På utsidan av insidan

Nr 6 December 2001 Tidskrift för Institutet för biomedicinsk laboratorievetenskap På utsidan av insidan Tarmens slemhinnebarriär en komplex konstruktion Equalis användarmöte för primärvården

För ganska exakt ett år sedan disputerade biomedicinska analytikern Annkatrin Herrmann vid Lunds universitet på en avhandling med titeln Intestinal Mucins Soluble and Insoluble Problems. För Laboratoriet har hon här skrivit en sammanfattning av sitt forskningsområde. På utsidan av insidan Slemmet i tarmen Slemhinnorna, som avgränsar kroppens ytor mot en potentiellt "farlig" omgivning är uppbyggda av ett epitelcellskikt som vilar på ett bindvävslager. På många ställen täcks dessa ytor av en slemfilm mukusgelen som tillsammans med epitelcellerna utgör en barriär mellan utsida och insida och därmed en första försvarslinje mot skadliga ämnen och mikroorganismer. Slem Det är högmolekylära glykoproteiner - så kallade muciner som ger mukusgelen dess karaktäristiska egenskaper. De slembildande mucinerna består av många subenheter som binds samman med disulfidbryggor till stora, oligomera strukturer (1-3). De flexibla, trådliknande makromolekylerna bildar ett nätverk som hindrar mikroorganismer och stora partiklar att nå epitelcellerna samtidigt som små molekyler som nedbrytningsprodukter från födoämnen tillåts passera. Bryter man disulfidbryggorna löses gelen upp och bildandet av oligomera strukturer anses därför vara en förutsättning för att mucinerna skall kunna bilda en gel (1, 4, 5). Gelen bryts ner och återskapas kontinuerligt genom att nya muciner syntetiseras och utsöndras från specialiserade celler, så kallade bägarceller, i epitelcellslagret och/eller submukösa körtlar (figur 1). Förutom muciner innehåller gelen vatten, elektrolyter, lipider och proteiner. Sammansättningen av gelen och därmed dess egenskaper varierar mellan olika vävnader för att på bästa sätt anpassas till lokala fysiologiska krav. De övre luftvägarna täcks av en tunn Figur 1. Schematisk bild av tarmslemhinna. Mucinerna produceras i bägarcellerna där de lagras i sekretgranula innan de utsöndras på slemhinnan. gel som med hjälp av ciliernas rörelse lätt kan transporteras upp mot munhålan så att främmande partiklar i inandningsluften som fångats i gelen kan avlägsnas (6). Epitelcellslagret i magtarm-kanalen täcks av en tjock, kontinuerlig mukusgel som skyddar epitelcellerna mot saltsyra, gallsalter och proteolytiska enzymer (7). Muciner Mucinerna består av en central proteinkedja från vilken ett stort antal (mer än 50% av molekylvikten) oligosackarider radierar ut och de klassificeras därför som glykoproteiner. Mucinerna utmärker sig som en särskild grupp genom att innehålla många olika kolhydratstrukturer, samt den mycket höga molekylvikten. Kolhydratstrukturerna är anrikade till vissa delar av proteinkedjan, så kallade mucindomäner, där den täta glykosyleringen hindrar proteinkedjan från att vecka sig och gör att mucinet i denna del av molekylen liknar en flaskborste (8) (Figur 2). Proteinkedjan i mucindomänen består till stor del av aminosyrorna serin, treonin och prolin i specifika sekvenser som upprepas efter varandra i mucindomänen (på engelska kallas en sådan sekvens för en tandem repeat ; TR). Aminosyrasekvensen i en TR är unik för mucinet och antalet upprepningar skiljer mellan olika muciner. Genetisk polymorfism kan leda till att antalet LABORATORIET 6/2001 5

upprepningar av TR-sekvensen varierar mellan olika individer, vilket innebär att mucindomänen i ett mucin kan vara olika lång hos olika personer. Detta kallas på engelska för variable number of tandem repeats (VNTR). Mellan mucindomänerna finns nakna cysteinrika regioner av proteinkedjan som bl. a. binder samman subenheterna i de oligomera mucinerna (Figur 2). Fjorton olika muciner är hittills kända och dessa har fått beteckningen MUC1-4, MUC5AC, MUC5B, MUC6-9, MUC11-13 samt MUC16. Northern blot analyser samt in situ hybridisering visar att samma mucin kan förekomma i flera olika vävnader och att varje vävnad har sin specifika mucin-profil. I human tarm