Handbok till PAXgene Blood RNA Kit

Juni 2015 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 50 (katalognr 762174) Version 2 762174 R2 1051083SV PreAnalytiX GmbH, Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon Producerad av QIAGEN GmbH för PreAnalytiX

Varumärken: PAXgene, PreAnalytiX (PreAnalytiX GmbH); QIAGEN, QIAcube (QIAGEN Group); BD Vacutainer, BD Hemogard, Safety-Lok (Becton, Dickinson and Company); Eppendorf (Eppendorf AG). PAXgene Blood RNA-kiten finns inte i alla länder; fråga gärna för mer information. Begränsat licensavtal Användning av denna produkt innebär att köparen eller användaren av PAXgene Blood RNA Kit godkänner följande villkor: 1. PAXgene Blood RNA Kit får endast användas i enlighet med handboken till PAXgene Blood RNA Kit och endast med produkter som ingår i kitet. PreAnalytiX ger ingen licens under någon av sina immateriella tillgångar för att använda eller inkludera komponenterna i detta kit med komponenter som inte ingår i detta kit förutom så som beskrivs i handboken till PAXgene Blood RNA Kit och ytterligare protokoll som finns på www.preanalytix.com. 2. Förutom de uttryckligen angivna licenserna, kan PreAnalytiX inte garantera att detta kit och/eller dess användning inte kränker oberoende tredje parts rättigheter. 3. Kitet och dess komponenter är licensierade för engångsbruk och ska inte återanvändas, lagas eller säljas vidare. 4. PreAnalytiX avsäger sig specifikt alla andra licenser, uttryckta eller underförstådda, förutom de specifikt stipulerade. 5. Köparen och användaren av kitet går med på att inte låta någon annan utföra något som kan leda till eller orsaka otillåtna situationer beskrivna ovan. 6. PreAnalytiX kan kräva upphävande av detta begränsade licensavtal i domstol, och ska ersättas för alla undersöknings- och rättegångskostnader, inkluderat advokatkostnad, vid åtgärder för att upprätthålla detta begränsade licensavtal eller någon av sina immateriella rättigheter avseende kitet och/eller någon av dess komponenter. För uppdaterade licensvillkor, se www.preanalytix.com. Villkorad försäljning Den nuvarande produkten levereras med en licens under vissa anspråk som gäller patentanspråken US-7 270 953 och US-7 682 790, liksom EP-1820793 B1 och utländska motsvarigheter, för användning av produkten för att bearbeta nukleinsyrakomplexet som bildas under provinsamlingen i ett PAXgene Blood RNA-rör. 2005-2015 PreAnalytiX GmbH, med ensamrätt. PreAnalytiX Company PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon Schweiz www.preanalytix.com PreAnalytiX distributörer PreAnalytiX produkter produceras för PreAnalytiX av QIAGEN eller BD och distribueras för PreAnalytiX av QIAGEN eller BD. Produkterna kan inte beställas från PreAnalytiX GmbH. Adressen till din lokala PreAnalytiX distributör finner du på sidan 71.

Innehåll Kitinnehåll 4 Symboler 7 Förvaringsförhållanden 9 Användningsområde 9 Begränsningar för produktanvändning 9 Kvalitetskontroll 9 Teknisk hjälp 10 Säkerhetsinformation 10 Inledning 13 Princip och användning 13 Provtagning och stabilisering 13 RNA koncentration och rening 18 Manuell RNA-rening 21 Automatiserad RNA-rening 32 Utrustning och reagenser som tillhandahålls av användaren 36 Viktiga anmärkningar 38 Användning av QIAcube 38 Starta QIAcube 38 Installation av protokoll på QIAcube 38 Laddning av QIAcube 39 Protokoll: Manuell rening av totalt RNA från humant helblod i PAXgene Blood RNA-rör (BRT) 49 Protokoll: Automatiserad rening av totalt RNA från humant helblod i PAXgene Blood RNA-rör (BRT) 55 Hjälp för felsökning 61 Bilaga A: Allmänna hänvisningar angående RNA-hantering 63 Bilaga B: Kvantifiering och bestämning av kvalitet för totalt RNA 64 Bilaga C: Hantering av PAXgene Blood RNA-rör 66 Beställningsinformation 67 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 3

Kitinnehåll PAXgene Blood RNA Kit (50) Katalognr 762174 Antal provpreparat 50 BR1 BR2 Resuspension Buffer (resuspenderingsbuffert) Binding Buffer* (bindningsbuffert) RES BUF BIND BUF 20 ml 18 ml BR3 Wash Buffer 1* (tvättbuffert 1) BR4 Wash Buffer 2 (tvättbuffert 2) (koncentrat) WASH BUF 1 WASH BUF 2 CONC 45 ml 11 ml BR5 Elution Buffer (elueringsbuffert) ELU BUF 6 ml RNFW Rnase-free Water (vatten, fritt från RNase) (flaska) PEL WASH 2 x 125 ml PK Proteinase K (proteinas K) (grönt lock) PROTK 2 x 1,4 ml PRC PAXgene RNA Spin Columns (PAXgene RNA-spinnkolonner) (röda) PAXgene RNA COL 5 x 10 PT Processing Tubes (reaktionsrör) (2 ml) PROC TUBE 6 x 50 Hemogard Secondary BD Hemogard Closures (sekundära BD Hemogard förslutningar) SEC CLOS 50 MCT Microcentrifuge Tubes (mikrocentrifugrör) (1,5 ml) MIC TUBE 3 x 50, 1 x 10 4 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

RNFD DNase I, RNase-free (DNase I, fritt från RNase) (lyofiliserat) DNA REM 1500 Kunitz units Tabellen fortsätter på nästa sida * Får ej komma i kontakt med desinfektionsmedel som innehåller blekmedel. Innehåller guanidinsalt. Se säkerhetsinformation på sidan 10. Tvättbuffert 2 (BR4) levereras som koncentrat. Tillsätt 4 volymer etanol (96 100 %, renhetsgrad p.a.) så som anges på flaskan innan den används för första gången för att framställa en bruksfärdig arbetslösning. Kunitz units är ett brukligt mått för mätning av DNase I; definierat som den mängd DNase I som orsakar en höjning av A260 med 0,001 per minut och milliliter vid 25 C och ph 5,0, varvid högpolymeriserat DNA används som substrat (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 och 363). Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 5

PAXgene Blood RNA Kit (50) Katalognr 762174 Antal provpreparat 50 RDD DNA Digestion Buffer (DNA digestionsbuffert) (vitt lock) DNA DIG BUF 2 x 2 ml DRB DNase Resuspension Buffer (DNase återsuspenderingsbuffert) (rör, lila lock) DNase RES BUF 2 ml PSC PAXgene Shredder Spin Columns (PAXgene Shredder-spinnkolonner) (lila) PAXgene SHRED COL 5 x 10 Handbook PAXgene Blood RNA Kit Handbook (handbok till PAXgene Blood RNA Kit) (version 2) 1 6 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Symboler <N> Innehåller reagenser som räcker för <N> tester Se bruksanvisningen Utgångsdatum Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik Katalognummer Lotnummer Materialnummer Komponenter Antal STERILE R KU Sterilisering genom strålning Kunitz units Tillsätta Innehåller Rekonstituerad Deoxyribonukleas I Etanol Guanidinisotiocyanat Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 7

