Teknisk rapport över genetiska analyser på varg i Sverige år 2013 Mikael Åkesson Grimsö forskningsstation

Transkript

1 Teknisk rapport över genetiska analyser på varg i Sverige år 2013 Mikael Åkesson Grimsö forskningsstation

2 SAMMANFATTNING Åkesson M (2014) Teknisk rapport över genetiska analyser på varg i Sverige år DNA-analyser av vargprov har under 2013 utförts inom ramen för en överenskommelse (dnr ) mellan Naturvårdsverket och Grimsö forskningsstation. Denna tekniska rapport är en redogörelse över prov som analyserats under 2013 samt en sammanställning över vilken framgång vi haft med att använda dessa för att identifiera art och population, födelserevir och individer. Under 2013 har Grimsö analyserat 627 prov från 18 olika län. Dessa har leverats främst från Länsstyrelser, men även från Statens Veterinärmedicinska anstalt (SVA) och Skandinaviska vargforskningsprojektet (SKANDULV). Totalt har 67 prov, fördelat på 35 ärenden analyserats med s.k. akut prioritet. Detta innebär att DNA-analys gjorts med avsikt att leverarera resultat inom fem arbetsdagar från provet inkomstdatum. Svarstiden var i genomsnitt 3.5 dagar och vi översteg aldrig den målsatta tiden på fem arbetsdagar. Från 56 av 67 akuta prov, gick det att dra säkra slutsatser om art- och populationstillhörhet. I 41 fall rörde det sig om Skandinavisk varg och i sju fall om varg med icke-skandinaviskt ursprung. Totalt 560 prov analyserades i syfte att bedöma status i vargrevir, särskilja vargrevir, identifiera revirhävdande djur samt identifiera och bestämma härkomsten för vargar som påträffats döda eller som har fällts under jakt. Majoriteten av proven (80 %) analyserades och rapporterades under första halvan av För 513 av 560 prov kunde vi bekräfta att provet kom från varg, varav 503 kom från skandinaviska vargar, fyra från en finskrysk varg och de resterande sex proven kom från vargar med obekräftat ursprung. Födelsereviret bestämmas i 474 fall, motsvarande 94 % av de 503 skandinaviska vargarna. Denna relativt höga analysframgång, med högre andel artbestämda prov, högre andel vargar med bestämd identitet och föräldraskap beror delvis på att vi gjort ett urval av 675 spillningar, som innan analys på mikrosatellitmarkörer har screenats, vilket innebär att spillning med låg DNA-kvalitet kunnat sorteras bort. Under 2013 identifierades totalt 267 individer. Födelsereviret kunde bestämmas för 153 av de 162 individerna som identifierades först Under 2013 identifierades fyra individer med finsk-rysk härkomst, varav två individer (G23-13 och G31-13) inte påträffats tidigare år. I rapporten redogör vi även för ett antal utvecklingsprojekt. Vi jämförde bland annat framgången för spillningar förvarade i silicagel med förvaring i frys och visar att analysframgången skiljer sig lite mellan metoderna. Detta innebär att vi ger klartecken för att använda silicagel som lagringsmetod. Ytterligare ett projekt som påbörjades 2013 är utvärdingen av insamlat urin-dna, med olika förvaringsmetoder. Vi har kunnat visa att urin-dna i vissa fall fungera bra för genetisk analys, men fortsatta analyser behövs för att utvärdera lämpliga insamlings- och lagringsmetoder samt kvantitativt hur framgångsrik användandet av urin-dna är. Under 2013 sammanställdes dessutom den första gemensamma databasen över identifierade vargar i Norge och Sverige. Idag innehåller den gemensamma databasen 1243 individer, samtliga inlagda i Rovbase ( och databasen uppdateras kontinuerligt. Mikael Åkesson (mikael.akesson@slu.se), Grimsö forskningsstation, Sveriges lantbruksuniversitet (SLU), Riddarhyttan. 2