uttrycks exempelvis MUC1-4, MUC5B samt MUC11-13. Förutom de gelbildande mucinerna finns det muciner som är förankrade i cellmembranet med mucindomänen riktad mot utsidan. Mycket tyder på att dessa cellytemuciner stöts av och de kan därför antas skydda slemhinnan genom att binda skadliga ämnen och bakterier som avlägsnas då mucinet lossnar från cellen. Strukturen hos de membranbundna mucinerna antyder att de är involverade i cellsignalering. De fyra gelbildande mucinerna, MUC2, MUC5AC, MUC5B samt MUC6, uppvisar stora sekvenshomologier i molekylens N- och C-terminala del, dels mellan varandra men också till von Willebrands faktorn. De gener som kodar för de gelbildande mucinerna är lokaliserade efter varandra på kromosom 11p15.5 och man tror att de har uppkommit genom en duplicering av en ancestor gene som har innehållit de domäner av von Willebrand faktorn som sedan konserverats i mucinerna (9, 10). "Assembly" av gelbildande muciner Likheterna mellan von Willebrand faktorn, och de gelbildande mucinerna har lett till spekulationer om att mucinerna fogas samman och processas på ett sätt som liknar assemblyn av detta protein. Von Willebrand faktorn är ett glykoprotein som består av identiska subenheter (molekylvikt 250 kda) sammanfogade med disulfidbindningar till multimera strukturer i storleksordningen 20 Mda. Von Willebrand faktorn syntetiseras som en prekursor - pre-pro von Willebrand faktor och efter det att signalpeptiden klyvts bort Figur 2. Mucinerna består av en proteinkedja från vilken ett stort antal linjära eller grenade oligosackarider strålar ut. I de oligomera mucinerna binds många mucinsubenheter samman med disulfidbindningar till långa flexibla trådliknande strukturer. dimeriserar pro-faktorn via disulfidbryggor mellan molekylens C-terminala delar. I golgiapparaten bildas multimerer genom att dimererna bildar disulfidbryggor mellan de N-terminala delarna. Den 741 aminosyror långa pro-peptiden klyvs bort innan von Willebrand faktorn utsöndras (se figur 3). Den mogna von Willebrand faktorn kan lagras i speciella organeller, så kallade Weibel-Palade kroppar innan den utsöndras (11). När de gelbildande mucinerna studeras med hjälp av elektronmikroskopi uppträder de som långa flexibla trådar med längder som varierar mellan en och tio mikrometer, vilket tyder på att subenheterna kopplas ihop efter varandra likt vagnarna i ett tåg (12, 13). Flera studier visar att mucinerna kan bilda dimerer genom disulfidbryggor i molekylens C-terminala del (14). Man har vidare visat ett det sker en klyvning i den C-terminala delen av mucinet och i MUC2 har man observerat en klyvning även i den N-terminal delen (15). Det är ännu oklart i vilket skede av multimeriseringen av mucinerna den O-länkade glykosyleringen sker. Monomerer och dimerer av MUC2 som saknar O-länkade kolhydrater har påvisats, vilket förklaras genom en stegvis assembly som börjar med en dimerisering av mucinet, som sedan glykosyleras innan det multimeriseras vidare (16). Andra undersökningar hävdar att oligomerisering av muciner sker tidigt efter en initial O-länkad glykosy- 6 LABORATORIET 6/2001

Figur 3. Schematisk bild som visar hur von Willebrand faktorn fogas samman och processas. De N- och C-terminala delarna av MUC2 uppvisar stora sekvenshomologier med detta glykoprotein och det spekuleras därför att MUC2 sammanfogas och processas på ett sätt som liknar det för Von Willebrand faktorn. lering med GalNAc, men innan resterande kolhydrater i oligosackariden kopplas på (17). Alternativt sker en fullständig oligomerisering innan de O-länkade kolhydraterna adderas. Studier av muciner med hjälp av radioaktiv inmärkning visar att assembly av MUC2 är en långsam process och att det tar mer än 48 timmar för en oligomer molekyl att formeras (18). Mucinernas kolhydratstrukturer Storleken på oligosackariderna varierar från en till tjugo monosackarider och dessa bildar både linjära och grenade strukturer. Oligosackariderna innehåller ofta sialinsyra och/eller sulfat vilket gör att mucinet blir negativt laddat (1, 19). Strukturen bestäms ytterst av vilka