Dako DuoCISH Kod SK108 Andra utgåvan Detta kit innehåller tillräckligt med reagens för 20 tester. För manuell användning eller automatisk användning på Dako Autostainer-instrument. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 1/15
Innehåll Sid. Avsedd användning... 3 Bakgrund... 3 Procedurprincip... 3 Reagenser... 4 Medföljande material... 4 Material som behövs, men inte ingår... 4 Försiktighetsåtgärder... 5 Förvaring... 6 FISH-procedur före Dako DuoCISH... 6 BRUKSANVISNING... 6 A. Reagensberedning... 6 A.1 Wash Buffer... 6 A.2 Red Chromogen Solution... 6 A.3 Blue Chromogen Solution... 6 A.4 Kontrastfärg... 7 B. Färgningsprocedur... 7 B.1 Proceduranmärkningar för manuell färgningsprocedur... 7 B.2 Manuellt färgningsprotokoll... 7 B.3 Proceduranmärkningar för automatisk färgningsprocedur (Dako Autostainer)... 8 B.4 Automatiserat färgningsprotokoll... 8 Kvalitetskontroll... 10 Användning av ljusfältsmikroskop... 10 Tolkning av färgningen... 10 Signalräkningsguide för genamplifieringsanalys... 11 Signalräkningsguide för translokationsanalys av delad signal... 11 Begränsningar... 11 Felsökning... 12 Förklaring av symboler... 15 (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 2/15
Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Dako DuoCISH är avsedd för kromogen visualisering i två färger av signaler som erhållits med Dako Texas Red- och FITC-märkta FISH-prober som utformats för detektion av genamplifikationer, deletioner och translokationer. Dako DuoCISH genererar röda och blåa kromogena signaler på samma vävnadssnitt för bedömning med ljusfältsmikroskopi. Kitet är avsett för manuell användning eller automatisk användning på Dako Autostainerinstrument. Bakgrund Dako DuoCISH är optimerat för kromogen visualisering i två färger av signaler som erhålls med Dako Texas Red- och FITC-märkta FISH-prober som utformats för detektion av genamplifikationer, deletioner och translokationer. Dako DuoCISH genererar kontrasterade och välbalanserade röda och blåa signaler på samma vävnadssnitt - som identifieras med ljusfältsmikroskopi vid låg förstoring och räknas vid hög förstoring. Dako DuoCISH innehåller alla nyckelreagenser, dvs. Peroxidase Block, CISH Antibody Mix, röda och blåa kromogener och substratbuffertar som är nödvändiga för att utföra 20 visualiseringar som motsvarar Dako FISH-analyserna med 20 tester. Denna procedur kan utföras manuellt eller automatiskt med användning av Dako Autostainer-instrument. Procedurprincip Dako DuoCISH innehåller de nyckelreagenser som krävs för att fullborda en immunhistokemisk färgningsprocedur i två steg för att detektera Dako Texas-Red- och FITC-märkta FISH-prober. Det sista steget i FISH-proceduren utesluts och i stället nedsänks vävnadsproverna i Dako Wash Buffer. Det första steget i Dako DuoCISH -proceduren är att blockera endogent peroxidas med bruksfärdigt Peroxidase Block, följt av inkubering med bruksfärdig CISH Antibody Mix, bestående av anti-fitc konjugerat med pepparrotsperoxidas (HRP) och anti-texas Red konjugerat med alkaliskt fosfatas (AP). Därefter inkuberas vävnadsproverna med Red Chromogen Solution, följt av inkubering med Blue Chromogen Solution. Den enzymatiska omvandlingen av de tillsatta kromogenerna resulterar i att synliga röda och blåa slutprodukter bildas på antigenplatsen (FISH-prober). Sålunda omvandlas de röda fluorescerande signalerna till röda, kromogena signaler och de gröna fluorescerande signalerna omvandlas till blåa, kromogena signaler. Proverna motfärgas sedan och förses med täckglas. Resultaten utvärderas med användning av ljusfältsmikroskop. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 3/15
