ASSISTERAD BEFRUKTNING - EN ÖVERSIKT Stefan Zalavary, Med Dr, Lab ansv, RMC/KK 2009-09-02
INFERTILITET (ofrivillig barnlöshet) Oförmåga av kvinna, man eller par att reproducera sig (frambringa ett levande barn) Definitioner WHO ofrivillig barnlöshet i 24 mån Utredningen startas efter 1 år Primär/sekundär infertilitet Incidens 10-15% av alla par Ca 250000 par i Sverige
INFERTILITET Varför så vanligt? Senarelagd familjebildning; kvinnan ofta > 30 år innan första försöket till graviditet Ökad exponering av yttre miljöfaktorer Ökning av sexuellt överförbara sjukdomar, t ex klamydia?! Fetma; BMI ökar
INFERTILITETSUTREDNINGEN Samtal med mannen och kvinnan: ex gällande infertilitetens duration, sexuella bekymmer, sjukdomar (genetiska), över/undervikt, exposition av toxiska ämnen, rökning/snusning, alkoholvanor mm Undersökning av kvinnan: cykelmönster (provtagning av t ex prolaktin, progesteron, FSH, LH), gynundersökning (ultraljud) av ovarier, uterus och äggledare Undersökning av mannen: Spermaprov 1-2 st; profil av viktigaste spermaparametrarna (antal/konc, rörlighet, morfologi, tecken på infektion, spermieantikroppar) Fördjupad analys om t ex få/inga spermier i ejakulatet: endokrina orsaker, genetiska (Klinefelter; 47XXY); testisbiopsi
ORSAKER TILL INFERTILITET Tubarskada - hinder i äggledarna Endometrios - slemhinnan har kommit ut i buken och satt sig runt äggledarna eller äggstockarna; inflammatorisk reaktion PCO - Polycystiskt Ovariesyndrom; förstorade ovarier med många små folliklar, ovulationsstörningar pga ändrad hormonbalans, androgena symptom, ofta övervikt Cervixfaktor - t ex störningar i cervixsekretets sammansättning Anovulation/ovulationsstörningar -ofta hormonstörningar Manlig faktor störd spermiebildning, defekt spermietransport, nedsatt kvalitet Oförklarad infertilitet - Ingen orsak kan påvisas
Aspermi/Azoospermi Pre-testikulär Testikulär Post-testikulär azoospermi (non-obstruktiv) azoospermi azoospermi Obstruktiv Dysfunktionell azoospermi aspermi/ Hypogonadotrop Kryptorkism azoospermi Hypogonadism Malign sjukdom - Kirurgi Kongenital Förvärvad Erektil dysfunktion - Kemoterapi CF/CBAVD - Epididymit Anejakulation - Strålbehandling - Lokalt trauma Retrograd ejakulation Lokalt trauma - Bäckenkirurgi - Spinal lesion Orkit - Sterilisering - Perifer neuropati Avvikande krom.uppsättn - Okänd genes Okänd genes
ART: HISTORIK OCH METODIK - Metoder för att temporärt öka fekunditeten (fruktsamheten) och som innebär moment av gamethantering - Kort historik: Inseminationer finns dokumenterade långt tillbaka i historien 1968 läkaren och laparoskopi experten Patrick Steptoe börjar samarbeta med cellbiologen Robert Edwards (England) 1972 första embryoåterföringen utförs 1976 första graviditeten (ektopisk; stim cykel, hmg) 1978 Första IVF-barnet Louise Brown föds i Oldham, England (naturlig cykel)
ART: HISTORIK OCH METODIK (forts) 1980-talet; utveckling av superovulationsmetodik 1982 Första IVF-barnet föds i Sverige (Sahlgrenska, Göteborg) 1984 Första Frysta IVF-barnet föds i Australien 1986 IVF påbörjas i Linköping 1992 Första ICSI-barnet föds (1994 i Sverige) 1994 Första frysgraviditeterna i Linköping 1997 ICSI påbörjas i Linköping, - 2005 1000e IVF-barnet Linköping; ca 1200 barn idag
ART: HISTORIK OCH METODIK (forts) ART innefattar ej ren hormonstimulering (COH; controlled ovarian hyperstimulation) Exempel på de vanligaste teknikerna: AID/AIH (artificial insemination donor/husband; givar/make insemination) kombineras ofta med COH GIFT (gamete intra fallopian transfer) ägg och spermier deponeras i äggledaren, dvs befruktning in vivo; sällsynt i Sverige ZIFT (zygote intra fallopian transfer) överföring av befruktade ägg till äggledaren; förekommer ej i Sverige IVF (in vitro fertilisering; provrörsbefruktning) ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) spermieinjektion i äggets cytoplasma SUZI (subzonal sperm injection) injektion av spermier under zona pellucida; utförs sällan idag
