 1 min). 5. Centrifugera Lysis Tubes (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 6. Tillsätt 200 µl etanol (96-100 %) till Lysis Tube (LT), stäng locket och blanda noggrant med pulserande vortexblandning i 15 s. 7. Centrifugera Lysis Tube (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 8. För in QIAamp Mini Spin Column i VacConnector (VC) på vakuumsystemet. 9. Applicera hela lysatet från steg 6 försiktigt på QIAamp Mini Spin Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. i Om flera prov bearbetas ska endast ett Lysis Tube (LT) öppnas åt gången. 10. Sätt igång vakuumpumpen. Efter att lysatet har transporterats igenom QIAamp Mini Spin Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. i Om flera QIAamp Mini Spin Columns bearbetas på samma gång rekommenderas att VacValve för varje kolonn stängs efter att lysatet har passerat för att minska tiden för detta vakuumsteg. i Om lysatet inte fullständigt passerat genom membranet efter tio minuter, placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT), stäng locket och centrifugera vid cirka 6 000 x g (8 000 varv/min) i tre minuter eller tills lysatet fullständigt passerat. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett annat rent Wash Tube (WT) och fortsätt med steg 10 i protokollet på sidan 24. i Vakuumsystemets ventil bör användas för snabb utjämning av vakuumtrycket. 11. Applicera 750 µl Wash Buffer 1 (AW1) till QIAamp Mini Spin Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. Låt kolonnens lock vara öppet och stäng ventilen på vakuumsystemet. Efter att Wash Buffer 1 (AW1) har transporterats igenom QIAamp Mini Spin Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. 12. Applicera 750 µl Wash Buffer 2 (AW2) till QIAamp Mini Spin Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. Låt kolonnens lock vara öppet och stäng ventilen på vakuumsystemet. Efter att Wash Buffer 2 (AW2) har transporterats igenom QIAamp Mini Spin Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas och släppa ut vakuumet. Vakuumprotokoll QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 21

Vakuumprotokoll 13. Stäng locket på QIAamp Mini Spin Column, ta bort den från vakuumsystemet och kasta VacConnector (VC). Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT) och centrifugera med maximal hastighet (cirka 20 000 x g eller 14 000 varv/min) i tre minuter för att fullständigt torka membranet. i Uteslutning av torrcentrifugeringen kan leda till inhibering av efterföljande analys. 14. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Elution Tube (ET) och kasta Wash Tube (WT) med filtratet. Öppna locket till QIAamp Mini Spin Column försiktigt och applicera 50 till 200 µl Elution Buffer (AE) till membranets centrum. Stäng locket och inkubera i rumstemperatur (15-25 C) i en minut. Centrifugera vid cirka 6 000 x g (8 000 varv/min) i en minut för att eluera DNA. i Följ underhållsproceduren för vakuumsystemet efter att protokollet utförts (se handboken som medföljer vakuumsystemet för mer detaljer). 22 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

Protokoll: Isolering och rening av genomiskt DNA från blodprov med en mikrocentrifug För isolering och rening av genomiskt DNA från 200 µl helblodsprov behandlat med EDTA eller citrat med en mikrocentrifug. Viktigt moment före start Metoden nedan ger anvisningar för bearbetning av ett enskilt blodprov. Flera prov kan emellertid bearbetas samtidigt. Antalet beror på kapaciteten för den mikrocentrifug som används. Saker som ska utföras före start Låt blodproven anta rumstemperatur (15-25 C) och se till att de är väl blandade. Om en fällning bildas i Lysis Buffer (AL) kan den lösas genom inkubering vid 56 C. Se till att Wash Buffer 1 (AW1), Wash Buffer 2 (AW2) och QIAGEN Protease (QP) har förberetts i enlighet med anvisningarna i Viktiga anmärkningar på sidan 15. Låt Elution Buffer (AE) anta rumstemperatur (15-25 C) för användning i steg 15. Ställ in ett värmeblock på 56 C för användning i steg 4. Spinnmetod Utförande 1. Pipettera 20 µl QIAGEN Protease (QP) i ett Lysis Tube (LT). i Kontrollera utgångsdatumet för det rekonstituerade proteaset före användning. 2. Tillsätt 200 µl blodprov till Lysis Tube (LT). 3. Tillsätt 200 µl Lysis Buffer (AL) till Lysis Tube (LT), stäng locket och blanda med pulserande vortexblandning i 15 s. Det är viktigt att prov och Lysis Buffer (AL) blandas noggrant för att garantera effektiv lysering och ge en homogen lösning. i Se till att korrekt volym av Lysis Buffer (AL) tillsätts genom försiktig pipettering eller genom användning av en lämplig pipett som Eppendorfs flerstegspipett eller motsvarande eftersom Lysis Buffer (AL) har hög viskositet. i Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till Lysis Buffer (AL). 4. Inkubera vid 56 C (± 1 C) i 10 min (± 1 min). 5. Centrifugera Lysis Tube (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 6. Tillsätt 200 µl etanol (96-100 %) till Lysis Tube (LT), stäng locket och blanda noggrant med pulserande vortexblandning i 15 s. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 23