RNase-Free DNase Set RNase-Free DNase Set GTIN-artikelnummer (Global Trade Item Number) Återanvänd inte Temperaturbegränsning Övre temperaturgräns Tillverkare Viktig anmärkning Skriv ner aktuellt datum efter att ha tillsatt etanol i flaskan Vid ankomst Leder till 8 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Förvaringsförhållanden PAXgene RNA-spinnkolonner (PRC), PAXgene Shredder-kolonner (PSC), proteinas K (PK) och alla buffertar (BR1, BR2, BR3, BR4 och BR5) kan förvaras torrt och vid den temperatur som anges på etiketten. RNase-Free DNase Set, som innehåller DNase I (RNFD), DNA digestionsbuffert (RDD) och DNase återsuspenderingsbuffert (DRB), skickas vid omgivningstemperatur. Direkt efter transporten ska alla komponenter som ingår i RNase-Free DNase Set förvaras i den temperatur som anges på etiketten. Vid korrekt förvaring är kitet stabilt fram till utgångsdatumet på kitlådan. Användningsområde PAXgene Blood RNA Kit används för att rena intracellulärt RNA ur helblod, som samlats in i PAXgene Blood RNA-röret (BRT). När kitet används med PAXgene Blood RNA-röret (BRT), tillhandahåller systemet renat intracellulärt RNA ur helblod för RT-PCR som används i molekylärdiagnostiska tester. Se produktcirkuläret till PAXgene Blood RNA Tube för information om användningen av PAXgene Blood RNA-rör (BRT). Prestandaegenskaperna för PAXgene Blood RNAsystemet gäller endast för FOS- och IL1B-gentranskriptioner. Användaren är ansvarig för att fastställa lämpliga prestandaegenskaper för PAXgene Blood RNAsystemet för andra target-transkript. Begränsningar för produktanvändning PAXgene Blood RNA Kit är avsett för rening av intracellulärt RNA ur humant helblod (4,8 x 10 6 1,1 x 10 7 leukocyter/ml) för in vitro-diagnostisk användning. Det är inte avsett för rening av genomisk DNA eller virala nukleinsyror ur humant helblod. På grund av det begränsade antalet transkript som har validerats avseende stabiliseringsspecifikationer (FOS- och IL1Bgentranskript) har man inte kunnat fastställa prestandaegenskaperna för alla transkript. Laboratoriepersonal ska granska tillverkarens uppgifter och sina egna uppgifter för att fastställa om det krävs en validering för andra transkript. Kvalitetskontroll För att säkerställa en enhetlig produktkvalitet testas varje lot av PAXgene Blood RNA Kit med fastlagda testkriterier enligt QIAGEN:s ISO-certifierade kvalitetsmanagementsystem. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 9

Teknisk hjälp Vi på QIAGEN är stolta över vår tekniska supports kvalitet och tillgänglighet. Våra avdelningar för teknisk support är bemannade med erfarna vetenskapsmän med bred praktisk och teoretisk expertis i molekylärbiologi och användningen av PreAnalytiX-produkter. Kontakta oss om du har frågor angående PAXgene Blood RNA Kit. Om du behöver teknisk hjälp eller mer information ringer du den tekniska servicen hos QIAGEN (se sidan 71). Säkerhetsinformation Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon även vid hantering av biologiskt eller kemiskt material, för att minimera risken för en infektion (t.ex. av HIV- eller hepatit B-virus) eller personskada. Mer information finns i lämpligt säkerhetsdatablad (SDS). Dessa är tillgängliga online i praktiskt och kompakt PDF-format på www.preanalytix.com/resources där du kan hitta, granska och skriva ut säkerhetsdatabladen för detta kit. VARNING: Tillsätt ALDRIG blekmedel eller sura lösningar direkt till avfallet från provberedningen. Bindningsbuffert (BR2) och tvättbuffert 1 (BR3) innehåller guanidintiocyanat, som kan bilda kraftigt reaktiva föreningar när de blandas med blekmedel. Om bindningsbuffert (BR2) eller tvättbuffert 1 (BR3) spills ut, ska utsatta ytor tvättas med lämpliga laboratorierengöringsmedel och vatten. Om den utspillda vätskan innehåller potentiellt smittbärande ämnen, ska ytan först rengöras med rengöringsmedel och vatten, och därefter med 1 % (v/v) natriumhypoklorit. RNA-stabiliseringslösningen och blodblandningen från PAXgene Blood RNAröret (BRT) kan desinficeras med 1 volym blekmedelslösning (5 % natriumhypoklorit) till 9 volymer RNA-stabiliseringslösning resp. blodblandning. Avfall från provberedning, t.ex. supernatanter efter centrifugeringssteg i RNAreningsproceduren, ska betraktas som potentiellt smittbärande. För att förstöra smittbärande material ska avfall därför först autoklaveras eller brännas innan det slängs. Beakta alltid gällande föreskrifter och riktlinjer angående avfallshantering. 10 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Nedanstående faro- och skyddsangivelser gäller för komponenter i PAXgene Blood RNA Kit. Se produktcirkuläret till PAXgene Blood RNA Tube för säkerhetsinformation om PAXgene Blood RNA-rör (BRT). BR2-buffert Innehåller: guanidintiocyanat. Fara! Skadligt vid förtäring. Skadligt vid hudkontakt eller inandning. Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Skadliga långtidseffekter för vattenlevande organismer. Utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra. Innehållet/behållaren lämnas till godkänd avfallsanläggning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/duscha. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN/läkare. Förvaras inlåst. Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. BR3-buffert Innehåller: etanol; guanidintiocyanat. Fara! Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Brandfarlig vätska och ånga. Utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra. Innehållet/behållaren lämnas till godkänd avfallsanläggning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/duscha. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN/läkare. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppna lågor. Rökning förbjuden. Förvaras på väl ventilerad plats. Förvaras svalt. Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 11