kolhydratsyntetiserande enzym glykosyltransferaser som den mucinproducerande cellen har tillgång till. Detta är genetiskt bestämt och strukturen hos kolhydraterna styrs bl.a. av vilken blodgrupp individen tillhör. Uppsättningen av glykosyltransferaser varierar mellan mucinproducerande vävnader, men även mellan mucinproducerande celler inom samma vävnad. Skillnaderna i kolhydratsubstituering av ett och samma mucin är i vissa fall så stora att olika "glykoformer" av ett mucin kan urskiljas (20, 21). Den biologiska signifikansen av den strukturella mångfald som oligosackariderna uppvisar är inte känd. En trolig funktion för de korta kolhydratstrukturerna är att ge mucinet en utsträckt form, medan de mer komplicerade strukturerna kan ha specialiserade funktioner som att skydda slemhinnan från att koloniseras av bakterier. De flesta bakterier koloniserar kroppens slemhinnor genom att binda till kolhydratstrukturer. Genom att bakterien binds till kolhydratstrukturer i mukusgelen istället för till epitelcellerna förhindras den att kolonisera slemhinnan. Mångfalden av kolhydratstrukturer hos mucinerna innebär att det krävs en stor mängd olika kolhydratspjälkande enzymer för att bryta ner dessa, fler än en enskild bakterie kan producera. Tarm-muciner bildar ett olösligt glykoproteinkomplex genom en ny bindning Vi har utvecklat en teknik att isolera och rena de stora gelbildande mucinerna genom upprepade extraktioner i 6M guanidiniumklorid och täthetsgradientcentrifugeringar. I motsats till muciner från luftvägar, livmoderhals och mage som till största delen kan extraheras i 6M guanidiniumklorid, kan muciner från tarm inte bringas i lösning såvida de inte behandlas med ett reagens som bryter disulfidbryggorna (22). Vi har därför utvecklat en metod att isolera tarm-muciner som ett olösligt glykoproteinkomplex. Den största delen (80%) av tarm-mucinerna förekommer i detta komplex och det faktum att komplexet kan solubiliseras med hjälp av reduktion antyder att det är uppbyggt av subenheter sammanfogade med disulfidbryggor. Två olika mucindomäner kan isoleras från komplexet och en stor mängd olika oligosackarider förekommer i dessa domäner där de enkla och korta strukturerna utgör den övervägande delen (23). Genom att använda polyklonala antikroppar resta mot sekvenser i MUC2 har vi kunnat visa att detta är det dominerade mucinet i human tjocktarm samt att i stort sett allt MUC2 i tjocktarmen förekommer som ett olösligt komplex. Reducering av komplexet ger upphov till antal subpopulationer och rening följt av karaktärisering av dessa med biofysikaliska metoder visar att populationerna motsvarar olika stora oligomerer av MUC2 subenheter (24, 25). MUC2 bildar oligomerer med hjälp av disulfidbryggor som håller samman subenheterna, men utöver dessa bindningar finns det i det olösli- LABORATORIET 6/2001 7

ga komplexet således en "ny" bindning som inte bryts genom reduktion. En stor del av den C-terminal delen av MUC2 subenheten klyvs ofta bort som ett 120kDa stort fragment (25). Vi har idag ingen förklaring till varför MUC2 bildar ett olösligt komplex och vi vet heller inte vilken typ av bindning eller vilka delar av mucinet som är involverade i denna "nya" bindning. Möjligtvis ligger förklaringen till komplexets olöslighet just i den "nya" bindningen och man kan föreställa sig linjära oligomerer av MUC2 sammanhållna av disulfidbryggor som i sin tur tvärbinds med den "nya" bindningen så att ett "rutnät" bildas. I en sådan struktur skulle antalet tvärbindningar kunna vara ett sätt att skapa en tätare eller glesare gel. Att skapa ett olösligt glykoproteinkomplex kan vara naturens sätt att möta de krav på en högt specialiserad mukusgel som behövs i tarmen. På vilket sätt den C-terminala klyvningen påverkar funktionen återstår också att undersöka. Kan förändringar i muciner varna för sjukdomar i tarmen? Inom forskningen har man länge försökt hitta tidiga tecken på förändringar som uppstår i tarmslemhinnan i samband med sjukdomar som exempelvis tumörsjukdomar och inflammatorisk tarmsjukdom. Man har i dessa sammanhang också