3 INNEHÅLL SAMMANFATTNING 2 INNEHÅLL 3 INLEDNING 4 METODIK 4 Extraktion av DNA 5 Screening 5 Markörer 6 Art- och populationsbestämning med mikrosatelliter 7 Artbestämning med mitokondrie-dna 7 Individbestämning 8 Könsbestämning 8 Födelserevir 8 Utvärdering av förvaringsmetod 8 RESULTAT OCH DISKUSSION 9 Akutärenden 9 Normalprioriterade ärenden 11 Individer 14 Tiveden 14 Förvaring i silicagel 14 Sammanslagning av individdatabaser från Norge och Sverige 15 Pågående utveckling av DNA-analys av urin i snö 15 REFERENSER 16 BILAGA 1 3

4 INLEDNING Vargarna i Skandinavien utgör en geografiskt avgränsad population som breder ut sig i delar av Sverige och Norge. I Sverige ansvarar Länsstyrelserna för inventeringen av vargarna, vilken i sin tur kvalitetsäkras, utreds och sammanställs av Viltskadecenter (SLU). DNA-analys är ett av verktygen som används vid inventeringen av den Skandinaviska vargpopulationen. Analyserna av svenska prover sker på DNA-laboratoriet vid Grimsö forskningsstation (SLU), som i enlighet med en överenskommelse (dnr ) mellan Naturvårdsverket och Grimsö forskningsstation har uppdraget att under perioden genom DNA-analys bistå inventeringen av svenska vargpopulationen samt ge råd och underlag vid löpande förvaltningsbeslut. Ytterligare en del av uppdraget är att övervaka populationsgenetiska parametrar, utveckla metoder, rådgöra vid utveckling av forskningsprojekt och att bidra till utvecklingen av en nordisk gemensam databas för varggenotyper. I Norge görs motsvarande DNA-analyser vid laboratoriet till Rovdata i Trondheim. Här redogör vi för DNA-analyser som utförts på Grimsö forskningsstation under året 2013 inom ramen för ovan nämnda avtal med Naturvårdsverket. I rapporten anges och sammanställs vilka prover som analyserats, var de har samlats in samt vilka slutsatser vi kunnat dra från proven med avseende på art, population, individ, kön och föräldraskap. Dessutom redogör vi för resultaten från flera pågående och avslutade utvecklingsprojekt, däribland Användning av ett nytt insamlingsmedium (silicagel) för enklare och bättre förvaring av insamlade spillningsprov. DNA-analyser av urin insamlat i snö med olika lagringsmetoder Sammanlagningen av individdatabaser från Grimsö i Sverige och Rovdata i Norge. METODIK De analyserade proverna har i enlighet med överenskommelse med Naturvårdsverket (dnr ), prioriteras enligt följande klasser: Akut: För att kunna vidta direkta förvaltningsåtgärder sker löpande analyser och rapportering av prover från misstänkta skadevållande vargar samt vargar som befinner sig i renskötselområdet. Svar skall ske inom 5 arbetsdagar från leveransdatum, med reservation för pågående hantering av andra akuta ärenden eller försenat svar från underleverantörer. Ett akutärende inkluderar ofta analyser av fler än ett prov för att öka chansen för lyckad bestämning. Enligt överenskommelsen förväntas Grimsö årligen kunna behandla 40 ärenden, motsvarande ca 100 prover. Normal: I samband med inventeringen av det svenska vargbeståndet analyseras uppskattningsvis 400 prover varje år. Dessa utgörs dels av avlämningar i form av spillning, blod och hår, dels av DNA-prover tagna direkt från djuren i samband med 4