DNase I Innehåller: Desoxyribonukleas. Fara! Kan orsaka allergisk hudreaktion. Kan orsaka allergi- eller astmasymtom eller andningssvårigheter vid inandning. Undvik att andas in damm/rök/gaser/dimma/ångor/sprej. Innehållet/behållaren lämnas till godkänd avfallsanläggning. Vid besvär i luftvägarna: Kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRALEN/läkare. VID INANDNING: Vid andningssvårigheter, flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. Ta av nedstänkta kläder och tvätta dem innan de används igen. Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. Använd andningsskydd. Proteinas K Innehåller: Proteinas K. Fara! Orsakar mild hudirritation. Kan orsaka allergi- eller astmasymtom eller andningssvårigheter vid inandning. Undvik att andas in damm/rök/gaser/dimma/ångor/sprej. Innehållet/behållaren lämnas till godkänd avfallsanläggning. Vid besvär i luftvägarna: Kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRALEN/läkare. VID INANDNING: Vid andningssvårigheter, flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. Använd andningsskydd. 12 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Inledning Vid många molekylärbiologiska undersökningar av cellulärt RNA är insamling av helblod det första steget. Ett stort problem vid sådana undersökningar är instabiliteten hos den cellulära RNA-profilen in vitro. Undersökningar hos PreAnalytiX har visat att antalet kopior av enskilda mrna-varianter i helblod kan förändras mer än tusen gånger under transport eller förvaring vid rumstemperatur.* Detta beror både på snabb RNA-nedbrytning och inducerat uttryck av vissa gener efter blodtappningen. Sådana förändringar i RNAuttrycksprofilen förhindrar tillförlitliga resultat vid studier av genuttryck. Därför är det mycket viktigt att ha en metod som bevarar RNA-uttrycksprofilen under och efter blodtappning för en noggrann genuttrycksanalys i humant helblod. Princip och användning PreAnalytiX har utvecklat ett nytt system vilket möjliggör insamling, stabilisering, förvaring och transport av prover av humant helblod, tillsammans med ett snabbt och effektivt protokoll för isolering av intracellulärt RNA. Systemet består av PAXgene Blood RNA-rör (BRT; amerikanska patentnummer 6 602 718 och 6 617 170) för blodtagning och RNA-stabilisering, följt av manuell eller automatiserad RNA-rening med PAXgene Blood RNA Kit. Både manuella och automatiska protokoll erbjuder i stort samma prestandan avseende RNAkvalitet och -utbyte. Prestationsdata för det manuella protokollet (sidorna 21 31) och det automatiska protokollet (sidorna 32 35) är inkluderade i denna handbok. Provtagning och stabilisering PAXgene Blood RNA-rör (BRT) innehåller en äganderättsskyddad reagenssammansättning som är baserad på en patenterad RNAstabiliseringsmetod. Denna reagenssammansättning skyddar RNA-molekyler mot nedbrytning orsakad av RNaser och minimerar ex vivo-förändringar i genuttryck. PAXgene Blood RNA-rör (BRT) är avsedda för insamling av humant helblod och stabilisering av cellulärt RNA i upp till 3 dagar vid 18 25 C (Fig. 1 och 2, sidan 15 och 16) eller upp till 5 dagar vid 2 8 C (Fig. 3 och 4, sidan 17 och 18). För närvarande tillgängliga data visar stabilisering av cellulärt RNA i minst 8 år vid 20 C eller 70 C. För mer information från pågående studier för utvärdering av stabilitet under längre tidsperioder, kontakta QIAGEN:s tekniska service. * Rainen, L. et al. (2002) Stabilization of mrna expression in whole blood samples. Clin. Chem. 48, 1883. En långvarig studie av blodförvaring i PAXgene Blood RNA-rör pågår. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 13

Den faktiska tiden av RNA-stabiliseringen kan variera beroende på RNAvarianten och den därpå följande nedströmsapplikationen. På grund av det begränsade antalet transkript som har validerats avseende stabiliseringsspecifikationer (FOS- och IL1B-gentranskript) har man inte kunnat fastställa prestandaegenskaperna för alla transkript. Laboratoriepersonal ska granska tillverkarens uppgifter och sina egna uppgifter för att fastställa om det krävs en validering för andra transkript. 14 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Förvaring (dagar) Förvaring (dagar) Figur 1. RNA-stabilitet i blodprover vid 18 25 C: FOS. Blodprov från tio givare, med duplikatprover, förvarades vid 18 25 C i det angivna antalet dagar, följt av totalt RNArening. A Blod samlades in och förvarades i PAXgene Blood RNA-rör (BRT), följt av rening av totalt RNA med PAXgene Blood RNA Kit. B Blod samlades in och förvarades i vanliga blodtagningsrör med EDTA som antikoagulans, och totalt RNA renades med en extraktionsmetod av standardtyp (med organiska lösningsmedel) och kiselmembranbaserad RNA-rening. De relativa transkriptnivåerna av FOS bestämdes genom realtids-, duplex RT- PCR, med 18S-rRNA som intern standard. Värdena för alla prover är inritade, med visade medelvärden och standardavvikelser. De streckade linjerna anger assayens mätnoggrannhet ± 3x total precision (2,34 C T ). Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 15

Förvaring (dagar) Förvaring (dagar) Figur 2. RNA-stabilitet i blodprover vid 18 25 C: IL1B. Blod samlades in och totalt RNA renades, efter förvaring vid 18 25 C, så som beskrivs i Fig. 1. De relativa transkriptnivåerna av IL1B bestämdes med realtids-, duplex RT-PCR, med 18S-rRNA som intern standard. Värdena för alla prover är inritade, med visade medelvärden och standardavvikelser. De streckade linjerna anger assayens mätnoggrannhet ± 3x total precision (1,93 C T ). 16 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Förvaring (dagar) Förvaring (dagar) Figur 3. RNA-stabilitet i blodprov vid 2 8 C: FOS. Blodprov från tio givare, med duplikatprover, förvarades vid 2 8 C i det angivna antalet dagar, följt av totalt RNA-rening. A Blod samlades in och förvarades i PAXgene Blood RNA-rör (BRT), och totalt RNA renades med PAXgene Blood RNA Kit. B Blod samlades in och förvarades i vanliga blodtagningsrör med EDTA som antikoagulans, och totalt RNA renades med en extraktionsmetod av standardtyp (med organiska lösningsmedel) och kiselmembranbaserad RNA-rening. De relativa transkriptnivåerna av FOS bestämdes genom realtids-, duplex RT-PCR, med 18S-rRNA som intern standard. Värdena för alla prover är inritade, med visade medelvärden och standardavvikelser. De streckade linjerna anger assayens mätnoggrannhet ± 3x total precision (2,34 C T ). Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 17

Förvaring (dagar) Förvaring (dagar) Figur 4. RNA-stabilitet i blodprov vid 2 8 C: IL1B. Blod samlades in och totalt RNA renades, efter förvaring vid 2 8 C, så som beskrivs i Fig. 3. De relativa transkriptnivåerna av IL1B bestämdes med realtids-, duplex RT-PCR, med 18S-rRNA som intern standard. Värdena för alla prover är inritade, med visade medelvärden och standardavvikelser. De streckade linjerna anger assayens mätnoggrannhet ± 3x total precision (1,93 C T ). 18 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

RNA koncentration och rening PAXgene Blood RNA Kit används för att rena totalt RNA ur 2,5 ml humant helblod som samlats in i ett PAXgene Blood RNA-rör (BRT). Proceduren är enkel och kan utföras antingen manuellt eller automatiskt (se flödesschema). I båda fallen påbörjas reningen med en centrifugering för att pelletera nukleinsyrorna i PAXgene Blood RNA-röret (BRT). Pelleten tvättas och återsuspenderas, följt av manuell eller automatisk RNA-rening. I princip följer båda protokollen samma förfarande med samma kitkomponenter. Den manuella PAXgene Blood RNA-proceduren Blod Tillsätt proteinas K och bindningsbuffert Inkubera Överför till PAXgene Shredder-spinnkolonn Blanda Överför supernatant från genomflödet till mikrocentrifugröret Tillsätt etanol Ladda på PAXgene RNAspinnkolonn Tvätta pelleten Bind totalt RNA Tvätta Återsuspen dera Digerera DNA Överför till mikrocentrifugr ör Tvätta Eluera Värm till 65 C Färdigt RNA Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 19

