Kit de Extração de DNA ocheck

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1 Kit de Extração de DNA ocheck Instruções de Uso IVD Made in Germany Preparação individual (Cat. No ) Para uso diagnóstico in vitro apenas por profissionais de Laboratório Revisão BQ / utubro 2018 Greiner Bio-ne GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Phone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com

2 GLSSÁRI DE SÍMBLS! en Batch code Use by Consult Instructions for Use Catalog Number Manufacturer In Vitro Diagnostic Medical Device Temperature limitation Contents sufficient for <n> tests Danger Warning Warning Important Note de Chargenbezeichnung Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch Anweisung lesen Katalognummer Hersteller In-Vitro- Diagnostika Medizinprodukt Temperaturbegrenzung Inhalt ausreichend für <n> Tests Gefahr Achtung Achtung Wichtiger Hinweis fr N o de lot Date limite de conservation jusqu au Lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro Limite de température Contenu suffisant pour <n> tests Danger Attention Attention Note importante es Código de lote A utilizar preferiblemente antes de Antes de usar, lea las instrucciones Número de catálogo Fabricante Producto medicinal de diagnóstica in vitro Limitación de temperatura Contenido suficiente para <n> ensayos Peligro Atención Atención Nota importante it Codice del lotto Da utilizzare entro e non oltre Leggere le istruzioni prima dell uso Numero catalogo Produttore Dispositivo medicodiagnostico in-vitro Contenuto sufficiente per test <n> Pericolo Limitazione temperatura Attenzione Attenzione Nota importante pt Código do lote A utilizar preferivelmente antes de Antes de usar, leia as instruções Número do item Fabricante Producto medicinal de diagnóstico in vitro Limitação de temperatura Conteúdo suficiente para <n> ensaios Perigo Atenção Atenção Aviso importante nl Lot nummer Tenminste houdbaar tot Gebruiksaanwijzing lezen Catalogusnummer Fabrikant In vitro diagnostisch medisch product Temperatuurbeperking Voldoende inhoud voor <n> tests Gevaar Waarschuwing Waarschuwing Belangrijke opmerking da Lotnummer Anvendes senest Læs brugsanvisningen Katalognummer Producent In vitro meskdicin doagnoseapparat Temperaturbegraensær Indeholder nok til <n> test Fare Advarsel Advarsel Vigtig henvisning sv Lot nummer Sista förbrukningsdag Läs bruksanvisningen före användning Katalognummer Tillverkare In vitromedicinsk doagnostisk apparatur Temperatur-begränsning Innehållet räcker till <n> tester Fara Varning Varning Viktigt meddelande pl Kod partii Termin zydatności Przed użyciem przeczytać instrukcję Producent Numer katalogowy Diagnostyka in vitro Produkt yw Zawartość wystarcza na <n> testów graniczenie temperatury Niebezpieczeństwo Uwaga Uwaga Ważne no batch nr. holdbar til Les bruksanvisning før bruk katalognummer produsent in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr temperaturbegrensning Innhold tilstrekkelig for <n> tester Fare bs bs Viktig merknad el κωδικός παρτίδας το λιγότερο διατηρείται πριν την χρήση διαβάστε τις οδηγίες Αριθμός Καταλόγου Παραγωγός In vitro διαγνωστικά ιατρικά προϊόντα περιoριoμός θερμοκραο ίας Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ ΚΊΝΔΥΝΟΣ ΠΡΟΣΟΧΉ ΠΡΟΣΟΧΉ Σημαντική υπόδειξη tr Parti kodu Son kullanma tarihi: Kullanmadan önce talimatı okuyun Katalog numarası Üretici firma In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü Sıcaklık sınırlaması İçeriği <n> test için yeterlidir Tehlikeli Dikkat Dikkat Önemli Not 2

3 ÍNDICE 1. CNTEÚD D KIT CNSUMÍVEIS E EQUIPAMENTS NECESSÁRI TRANSPRTE E ARMAZENAMENT INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA DESCARTE DE RESÍDUS INTRDUÇÃ Finalidade Uso inadequado Material da amostra Para PapilloCheck Para PelvoCheck CT/NG Para ParoCheck Princípios básicos da purificação do DNA INSTRUÇÕES PARA FLUX DE TRABALH ocheck Instruções gerais Separação das salas Cuidados e precauções Prevenção da contaminação Precauções gerais Segurança no trabalho PRCEDIMENT DE EXTRAÇÃ Preparação das soluções de trabalho e condições de armazenamento Preparação das amostras Preparação das amostras para PapilloCheck e PapilloCheck high-risk Preparação de amostras de esfregaço vaginal e cervical para PelvoCheck CT/NG Preparação de amostras individuais de urina para PelvoCheck CT/NG Preparação de pool de amostras de urina para PelvoCheck CT/NG Preparação de amostra para ParoCheck Protocolo padrão Preparação Pré-lise Lise Ajuste das condições de ligação do DNA Ligação do DNA Lavagem das Colunas Spin Secagem das Colunas Spin Eluição do DNA RESLUÇÃ DE PRBLEMAS ASSISTÊNCIA TÉCNICA CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENH PRTCLS CURTS