Reagenser Medföljande material Materialen som anges nedan är tillräckliga för 20 tester. Antalet tester är baserat på användning av 200 µl reagens per objektglas. Kitet ger tillräckligt med material för 10 enskilda färgningskörningar. Flaska 1 Flaska 2 Flaska 3 Flaska 4 1 x 6 ml 1 x 6 ml 1 x 10,5 ml 1 x 7 ml Peroxidase Block Bruksfärdigt. 3 % väteperoxid innehållande 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ). CISH Antibody Mix Bruksfärdig. Blandning av pepparrotsperoxidaskonjugerad antikropp mot fluorescein och alkaliskt fosfataskonjugerad antikropp mot Texas Red, levererad i 50 mmol/l Tris-buffert med stabiliseringsmedel och konserveringsmedel, ph 7,5. Red Substrate Buffer Substratbuffert för spädning av Red Chromogen. Blue Substrate Buffer Substratbuffert för spädning av Blue Chromogen. Flaska 5 1 x 110 µl Flaska 6 1 x 550 µl Red Chromogen Skall spädas i Red Substrate Buffer (flaska 3). Blue Chromogen Skall spädas i Blue Substrate Buffer (flaska 4). Material som behövs, men inte ingår Dako Wash Buffer, kod S3006 Dako Hematoxylin, kod S3301 Permanent monteringsmedel (inte alkohol- och xylenbaserat) (t.ex. Tissue-Mount från Sakura) Vattenhaltigt monteringsmedel (t.ex. Aquatex från Merck eller EMD Chemicals (USA)) Ljusfältsmikroskop Täckglas Destillerat eller avjoniserat vatten Luddfri duk Andra material som krävs för att utföra manuell färgning innefattar följande: Fuktkammare Färgningskärl eller -bad Timer (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 4/15
Andra material som krävs för att utföra automatisk färgning på Dako Autostainer/ Autostainer Plus-instrument innefattar följande: Autostainer Reagent Vials (kod S3425) Andra material som krävs för att utföra automatisk färgning på Dako Autostainer Plus Link-instrument innefattar följande: Reagent Bottles, User-Fillable: 12 ml (kod SK201) eller 5 ml (kod SK200) Försiktighetsåtgärder 1. För in vitro-diagnostik. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3 ), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan NaN 3, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering så att inte metallazider ackumuleras i avloppet. 4. Flaska 5: Reagenset innehåller Fast Red KL Salt och är märkt: Giftigt R45 Kan ge cancer. S35 Produkt och förpackning skall oskadliggöras på säkert sätt. S45 Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten. S53 Undvik exponering - begär specialinstruktioner före användning. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner (enligt EU-direktivet 94/33/EC). 5. Flaska 6: Reagenset innehåller 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihydro-3,3-dimetyl-1- (4-sulfobutyl)-2H-indol-2-yliden]-1-propenyl]-3,3-dimetyl-1-(4-sulfobutyl)-3H-indolium, ter trifluoroacetat. Varning: Denna produkt innehåller en substans som ännu inte testats fullständigt. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner (enligt EU-direktivet 94/33/EC). 6. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. 7. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering. 8. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögonen och huden. 9. Oanvänd lösning måste kasseras enligt lokala och statliga föreskrifter. 10. Dako DuoCISH -reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i förlust av prestanda. 11. Andra inkubationstider och temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. 12. Minimera mikrobiell kontaminering av reagenserna för att undvika felaktiga resultat. 13. Före beredning av Blue Chromogen Solution skall Blue Chromogen (flaska 6) blandas väl för att säkerställa att kromogenen löses upp helt. 14. Det rekommenderas att man följer standardproceduren för service och underhåll av Dako Autostainer-instrumentet. 15. Personer med blå/röd färgblindhet bör poängsätta proverna med försiktighet. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 5/15