Den automatiska PAXgene Blood RNA-proceduren Blod Tillsätt proteinas K och bindningsbuffert Inkubera Blanda Överför till PAXgene Shredderspinnkolonn Tillsätt etanol till genomflöde Tvätta pelleten Återsuspende ra Överför till mikrocentrifugrö r och ladda i QIAcubeskakapparaten Ladda på PAXgene RNA-spinnkolonn Bind totalt RNA Tvätta Digerera DNA Helautomatiserad på QIAcube Tvätta Överför PAXgene RNAspinnkolonn Eluera Stäng locken på mikrocentrifugrören och överför till QIAcubeskakapparaten Värm till 65 C Färdigt RNA 20 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Manuell RNA-rening Den återsuspenderade pelleten inkuberas i optimerade buffertar med proteinas K (PK), för att digerera proteiner. Ytterligare en centrifugering med PAXgene Shredder-spinnkolonnen (PSC) utförs för att homogenisera cell-lysatet och avlägsna rester av celldebris. Supernatanten av genomflödesfraktionen överförs till ett nytt mikrocentrifugrör. Etanol tillsätts för att justera bindningsförhållanden, och lysatet appliceras på en PAXgene RNA-spinnkolonn (RPC). Under en kortvarig centrifugering binds RNA selektivt till silikonmembranet efterhands som kontaminanter passerar igenom. Resterande kontaminationer avlägsnas genom flera effektiva tvättsteg. Mellan det första och andra tvättsteget behandlas membranet med DNase I (RNFD), för att avlägsna spårmängder av bundet DNA. Efter tvättstegen elueras RNA i elueringsbuffert (BR5) och värmedenatureras. Totalt RNA som renats med PAXgene Blood RNA System är höggradigt ren. Med det manuella protokollet är A 260 /A 280 -värdena mellan 1,8 och 2,2, och det finns 1 % (w/w) genomiskt DNA i 95 % av alla prover, enligt mätning med kvantitativ realtids-pcr av en sekvens av betaaktingenen. Minst 95 % av proverna visar ingen inhibition i RT-PCR, vid användning av upp till 30 % av eluatet. Vid användning av det manuella protokollet är genomsnittstiden för provbearbetning (baserat på 12 genomförda provberedningar) cirka 90 minuter, med endast 40 minuters hanteringstid. RNA-utbyten från 2,5 ml friskt humant helblod är 3 µg för 95 % av de bearbetade proven. Eftersom utbytet till stor del beror på givaren, kan det enskilda utbytet variera. För enskilda givare levererar PAXgene Blood RNA-systemet höggradigt reproducerbara och repeterbara utbyten (Fig. 5 och 6, sidan 22 och 23) och reproducerbar och repeterbar RT-PCR (Fig. 7 och 8, sidan 29 och 30), vilket gör det mycket robust för kliniska diagnostiska tester. Fig. 5 (sidan 22) visar total repeterbarhet och reproducerbarhet hos PAXgene Blood RNA-systemet. I vidare testserier undersöktes påverkan av olika PAXgene Blood RNA Kit-loter och olika laboranter på reproducerbarheten av RNA-utbytet och realtids-rt-pcr-resultatet. Eftersom poolade blodprov användes för dessa studier istället för prov som tagits individuellt med PAXgene Blood RNA-rör (BRT), speglar resultaten inte hela systemets repeteringsprecision, inklusive variationer mellan enskilda blodtappningar, utan endast repeteringsprecision för provberedningen (se Fig. 6, sidan 23). Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 21

Medelvärde av RNA-utbyte (µg/2,5 ml blod) RNA-utbyte (µg/2,5 ml blod) Givare Givare Figur 5. Reproducerbar och repeterbar RNA-rening. Fyrdubbla blodprov från 14 givare behandlades manuellt av tre olika laboratorietekniker (A, B och C). Därvid användes tre olika satser laboratorieutrustning, och alla prover som beretts av en enskild laboratorietekniker bearbetades med samma utrustning. A Medelvärden och standardavvikelser av RNA-utbytet per replikatprov från samma givare, utfört av olika laboratorietekniker, visas. B Tolv replikatblodprover från var och en av de 14 givarna bearbetades av de tre olika laboratorieteknikerna. Medelvärden och standardavvikelser för RNA-utbyte per prov från samma givare och alla laboratorietekniker visas. Hos alla RNA-proven varierade A 260 /A 280 - kvoterna mellan 1,8 och 2,2. 22 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

RNA-utbytets RNA-utbyte (µg/2,5 ml blod) Givarpool Givarpool Figur 6. Repeterbarhet och reproducerbarhet av RNA-utbyte med olika operatörer och olika loter av PAXgene Blood RNA Kit med poolade blodprov. Blodprov från 30 olika givare samlades in i PAXgene Blood RNA-rör (BRT; 12 rör per givare, dvs. tillsammans 360 rör). Innehållet i rören från 3 givare poolades och i därefter återigen alikvoterat till 36 prov. Dessa 36 prov per pool av tre givare bearbetades manuellt av tre olika laboranter. Varje laborant använde PAXgene Blood RNA Kit ur tre olika loter för extraktionen och bearbetade fyrdubbla prover från var och en av de tio givarpoolerna. A RNA-utbyte och standardavvikelse för varje laborant-lot-kombination. Fyrdubbla blodprover från 10 givarpooler bearbetades av tre olika laboranter (A, B, C), med var och en av de tre kitloterna (1, 2, 3). Det genomsnittliga utbytet (kolonner) och standardavvikelser (felstaplar) per fyrdubbla prover från en och samma givarpool för olika laboranter och olika kitloter presenteras. B RNA-utbytets variationskoefficient (CV) per givarpool för alla laborant- lotkombinationer (A, B, C; 1, 2, 3) beräknad utifrån det genomsnittliga utbytet och standardavvikelsen för utbytet som avbildas i Fig. 6A. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 23

Tabell 1A. Reproducerbarhet inom varje lot och inom varje användare för utvalda givarpooler (1, 6, 9, 10) Givarpool 1 5,1 x 10 6 celler/ml Givarpool 6 6,5 x 10 6 celler/ml Givarpool 9 8,4 x 10 6 celler/ml Givarpool 10 10,2 x 10 6 celler/ml Kombination av data Lot 1, användare A Lot 1, användare B Lot 1, användare C Lot 2, användare A Lot 2, användare B Lot 2, användare C Lot 3, användare A Lot 3, användare B Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) 8,03 0,42 5 9,55 0,99 10 7,52 0,41 6 7,96 0,49 6 7,98 1,17 15 9,38 1,94 21 8,82 1,72 19 8,90 0,76 9 7,87 0,45 6 10,71 0,65 6 10,14 1,46 14 10,22 1,29 13 7,32 0,98 13 9,78 1,89 19 6,92 0,27 4 7,63 1,23 16 6,09 1,04 17 9,82 2,83 29 7,20 0,71 10 7,00 0,56 8 6,87 0,31 4 10,37 0,74 7 9,14 1,52 17 11,56 1,21 10 7,04 0,90 13 8,96 0,68 8 8,18 0,76 9 7,85 0,82 10 6,98 1,22 17 7,73 0,97 13 6,41 0,88 14 8,88 2,17 24 CV (%) 24 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Lot 3, användare C 8,78 0,89 10 10,59 1,94 18 10,78 0,56 5 10,88 0,37 3 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 25