4 Importador e distribuidor: Greiner Bio-ne Brasil Produtos Médicos Hospitalares Ltda. Av. Affonso Pansan, Vila Bertini - CEP Americana - SP FNE - (0xx) (19) FAX - (0xx)(19) CNPJ / site: Responsável Técnico: Dra. Nádia Camila Gennaro Alves - CRF-SP n Registro ANVISA/MS Nº Informações de uso do produto, solicitar via support.dx@gbo.com 1. CNTEÚD D KIT Kit de Extração De DNA ocheck Nome Volume/Unidades BUF L1 Tampão L1 20 ml BUF L2 Tampão L2 12 ml REAG L3 Reagente L3 3 ml BUF W1 Tampão W1 30 ml BUF W2 Tampão W2 (concentrado) 25 ml BUF E Tampão E 13 ml Proteinase K Proteinase K (liofilizada) 30 mg Proteinase BUF PKB Tampão da Proteinase PKB 1.8 ml Carreador RNA Carreador RNA (liofilizado) 0.3 mg Colunas Spin Tubo de Coleta Colunas Spin 50 Tubos de Coleta 250 BUF L4 Etiqueta para o Tampão L4 1 Instruções para o download das Instruções de Uso 1 4

5 2. CNSUMÍVEIS E EQUIPAMENTS NECESSÁRIS Consumíveiss Greiner Bio-ne Cat. No. Quantidade Kit de Extração de DNA ocheck testes Ponteiras estéreis com filtro, livre de DNase e RNase para micropipetas Ponteiras com filtro de 0,5-10 µl Ponteiras com filtro de 0,5-20 µl Ponteiras com filtro de µl Ponteiras com filtro de µl Ponteiras com filtro de µl Consumíveis adicionais necessários Tubos de reação de 1,5 ou 2,0 ml livre de DNAse e RNAse com tampa de segurança ou tampa de rosca para os passos de lise Etanol p.a % Luvas descartáveis Equipamentos adicionais necessários Microcentrífuga adequada para tubos de reação de 1,5 ou 2,0 ml e g Agitador (Vortex) Bloco de aquecimento, banho-maria ou termomisturador com capacidade para tubos de reação de 1,5 ou 2,0 ml para incubação a 70 C e 56 C Micropipetas diversas entre μl Descarte de resíduos Timer Se o DNA for extraído a partir de uma amostra de pool de urina para a análise com PelvoCheck CT/NG, consulte o documento Protocolo de suporte para amostras de pool de urina PelvoCheck CT/NG" para obter informações sobre consumíveis e equipamentos adicionais necessários. 5

6 3. TRANSPRTE E ARMAZENAMENT armazenamento e o envio do Kit de Extração de DNA ocheck ocorre entre C. Armazenamento de soluções prontas para uso de trabalho, ver na seção INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA Kit de extração DNA ocheck é exclusivamente de uso laboratorial, não deve ser utilizado como medicamento, produto doméstico ou para outras finalidades. uso do produto deve ser realizado exclusivamente por profissionais, tais como técnicos ou médicos treinados em técnicas de biologia molecular. Utilizar sempre um avental de laboratório apropriado, luvas descartáveis, óculos de segurança e seguir as! instruções de segurança descritas nessa seção e na seção 7.3. Informação regulatória: Embalagem de acordo com o regulamento CE n 1272/2008: misturas prejudiciais classificadas nas seguintes categorias: toxicidade aguda, oral (categoria 4), irritação da pele (categoria 2), irritação ocular (categoria 2), líquidos inflamáveis (categoria 3), toxicidade específica para órgãos-alvo exposição única, não devem ser rotulados com H e P até 125 ml. Isso se aplica a todos os componentes do Kit de Extração de DNA ocheck, com exceção da Proteinase K (lyo). De acordo com o regulamento CE n 1272/2008, os pacotes internos devem ser rotulados apenas com símbolo (s) e identificação do produto. Componente do kit Quantidade de substância perigosa Classificação de acordo com o Regulamento (EC) No 1272/2008 Pictograma GHS e palavras de aviso Requisitos para perigos e precauções Proteinase K (lyo.), 30 mg (CAS No ) Irritação da pele (categoria 2) Sensibilização da pele (categoria 1A/1B) Irritação dos olhos (categoria 2) Sensibilização respiratória (categoria 1A/1B) Toxicidade específica para órgãos-alvo - exposição única (categoria 3) PERIG H315 H317 H319 H334 H335 P261 P305+P351+P338 P342+P311 Causa irritação na pele. Pode causar reações alérgicas na pele. Provoca irritação séria nos olhos. Pode causar alergia ou sintomas de asma ou dificuldades respiratórias, se inalado. Pode causar irritação respiratória. Evite respirar poeira. Utilizar luvas/óculos de proteção SE NS LHS: lavar cuidadosamente com água por vários minutos. Remova as lentes de contato, se presentes e fáceis de retirar. Continue enxaguando. Se forem sentidos sintomas respiratórios: Chamar um CENTR DE INTXICAÇÃ ou médico. Tampão L2, 12 ml (cloreto de guanidina, 50-66%, CAS No ) Toxicidade oral aguda (Categoria 4) Irritação na pele (categoria 2) Irritação nos olhos (categoria 2) ATENÇÃ H302 H315 H319 P280 Perigoso se ingerido. Causa irritação na pele. Provoca irritação séria nos olhos. Usar luvas de proteção / proteção vestuário / proteção para os olhos / proteção facial. 6