Förvaring Förvara reagenserna vid 2 8 C i mörker. Får ej fry sas. Användaren måste validera reagensprestanda om reagensernas förvaringsförhållanden avviker från vad som specificerats i produktbladet. Använd inte kitet efter det utgångsdatum som anges på förpackningen. Kromogener och substratbuffertar kan påverkas negativt om de exponeras för värme. Lämna inte dessa reagenser i rumstemperatur. Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Det är därför viktigt att utvärdera normala celler i det analyserade provet Kontakta vår Tekniska Support om oväntad färgning observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara problem med Dako DuoCISH. FISH-procedur före Dako DuoCISH Dako DuoCISH appliceras på vävnadssnitten som färgats med Dako FISH-prober. Det rekommenderas att användaren är förtrogen med respektive Dako FISHprocedur/användarhandbok. För att utföra Dako DuoCISH utesluts det sista steget i Dako FISH-färgningsproceduren (dehydrering, lufttorkning och montering av objektglasen med Fluorescence Mounting Media) och i stället nedsänks vävnadsproverna i spädd Dako Wash Buffer (kod S3006), se avsnittet BRUKSANVISNING, A.1 Wash Buffer. BRUKSANVISNING A. Reagensberedning Följande reagenser måste beredas före färgningen: Alla reagenser (förutom Red Chromogen, flaska 5) skall anta jämvikt vid rumstemperatur (20 25 C) före reagensberedning. A.1 Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd av Dako Wash Buffer (10x) (kod 3006), 1:10 med användning av destillerat eller avjoniserat vatten för den planerade färgningsproceduren. Oanvänd spädd lösning kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera lösningen om den är grumlig. A.2 Red Chromogen Solution Vänd eller blanda lösningen och centrifugera en kort stund innan en alikvot av Red Chromogen tas från flaska 5. Bered en tillräcklig mängd Red Chromogen Solution, men minst 1 ml. Följande procedur ger 1,01 ml Red Chromogen Solution: Överför 1 ml Red Chromogen-buffert från flaska 3 till en tom, lämplig flaska. Tillsätt 10 µl Red Chromogen från flaska 5. Blanda väl. OBS! Den beredda Red Chromogen Solution bör användas inom 20 minuter. För bästa resultat skall Red Chromogen Solution beredas precis före användning. A.3 Blue Chromogen Solution Blanda kromogenen väl i 10 sekunder, t.ex. med en vortexblandare, innan en alikvot av Blue Chromogen tas från flaska 6 och centrifugera en kort stund för att avlägsna vätska från locket. Fortsätt sedan omedelbart med beredningen av Blue Chromogen Solution. Bered en tillräcklig mängd av Blue Chromogen Solution för hela körningen. Följande procedur ger 1,07 ml Blue Chromogen Solution: För att bereda 1,075 ml Blue Chromogen Solution ska 1 ml Blue Substrate Buffer överföras från flaska 4 till en tom, lämplig flaska. Tillsätt 75 µl välblandad Blue Chromogen från flaska 6. Blanda väl. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 6/15
Om en mindre volym av Blue Chromogen Solution krävs skall komponenterna minskas proportionerligt dvs. för att bereda 0,2 ml Blue Chromogen Solution skall 15 µl välblandad Blue Chromogen från flaska 6 tillsättas 200 µl Blue Substrate Buffer från flaska 4. OBS! Det rekommenderas att bereda Blue Chromogen Solution minst 30 minuter före användning. Blue Chromogen Solution bör användas inom 8 dagar (vid förvaring vid 2 8 ºC i mörker). A.4 Kontrastfärg Späd en tillräcklig mängd av Dako Hematoxylin (kod S3301), 1:5 med användning av destillerat eller avjoniserat vatten för den planerade färgningsproceduren. Oanvänt spätt hematoxylin kan förvaras vid rumstemperatur (20 25 C) i en dag. För manuell färgning, fortsätt till B.1 Manuell färgningsprocedur. För automatisk färgning, fortsätt till B.3 Automatisk färgningsprocedur. B. Färgningsprocedur B.1 Proceduranmärkningar för manuell färgningsprocedur Användaren skall läsa dessa instruktioner noggrant och bekanta sig med alla komponenter före användning (se Försiktighetsåtgärder). Alla reagenser (förutom Red Chromogen, flaska 5) skall anta jämvikt vid rumstemperatur (20 25 C) före användning. Likaså skall alla inkub eringar utföras vid rumstemperatur (20 25 C). Se till att vävnadssnitten inte torkar ut under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. B.2 Manuellt färgningsprotokoll Utförs vid rumstemperatur (20 25 C) Steg 1: Tvättning I stället för att utföra det sista steget i Dako FISH-färgningen (dehydrering, lufttorkning och montering av objektglasen med Fluorescence Mounting