5 undersökning av döda kroppar eller vid märkning av levande vargar. Länsstyrelsernas prov kommer till labbet via Viltskadecenter som genomför registrering, sortering och prioritering. Under 2013 har Viltskadecenter mottagit ca 1200 prov. Urvalet av inkomna prov för analys har gjorts av Viltskadecenter i samråd med länen i syfte att: bekräfta föryngring bedöma status och särskilja stationär förekomst av varg identifiera de revirhävdande vargarna i familjegrupperna/paren bestämma individ och härkomst för vargar som påträffats döda eller fällts under jakt bestämma art och individ för misstänkta vargar som angripit tamdjur bestämma art och individ för misstänkta vargar i renskötselområdet bistå riktade sök efter invandrande vargar Extraktion av DNA Oavsett vilken typ av analys som bedrivs så föregicks allt genetiskt arbete med att extrahera och rena DNA från övrigt material. Metoderna för att extrahera DNA varierade beroende på typ av material. För spillning användes ISOLATE Fecal DNA Kit (Nordic Biosite). För hårsäckar, små kvantiteter blod och urin användes ett protokoll där DNA-extraheras med hjälp av proteinas och natrium-acetat följt av rening med etanol. För bitsår användes QIAamp DNA Investigator Kit (Qiangen Inc.). DNA från vävnad och rika mängder blod extraherades med fenol och kloroform-isoamylalkohol följt av rening med etanol. Screening Under 2013 har de flesta normalprioriterade spillningar först testats på en av de 30 mikrosatelimarkörer (kallad 2096) som senare används för bestämning av bland annat individ och föräldraskap (se nedan). Ändamålet med denna s.k. screening var att öka analysframgången bland de prov som gick vidare för analys på fler markörer. Valet av screening-markör baserades på att använda en av de bäst fungerande markörerna som vid test på räv-dna inte visade någon PCR-produkt. På detta sätt screenar vi bort spillningar med dålig DNA-kvalitet samt spillningar från räv. Total 675 spillningsprov screenades innan fortsatt analys, genom att köra PCR på fyra replikat av varje prov på screeningmarkören (Tabell 1). Baserat på hur många replikat som visade en synlig PCR-produkt (vid visualisering på agaros-gel) kunde Viltskadecenter bestämma huruvida det var värt att gå vidare med provet eller inte. Prov som fungerade på färre än två replikat gick i de flesta fall inte vidare för analys på fler markörer. Med de prover som hade fungerat på färre än två replikat och ändå gick vidare, var analysframgången mycket sämre, vilket visades genom bland annat färre fungerande markörer (Spearman rank korrelation, R = 0.25, p<0.001) och lägre andel prov som kunde bestämmas till individ (χ 2 =137.2, p<0.001, Tabell 1). 5

6 Tabell 1. Antalet fungerande replikat (kallat screeningframgång) bland de 675 spillningsprov som screenades på mikrosatellit 2096 samt analysframgången för de 455 prov som gick vidare för analys på 30 autosomala mikrosatelliter. Screeningframgång Antal Antal för vidare analys Antal (procent) bestämda till individ (14 %) (14 %) (63 %) (86 %) (94 %) 24.5 Medelantal fungerande mikrosatellitmarkörer Markörer För genetiska analyser har vi använt oss av 30 autosomala mikrosatelliter, en mikrosatellit på den hanspecifika Y-kromosomen, en specifik könsbestämningsmarkör samt fem markörer från mitokondriellt DNA. En mikrosatellit utgörs av repeterade korta (1-6 baser) DNAsekvenser i följd som, på grund av sin höga mutationsfrekvens och låga fitnesspåverkan, ofta visar hög variation i en population. Variationen i en mikrosatellit utgörs av skillnader i antalet repetitioner och kan alltså visualiseras genom uppskattning av markörens längd. Detta sker genom att amplifiera markören med hjälp av PCR följt av separering av olika längdvarianter (s.k. alleler) genom elektrofores. Däggdjur är diploida och varje individ bär därför på två uppsättningar av varje autosomal mikrosatellit. Om en individ bär på två alleler av samma längd sägs individen vara homozygot. Om allelerna är av olika längd sägs individen vara heterozygot. Alleluppsättningen på en markör utgör en genotyp, som tillsammans med genotyperna för ett antal andra mikrosatelliter används för att bland annat bestämma art, geografiskt ursprung, identitet samt föräldraskap. DNA-prover som samlas in i fält kan utsättas för miljöförhållanden som försämrar DNA-kvaliteten. En robust genotyp bygger därför på att hitta replikat för varje allel. Därför upprepas PCR för varje prov och markör fyra gånger. En individ bedöms som homozygot för en mikrosatellit då genotypen upprepat tre gånger och ingen annan allel observeras i något av replikaten. Kriteriet för en heterozygot genotyp är att varje allel observeras i minst två av upprepningarna. I de fall då genotypen är okänd kan en halv genotyp utdelas, vilket innebär att den endast består av en säker allel, medan den andra allelen bedöms som osäker och därför är utelämnad från analyserna. Halva genotyper används inte alltid vid automatiserade analyser, men kan erbjuda värdefull information vid manuell bestämning av individer och föräldraskap. 6