7 Kit component Quantity Hazardous content Classificação de acordo com o Regulamento (EC) No 1272/2008 Pictograma GHS e palavras de aviso Requisitos para perigos e precauções Tampão W1, 30 ml (cloreto de guanidina, 36-50%, CAS No ; 2-propanol, 20-50%, CAS No ) Toxicidade oral aguda (Categoria 4) Irritação na pele (categoria 2) Irritação nos olhos (categoria 2) Líquidos inflamáveis (categoria 3) ATENÇÃ H302 H315 H319 H226 P280 Perigoso se ingerido. Causa irritação na pele. Provoca irritação séria nos olhos. Líquido e vapor inflamáveis. Usar luvas de proteção / proteção vestuário / proteção para os olhos / proteção facial. A versão atualizada da Folha de Dados de Segurança para este produto pode ser obtida através do website da Greiner Bio-ne: 5. DESCARTE DE RESÍDUS cloreto de guanidina nos Tampões L2 e W1 podem formar compostos altamente reativos quando combinado com água sanitária. A água sanitária ou as soluções ácidas não devem ser adicionadas diretamente aos resíduos da preparação da amostra. A contaminação de resíduos líquidos com material infeccioso residual é altamente improvável, mas não pode ser completamente excluída. Portanto, os resíduos líquidos devem ser considerados infecciosos, manipulados e eliminados de acordo com os regulamentos locais de segurança. Por favor, siga cuidadosamente as diretrizes federais, estatais e locais para a eliminação dos resíduos. 7

8 6. INTRDUÇÃ 6.1 Finalidade Kit de Extração de DNA ocheck (Greiner Bio-ne; Cat. Nº ) é um kit para diagnóstico in vitro e se destina à preparação de DNA a partir de amostras humanas para serem analisadas com testes da linha de produtos ocheck. PapilloCheck (Greiner Bio-ne; Cat. No ) PapilloCheck high-risk (Greiner Bio-ne; Cat. No ) PelvoCheck CT/NG (Greiner Bio-ne; Cat. No ) ParoCheck (Greiner Bio-ne; Cat. No , , , ) Kit de Extração de DNA ocheck preenche os requisitos da Diretiva de Dispositivos Médicos de Diagnóstico In Vitro (98/79/CE), e desta forma apresenta a marca da conformidade CE. produto se destina para uso APENAS por profissionais, tais como técnicos e médicos treinados nas técnicas de biologia molecular. 6.2 Uso Inadequado Kit de Extração de DNA ocheck NÃ se destina a ser utilizado com CarnoCheck (Greiner Bio- ne) ou qualquer produto que não faça parte da linha de produtos ocheck. 8