IVF-ET (översikt) Oocyter befruktas in vitro och embryon överförs till uterus Ingående moment: 1. Hormonstimulering av äggstockarna 2. Tillvaratagande och preparation av gameter 3. Befruktning av oocyterna 4. Odling av de befruktade oocyterna 5. Återläggande av pre-embryon till uterus 6. Nedfrysning av extra kvalitetsembryon
IN VITRO FERTILIZATION (IVF) Stimulation of ovaries Gamete collection and preparation Fertilization Culture of embryos Embryotransfer Supernumerary embryo cryopreservation
1. Hormonstimulering Mängder med varianter; vanligast sk långt protokoll Nedreglering med GnRH-agonist (CD1, 21; 2-3 veckor), desensibilisering, naturlig LH-peak hämmas; alt GnRHantagonister till nedreglering Stimulering med rfsh (hmg, human menopausal gonadotrophins) (clomifen; östrogen-receptor antagonist, hämmar neg-feedback) Under stimuleringsförfarandet monitoreras kontinuerligt follikelutvecklingen, endometrietjockleken/utseendet med ultraljud; upprepad analys av serum-östradiol Ovulationsinduktion med hcg (1-2 folliklar > 18 mm)
2. Gamethantering (kvinnan) OPU (ovum-pic-up) görs i lokalanestesi (34-38 h post hcg) Nål med tillkopplad transducer förs in transvaginalt utsug av follikelinnehållet till rör Lab.personal identifierar antalet oocyter i mikroskop, tvättar och överför dessa till odlingsmedium inkubator för ekvilibrering innan befruktning Ev avlägsnande av cumulus/corona celler med hyaluronidas (denudering) mognadsgrad av oocyterna MII, MI, Gv
Oocyte retrieval (OPU) Ultrasound-guided transvaginal follicle puncture 10-15 min/patient 12 oocytes/patient
2. Gamethantering (mannen) Sperma lämnas i sterilt rör (3 dagars abstinenstid) Syftet med preparationen är att snabbt separera spermierna från seminalplasman och att selektera ut den bästa populationen; spermierna blir också kapaciterade (=befruktningsdugliga) De vanligaste metoderna är sk swim-up och densitetscentrifugering Om utredningen visat på azoospermi (grav oligozoospermi): Upptining av tidigare nedfrysta testikulära spermier erhållna via aspiration (TESA) eller testikelbiopsi (TESE) ett fåtal spermier erhålls befruktningen sker senare alltid via ICSI Upptining av tidigare nedfrysta ejakulerade spermier; t ex patienter som fryst in sperma inför behandling av sjukdom (cancer, RA, ulcerös colit); pat med kraftigt varierande spermaprover; donatorsperma; andra orsaker
Preparation of spermatozoa Sperm samples are collected, prepared (removal of seminal plasma, dead sperm, WBC), washed and diluted to appropriate concentration
3. Fertilisering (ca 39-41 h post hcg) - Standard IVF: Bestämd mängd spermier (ca 10-50000) tillförs till varje ägg (utförs i mediedroppar täckta av olja i petriskål) - Kort befruktning: de inseminerade äggen flyttas över till nya mediedroppar efter 2-3 timmar (minimerar exposition av ROS från döda spermier till oocyten) - Mikroinjektionstekniker: ICSI vanligast; en spermie selekteras och sugs upp i pipett, införs sedan direkt i oocytens cytoplasma - Indikation för ICSI, t ex vid kraftigt avvikande spermaprov (antal, rörlighet, morfologi) eller vid tidigare misslyckad befruktning med standard IVF teknik; < 1 milj prog rörliga spermier efter preparation - SUZI spermier injiceras i perivitellinområdet, risk för polyspermi - PZD hål görs i zona. p. spermier injiceras nära hålet sämre implantationsförmåga, troligen pga minskad skydd mot yttre substanser
Standard IVF -The most biological/natural way to fertilize the oocytes - Each oocyte is mixed with 10-25000 motile sperm - Performed when normal appearance of the sperm sample