7 Art- och populationsbestämning med mikrosatelliter För att särskilja genetiska profiler från räv, hund, finsk-rysk varg och skandinavisk varg har vi använt oss av ett grupperingsindex (Paetkau m.fl. 1995), dvs. sannolikheten (L) för att en genotyp härstammar från en given population (i). Som referensmaterial har vi använt oss av en databas på 20 rävar, 53 hundar, 92 finsk-ryska vargar, samt 206 skandinaviska vargar. Uträkningar av grupperingsindex gjordes med det internet-baserade programmet DOH ( jbrzusto/doh.php#runtest). För att uppskatta den statistiska säkerheten på den mest sannolika populationen beräknades log of odds (LOD) ratio scores : LOD = 2*ln(Li/Lj) där Li och Lj är grupperingsindex för genotypen i den mest sannolika respektive näst mest sannolika populationen. Då LOD går mot värdet 1, vilket innebär att Li och Lj närmar sig varandra, kan ingen säker slutsats dras om vilken av de två populationerna som individen kommer ifrån. Vi har använt oss av ett gränsvärde på LOD = 3 för signifikant gruppering till en population, vilket motsvarar en chans på tusen att resultatet ger en felaktig uppskattning av populationstillhörighet. Under 2013 utvidgade vi vårt referensmaterial av hundar, med fokus på större raser. Salivprov togs från 29 hundar av olika raser och blandraser i trakten kring Lindesberg, däribland labrador, vorsteh, jämthund, riesenschnauzer, rottweiler, schillerstövare, schäfer, Australian shepherd, borderterrier, boxer, holländsk herde, hovawart, schweizisk sennenhund och skotsk hjorthund. Proverna extraherades och typades på ovan nämnda mikrosatellitmarkörer i enlighet med ovan beskrivna metoder. Artbestämning med mitokondrie-dna I specifika fall då artbestämning var angelägen och mikrosatelliter inte levererade tillräcklig information analyserades proven på mitokondriella markörer. Eftersom varje levande cell bär på flera uppsättningar mitokondriellt DNA är sannolikheten för lyckad amplifiering på mitokondriellt DNA större än för nukleärt DNA. Variationen på dessa markörer studeras genom sekvensering eller elektrofores. Fyra av fem markörer finns på genen för cytokrom b (cytb) och den sista finns på kontrollregionen (även kallad d-loop). Markörena på cytb utgjordes av: cytb [lo] som indikerar förekomst av mtdna från lodjur cytb [björn] som indikerar förekomst av mtdna från järv och björn cytb [räv] indikerar förekomst av mtdna från räv. cytb [grävling] indikerar förekomst av mtdna från grävling För alla dessa markörer används primers som är designade att amplifiera arterna så specifikt som möjligt, vilket innebär att de inte ger produkter på från DNA av de övriga rovdjuren (inklusive varg och hund) samt ett urval av potentiella bytesdjur (t.ex. älg, rådjur och ren). Sekvensen av d-loop (d-loop [varg] ) amplifierades med primers som binder hunddjurspecifikt till kontrollregionen (designade för att inte amplifiera lo, järv, björn, får, ko och ren) och 7