9 6.3 Material da amostra Para PapilloCheck Para aplicação com o PapilloCheck (Greiner Bio-ne; Cat. No ) e PapilloCheck high-risk (Greiner Bio-ne; Cat. N.º ), o Kit de Extração de DNA ocheck foi projetado e testado para extrair DNA genômico viral e humano de esfregaços cervicais coletados com um dos seguintes sistemas de coleta de amostras: PapilloCheck Collection Kit (Greiner Bio-ne; Cat. No ) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, USA) Surepath TM (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) STM TM (Qiagen, Hilden, Germany) Para PelvoCheck CT/NG Para a aplicação com o PelvoCheck CT/NG (Greiner Bio-ne; Cat. N.º ), o Kit de Extração de DNA ocheck foi validado para a extração de DNA genômico e bacteriano humano a partir de amostras de urina humana e esfregaços vaginais e cervicais utilizando os seguintes sistemas de coleta: Para amostras de urina: Kit de coleta SAFE PelvoCheck (Greiner Bio-ne; Cat. No ) Kit de coleta STRAW PelvoCheck (Greiner Bio-ne; Cat. No ) Para amostras de esfregaço vaginal e cervical: Tubo de coleta com o meio de transporte do Kit de Coleta PapilloCheck (Greiner Bio-ne; Cat. No ) e, se aplicável, Copan CLASSIQSwab (Copan Flock Technologies; Cat. No KS01) Como material de amostra, amostras de urina individuais ou até um pool de 5 amostras individuais podem ser usadas para análise. protocolo padrão na seção 8.3 destina-se a extração de amostras individuais. Se o DNA for extraído a partir de um pool de urina com PelvoCheck CT / NG, consulte o documento "Protocolo de suporte para pool de amostras de urina para PelvoCheck CT / NG" Para ParoCheck Para a aplicação com o ParoCheck (Greiner Bio-ne; Cat. No , , , ) o Kit de Extração de DNA ocheck foi validado para extração de DNA bacteriano a partir de amostras de placas subgingivais coletadas com o Kit de Coleta ParoCheck (Greiner Bio- ne; Cat No ) utros sistemas de coleta de amostra não foram validados e não podem ser utilizados com o Kit de Extração de DNA ocheck. 9

10 6.4 Princípios básicos da purificação do DNA Kit de Extração de DNA ocheck é designado para a purificação de DNA genômico viral, bacteriano e humano a partir de amostras de origem humana. A amostra é lisada rapidamente e eficientemente através da adição de Proteinase K e Tampão L1. tampão de lise e o etanol criam condições apropriadas para a ligação dos ácidos nucléicos à membrana de sílica das Colunas de Ligação. Para amostras de pool de urina o passo de lise é realizado sem o Tampão L1. As condições apropriadas de lise são alcançadas utilizando o Meio de Coleta PelvoCheck. carreador de RNA melhora a ligação e a recuperação do DNA genômico viral e bacteriano de baixa concentração. s contaminantes (potenciais inibidores de PCR), tais como sais, metabolitos e componentes celulares macromoleculares solúveis, são retirados durante os passos de lavagem com tampões de lavagem. DNA genômico viral, bacteriano e humano puro é finalmente eluído sob condições de baixa força iônica em um tampão de eluição ligeiramente alcalino. Após a purificação, o DNA está numa solução adequada para análise direta com ensaios realizados com a linha de produtos ocheck. 10

11 7. INSTRUÇÕES PARA FLUX DE TRABALH ocheck 7.1 Instruções Gerais Ao implementar técnicas de última geração utilizadas na biologia molecular em um laboratório, as seguintes instruções devem ser consideradas para garantir a máxima segurança para funcionários do laboratório e resultados de alta qualidade. A execução de técnicas de biologia molecular, como extração de DNA, amplificação e detecção de produtos de amplificação, necessita de pessoas adequadamente qualificadas. Além disso, um fluxo de trabalho limpo e bem estruturado é necessário para evitar resultados errados, como os que ocorrem devido à degradação do DNA ou contaminação por produtos de amplificação. Para garantir isso, é necessário separar as áreas de extração, amplificação e detecção conforme descrito no Capítulo 7.2. Cada área deve ser equipada com equipamentos separados, consumíveis, aventais e luvas. Nunca transfira aventais, luvas ou equipamentos de uma área distinta para outra. 7.2 Separação das salas A Figura 1 mostra um exemplo de como um laboratório pode ser separado em 3 seções distintas. Uma apenas se utiliza para a extração de DNA, outra para a preparação e realização de reações de PCR e a última destina-se a hibridização e análise. Cada sala será utilizada exclusivamente para a aplicação ou técnica indicada, para evitar a contaminação de amostras. A utilização de cores pode ser vantajosa para evitar a troca acidental de equipamento e consumíveis entre as áreas.! Não se deve trocar nem equipamento nem consumíveis entre as diferentes salas de laboratório e espaços. Portanto, as duplicações de equipamento e consumíveis são uma necessidade e têm de ser consideradas. Sala 1 Sala 2 Sala 3 Figura 1: Separação de salas no fluxo de trabalho ocheck Sala 1: extração de DNA; Sala 2: preparação de reação e divisão de PCR da mistura de reação numa bancada limpa; espaço separado para a adição do DNA eluído; Sala 3: hibridização e análise 11