Media) nedsänks objektglasen för CISH- färgningen i spädd Wash Buffer (se A.1 Wash Buffer) i 3 minuter. Steg 2: Peroxidase Block Slå bort överskottsbuffert. Torka försiktigt runt provet med en luddfri duk för att avlägsna all återstående vätska och för att hålla reagenserna inom det föreskrivna området. Täck provet med 200 µl Peroxidase Block. Inkubera i 5 (±1) minuter. Placera i ett bad med spädd Wash Buffer i 3 minuter. Upprepa en gång i färsk Wash Buffer. Steg 3: CISH Antibody Mix Slå bort överflödig buffert och torka objektglasen enligt beskrivning ovan. Täck provet med 200 µl CISH Antibody Mix. Inkubera i 30 (±1) minuter i en fuktkammare. Placera i ett bad med spädd Wash Buffer i 3 minuter. Upprepa en gång i färsk Wash Buffer. Steg 4: Red Chromogen Solution (bered precis före användning) Slå bort överflödig buffert och torka objektglasen enligt beskrivning ovan. Täck provet med 200 µl Red Chromogen Solution. Inkubera i 10 minuter i en fuktkammare. Placera i ett bad med spädd Wash Buffer i 3 minuter. Upprepa en gång i färsk Wash Buffer. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 7/15
Steg 5: Blue Chromogen Solution (bered 30 minuter före användning) Slå bort överflödig buffert och torka objektglasen enligt beskrivning ovan. Täck provet med 200 µl Blue Chromogen Solution. Inkubera i 10 minuter i en fuktkammare. Placera i ett bad med spädd Wash Buffer i 3 minuter. Upprepa en gång i färsk Wash Buffer. Steg 6: Motfärg Placera objektglasen i hematoxylin (Dako Hematoxylin (kod S3301) spätt 1:5) i 5 minuter. Skölj med Wash Buffer och placera vävnadssnitten i ett färskt bad med Wash Buffer i minst 5 minuter för att blåfärga hematoxylinmotfärgen. Skölj noggrant med destillerat eller avjoniserat vatten. Lufttorka snitten eller torka snitten i 30 minuter vid 37 C på Dako Hybridizer. Låt snitten svalna till rumstemperatur före montering. Steg 7: Montering Efter att vävnadsproverna fått lufttorka fullständigt skall de täckas med permanent (inte alkohol- /inte xylenbaserat) eller vattenhaltigt monteringsmedel. För permanent montering kan t.ex. Tissue-Mount från Sakura användas. För vattenhaltig montering kan t.ex. Aquatex från Merck eller EMD Chemicals (USA) användas. OBS! Proverna får inte exponeras för alkohol eller xylen före montering. Detta kan äventyra reaktionens känslighet och resultera i negativa effekter på färgningen. B.3 Proceduranmärkningar för automatisk färgningsprocedur (Dako Autostainer) Alla inkuberingar skall utföras vid rumstemperatur (20 25 C). I stället för att utföra det sista steget i Dako FISH-färgningen (dehydrering, lufttorkning och montering av objektglasen med Fluorescence Mounting Media) laddas objektglasen för Dako DuoCISH -metoden på Autostainer. För automatisk färgning på Dako Autostainer-/Autostainer Plus-instrument bör reagenserna (se Reagensberedning) flaska 1 (Peroxidase Block) och flaska 2 (Antibody Mix) beredas i Dako Autostainer Reagent Vials (kod S3425). Maximalt antal objektglas i en körning är 30 på grund av hållbarheten för Red Chromogen Solution efter beredning. För automatisk färgning på Autostainer Plus Link-instrument bör reagenserna (se Reagensberedning) beredas i Dako Reagent Bottles, User-Fillable (12 ml: kod SK201, 5 ml: kod SK200). Reagenserna som levereras med kitet är tillräckliga för 20 tester i 6 7 enskilda körningar. Om 20 objektglas bearbetas i en körning skall de påfyllningsbara på 12 ml (SK201) användas. Flaska 1 och 2 är bruksfärdiga och innehåller tillräckligt med reagenser för 20 objektglas. Var uppmärksam på inkompatibilitet med andra protokoll i samma Autostainer-körning på grund av hållbarheten för Red Chromogen Solution efter beredning. B.4 Automatiserat färgningsprotokoll Ladda objektglasen på Dako Autostainer Se till att vävnadssnitten inte torkar ut när de laddas på Dako Autostainer och under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. Kontakta vår Tekniska Support om mallprotokollet (se figur 1) inte finns på Dako Autostainerinstrumentet. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 8/15