Spinnmetod 7. Centrifugera Lysis Tube (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 8. Applicera hela lysatet från steg 6 försiktigt på QIAamp Mini Spin Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. i Om flera prov bearbetas ska endast ett Lysis Tube (LT) öppnas åt gången. 9. Stäng locket på QIAamp Mini Spin Column och centrifugera vid cirka 6 000 x g (8 000 varv/min) i en minut. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT) och kasta röret med filtratet. i Om lysatet inte fullständigt passerat igenom membranet efter centrifugering vid cirka 6 000 x g (8 000 varv/min), centrifugera igen med maximal hastighet (cirka 20 000 x g eller 14 000 varv/min) i en minut. 10. Öppna QIAamp Mini Spin Column försiktigt och tillsätt 500 µl Wash Buffer 1 (AW1) utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. 11. Stäng locket på QIAamp Mini Spin Column och centrifugera vid cirka 6 000 x g (8 000 varv/min) i en minut. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT) och kasta röret med filtratet. 12. Öppna QIAamp Mini Spin Column försiktigt och tillsätt 500 µl Wash Buffer 2 (AW2) utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. 13. Stäng locket på QIAamp Mini Spin Column och centrifugera med maximal hastighet (cirka 20 000 x g eller 14 000 varv/min) i en minut. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT) och kasta röret med filtratet. 14. Centrifugera med maximal hastighet (cirka 20 000 x g eller 14 000 varv/min) i tre minuter för att fullständigt torka membranet. i Uteslutning av torrcentrifugeringen kan leda till inhibering av efterföljande analys. 15. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Elution Tube (ET) och kasta Wash Tube (WT) med filtratet. Öppna locket till QIAamp Mini Spin Column försiktigt och applicera 50 till 200 µl Elution Buffer (AE) till membranets centrum. Stäng locket och inkubera i rumstemperatur (15-25 C) i en minut. Centrifugera vid cirka 6 000 x g (8 000 varv/min) i en minut för ett eluera DNA. 24 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 25