12 Todo o procedimento da extração de DNA com o Kit de Extração DNA ocheck deve ser realizado na sala 1, a sala de extração de DNA. Após sair desta sala, é necessário trocar de avental. Dentro do fluxo de trabalho ocheck, a extração de DNA é o processo mais sensível a contaminação, por isso é essencial que se cumpram rigorosamente as instruções contidas neste documento. Além disso, devem cumprir-se as orientações de prevenção de contaminação descritas no capítulo Na sala 2, prepara-se e divide-se a mistura de reação de PCR numa bancada limpa. A adição do DNA extraído na sala 1 deve ser realizada num espaço separado dentro da sala 2. Após sair desta sala, é necessário trocar de avental. Na terceira sala de laboratório, ocorre a reação de hibridização e realizam-se os passos de lavagem. Na sala 3, também está instalado o CheckScanner em conjunto com o Software CheckReport para a análise final de ensaios da linha de produtos ocheck. 7.3 Cuidados e Precauções Prevenção da contaminação Aventais de laboratório devem ser utilizados durante todo o procedimento e diferentes conjuntos de aventais de laboratório são necessários para cada sala do laboratório. Luvas devem ser frequentemente trocadas, principalmente durante a manipulação das amostras. Limpeza do laboratório: o local de trabalho deve ser descontaminado antes e após o trabalho com uma solução de limpeza apropriada. Tubos de reação: nunca toque no interior da tampa do tubo de reação. Para evitar contaminação cruzada, abra um tubo de cada vez. Para evitar contaminação, utilize tubos de reação com tampa de segurança ou tampa com rosca para os passos de lise. Pipetar amostras: devem ser utilizadas ponteiras com filtro apropriadas para micropipetas (estéreis, livres de DNase, RNase e DNA humano). As ponteiras das pipetas devem ser sempre trocadas entre transferências de líquidos Precauções gerais No momento da chegada, verifique se os componentes do Kit de Extração de DNA ocheck têm danos. Se um dos componentes estiver danificado (por ex. frascos de tampão), contate o seu distribuidor local Greiner Bio-ne. Não utilize componentes do kit danificados, pois a sua utilização pode levar a um fraco desempenho do kit de extração. Não utilize reagentes fora do prazo de validade. Não utilize o Kit de Extração de DNA ocheck após o prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Utilize apenas equipamentos/reagentes fornecidos com o kit e os recomendados pelo fabricante. É necessária uma calibração/verificação regular das pipetas, do banho-maria e do bloco de aquecimento. A pipetagem de quantidades pequenas de líquido na gama do microlitro é um desafio. Portanto, tenha cuidado para pipetar com micropipetas com a maior precisão possível. Todos os passos da centrifugação devem ser realizados à temperatura ambiente (18-25 C). Reagentes não utilizados e resíduos devem ser descartados de acordo com as normativas federais e estaduais. 12

13 7.3.3 Segurança no trabalho Este kit é de uso exclusivo para diagnóstico in vitro e só deve ser utilizado por pessoas treinadas em procedimentos laboratoriais para diagnóstico in vitro. Nunca pipetar soluções com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar produtos cosméticos nas áreas de trabalho. Tomar cuidado ao manipular amostras biológicas contendo materiais humanos potencialmente infecciosos. Para minimizar o risco de infecção por material potencialmente infeccioso, recomenda-se trabalhar em capela de fluxo laminar. Manipular e descartar todas as amostras biológicas como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos. Evitar o contato direto com as amostras biológicas assim como respingos ou pulverizações. Usar sempre avental de laboratório, luvas e óculos de proteção ao trabalhar com amostras humanas. Lavar as mãos cuidadosamente após manipular amostras e reagentes. A versão atualizada da Folha de Dados de Segurança para este produto pode ser obtida através do website da Greiner Bio-ne: 13

14 8. PRCEDIMENT DE EXTRAÇÃ 8.1 Preparação das soluções de trabalho e condições de armazenamento Todos os componentes do kit devem ser armazenados a temperatura ambiente (10-30 C) e estão estáveis durante dois anos após a data de fabricação. Para as condições de armazenamento de cada componente do kit durante o uso, veja abaixo: Antes de iniciar o protocolo com o Kit de Extração de DNA ocheck, prepare as seguintes soluções: 1. Solução de Proteinase K: antes de utilizar o kit pela primeira vez, adicione 1,35 ml de Tampão de Proteinase (PKB) para dissolver a Proteinase K liofilizada. Divida a solução em alíquotas e conserve a -20 ºC por até 6 meses. Não volte a congelar. 2. Tampão W2: adicione 100 ml de etanol (p.a. 99,8%) ao Tampão W2 concentrado. Assinale a data atual no rótulo do frasco. Tampão W2 está estável à temperatura ambiente (18-25 C) até um ano. 3. Tampão L4: transfira o Tampão L2 para o Reagente L3 completamente e misture bem. Rotule o frasco com a etiqueta L4 fornecida com o kit. Assinale a data atual no rótulo do frasco. Tampão L4 resultante está estável por até um ano à temperatura ambiente (18-25 C). 4. Solução de Carreadora de RNA: adicione 900 μl de Tampão L1 para dissolver o Carreador de RNA liofilizada. Distribua o Carreador de RNA dissolvido em alíquotas. Conserve a solução de Carreador de RNA dissolvida a -20 C por até 8 meses. Não volte a congelar! Uma vez descongelados, os frascos usados devem ser eliminados. Durante a conservação, especialmente a baixas temperaturas, pode formar-se um precipitado branco nos Tampões L1, L2, ou L4. Esses precipitados podem dissolver-se facilmente incubando o frasco a C antes da utilização. 14