Automatiserat färgningsprotokoll Använd programmet Autoprograms för att ställa in program och starta Dako DuoCISH programmet. Steg 1: Placera reagensflaskorna (förutom flaskan med Red Chromogen Solution) i Dako Autostainer-reagensställ enligt den datagenererade reagenskartan. Steg 2: Ladda objektglasen på Dako Austostainer-instrumentet enligt den datorgenererade objektglaskartan. Steg 3. Starta körningen. För färgning på Autostainer Plus Link-instrument skall du välja Air blow för att fullborda programmet. Steg 4: Efter steg 6 (se figur 2) kommer Dako Autostainer-instrumentet att stanna. Bered då en flaska med Red Chromogen Solution (se Reagensberedning) och placera flaskan i Dako Autostainers reagensställ enligt den datagenererade reagenskartan. Steg 5: Ta ut objektglasen ur Dako Autostainer efter programmet har avslutats. Figur 1. Allmänt program för Dako Autostainer-instrument 1. Wash Buffer, skölj 2. Peroxidase Block, 200 µl, 5 minuter 3. Wash Buffer, skölj 4. CISH Antibody Mix, 200 µl, 30 minuter 5. Wash Buffer, skölj 6. Wash Buffer, skölj 7. Red Chromogen Solution, 200 µl, 10 minuter 8. Wash Buffer, skölj 9. Wash Buffer, skölj 10. Blue Chromogen Solution, 200 µl, 10 minuter 11. Wash Buffer, skölj 12. Wash Buffer, skölj 13. Utspätt hematoxylin, 200 µl, 5 minuter 14. Wash Buffer, skölj 15. Wash Buffer, 200 µl, 5 minuter 16. Avjoniserat vatten, skölj 17. Avjoniserat vatten, skölj 18. Lufttorka* * För Dako Autostainer Plus Link-instrument skall du välja Air blow för att fullborda programmet. Steg 6: Montering Efter att vävnadsproverna har fått lufttorka fullständigt (t.ex. 30 minuter vid 37 C på Dako Hybridizer) skall de täckas med permanent (inte alkohol-/xylenbaserat) eller vattenhaltigt monteringsmedel. För permanent montering kan t.ex. Tissue-Mount från Sakura användas. För vattenhaltig montering kan t.ex. Aquatex från Merck eller EMD Chemicals (USA) användas. OBS! Proverna får inte exponeras för alkohol eller xylen före montering. Detta kan äventyra reaktionens känslighet och resultera i negativa effekter på färgningen. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 9/15
Kvalitetskontroll 1. Signalerna måste vara tydliga, välbalanserade i intensitet och prickstorlek, distinkta och lätta att utvärdera. 2. Normala celler medger en intern kontroll av färgningskörningen. Normala celler bör ha 1 2 klart synliga blåa och 1 2 klart synliga röda signaler där de röda och blåa signalerna är välbalanserade i intensitet och prickstorlekar. Signaldistribuering beror på den specifika prob som används. Se probens produktblad för vägledning. På grund av vävnadssnittning kommer vissa normala celler att ha mindre än de förväntade två signalerna för varje färg. Misslyckad detektion av signaler i normala celler tyder på analysfel och resultaten skall anses som ogiltiga. Numerisk utvärdering av normala celler bör ge ett resultat som motsvarar det förväntade värdet. 3. Kärnmorfologin måste vara intakt. Ett stort antal spökliknande celler och en i allmänhet dålig kärnmorfologi tyder på för stark nedbrytning av provet, vilket kan resultera i förlust eller fragmentering av signaler. Sådana prover skall anses vara ogiltiga. 4. Skillnader i vävnadsfixering, bearbetning och inbäddning i användarens laboratorium kan ge variationer i resultat, vilket kräver rutinmässig utvärdering av interna kontroller. Användning av ljusfältsmikroskop Använd ett mikroskopobjektiv av tillräckligt bra kvalitet och förstoring för att medge optimal poängsättning av proverna. Justera ljusintensiteten för att medge lätt separering av blå och röd färg. Fokusera upp och ned för att hitta alla signaler i den enskilda kärnan. Tolkning av färgningen Proverna måste poängsättas enligt de riktlinjer som tillhandahålls med den FISH-prob som används med Dako DuoCISH -kitet. Eftersom CISH-signalerna är något större än de motsvarande FISH-signalerna måste följande regler iakttas: För