Tabell 1B. Reproducerbarheten inom varje användare och mellan alla loter för valda givarpooler (1, 6, 9, 10) Givarpool 1 5,1 x 10 6 celler/ml Givarpool 6 6,5 x 10 6 celler/ml Givarpool 9 8,4 x 10 6 celler/ml Givarpool 10 10,2 x 10 6 celler/ml Kombination av data Användare A, alla lotnummer Användare B, alla lotnummer Användare C, alla lotnummer Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) 7,46 0,85 11 9,43 1,22 13 7,54 0,72 10 7,81 0,82 11 7,02 1,31 19 8,98 2,09 23 7,48 1,50 20 8,26 1,54 19 7,84 0,98 13 10,56 1,15 11 10,02 1,34 13 10,89 1,10 10 CV (%) Tabell 1C. Reproducerbarhet inom varje lot och mellan alla användare för utvalda givarpooler (1, 6, 9, 10) Givarpool 1 5,1 x 10 6 celler/ml Givarpool 6 6,5 x 10 6 celler/ml Givarpool 9 8,4 x 10 6 celler/ml Givarpool 10 10,2 x 10 6 celler/ml Kombination av data Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) 26 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Lot 1, alla användare Lot 2, alla användare Lot 3, alla användare 7,96 0,69 9 9,88 1,34 14 8,83 1,63 19 9,02 1,27 14 6,76 0,93 14 9,99 1,84 18 7,75 1,36 18 8,73 2,31 26 7,60 1,27 17 9,09 1,71 19 8,46 1,99 24 9,20 1,80 20 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 27

Tabell 1D. Reproducerbarhet mellan alla loter och alla användare för utvalda givarpooler (1, 6, 9, 10) Givarpool 1 5,1 x 10 6 celler/ml Givarpool 6 6,5 x 10 6 celler/ml Givarpool 9 8,4 x 10 6 celler/ml Givarpool 10 10,2 x 10 6 celler/ml Kombination av data Lot 1, alla användare Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) CV (%) Medelutbyte (µg) SD (µg) 7,44 1,09 15 9,66 1,65 17 8,35 1,70 20 8,99 1,80 20 CV (%) Detaljerad analys av 4 representativa givarpooler. Poolerna valdes i enlighet med antalet vita blodkroppar och reflekterar de övre, mellersta och lägre värdena av det normala antalet vita blodceller (4,8 x 10 6 1,1 x 10 7 leukocyter/ml). Antalet vita blodkroppar representerar medelvärdet av antalet vita blodkroppar från de 3 givarna per givarpool. 28 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Laborant Laborant Figur 7. Reproducerbarhet för RT-PCR mellan användare RNA som renats i experimentet som beskrivs i Fig. 6 användes för realtids-rt-pcr. Relativa transkriptnivåer av A FOS och B IL1B bestämdes genom realtids-, duplex-rt-pcr, med 18S-rRNA som intern standard. Värdena för alla prover är inritade, relativt till värdena för användare 1 (10 givarpooler x 3 kitloter x 4 repetitioner = 120 datauppsättningar för varje gen) med medelvärden (röda linjer) och standardavvikelser (svarta staplar) för alla visade värden. De streckade linjerna anger assayernas totala precision ± 3x (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 29

Lot Figur 8. Reproducerbarhet för RT-PCR mellan kitloter. RNA som renats i experimentet som beskrivs i Fig. 6 användes för realtids-rt-pcr. Relativa transkriptnivåer av A FOS och B IL1B bestämdes genom realtids-, duplex-rt-pcr, med 18S-rRNA som intern standard. Värdena för alla prover är inritade, relativt till värdena för kitlot 1 (10 givarpooler x 3 användare x 4 repetitioner = 120 datauppsättningar för varje gen) med medelvärden (röda linjer) och standardavvikelser (svarta staplar). De streckade linjerna anger assayernas totala precision ± 3x (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). Lot 30 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Tabell 2. Sammanfattning av RT-PCR-resultaten från Fig. 7 och 8 Testsystem FOS/ 18S rrna assay IL1B/18S rrna assay Jämförelse av data Medelvärde ( C T ) ± SD ( C T ) Medelvärde ( C T ) ± SD ( C T ) Reproducerbarheten mellan alla loter för varje laborant Alla användare, lot 1 lot 1 Alla användare, lot 1 lot 2 Alla användare, lot 1 lot 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,48 0,07 0,66 0,21 0,52 0,11 0,71 Reproducerbarheten mellan alla loter för varje laborant Alla loter, användare A användare A Alla loter, användare A användare B Alla loter, användare A användare C 0,00 0,00 0,00 0,00 0,46 0,44 0,06 0,69 0,31 0,60 0,15 0,71 Laborant: Tekniker som genomförde experimenten. Lot: Nummer på kitlot som användes i studien. SD: Standardavvikelse. Genomsnittliga C T -värden (N = 120) och standardavvikelser visas för data som presenteras i Fig. 7 och 8. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 31

Automatiserad RNA-rening Provberedning med QIAcube följer samma steg som den manuella proceduren, vilket gör att du kan fortsätta använda PAXgene Blood RNA Kit för rening av högkvalitativ RNA. Se användarhandboken till QIAcube (QIAcube User Manual) och www.qiagen.com/myqiacube för mer information om QIAcube. Det automatiserade RNA-reningsprotokollet består av 2 delar (eller protokoll), PAXgene Blood RNA Part A och PAXgene Blood RNA Part B, med ett kortvarigt manuellt ingripande mellan de två delarna. Den centrifugerade, tvättade och återsuspenderade nukleinsyrapelleten (se RNA-koncentration och -rening, sidan 19) överförs från PAXgene Blood RNAröret (BRT) till reaktionsrör (PT), vilka placeras i termoskakapparaten på QIAcube-arbetsbordet. Laboranten väljer och startar protokollet PAXgene Blood RNA Part A från menyn. QIAcube utför stegen i protokollet till och med eluering av RNA i elueringsbuffert (BR5). Laboranten överför mikrocentrifugrören (MCT), som innehåller renad RNA, till termoskakapparaten för QIAcube. Laboranten väljer och startar protokollet PAXgene Blood RNA Part B från menyn, och värmedenaturering utförs av QIAcube. Den genomsnittliga tiden för provberedning (baserat på 12 genomförda RNAberedningar) är cirka 125 minuter, varav hanteringstiden utgör cirka 20 minuter. RNA-utbyten från 2,5 ml friskt humant helblod är 3 µg för 95 % av de bearbetade proven. Fig. 9 (sidan 33) visar RNA-utbytet från totalt 288 prover beredda med det automatiska protokollet med 3 kitloter av 3 laboranter. Eftersom poolade blodprover har använts istället för prov som tagits individuellt med PAXgene Blood RNA-rör (BRT) återspeglar testens resultat inte det förväntade RNA-utbytet från enstaka prover av individuella blodtappningar. Eftersom utbytet till stor del beror på givaren, kan det enskilda RNA-utbytet variera (Fig. 9, sidan 33). 32 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