15 8.2 Preparação das amostras! Sempre misture as amostras agitando com vortex antes de pipetar a amostra no primeiro tubo de reação Preparação das amostras para PapilloCheck e PapilloCheck high-risk As amostras de esfregaços cervicais humanos que são coletadas em Kit de Coleta PapilloCheck (Greiner Bio-ne; Cat.-No ) Meio de Coleta PreservCyt (Hologic, Bedford, MA USA) podem ser processadas diretamente. As amostras de esfregaços cervicais que são coletadas em Meio de Coleta Surepath TM (BD, Franklin Lakes, NJ USA) mtêm de ser lavadas antes da utilização: centrifugar 250 μl da amostra durante 5 minutos a g e ressuspenda o pellet em 250 μl de água destilada. As amostras de esfregaços cervicais que são coletadas em Meio de Coleta STM TM (Qiagen, Hilden, Germany) devem ser diluídas com água destilada: 100 μl da amostra μl de água destilada.! Regra geral, se a amostra do esfregaço cervical for muito concentrada e já estiver agregada, tem de ser diluída e homogeneizada antes de se iniciar a extração! Pipetar 250 μl da solução de amostra para um tubo de reação de 1,5 ml ou 2 ml. Para evitar contaminação, utilize tubos de reação com tampa de segurança ou com tampa de rosca para os passos de lise. Recomenda-se que valide todo o processo de isolamento de DNA de cada ciclo de extração de DNA utilizando um controle de amostra negativo Preparação de amostras de esfregaço vaginal e cervical para PelvoCheck CT/NG As amostras de esfregaço vaginal e cervical que são coletadas em Kit de Coleta PapilloCheck (Greiner Bio-ne; Cat.-No ) podem ser processadas diretamente. Pipetar 250 μl da amostra para um tubo de reação de 1,5 ml ou 2 ml. Recomenda-se que utilize tubos de reação com tampa de segurança ou tampa com rosca para os passos de lise. Para validar a extração de DNA, deve utilizar-se um controle de amostra negativo para cada ciclo de extração. 15

16 Extração de DNA Preparação de amostras individuais de urina para PelvoCheck CT/NG Sala 1 As amostras de urina que são coletadas em: Kit de Coleta SAFE PelvoCheck (Greiner Bio-ne; Cat. No ) Kit de Coleta STRAW PelvoCheck (Greiner Bio-ne; Cat. No ) podem ser processadas diretamente. Pipetar 250 μl da amostra para um tubo de reação de 1,5 ml ou 2 ml. Recomenda-se que utilize tubos de reação com tampa de segurança ou tampa com rosca para os passos de lise. Para validar a extração de DNA, deve utilizar-se um controle de amostra negativo para cada ciclo de extração Preparação de pool de amostra de urina PelvoCheck CT/NG Para a preparação da amostra de um pool de amostras de urina, consulte o documento: "Protocolo de suporte para o pool de amostras de urina para PelvoCheck CT / NG" Preparação de amostra para ParoCheck Para a preparação da amostra de amostras de placas subgingivais, consulte o documento: "Protocolo de suporte para extração de DNA de amostras subgingivais com o Kit de Extração de DNA ocheck (Cat No ) para mais Análise com ParoCheck ". s protocolos de suporte estão disponíveis separadamente em: Protocolo padrão protocolo padrão destina-se a extração de: amostras de esfregaço cervical amostras de esfregaço vaginal amostras de urina individuais Para a extração de: amostras de um pool de urina consulte o documento: "Protocolo de suporte para o pool de amostras de urina para PelvoCheck CT/NG. Para extração de: amostras de placas subgingivais, consulte o documento: "Protocolo de suporte para extração de DNA de amostras subgingivais com o Kit de Extração de DNA ocheck (Cat No ) para mais Análise com ParoCheck ". s protocolos de suporte estão disponíveis separadamente em: Preparação Verifique se a centrífuga está regulada à temperatura ambiente (18-25 C). Prepare as amostras de acordo com o capítulo 8.2. Regule os blocos de aquecimento ou o banho-maria para 56 C e 70 C, respectivamente. Antes da eluição, incube o Tampão E de eluição a 70 C. Certifique-se de que as soluções para análise foram preparadas de acordo com o capítulo P R T C L C U R T