8 lämpar sig särskilt för särskiljningen mellan varg och hund, samt till viss del även särskiljningen mellan skandinavisk och icke-skandinavisk varg. Sekvenserna jämfördes mot kända sekvenser i databasen NCBI s Genbank ( Vid körningen av alla fem markörerna kördes replikat av proven tillsammans med lämpliga referensprover (från lo, järv, räv eller varg) samt en negativ kontroll. Referensproven användes för att kontrollera att PCR fungerade och den negativa kontrollen användes för att kontrollera att eventuellt DNA från omgivningen (d.v.s. labbet) inte hamnat i proven. Individbestämning Alla genotyper från vargar matchades mot databasen på upp till 1136 unika genotyper från vargar påträffade i Skandinavien. Potentiellt matchande genotyper identifierades genom individual-assignment i CERVUS version 3.0 (Kalinowski m.fl. 2007). Med hänsyn till att vissa markörer kan vara feltypade har vi valt en inställning i programmet där viss felmatchning tolereras. Därefter utvärderade vi matchningarna manuellt. Könsbestämning Könsbestämning gjordes dels genom analysen av en mikrosatellitmarkör bunden till Y- kromosomen, dels genom en specifik könsbestämningsmetod utvecklad av Seddon m.fl. (2005). Den första markören kan användas för att bekräfta hankön. Den andra metoden inkluderar två markörer placerade på Y- respektive X-kromosomen och är utvecklad för att bestämma både han- och honkön på hunddjur. Under 2012, modifierades denna metod bl.a. för att öka utfallet från honor. Detta gjordes genom att utifrån en DNA-sekvens publicerad i Seddon m.fl (2005) designa nya PCR primers för både Y- och X-markören. De nya primrarna placerades maximalt ett trettiotal baspar ifrån tidigare primers och de amplifierar därmed i princip samma Y-och X-region. Skillnaden består främst i att de ger kraftigare PCR amplifiering och därmed en tydligare kategorisering. Födelserevir För alla skandinaviska vargar gjordes försök att bestämma föräldraskap. Detta utfördes i stort sett manuellt och bygger på principen att bland kända föräldrapar hitta det par som bäst förklarar genotypen hos den påträffade individen. I de fall som inget av de kända paren matchade som föräldrar användes CERVUS föräldraskapsanalys med föräldrapar utan hänsyn till kön. Detta följdes av en statistisk jämförelse mellan olika potentiella föräldrapar samt manuell kontroll av eventuella felmatchande markörer. Utvärdering av förvaringsmetod För kvalitetssäkrarna kan det vara mer praktiskt att samla in och förvara spillningsprover för DNA-analys i rör med torkningsmedel jämfört med att behöva förvara och skicka prover frysta. Med frysning som förvaringsmetod behöver proverna så snabbt som möjligt läggas i en frysbox och sedan helst förvaras frysta fram till DNA-extraktionen. Upprepad tining och frysning försämrar provets kvalitet och bör därför undvikas. Silicagel (även kallad kiselgel eller kiseldioxid) är en ogiftig produkt som har stor förmåga att absorbera fukt och har av vissa laboratorier använts för att förvara spillning i. Fördelen med förvaring i silicagel är att 8