studerat förändringar som kan knytas till muciner. Ulcerös kolit karaktäriseras av en inflammatorisk process som börjar i den nedersta delen av tjocktarmen och det har föreslagits att förändringar i mucinuttryck och/eller sammansättningen i mukusgelen leder till att det bildas ett slem med en nedsatt skyddsfunktion. I det aktiva stadiet av sjukdomen ser man en minskning av antalet bägarceller och mukusgelen är tunnare jämfört med den man finner i den milt inflammerade tarmen. Förändringar i sammansättningen och längden av kolhydratstrukturerna i mucinerna har postulerats i samband med ulcerös kolit, men dessa har inte kunnat knytas till något specifikt mucin (26). Man har heller inte kunnat peka på några förändringar i mängden av de olika mucinerna i samband med sjukdomen jämfört med den normala tarmen. I samband med tjocktarmscancer har man hittat förändringar i mrna samt proteinnivåer med avseende på de muciner som förekommer i tarmen. Man har även i vissa cancerformer påvisat muciner som normalt inte finns i tarmen. Det har varit känt en längre tid att mucinernas kolhydratstrukturer förändras vid tjocktarmscancer, det är dåligt utrett om dessa inträffar tidigt eller om de kan associeras med att specifikt mucin (27). Vi har isolerat MUC2 från normal tjocktarmsslemhinna samt från tumörer hos individer med tjocktarmscancer och med hjälp av antikroppar resta mot olika kolhydratstrukturer studerat om det föreligger skillnader i kolhydratsubstitutionen mellan MUC2 från tjocktarmscancer och den intilliggande, till synes normala vävnaden. Kolhydratstrukturen, sialyl-tn, som inte kan påvisas på MUC2 från normal slemhinna, återfinns på MUC2 i alla de tumörprover vi hittills studerat. Detta är det första exemplet på att ett definierat oligomert mucin är substituerat med en "felaktig" kolhydratstruktur i samband med tjocktarmscancer (28). Slutsatser Glykoproteinerna som utgör basen i slemhinnebarriärens skyddsfunktion är stora och komplexa strukturer som hittills har varit svåra att isolera och studera. Utveckling av denna speciella nisch inom "matrixbiologin", som fokuserar på gränsytan mellan kroppens insida och utsida, har därför brottats med stora metodologiska problem. Vi har utvecklat tekniker för att identifiera muciner både i provrör och på vävnadssnitt samt för att studera deras struktur och egenskaper. Detta är en förutsättning för en ökad förståelse hur skyddet kan upprätthållas och de patologiska tillstånd som kan uppstå då skyddet sviktar samt hitta eventuella markörer för att på ett tidigt stadium upptäcka detta. ANNKATRIN HERRMANN Referenser 1. Allen, A. (1981) Structure and function of gastroointestinal mucus., Raven Press, New York. 2. Neutra, M. R., and Forstner, J. F. (1987) in Physiology of the Gastrointestinal Tract (Johnson, L. R., Ed.), pp. 975-1009 RavenPress, Ltd, New York. 3. Sellers, L. A., Allen, A., Morris, E. R., and Ross-Murphy, S. B. (1988) Carbohydr. Res. 178, 93-110. 4. Allen, A. (1983) Trends Biochem. Sci 8, 196-173. 5. Forstner, J. F., Jabbal, I., Qureshi, R., Kells, D. I., and Forstner, G. G. (1979) Biochem. J. 181, 725-732. 6. Reid, R. C., Bhaskar, K., and Coles, S. J. (1982) Adv. Exp. Med. Biol 144, 369-391. 7. Sellers, L. A., Allen, A., Morris, E. R., and Ross-Murphy, S. B. (1987) Biorheology 24, 615-623. 8. Jentoft, N. (1990) Trends Biochem. Sci. 15, 291-294. 9. Desseyn, J. L., Buisine, M. P., Porchet, N., Aubert, J. P., Degand, P., and Laine, A. (1998) J. Mol. Evol. 46, 102-106. 10. Buisine, M. P., Desseyn, J. L., Porchet, N., Degand, P., Laine, A., and Aubert, J. P. (1998) Biochem. J. 332, 729-738. 11. Ruggeri, Z. M., and Ware, J. (1993) Faseb. J. 7, 308-316. 12. Sheehan, J. K., Oates, K., and Carlstedt, I. (1986) Biochem. J. 239, 147-153. 13. Sheehan, J. K., Brazeau, C., Kutay, S., Pigeon, H., Kirkham, S., Howard, M., and Thornton, D. J. (2000) Biochem. J. 347, 37-44. 14. Perez-Vilar, J., Eckhardt, A. E., and Hill, R. L. (1996) J. Biol. Chem. 271, 9845-98450. 15. Khatri, I. A., Forstner, G. G., and Forstner, J. F. (1998) Biochem. J. 331, 323-330. 8 LABORATORIET 6/2001