26 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

QIAGEN-företag På bakre omslaget finns kontaktinformation för lokala QIAGEN-kontor. QIAGEN-distributörer Argentina Tecnolab S.A. Tel: (011) 4555 0010 Fax: (011) 4553 3331 E-post: info@tecnolab.com.ar Hemsida: www.tecnolab.com.ar Belgien/Luxemburg Westburg b.v. Tel: 0800-1-9815 Fax: (31) 33-4951222 E-post: info@westburg.nl Hemsida: www.westburg.nl Brasilien Uniscience do Brasil Tel: 011 3622 2320 Fax: 011 3622 2323 E-post: info@uniscience.com Hemsida: www.uniscience.com Cypern Scientronics Ltd Tel: 02-357 22 765416 Fax: 02-357 22 764614 E-post: a.sarpetsas@biotronics.com.cy Danmark VWR International A/S Tel: 43 86 87 88 Fax: 43 86 87 90 E-post: info@dk.vwr.com Hemsida: www.vwr.com Egypten Clinilab Tel: 52 57 212 Fax: 52 57 210 E-post: Clinilab@link.net Finland VWR International Oy Tel: (09) 804 551 Fax: (09) 8045 5200 E-post: info@fi.vwr.com Hemsida: www.vwr.com Grekland BioAnalytica S.A. Tel: (210)-640 03 18 Fax: (210)-646 27 48 E-post: bioanalyt@hol.gr Hemsida: www.bioanalytica.gr Indien Genetix Tel: (011)-2542 1714 eller (011)-2515 9346 Fax: (011)-2546 7637 E-post: genetix@nda.vsnl.net.in Israel Westburg (Israel) Ltd. Tel: 08-6650813/4 eller 1-800 20 22 20(tullfri) Fax: 08-6650934 E-post: info@westburg.co.il Hemsida: www.westburg.co.il Kina Gene Company Limited Tel: (852)2896-6283 Fax: (852)2515-9371 E-post: Hong Kong: info@genehk.com Peking: info_bj@genecompany.com Shanghai: info_sh@genecompany.com Chengdu: gene@public.cd.sc.cn Guangzhou: info_gz@genecompany.com Korea LRS Laboratories, Inc. Tel: (02) 924-86 97 Fax: (02) 924-86 96 E-post: webmaster@lrslab.co.kr Hemsida: www.lrslab.co.kr Kroatien INEL Medicinska Tehnika d.o.o. Tel: (01) 2984-898 Fax: (01) 6520-966 E-post: inel-medicinska-tehnika@zg.htnet.hr Malaysia RESEARCH BIOLABS SDN. BHD. Tel: (603)-8070 3101 Fax: (603)-8070 5101 E-post: biolabs@tm.net.my Hemsida: www.researchbiolabs.com Mexico Quimica Valaner S.A. de C.V. Tel: (55) 55 25 57 25 Fax: (55) 55 25 56 25 E-post: ventas@valaner.com Hemsida: www.valaner.com Nederländerna Westburg b.v. Tel: (033)-4950094 Fax: (033)-4951222 E-post: info@westburg.nl Hemsida: www.westburg.nl Norge VWR International AS Tel: 02 29 0 Fax: 22 90 00 40 E-post: info@no.vwr.com Hemsida: www.vwr.com Nya Zeeland Biolab Ltd Tel: (09) 980 6700 eller 0800 933 966 Fax: (09) 980 6788 E-post: biosciences@nzl.biolabgroup.com Hemsida: www.biolabgroup.com/nzl Österrike VWR International GmbH Tel: (01) 576 00 0 Fax: (01) 576 00 600 E-post: info@at.vwr.com Hemsida: www.vwr.com Polen Syngen Biotech Sp.z.o.o. Tel: (071) 351 41 06 eller 0601 70 60 07 Fax: (071) 351 04 88 E-post: info@syngen.pl Hemsida: www.syngen.pl Portugal IZASA PORTUGAL, LDA Tel: (21) 424 7312 Fax: (21) 417 2674 Singapore Research Biolabs Pte Ltd Tel: 62731066 Fax: 62734914 E-post: sales@researchbiolabs.com Slovakien BIO-CONSULT Slovakia spol. s.r.o. Tel/Fax: (02) 5022 1336 E-post: bio-cons@cdicon.sk Hemsida: www.bioconsult.cz Slovenien MEDILINE d.o.o. Tel: (01) 830-80-40 Fax: (01) 830-80-70 eller (01) 830-80-63 E-post: mediline@siol.net Spanien IZASA, S.A. Tel: (93) 902.20.30.90 Fax: (93) 902.22.33.66 E-post: suministros@izasa.es Sverige VWR International AB Tel: (08) 621 34 00 Fax: (08) 760 45 20 E-post: info@se.vwr.com Hemsida: www.vwr.com Sydafrika Southern Cross Biotechnology (Pty) Ltd Tel: (021) 671 5166 Fax: (021) 671 7734 E-post: info@scb.co.za Taiwan TAIGEN Bioscience Corporation Tel: (02) 2880 2913 Fax: (02) 2880 2916 E-post: taigen@ms10.hinet.net Thailand Theera Trading Co. Ltd. Tel: (02) 412-5672 Fax: (02) 412-3244 E-post: theetrad@samart.co.th Tjeckien BIO-CONSULT spol. s.r.o. Tel/Fax: (420) 2 417 29 792 E-post: info@bioconsult.cz Hemsida: www.bioconsult.cz Turkiet Medek Medikal Ürünler ve Saglik Hizmetleri A. S. Tel: (216) 302 15 80 Fax: (216) 302 15 88 E-post: makialp@med-ek.com Ungern Kasztel-Med Co. Ltd. Tel: (01) 385 3887 Fax: (01) 381 0695 E-post: info@kasztel.hu Hemsida: www.kasztel.hu Alla övriga stater QIAGEN GmbH, Germany QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 27

Australien QIAGEN Pty Ltd ABN 75 072 382 944 PO Box 25 Clifton Hill Victoria 3068 Beställningar 03-9489-3666 Fax 03-9489-3888 Teknisk Support 1-800-243-066 Frankrike QIAGEN S.A. 3 avenue du Canada LP 809 91974 COURTABOEUF CEDEX Beställningar 01-60-920-920 Fax 01-60-920-925 Teknisk Support 01-60-920-930 Italien QIAGEN S.p.A. Via Grosio, 10/10 20151 Milano Beställningar 02-33430411 Fax 02-33430426 Teknisk Support 02-33430414 Japan QIAGEN K.K. Forefront Tower II 13-1, Kachidoki 3 Chome Chuo-ku, Tokyo 104-0054 Telefon 03-5547-0811 Fax 03-5547-0818 Teknisk Support 03-5547-0811 Kanada QIAGEN Inc. 2800 Argentia Road Unit 7 Mississauga Ontario L5N 8L2 Beställningar 800-572-9613 Fax 800-713-5951 Teknisk Support 800-DNA-PREP (800-362-7737) Schweiz QIAGEN AG Auf dem Wolf 39 4052 Basel Beställningar 061-319-30-30 Fax 061-319-30-33 Teknisk Support 061-319-30-31 Storbritannien och Irland QIAGEN Ltd. QIAGEN House Fleming Way Crawley West Sussex, RH10 9NQ Beställningar 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Teknisk Support 01293-422-999 Tyskland QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 40724 Hilden Beställningar 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Teknisk Support 02103-29-12400 USA* QIAGEN Inc. 27220 Turnberry Lane Valencia CA 91355 Beställningar 800-426-8157 Fax 800-718-2056 Teknisk Support 800-DNA-PREP (800-362-7737) * Adress från och med 1:a februari 2004. Före detta datum, använd adressen QIAGEN Inc., 28159 Avenue Stanford, Valencia, CA 91355. WWW.QIAGEN.COM 1025818 01/2004