ICSI- Intracytoplasmic sperm injection Performed with a specific micromanipulation equipment coupled to an inverted microscope A single sperm is immobilized and deposited into the oocyte cytoplasm
ICSI-utrustning
4. Odling - De inseminerade/injicerade oocyterna odlas över natt (6% CO 2, 37 o C, 95% RH, ph 7.3-7.4) - Dag 1 fm: inspektion av äggen för normal fertilisering (17-20 h): 2 pronuklei (+ 2 polkroppar; ca 60-70%), sortering, byte av medium - Dag 1 em: inspektion och sortering av de normalt befruktade som delat sig till 2-cellsstadiet (early cleavage, 25-27 h) - Ytterligare odling 1-5 dagar (byte av odlingsmedium) - Vanligast är odling 2-3 dygn efter insemination/injektion (motsvarar 4-10 blastomerer) - Få kliniker odlar rutinmässigt till blastocyststadiet (dag 5-6) - selektion av embryon med bäst implantationspotential? - nackdelar: kostsamt, höga krav på odlingsförhållanden, frysning/tining svårare
Handling of gametes/embryos Gametes/embryos are cultured in petridishes with specific IVFculture media Spend most of their time in CO 2 -incubators Outside the incubators, handling of gametes/embryos is always performed in LAF-benches
Normal/Abnormal fertilization Normally fertilized oocyte (2PN) 20 h post-insemination Abnormally fertilized oocyte (3PN) 20 h post-insemination
Embryo development day 2-3 High quality day-2 embryo with 4 blastomeres High quality day-3 embryo with 8 blastomeres
Embryo development day 4-6 Day-4 embryo (morulae; 16-32 cells), entered into the compaction phase Day-6 embryo (blastocyst); differentiation into an outer trophoblast (T) and the inner cell mass (ICM; embryoblast); fluid-filled space = blastocoel (C)
Hatching prior to implantation day 6-7 The blastocyst hatches from its zona pellucida (egg-shell) at day 7 and thereafter (hopefully) implants into the endometrium
Assisted Hatching
Embryobiopsi inför PGD
5. Återföring - Embryotransfer - Dag 2-3 vanligast (4-10 blastomerer) - Selektion av de bästa pre-embryona (scoring), på grundval av embryonas utseende och klyvningshastighet - 1-2 st embryon överförs i Sverige (rekommendation att överföra 1 st; RMC ca 80% SET) - Det utvalda embryot sugs in i mjuk kateter med specifikt transfermedium (lab), läkaren för in katetern i uterus och deponerar embryot (ultraljudsguidning) - Hela proceduren tar oftast bara några minuter; vila 10 min innan hemgång - Lutealstöd i form av progesteron (vagitorier) ges för att förstärka corpus luteum funktionen - ökar endometriets receptivitet och fortgåendet av en eventuell graviditet
Embryotransfer Most often performed at day 2-3 (4-8 blastomeres) Abdominal ultrasound A soft catheter, usually containing one embryo, is introduced through the cervix into the uterine cavity
Klassiska morfologiparametrar Scoring Fragmentering Klyvningshastighet Jämnstora blastomerer Blastomerernas form Cytoplasmans utseende Blastomerexpansion Zona pellucidas utseende Synliga mononukleära blastomerer Storlek/morfologi av pronuklei
Fragmentering
Utvecklings/klyvningshastighet
Jämnstora blastomerer
Blastomerernas form
Cytoplasmans utseende
Blastomerexpansion
Zona pellucidas utseende
Synliga mononukleära blastomerer
Storlek/morfologi av pronuklei
Storlek/morfologi av pronuklei
6. Nedfrysning av embryon - Övertaliga embryon av god kvalitet fryses i strån i ca 50% av de fullständiga behandlingarna - Problem vid nedfrysning av levande material: intracellulär isbildning och osmotiska förändringar - Princip: H 2 O i cellerna ersätts stegvis med en sk cryoprotektant - Specifik programmerbar frysutrustning - Lagring i tankar med flytande kväve (N 2 liq, -196 o C); - Upptining Frys ET: oftast i sk naturlig cykel - LH-peak registreras med urinsticka, tining+återläggning 3 dagar efter LH-peak (om dag 2 embryon) - patienten slipper det jobbiga stimuleringsförfarandet - sparar pengar - Hos patienter med oregelbunden mens görs en sk stimulerad/subst cykel - Cryoprotektanten ersätts stegvis med H 2 O överföring till odlingsmedium - ET sker 1-3 timmar efter tining - Ca 80% av embryona överlever