17 8.3.2 Pré-lise Adicione 80 μl de Tampão L1. Adicione 2,4 μl de solução de Carreador de RNA preparada. Adicione 20 μl de solução de Proteinase K. Feche a tampa e misture brevemente com o agitador vortex de impulso.!! Extração de DNA Sala 1 Incube a 56 C durante pelo menos 30 minutos. Agite as amostras utilizando um termo mixer a 650 rpm. Se utilizar um bloco de aquecimento ou banho-maria, agite ocasionalmente as amostras com o agitador ao longo do período de incubação Lise Se forem processadas várias amostras, a Proteinase K, o Tampão L1 e o Carreador de RNA devem ser pré misturados diretamente antes da utilização. Nunca misture o Tampão L1 e a Proteinase K por mais de minutos antes de adicionar a amostra. A Proteinase K tem tendência para auto-digestão no Tampão L1 sem substrato. Centrifugue brevemente o tubo de reação para remover gotas do interior da tampa. Adicione 250 μl de Tampão L4. Feche a tampa e misture com o agitador durante 10 segundos. lncube a 70 ºC durante 15 minutos. Feche bem a tampa dos tubos de reação para evitar a abertura acidental das tampas Ajuste das condições de ligação do DNA Centrifugue brevemente o tubo de reação para remover gotas do interior da tampa. Adicione 300 μl de etanol (p.a. 99,8 %) à amostra. Feche de imediatamente a tampa e misture cuidadosamente com o agitador durante 15 segundos. Centrifugue brevemente o tubo de reação para remover gotas do interior da tampa Ligação do DNA Para evitar a contaminação: coloque luvas novas antes deste passo! Para cada amostra, coloque uma Coluna Spin em Tubo de Coleta. Pipete cuidadosamente 450 μl dos lisados para a Coluna Spin e centrifugue a g durante 1 minuto à temperatura ambiente. Não elimine o resto do lisado! Elimine o Tubo de Coleta contendo o filtrado. P R T C L C U R T 17

18 Extração de DNA Para evitar a contaminação: coloque luvas novas antes deste passo! Sala 1 Prepare novos Tubos de Coleta e coloque as Colunas Spin em no vos Tubos de Coleta. Pipete o resto de 450 μl do lisado para a Coluna Spin. Centrifugue a g durante 1 minuto à temperatura ambiente. Para evitar a contaminação: coloque luvas novas antes deste passo! Elimine o Tubos de Coleta com o filtrado e coloque as Colunas Spin em um novo Tubos de Coleta Lavagem das Colunas Spin Adicione 500 μl de Tampão W1 na Coluna Spin. Centrifugue a g durante 1 minuto à temperatura ambiente. Elimine o Tubo de Coleta com o filtrado e coloque a Coluna Spin em um novo Tubo de Coleta. Adicione 600 μl de Tampão W2 na Coluna Spin. Centrifugue a g durante 1 minuto à temperatura ambiente. Elimine o Tubo de Coleta com o filtrado e coloque a Coluna Spin em um novo Tubo de Coleta Secagem das Colunas Spin Centrifugue a g durante 1 minuto para secar a membrana completamente.!!! Este passo é necessário para eliminar vestígios de etanol. etanol no Tampão W2 inibe reações enzimáticas e deve ser removido completamente antes da eluição do DNA Eluição do DNA Utilize Tampão E pré-aquecido (70 C)! Para evitar uma perda de temperatura durante os passos de pipetagem, recomenda-se encher os tubos de reação de 1,5 ou 2,0 ml com um máximo de 1300 μl de Tampão E (suficiente para n = 12 amostras). Para evitar a contaminação: coloque luvas novas antes deste passo! Coloque a Coluna Spin em um novo tubo de reação de 1,5 ml. Adicione 100 μl de Tampão E pré-aquecido (70 C) no centro da membrana na Coluna Spin. Feche a tampa e incube à temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugue a g durante 1 minuto. Armazene o DNA extraído -20 C. Para efetuar mais uma análise com ensaios realizados com a linha de produtos ocheck consulte as lnstruções de Utilização respectivas (PapilloCheck, PapilloCheck high-risk e PelvoCheck CT/NG). P R T C L C U R T 18