RNA-utbyte (µg/2,5 ml blod) Figur 9. RNA-utbyte automatiserad bearbetning. Blodprov från 48 givare samlades in i PAXgene Blood RNA-rör (BRT) (6 rör per givare, dvs. tillsammans 288 rör). Innehållet i rören från 6 givare poolades och därefter återigen alikvoterat till 36 prov. Dessa 36 prover per pool av 6 givare bearbetades av tre olika laboranter (A, B, C). Varje laborant använde PAXgene Blood RNA Kit ur tre olika loter (1, 2, 3) för automatiserad extraktion och bearbetade fyrdubbla prover ur var och en av de 8 givarpoolerna. RNA-utbytet för alla de individuella proverna visas för varje laborant-lotkombination. Minst 95 % av proverna visar ingen inhibition i RT-PCR, vid användning av upp till 30 % av eluatet. Med det automatiserade protokollet är korskontamination mellan proverna omöjlig att upptäcka, om den mäts med kvantitativ, realtids- RT-PCR av sekvenser av betaglobin- och FOS-transkript i RNA-negativa prover (vatten) jämfört med RNA-positiva prover (humant helblod) i samma körning. RNA renat med PAXgene Blood RNA-systemet och det automatiserade protokollet är höggradigt rent, vilket visas genom bristen på RT-PCR-inhibition (se ovan) och A 260 /A 280 -värden mellan 1,8 och 2,2. Genomiskt DNA finns till 1 % (w/w) i 95 % av alla prover, uppmätt med kvantitativ realtids-pcr av en sekvens av betaaktingenen. Fig. 10 och 11 visar A 260 /A 280 -värden och relativt genomiskt DNA för totalt 288 prover beredda med det automatiserade protokollet med 3 kitloter av 3 laboranter. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 33

Genomiskt DNA (w/w) (%) RNA-renhet (A 260 /A 280 ) Figur 10. RNA-renhet (A 260 /A 280 -värden) automatiskt bearbetade. RNA renades av 3 olika laboranter (A, B, C) med 3 olika loter (1, 2, 3) av PAXgene Blood RNA Kit i experimentet som beskrivs i Fig. 9. A 260/A 280 -värden för alla individuella prover visas för varje laborant-lotkombination. Figur 11. RNA-renhet (% genomiskt DNA-kontamination) automatiserad bearbetning. RNA renades av 3 olika laboranter (A, B, C) med 3 olika loter (1, 2, 3) av PAXgene Blood RNA Kit i experimentet som beskrivs i Fig. 9. Genomiskt DNA-mängder (w/w) i alla individuella prover visas för varje laborant- lot-kombination. Det automatiserade protokollet för RNA-rening med PAXgene Blood RNAsystemet levererar höggradigt reproducerbara och repeterbara RT-PCR-resultat, som visas i Fig. 12 (sidan 35), vilket gör det mycket robust för kliniska diagnostiska tester. 34 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Medel värde Medel värde Figur 12. Reproducerbarheten hos RT-PCR mellan automatiserade och manuella protokoll. RNA renades av 3 olika laboranter (A, B, C) med 3 olika loter (1, 2, 3) av PAXgene Blood RNA Kit med det automatiserade protokollet i experimentet som beskrivs i Fig. 10. Samtidigt renades RNA från motsvarande replikatrör med det manuella protokollet. Relativa transkriptnivåer av A FOS och B IL1B bestämdes genom realtids-, duplex-rt-pcr, med 18SrRNA som intern standard. Möjliga skillnader i transkriptnivåer mellan RNA preparerat från parade blodprover med både extraktionsprotokoll (automatiserade och manuella protokoll) beräknades med C T -metoden. Individuella C T -värden för alla provpar (4 replikat x 8 givarpooler x 3 kitloter x 3 laboranter= 288 par för varje gen) är inritade som enstaka punkter med medelvärden (större punkter) och standardavvikelse (svarta staplar) för alla prover som visas. De streckade linjerna anger assayernas totala precision ± 3x (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 35

Utrustning och reagenser som tillhandahålls av användaren Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Mer information finns i tillämpliga säkerhetsdatablad (SDS) som kan erhållas från produktleverantören. För alla protokoll PAXgene Blood RNA-rör (BRT, kat. nr. 762165) Etanol (96 100 %, renhetsgrad p. a.) Pipetter* (10 μl till 4 ml) Sterila RNase-fria pipettspetsar med aerosolbarriär Graderad mätcylinder Centrifug* som kan komma upp i 3 000 5 000 x g, utrustad med en swing-out-rotor och bägare som rymmer PAXgene Blood RNA-rör (BRT) Vortexblandare* Krossad is Permanent penna för märkning För det manuella protokollet Mikrocentrifug* med variabel hastighet 1 000 8 000 x g, med rotor för 2 ml mikrocentrifugrör Skakinkubator* som kan inkubera vid 55 C och 65 C och skaka vid 400 rpm, inte överstigande 1 400 rpm (t.ex. Eppendorf Thermomixer Compact eller liknande) * Se till att instrumenten har kontrollerats, underhållits och kalibrerats regelbundet enligt tillverkarens rekommendationer. Se till att du känner till instruktionerna för hantering av RNA (Bilaga A, sidan 63). För tillsatsen av etanol till buffert BR4-koncentratet. 36 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

För det automatiserade protokollet QIAcube* (QIAGEN, kat.nr. 9001882 [110 V], kat.nr. 9001293 [230 V]) Sax QIAcube-konsumtionsprodukter Filter-Tips, 1000 μl (1024) (QIAGEN, kat. nr. 990352) Reagensflaskor, 30 ml (6) (QIAGEN, kat. nr. 990393) Rotoradaptrar (10 x 24) (QIAGEN, kat. nr. 990394) QIAcube-tillbehör Ställ för reagensflaskor (QIAGEN, kat. nr. 990390) Ställ för rotoradapter (QIAGEN, kat. nr. 990392) * Se till att instrumenten har kontrollerats, underhållits och kalibrerats regelbundet enligt tillverkarens rekommendationer. Även inkluderat i startpaketet, QIAcube (QIAGEN, kat. nr. 990395). Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 37

Viktiga anmärkningar Användning av QIAcube Se till att du känner till hur man använder QIAcube. Läs användarhandboken till QIAcube och annan information som medföljer QIAcube, och lägg särskilt märke till säkerhetsinformationen innan du påbörjar de automatiserade PAXgene Blood RNA-protokollen. Starta QIAcube Stäng QIAcube-luckan och slå på QIAcube med strömbrytaren (se Fig. 13, sidan 39). Ett tutande ljud hörs och startskärmen visas. Instrumentet utför själv initialiseringstestet. Installation av protokoll på QIAcube Det är nödvändigt att installera protokollet innan den första RNAberedningskörningen kan göras på QIAcube. Installera protokollen PAXgene Blood RNA Part A och PAXgene Blood RNA Part B. Protokollen finns på www.qiagen.com/myqiacube och måste laddas ner till USB-minnet som medföljer QIAcube och överföras till QIAcube via USB-porten. USB-porten, som finns bakom skyddsluckan (se Fig. 13, sidan 39), ansluter QIAcube till ett USB-minne (medföljer QIAcube). Datafiler, såsom loggfiler eller rapportfiler, kan också överföras via USB-porten från QIAcube till USB-minnet. USB-porten är endast avsedd för USB-minnet som tillhandahålls av QIAGEN. Anslut inte andra enheter till denna port. Ta inte bort USB-minnet när du laddar ner protokoll eller överför filer, eller under en protokollkörning. 38 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