9 det initialt kan ske i rumstemperatur. Nackdelen kan dock vara att risken för kontamination i fält är större, eftersom hantering av spillningen blir mer påtaglig då endast en liten mängd (ca 1 cm 3 ) spillning ska samlas in, vilken måste skäras ut och föras över till silicagel. Vi har dock resultat som indikerar att kontamination inte är ett större problem vid insamling i silicagel än andra insamlingsmetoder (Åkesson 2013). För mer information kring insamlingsmetodiken se bilaga 2 i Åkesson (2013). Under 2013 jämfördes analysframgången av spillningar som lagrats i en av två olika lagringsmetoder: 1) fryst samt 2) vid rumstemperatur i silicagel. Som mått på analysframgång användes resultaten för screeningen (se ovan beskriven metod), där PCR för att amplifiera en screeningmarkör kördes fyra gånger för varje prov. I enlighet med Tabell 1 är antalet replikat som visar en synlig PCR-produkt (vid visualisering på agarosgel) en indikator på hur många mikrosatellitmarkörer som senare kommer att ge information om identitet och födelserevir. Analysframgången kategoriserades i två grupper, en med låg analysframgång som gav resultat på 0-1 replikat och en med hög analysframgång med resultat på 2-4 replikat. Instruktioner skickades ut till de länsstyrelser (Länsstyrelserna i norra och södra förvaltningsområdet samt Dalarna) som ombads samla in spillning i silicagel. En bit spillning (max 1 cm 3 ) skars eller bröts av med ett noga rengjort instrument. Biten placerades i ett 50 ml rör, innehållande ml silica. Silicagelen innehåller en fuktindikator, vilket innebär att kulorna ändrar färg från gul till vit då de inte längre absorberar fukt. Vi analyserade även om analysframgången påverkades om silicagelen var mättad på fukt eller inte. RESULTAT OCH DISKUSSION Totalt analyserades 627 prov, varav 67 prov (fördelade på 35 ärenden) akutprioriterades och 560 prov normalprioriterades (Tabell B1 i Bilaga 1). Bland de 627 proven var 78 prov sådana som tagits direkt från levande eller döda djur i form av blod, vävnad eller hår. Resten (n = 549) var prov som tagits i fält med misstanke om att de innehöll avlämnat DNA från varg. Dessa utgjorde 526 spillningar, 5 hårprov och 18 provtagningar av blodspår. Akutärenden De 35 akuta ärendena omfattade 67 prov (62 spillningar, 2 hårprov, 1 blodspår och 2 vävnadsprov) insamlade från 9 olika län (Tabell 2, Figur 3), inkomna under hela året (Figur 1). Tiden från inlämningsdatum till rapportering tog i genomsnitt 3.5 dagar. Behandlingstiden var aldrig längre än fem arbetsdagar. Utlåtande om art- och populationstillhörighet kunde göras i 34 (97 %) av de 35 akuta ärendena. Art och populationstillhörighet kunde bestämmas för 56 (84 %) av 67 prov, vilket är en högre andel än tidigare år som varierat mellan 69 % och 76 %. Bland de 56 bestämda proverna var 41 från skandinavisk varg, sju från finskrysk varg, fem från hund och tre från räv. I de 41 fall då det rörde sig om skandinavisk varg kunde födelserevir bestämmas i 38 (93 %) fall, då direkt från provets genotyp eller indirekt från tidigare analyser av samma individ. De sju proverna från varg med finskryskt ursprung identifierades till G82-10 (även kallad 9

10 Junseletiken), M (Hanen från Galven och Prästskogen), G23-13 och G De två sistnämna individerna translokerades från Norrbottens län till Örebro län den 19 februari 2013 efter att ha identifierats i Norrbottens län 16 januari 2013 (se nedan för mer information). Tabell 2. Antal prov och analysframgång av akut- och normalprioriterade prov för olika insamlare, vilka inkluderar 18 olika länsstyrelser (LST), SKANDULV och Statens Veterinärmedicinska Anstalt (SVA). Analysframgången uppskattas som procent av totala antalet analyserade prov som kunnat bestämmas till art och population (; andelen andra arter än varg anges inom parantes) samt andelen av vargprover där födelserevir eller härkomst från finska/ryska vargpopulationen kunnat bestämmas. Akutprioriterade prov Normalprioriterade prov Insamlare Antal ärenden (prov) LST Norrbotten 3 (5) 100 (0) 80 Art / Population 1) Revir Antal prov Art / Population 1) Revir / Härkomst LST Västerbotten LST Västernorrland 4 (5) 100 (20) (0) 100 LST Jämtland 11 (23) 65.2 (21.7) (16.7) 33.3 LST Gävleborg 4 (10) 100 (0) (2.8) 83.3 LST Dalarna 6 (15) 86.7 (13.3) (2.3) 81.8 LST Stockholm (0) 100 LST Västmanland (2.3) 77.3 LST Örebro 3 (3) 100 (0) (1.9) 92.6 LST Värmland 1 (1) 100 (0) (2.3) 85.6 LST Östergötland (0) 100 LST Västra Götaland (6.3) 93.8 LST Jönköping 1 (2) 50 (0) (0) 100 LST Halland 2 50 (0) 50 LST Kronoberg (0) 100 LST Kalmar LST Blekinge (0) 100 LST Skåne 1 (1) 100 (0) (100) 0 SKANDULV 1 (2) 100 (0) (0) 100 SVA (1.7) 90 Antal Jan Feb Mar Apr Maj Jun Jul Aug Sep Okt Nov Dec Prov Ärenden Figur 1. Antal inkomna prover/ärenden till Grimsö forskningsstation som behandlats akut. 10