19 9. RESLUÇÃ DE PRBLEMAS Problema e causa Comentários e Sugestões ZER U BAIX RENDIMENT DE DNA Lise Incompleta Números insuficientes de células na amostra Reagentes não usados corretamente Diluição não ideal do DNA das colunas Amostras não homogeneizadas completamente e misturadas com solução L1/ Proteinase K. A mistura tem que ser colocada em vortex imediatamente depois da adição de solução L1. Para amostras de urina PelvoCheck : se o controle da amostra do PelvoCheck falhar, é possível que a amostra de urina esteja muito diluída. Isso pode ser devido ao fato de: 1. nenhuma amostra de urina de primeiro vazio foi coletada; 2. o volume de urina coletado foi muito grande (> 30 ml) 3. armazenamento e / ou transporte incorreto da amostra. Neste caso, é necessária uma nova coleta da amostra de urina Redução de atividade de Proteinase K: Dividir a proteinase K diluída em alíquotas e armazenar a -20 C por até 6 meses. Não recongelar as alíquotas individuais. Preparar soluções L3, W2 e a solução de proteinase K de acordo com a seção 8.1. Adicionar etanol aos lisados antes de carregá-los nas colunas Pré aquecer a Tampão E a 70 C antes da diluição. Aplicar o Tampão E diretamente no centro da membrana sílica. CLUNAS ENTUPIDAS Lise Incompleta Reagentes não usados corretamente Amostras não homogeneizadas completamente e misturadas com solução L1/ Proteinase K. A mistura tem que ser colocada em vortex imediatamente depois da adição de solução L1. Redução de atividade de Proteinase K: Dividir a proteinase K diluída em alíquotas e armazenar a -20 C por até 6 meses. Não recongelar as alíquotas individuais. Preparar soluções L3, W2 e a solução de proteinase K de acordo com a seção 8.1. Adicionar etanol aos lisados antes de carregá-los nas colunas. DESEMPENH NÃ IDEAL D DNA EM REAÇÕES ENZIMÁTICAS Excesso de etanol e sal Contaminação do DNA por substâncias inibidoras Certifique-se de centrifugar por pelo menos 1 minuto a g para que remova toda a solução W2 etanoica antes da diluição do DNA. Se por qualquer razão o nível de solução W2 tiver alcançado a saída da coluna após a secagem, repita a centrifugação. Não resfriar a solução W2 antes do uso. Solução fria não removerá o sal de maneira efetiva. Equilibre a solução W2 em temperatura ambiente antes do uso. Repetir a extração de DNA a partir da amostra original. 19

20 10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA A Greiner Bio-ne dispõe de um Departamento de Assistência Técnica com cientistas experientes, com conhecimentos práticos e teóricos em biologia molecular e produtos ocheck. Se você tiver alguma dúvida ou tiver alguma dificuldade em relação aos produtos ocheck, não hesite em contactar a Greiner Bio-ne diretamente via support.dx@gbo.com ou entre em contato com distribuidor local da Greiner Bio-ne. 11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENH Kit de Extração DNA ocheck é um acessório IVD para os ensaios da linha de produtos ocheck. desempenho analítico e específico do kit de extração DNA ocheck foi testado em combinação com ensaios relevantes. s dados estão disponíveis mediante solicitação. 20

21 12. PRTCLS CURTS Extração de DNA Sala 1 protocolo curto destina-se a extração de amostras individuais para PapilloCheck, PapilloCheck high-risk e PelvoCheck CT/NG. Se o DNA for extraído a partir de um pool de amostras de urina para o ensaio com PelvoCheck CT/NG ou amostras de placas subgingivais para ParoCheck, por favor consultar os respectivos protocolos de suporte disponíveis em 1. PREPARAÇÃ Checar se a centrífuga está configurada para temperatura (18-25 C) Preparar as soluções de trabalho de acordo com a seção 8.1 Configurar o bloco de aquecimento ou banho maria para 56 C e 70 C Pré aquecer o tampão de Eluição E a 70 C Preparar as amostras de acordo com a seção 8.2 Pipetar 250 μl de amostra em um tubo de reação de 1.5 ou 2.0 ml 2. PRÉ-LISE 80 μl Tampão L1 2.4 μl Carreador de RNA 20 μl Proteinase K Agitar brevemente! 56 C durante pelo menos 30 minutos Centrifugar brevemente! 3. LISE 250 μl Tampão L4 Agitar brevemente! 70 C por 15 minutos Centrifugar brevemente! 4. AJUSTE DAS CNDIÇÕES LIGAÇÃ DNA 300 μl etanol Agitar brevemente! Centrifugar brevemente! P R T C L C U R T 21

22 Extração de DNA Sala 1 5. LIGAÇÃ D DNA Preparar as Colunas Spin 450 μl lisado 1 minuto a g 450 μl lisado 1 minuto a g 6. LAVAGEM DAS CLUNAS SPIN 500 μl Tampão W1 1 minuto a g 600 μl Tampão W2 1 minuto a g 7. SECAGEM DAS CLUNAS SPIN Centrifugar 1 minuto a g 8. ELUIÇÃ D DNA 100 μl Tampão E (pré aquecido 70 C) 1 minuto a temperature ambiente (18-25 C) 1 minuto a g P R T C L C U R T 22