genamplifieringsanalyser Om en signal verkar ha mer än ett ursprungscentrum, och följaktligen har en form som skiljer sig signifikant från en rund prick, skall den räknas som två signaler (se signalräkningsguiden nedan). I kärnor med höga nivåer av genamplifiering kan de röda signalerna positioneras mycket nära varandra och bilda ett kluster av signaler. I dessa fall kan antalet röda signaler inte räknas utan måste uppskattas. Speciell uppmärksamhet måste riktas mot de blåa signalerna eftersom kluster av röda signaler kan täcka de blåa signalerna och göra dem svåra att se. Vid tveksamhet skall kärnorna inte inkluderas i utvärderingen. För translokationsanalyser av delad signal En delning ses när blåa och röda signaler är tydligt separerade. Överlappande blåa och röda signaler indikerar samlokalisering (ingen delning). Vid tveksamhet skall kärnorna inte inkluderas i utvärderingen. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 10/15
Signalräkningsguide för genamplifieringsanalys 1 Skall ej räknas. Kärnorna överlappar, inte alla områden i kärnorna är synliga. 2 Räkna som 3 blåa och 12 röda signaler (klusteruppskattning). 3 Räkna som 2 blåa och 1 röd signal. Signaler som verkar ha mer än ett ursprungscentrum skall räknas som två signaler. 4 Räkna ej (alltför starkt nedbrutna kärnor). 5 Räkna som 2 blåa och 5 röda signaler. Signaler som verkar ha mer än ett ursprungscentrum skall räknas som två signaler. 6 Räkna som 1 blå och 5 röda signaler. 7 Räkna som 3 blåa (1 blå oskarp) och 3 röda signaler. 8 Kluster av röda signaler döljer blåa signaler. Gå till en högre förstoringsnivå för att bekräfta närvaro eller frånvaro av blåa signaler. Räkna ej vid tveksamhet. Signalräkningsguide för translokationsanalys av delad signal 1 Poängsätt ej. Kärnorna överlappar, inte alla områden i kärnorna är synliga. 2 Poängsätt som två uppsättningar av samlokaliserade signaler (translokationsnegativ cell). 3 Poängsätt ej (alltför starkt nedbrutna kärnor). 4 Räkna som en uppsättning av samlokaliserade signaler och en uppsättning av delade signaler (translokationspositiv cell) Begränsningar 1. Dako DuoCISH appliceras på vävnadssnitten som färgats med Dako FISH-prober. Användare bör därför vara förtrogna med Dako FISH-proceduren och användarhandboken. 2. Dako DuoCISH en procedur i flera steg som kräver utbildning i val av lämpliga reagenser, beredning av CISH-objektglaset och tolkning av färgningsresultaten. 3. Överdriven eller ofullständig motfärgning kan kompromettera korrekt tolkning av resultaten. 4. Substituera inte reagenser med reagenser som har andra partinummer eller med reagenser från andra tillverkare. 5. Färgningsproceduren bör utföras vid omgivningstemperatur 20 25 C. 6. Användning av Dako DuoCISH har inte validerats för användning med Dako pharmdx FISH-kit. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 11/15
Felsökning Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Ingen signal eller svaga signaler 1a. Kitet har exponerats för höga temperaturer under transport eller förvaring 1b. Flaska 1 och flaska 2 har exponerats för ljus 1c. Reagenserna används inte i korrekt ordning 1d. Programmeringsfel. Reagenserna används inte i korrekt ordning 1e. Otillräckligt reagens i reagensflaskan 1f. Otillräckliga inkuberingstider 1g. Otillräcklig blandning av Blue Chromogen (flaska 6) före beredning av Blue Chromogen Solution 1h. Red Chromogen Solution och/eller Blue Chromogen Solution används inte inom den angivna tiden 1i. Mikroskopinställningar är inte optimala för CISH- utvärdering - Otillräckligt ljus - Högre förstoring (x60 eller x100 objektiv) - För utvärdering av translokationsprober, byt till x40 eller x60 oljeobjektiv 1a. Kontrollera förvaringsförhållanden. Tillförsäkra att frys- elementet var kallt när sändningen mottogs. Tillförsäkra att kitet har förvarats vid högst 2 8 C. 1b. Tillförsäkra att flaska 1 och flaska 2 har förvarats i mörker. 1c. Granska applicering av reagenser. 