11 Antal ärenden Behandlingstid Figur 2. Behandlingstiden för akuta ärenden som kommit in till Grimsö forskningsstation under Behandlingstiden är antal arbetsdagar från att provet anlänt till Grimsö fram tills att ärendet rapporterats till berörda län och Naturvårdsverket. Normalprioriterade ärenden Under 2013, analyserade vi 560 prov i enlighet med normal prioritering. Dessa samlades in i 15 olika län (Tabell 2, Figur 4). I likhet med 2012 avvek vi från rapporteringschemat som avtalats mellan Naturvårdsverket och SLU. Enligt avtalet ska rapportering av högst 44 prover per månad rapporteras (med deadline fyra veckor efter 10 januari, 15 februari, 15 mars, 15 april, 15 maj, 15 juni, 1 augusti, 15 oktober och 20 november). Istället rapporterades den stora majoriteten (445 av 560) av proven den första halvan av året. Av 560 analyserade prov har art- och populationstillhörighet kunnat bestämmas i 522 (93 %) fall. Bland dessa var 503 från skandinavisk varg, fyra från finsk-rysk varg ( Galvenhanen M , samt Tivendenparet G23-13 och G31-13), sju från hund och åtta från räv. I ytterligare sex fall påträffades DNA från varg, men med osäkert geografiskt ursprung. Bland de 503 proven som bestämdes till skandinavisk varg kunde födelsereviret bestämmas i 474 (94 %) fall, vilket är mer än tidigare år, då motsvarande siffra varierat mellan 74 % och 87 %. Bland de 484 normalprioriterade prov som utgjordes av spillning, blodspår eller hår kunde art- och populationstillhörighet bestämmas i 450 fall (93 %). Detta är bättre än alla tidigare år, då framgången varierat mellan 68 % och 89 %. Detta kan bero på spillningarna som analyserades under 2013 var ett urval baserat på ett screening-test, som ger en indikation på spillningars DNA-kvalitet och anlysframgång. 11

12 Figur 3. Insamlingsplats samt art-/populationsbestämning av akutprioriterade prover under

13 Figur 4. Insamlingsplats samtt och art-/populationsbestämning av a normalprioriterade prover från avlämningar (spillning, hår, blodspårr och urin) hittade i fältt under

14 Antal prov Jan Feb Mar Apr Maj Jun Jul Aug Sep Okt Nov Dec Månad för rapportering Figur 5. Antal normalprioriterade prov, vars analysresultat rapporterades varje månad. Individer Totalt identifierades 267 individer bland akut- och normalprioriterade prov analyserade under 2013 (Bilaga 1). Bland dessa var 162 vargar inte identifierade tidigare år. Födelsereviret kunde bestämmas för 258 individer, av vilka 153 utgjorde nya individer för vår databas. Under 2013 identifierades fyra individer med finsk-rysk härkomst, av vilka två identifierades för första gången 2013 (se Tiveden nedan). Tiveden Den 16 januari identifierades två vargar (G23-13 och G31-13) i Norrbottens län som kunde bestämmas till finsk-ryska vargpopulationen. De två vargarna translokerades från Norrbottens län till Örebro län den 19 februari Paret stannade i området och föryngring bekräftades i området senare För att bekräfta om det var Tivedenparet som ynglat samt i så fall hur ungar de fått, extraherades DNA från 37 spillningar insamlade på rendez-vousplatser i början av augusti Efter screening (se ovan) togs 17 spillningar vidare för analys på 30 mikrosatelliter. Bland dessa kunde individ bestämmas för sju prov. Dessa kom från tre olika individer (G150-13, G och G152-13) som alla med signifikant säkerhet hade G23-13 och G31-13 som föräldrar. Detta bekräftar att det translokerade paret hade ynglat samt att de var minst tre individer baserat på DNA. Förvaring i silicagel Totalt 496 spillningsprov användes i jämförelsetest mellan två olika förvaringsmetoder av spillning, varav 314 förvarades fryst fram till extraktion och 206 förvarades i silicagel i rumstemperartur. Analysen gjordes separat för spillningar insamlade på barmark (n= 143) och på snö (n=353), eftersom analysframgången skiljde sig kraftigt åt mellan de två insamlingsförhållandena, med 43 % (62 av 143) spillningar med hög analysframgång på barmark och motsvarande 85 % (301 av 353) på snö (χ 2 = 91.1, p<0.001). 14