2 1 3 4 6 5 Figur 13. QIAcube sedd framifrån. 1 Pekskärm 4 USB-port bakom skyddsluckan 2 Lucka 5 Strömbrytare 3 RS232 seriell port bakom skyddsluckan (endast avsedd för QIAGEN:s instrumentservicespecialister) 6 Avfallslåda Laddning av QIAcube För att spara tid kan laddningen göras under en eller båda av de två 10- minuters centrifugeringsstegen (steg 3 och 5) i Protokoll: Automatiserad rening av totalt RNA från humant helblod i PAXgene Blood RNA-rör (BRT), sidan 55. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 39

Reagensflaskor Fyll försiktigt 4 QIAcube-reagensflaskor med reagenserna som beskrivs i tabell 3 (fyll flaskorna upp till markeringen på reagensflaskorna). Märk flaskor och lock tydligt med buffertnamn och ställ dem i lämplig position i stället för reagensflaskor (se Fig. 14, sidan 41). Före varje körning i QIAcube fyller du noga de fyra reagensflaskorna som listas i tabell 3 upp till markeringen för maxnivå, eller, om detta inte är möjligt, till den nivå som tillåts av de buffertvolymer som tillhandahålls i PAXgene Blood RNA Kit. Märk flaskor och lock tydligt med buffertnamn och ställ de fyllda reagensflaskorna i rätt positioner i stället för reagensflaskor. Sätt stället på QIAcube-arbetsbordet så som visas (Fig. 14 och 15, sidan 41). Den tillhandahållna volymen av buffert BR2 kan inte fylla en reagensflaska upp till markeringen. Buffertarna BR3 och BR4 kan eventuellt inte fylla flaskan upp till markeringen efter bearbetning av flera prover i föregående körningar. Ta bort locken innan flaskorna placeras på arbetsbänken. Buffertvolymerna i PAXgene Blood RNA Kit (50) är tillräckliga för maximalt 7 RNA-beredningskörningar på QIAcube. Flera körningar med färre prover ska undvikas för att buffertvolymen ska räcka till bearbetning av samtliga 50 prover. Tabell 3. Positioner i reagensstället Position Reagens 1 Bindningsbuffert (BR2) 2 96 100 % etanol 3 Tvättbuffert 1 (BR3) 4 Tvättbuffert 2 (BR4)* 5 (lämna tomt) 6 (lämna tomt) * Tvättbuffert 2 (BR4) levereras som ett koncentrat. Tillsätt 4 volymer etanol (96 100 %, renhetsgrad p.a.) så som anges på flaskan innan den används för första gången för att framställa en bruksfärdig arbetslösning. A 40 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Position 1 Bindnings buffert (BR2) Position 2 96 100 % etanol Position 3 Tvättbuffer t 1 (BR3) Position 4 Tvättbuffer t 2 (BR4) B Position 5 tom Position 6 tom Figur 14. Laddning av stället för reagensflaskor. A Schema för positioner och innehåll i flaskorna i stället för reagensflaskor. B Laddning av stället på QIAcube. 1 8 9 2 5 6 7 3 4 Figur 15. Insidan av QIAcube. 1 Centrifuglock 6 Mikrocentrifugrörsfack 2 Centrifug 7 Spetshållare 3 Skakapparat 8 Kasseringsfack för spetsar och kolonner 4 Ställ för reagensflaskor 9 Robotarm 5 Spetssensor Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 41

Spinnkolonner (PRC, PSC), mikrocentrifugrör (MCT) och QIAcubelaboratoriematerial i plast. Placera 2 spetshållare fyllda med filterspetsar 1000 μl på QIAcube (se Fig. 15, sidan 41). Fyll vid behov på ställen med spetsar. Använd bara 1 000 µl filterspetsar avsedda för användning med QIAcube. Märk rotoradaptrar och mikrocentrifugrör (MCT) för varje prov med en permanent märkpenna. Öppna PAXgene Shredder-spinnkolonnerna (PSC) som ska användas och klipp av locken helt med en sax (se Fig. 16). För att QIAcube-robotgriparen ska fungera korrekt, tar du bort (klipp av) locket het och alla plastdelar som fäster locket vid PAXgene Shredder-spinnkolonnerna (PSC; se Fig. 16). Annars kan robotgriparen inte greppa spinnkolonnerna (PSC, PRC) ordentligt. Ladda PAXgene RNA-spinnkolonnen (PRC), PAXgene Shredder-spinnkolonnen (PSC, utan lock), och det märkta mikrocentrifugröret (MCT) i rätt positioner i varje märkt rotoradapter enligt illustrationen i tabell 4 och Fig. 17 (sidan 43). Se till att spinnkolonnens (PRC) och mikrocentrifugrörets (MCT) lock är helt nedtryckta i botten i facken på rotoradapterns kant, annars kommer locken att lossna vid centrifugering. Kolonnlock borttaget på rätt sätt Kolonnlock borttaget på fel sätt; en del av locket sitter kvar Figur 16. Laddning av PAXgene Shredder-spinnkolonn (PSC). PAXgene Shredderspinnkolonn (PSC) laddas i rotoradapterns mellanposition. Klipp av locket innan kolonnen laddas (PSC). 42 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Tabell 4. Labbprodukter i rotoradaptern Position Reagens Lockposition 1 PAXgene RNA-spinnkolonn (röd, PRC) L1 2 PAXgene Shredder-spinnkolonn (lila, PSC) (klipp av lock före placering i rotoradapter) 3 Mikrocentrifugrör (MCT)* L3 * Använd de mikrocentrifugrör (1,5 ml) som medföljer PAXgene Blood RNA Kit. Figur 17. Positioner i rotoradaptern. Rotoradaptern har tre rörpositioner (1 3) och tre lockpositioner (L1 L3). Laddning av centrifugen Ladda de monterade rotoradaptrarna i centrifugbägarna enligt illustrationen i Fig. 18 (sidan 44). Vid bearbetning av färre än 12 prover, se till att ladda centrifugrotorn så att den är radialt balanserad (se Fig. 19, sidan 45). Alla centrifugbägare måste monteras före protokollkörningen, även om färre än 12 prover ska bearbetas. Ett enda prov eller 11 prover kan inte bearbetas. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 43

Figur 18. Laddning av centrifugen. Ladda de monterade rotoradaptrarna i centrifugbägarna. 44 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

2 prover 3 prover 4 prover 5 prover 6 prover 7 prover 8 prover 9 prover 10 prover Figur 19. Laddning av centrifug och skakapparat. Centrifug- och skakarpositioner visas för bearbetning från två (2 prover) till tio (10 prover) prover. Ett enda eller 11 prover kan inte bearbetas. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 45