1d. Kontrollera programnätet för att bekräfta att färgnings- körningen programmerades korrekt. 1e. Tillförsäkra att tillräckligt med reagens laddas i reagensflaskorna innan körningen startas. Se reagenskartan för erfordrade volymer. 1f. Gå igenom anvisningarna för färgnings proceduren. 1g. Blanda Blue Chromogen (flaska 6) väl i 10 sekunder och centrifugera en kort stund för att avlägsna vätska från locket. 1h. Beredd Red Chromogen Solution måste användas inom 20 minuter. Beredd Blue Chromogen Solution måste användas inom 8 dagar (vid förvaring vid 2 8 ºC i mörker). 1i. Pröva olika mikroskopjusteringar. Vid tveksamhet skall du kontakta din lokala mikroskop tillverkare. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 12/15
2. Områden utan signal 3. Alltför kraftig bakgrundsfärgning av objektglas 4. Alltför kraftig specifik färgning 5 Dålig vävnadsmorfologi 2a. För liten reagensvolym 2b. Luftbubblor instängda under montering 3a. Objektglasen har inte sköljts ordentligt 3b. Snitten torkade under den manuella färgnings- proceduren 3c. Snitten torkade under den automatiserade färgnings- proceduren 3d. Snitten torkade under laddning av Autostainer 4a. Reagensinkuberingstiderna alltför långa 4b. Felaktig tvättlösning har använts 2a. Säkerställ att reagensvolymen är tillräckligt stor för att täcka vävnadsområdet. 2b. Undvik luftbubblor. Om dessa observeras skall du byta från permanent monteringsmedel (inte alkohol-/xylen- baserat) till vattenhaltigt monteringsmedel. 3a. Använd färsk Wash Buffer. Tillförsäkra att Autostainer är tillräckligt påfylld före körning. Kontrollera för att säkerställa att det finns tillräckligt med buffert för hela körningen. 3b. Använd fuktkammare. Torka endast av tre till fyra objektglas åt gången innan reagenset appliceras. 3c. Bekräfta att lämplig volym av reagenset appliceras på objektglasen. Tillförsäkra att Autostainer körs med huven i stängt läge och inte exponeras för alltför hög värme. 3d. Tillförsäkra att snitten är fuktiga med buffert medan de laddas och innan körningen påbörjas. 4a. Gå igenom anvisningarna för färgningsproceduren. 4b. Använd endast Wash Buffer som rekommenderas för kitet. 5. Alltför kraftigt nedbruten vävnad 5. Förkorta inkubationstiden för pepsin i Dako FISHfärgningsproceduren. För neutralbuffrat formalin (24 timmar) och paraffininbäddad vävnad är 2 minuters inkubation av pepsin vid 37 C en bra startpunkt. En balans föreligger mellan vävnadsmorfologi och signalintensitet/-kvalitet som användaren bör vara medveten om när en pepsingradient framställs i FISH-proceduren, eftersom både alltför svag och alltför stark nedbrytning av vävnadsprover har en effekt på signalintensitet/-kvalitet. 6. Motfärgning 6a. Motfärgning med hematoxylin är för stark 6a. Ytterligare spädning av (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 13/15
med hematoxylin gör det svårt att se de specifika Dako DuoCISH signalerna 7. Alltför kraftig bakgrundsfärgning med användning av FISHtranslokationsprober 7a. Tvättningen i FISH-proceduren var inte tillräckligt stringent 7b. Blue Chromogen-färgning är för stark hematoxylin. 7a. Extra stringenstvätt i FISHproceduren. Förläng tiden för stringenstvätten t.ex. från 10 till 20 minuter. 7b. Späd Blue Chromogen Solution ytterligare, t.ex. 37,5 µl kromogen per 1 ml substratbuffert. Dessutom kan kontrastfärgning uteslutas för att förbättra balansen mellan signalintensitet och bakgrundsfärgning. OBS! Om problemet inte härrör från någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna åtgärden inte löser problemet, kontakta Dako Teknisk Support för ytterligare hjälp. (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 14/15
Förklaring av symboler Katalognummer Temperaturbegränsning Batchkod Hälsoskadlig In vitro-diagnostisk medicinsk utrustning Läs bruksanvisningen Förvaras i mörker Innehåller tillräckligt för <n> tester Använd före Tillverkare Tillverkad av Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 www.dako.com (119277-002) SK108/SE/ULH 20090810 sid. 15/15