Kryopreservation Permeabla kryoprotektanter Undvika intracellulär isbildning Dimetylsulfoxid (DMSO) Propandiol (PrOH) Etylenglykol (EG) Non-permeabla kryoprotektanter Reglera ändringar i osmotiskt tryck Sukros
Kryopreservation
DE VIKTIGASTE PARAMETRARNA SOM PÅVERKAR IVF-RESULTATEN Kvinnans ålder > 38 år sjunker grav.frekvensen dramatiskt Antalet embryon återförda? - Kvaliteten på de återförda embryona Endometriets receptivitet
RESULTAT - SVERIGE - 2004: - 12871 IVF-behandlingar i Sverige (11518 Danmark) - 1432 IVF-behandlingar per miljon invånare (2128 Danmark) - IVF-barn utgjorde 2,9% av alla födda barn (4,2% Danmark) - 16 IVF-kliniker (10 privata, 6 offentliga) idag; Linköping (1), Malmö (3), Göteborg (3), Örebro (1), Stockholm (4), Uppsala (2), Falun (1), Umeå (1) Graviditeter/förlossningar per embryoåterföring IVF 33,5% 26,4% ICSI 29,6% 23,5% FRET 25,4% 18,5% Fördelning enkelbörd/flerbörd färska resp fryscykler Enkelbörd 94,3% (1912 st) 90,4% (450 st) Tvillingbörd 5,6% (114 st) 9,4% (47 st) Trillingbörd 0,0% (1 st) 0,2% (1 st)
RESULTAT RMC 2006 Färska cykler IVF ICSI Ägguttagningar (OPU) 241 187 Embryoåterföringar (ET) 220 178 Embryon per ET 1,22 1,29 Pos hcg per ET 45,0% 39,9% Klin grav per ET 37,7% 34,8% Förlossningar per ET 31,8% 30,9% Frys/tiningscykler Embryoåterföringar 156 Embryon per ET 1,19 Pos hcg per ET 32,1% Klin grav per ET 27,6% Förlossningar per ET 22,4% Totalt (IVF+ICSI)
RISKER MED IVF Överstimulering (OHSS) - av hormonbehandlingen, - ca 10% mild variant, ej behandlingskrävande - 1-3% behandlingskrävande: stora ovariecystor, vätska i buken och bröstet respirations/njurproblem, koagulationsdefekter risken minskas bl a genom att stimuleringen bryts, mindre dos av hcg ges, ingen ET utförs (graviditet ökar risken) Mkt liten risk för blödning/ infektion i samband med ägguttaget Flerbörd: ca 20-25% 2001-2002 ökad risk för prematurfödsel (lägre födelsevikt) --> förlossningskomplikationer/utvecklingsstör ningar???? Andel SET 70-80% idag Enkelbörd: Ökad risk för prematuritet och låg födelsevikt Inga betydande skillnader mellan IVF-barn och vanliga barn vad gäller missbildningar, utvecklingsstörningar eller kromosomrubbningar Viss risk för överföring av defekta gener i Y-kromosomen (ex DAZ, AZF) vid ICSI Imprinting defekter?
SAMMANFATTNING - RISKER De allra flesta barn som föds efter IVF är friska och de absoluta riskerna för IVF-barn är små Den största risken utgörs av flerbörd, men frekvensen flerbörd kommer att reduceras i takt med att allt fler återföringar görs med enbart ett embryo
LAGAR OCH REKOMMENDATIONER Provtagning av HIV, HTLV, hepatit B+C, och syfilis på alla patienter som genomgår ART Insemination: parterna gifta, sambo, skriftligt samtycke av mannen AID: endast med frusen sperma (6 mån karantän); barn uppkomna efter AID (gametdonation) har rätt att veta donatorns identitet vid 18 år; givare ej lämplig att vara äldre än 50 år, ej upphov till fler än 6 barn Kvinnan < 43år (rekommendation < 38 år) och mannen < 55 år vid IVF Äggdonation och spermiedonation tillåten i samband med IVF fr om 2003, dock är embryodonation och surrogatmoderskap (befruktade embryon införs i annan kvinnas uterus) förbjudet; jfr t ex Finland
LAGAR OCH REKOMMENDATIONER (forts) Insemination eller IVF med donerade spermier tillåten på lesbiska par from juli 2005 Frysning av embryon max 5 år Gameterna, eller av dessa uppkomna embryon, får ej utsättas för försök innan återföring till kvinnan Återläggning av 1 embryo vid ET rekommenderas utvecklingen går mot strikt överföring av endast 1 embryo
FRÅGOR? RMC/KKs hemsida: http://www.lio.se/templates/pagewithcolumn.aspx?id=47229