Reaktionsrör (PT) Ta bort alla reaktionsrör (PT) som finns kvar i facken för mikrocentrifugrören från tidigare körningar (se Fig. 15, sidan 41). Fyll 3 reaktionsrör (PT) med den mängd reagens som angivits i tabell 5, enligt antalet prover i körningen. För DNase I-inkubationsblandning pipetterar du den angivna volymen DNA digestionsbuffert (RDD) i ett reaktionsrör (PT) och tillsätter den angivna mängden DNase I (RNFD)-stamlösning. Blanda försiktigt genom att pipettera den färdiga blandningen upp och ner 3 gånger med en 1 000 µl pipettspets. Använd de reaktionsrör (PT) på 2 ml som medföljer PAXgene Blood RNA Kit. Märk rören (PT) tydligt med reagensnamn och placera dem i lämplig position i mikrocentrifugrörsfacken, enligt illustrationen i tabell 6 (sidan 48). DNase I (RNFD) är mycket känsligt för fysikalisk denaturering. Blanda endast genom pipettering, med användning av pipettspetsar med vid kanal för att reducera motstånd. Undvik vortexblandning. Se till att endast pipettera den erforderliga mängden som angivits i tabell 5. Tabell 5. Mängden reagens som behövs i reaktionsrören för mikrocentrifugrörsfacken Antal prover Proteinase K (PK) Reagensvolym för angivet antal prover (µl) DNase I inkubationsblandning 2 126 187 (23 DNase I + 164 Buffer RDD) Elueringsbuffert (BR5) 313 3 170 261 (33 DNase I + 228 Buffer RDD) 4 213 334 (42 DNase I + 292 Buffer RDD) 5 256 407 (51 DNase I + 356 Buffer RDD) 6 299 481 (60 DNase I + 421 Buffer RDD) 7 342 554 (69 DNase I + 485 Buffer RDD) 8 386 627 (78 DNase I + 549 Buffer RDD) 399 486 572 658 745 831 46 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

9 429 701 (88 DNase I + 613 Buffer RDD) 10 472 775 (97 DNase I + 678 Buffer RDD) 12 558 921 (115 DNase I + 806 Buffer RDD) 918 1004 1177 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 47

Tabell 6. Mikrocentrifugrörsfack Position A B C Innehåll Proteinase K (PK) DNase I inkubationsblandning Elueringsbuffert (BR5) Behållare Reaktionsrör (PT)* Reaktionsrör (PT)* Reaktionsrör (PT)* * Använd reaktionsrören (PT) på 2 ml som medföljer PAXgene Blood RNA Kit. 48 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015

Protokoll: Manuell rening av totalt RNA från humant helblod i PAXgene Blood RNA-rör (BRT) Viktigt att tänka på innan du börjar Kontrollera att kitet är intakt och oskadat och att buffertarna inte har läckt. Använd inga kit med synliga skador. När du använder en pipett kontrollerar du att korrekt volym är inställd och att vätska aspireras och dispenseras noggrant och fullständigt. För att förhindra att ett prov överförs till fel reaktionsrör eller spinnkolonn, ser du till att alla rör och kolonner märks på rätt sätt med en permanent märkpenna. Märk locken och rören (PT, MCT). Märk även spinnkolonnernas reaktionsrör (PT). Förslut alltid reaktionsrören eller kolonnerna när vätska har tillsatts. Om prov- eller buffertvätska spills ut under proceduren kan RNA-utbytet och -renheten reduceras. Om inget annat anges, ska alla protokollsteg, inklusive centrifugeringarna, genomföras vid rumstemperatur (15 25 C). På grund av sensitiviteten hos nukleinsyraamplifikationsmetoder ska nedanstående försiktighetsåtgärder vidtas vid provhantering för att förhindra korskontamination: Pipettera försiktigt provet i spinnkolonnen (PRC, PSC) utan att fukta kolonnens rand. Byt alltid pipettspetsar mellan vätskeöverföringar. Använd pipettspetsar med aerosolbarriär. Se till att membranet i kolonnen (PRC, PSC) inte kommer i kontakt med pipettspetsen. Efter vortexblandning eller upphettning av ett mikrocentrifugrör (MCT), ska du centrifugera kortvarigt för att få bort dropparna från lockets insida. Bär handskar under hela proceduren. Om handskarna kommer i kontakt med provet ska de genast bytas ut. Förslut alltid spinnkolonnen (PRC, PSC) innan den sätts in i mikrocentrifugen. Centrifugera enligt protokollets angivelser. Öppna endast en spinnkolonn (PRC, PSC) åt gången och var noga med att undvika aerosolbildning. Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015 49

För en effektiv parallellbearbetning av flera prov fyller du ett ställ med reaktionsrör (PT), i vilket spinnkolonnerna (PRC, PSC) kan placeras efter centrifugeringen. Kassera de använda reaktionsrören (PT) som innehåller filtrat och ställ in nya reaktionsrör (PT) med spinnkolonner (PRC, PSC) direkt i mikrocentrifugen. Saker som ska utföras före start Samla in blod i PAXgene Blood RNA-rör (BRT) enligt anvisningarna i produktcirkuläret för PAXgene Blood RNA-rör. Vid behov går du till Bilaga C (sidan 66) där det finns rekommendationer om hur PAXgene Blood RNArör (BRT) ska hanteras. Se till att PAXgene Blood RNA-rör (BRT) inkuberas i minst 2 timmar vid rumstemperatur efter blodtagning för att garantera att blodcellerna har lyserats helt. Inkubation av PAXgene Blood RNA-rör (BRT) över natten kan leda till ett högre utbyte. Om PAXgene Blood RNA-röret (BRT) har förvarats vid 2 8 C, 20 C eller 70 C efter blodtagning, ska röret först utjämnas till rumstemperatur och sedan förvaras vid rumstemperatur i två timmar innan proceduren inleds. Läs säkerhetsinformationen på sidan 10. Läs riktlinjerna om hantering av RNA (Bilaga A, sidan 63). Se till att alla instrument, t.ex. pipetter och skakinkubatorn, kontrolleras och kalibreras regelbundet enligt tillverkarens angivelser. En skakinkubator behövs för protokollsteg 5 och 20. Ställ in skakinkubatorns temperatur på 55 C. I bindningsbufferten (BR2) kan en fällning bildas vid förvaring. Vid behov kan denna lösas upp genom uppvärmning till 37 C. Tvättbuffert 2 (BR4) levereras som koncentrat. Tillsätt 4 volymer etanol (96 100 %, renhetsgrad p.a.) så som anges på flaskan innan den används för första gången för att framställa en bruksfärdig arbetslösning. Innan RNase-Free DNase Set används för första gången ska en DNase I- stamlösning beredas. Lös upp DNase I (RNFD; 1500 Kunitz units)* i 550 μl DNase-återsuspenderingsbuffert (DRB), som levereras med kitet. Se till att inget DNase I (RNFD) går förlorat när behållaren öppnas. Rekonstituerat DNase I (RNFD) får inte vortexblandas. DNase I är mycket känsligt för fysikalisk denaturering. Blandning ska endast utföras genom att röret vänds försiktigt. * Kunitz units är ett brukligt mått för mätning av DNase I; definierat som den mängd DNase I som orsakar en höjning av A 260 med 0,001 per minut och milliliter vid 25 C och ph 5,0, varvid högpolymeriserat DNA används som substrat (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 och 363). 50 Handbok till PAXgene Blood RNA Kit 06/2015