15 Skillnaden i lagringsmetod var inte signifikant under något av insamlingsförhållandena; barmark (χ 2 = 2.3, p=0.13) samt snö (χ 2 = 1.0, p=0.32). Bland silicagel-proven påverkades inte analysframgången inte av huruvida fuktighetsindikatorn visade gul färg (d.v.s. att silicagelen fortfarande har vattenabsorberande förmåga) eller vit färg (då silicagelen förlorat mycket av sin absorberande förmåga). Under snöförhållanden var analysframgången högre för spillningar i gul silica (92 %) än vit silica (77 %) även om det inte var någon sådan klar statistisk skillnad (χ 2 = 2.6, p<0.10). Sammanfattningsvis kan sägas att analysframgången skiljer sig mycket lite åt mellan de två lagringsmetoderna. Det finns en svag tendens att silicagel som förlorat sin absorberande förmåga fungerar sämre som lagringsmedia, men detta kunde inte påvisas statistiskt. Notera dock att länsstyrelserna instruerades att samla i en maximal volym på 1 cm 3 spillning och vi vet inte hur större mängd insamlad spillning i förhållande till mängd silicagel påverkar analysframgången. Det rekommenderas att länsstyrelserna primärt använder sig av silicagel som lagringsmedia samt håller sig till att samla in samma mängd (ca 1 cm 3 ) som tidigare. Sammanslagning av individdatabaser från Norge och Sverige Den 28 juni 2013 sammanställdes den första gemensamma databasen över identifierade vargar i Norge och Sverige mellan Grimsö och Rovdata. Arbetet, som påbörjades för flera år sedan, började med att vi bestämde oss för vilka genetiska markörer som skulle köras gemensamt. Vi kom fram till 18 gemensamma markörer, av vilka fem var nya för DNAlabbet i Grimsö. Därefter påbörjades ett arbete med att ta fram genotyper på vargindivider bakåt i tiden på de fem nya markörerna. Totalt uppdaterades 284 individer, med fokus på de som ynglat och därmed bidragit till släktträdet över populationen. Efter kompletteringen fortsatte arbetet med att kalibrera mikrosatelliternas allelidentiteter mellan de båda labben, d.v.s. vi tog fram en översättningstabell för vad respektive allel kallades i Sverige och Norge. Detta gjordes genom att jämföra allelerna från märkta och döda individer, från vilka båda labben tagit fram genotyper. Därefter kunde databaserna från Norge och Sverige slås samman. Idag innehåller den gemensamma databasen 1243 individer, varav 324 har typats och identifierats i båda labben. Sedan juli 2013 finns alla individer inlagda i Rovbase ( och den gemensamma databasen uppdateras kontinuerligt. Pågående utveckling av DNA-analys av urin i snö I samband med spårning påträffas ofta urinmarkeringar och under 2013 påbörjades ett projekt med att testa olika insamlingsmetoder för DNA-analys av urin. Tio kvalitetssäkrare blev instruerade att samla in urin i enlighet med två olika extraktionsmetoder: 1) Insamling av snö med urin i förbehandlade provrör (Urine Collection and Preservation Tubes, Norgen Biotek Corp.). Provet förvaras i rumstemperatur och DNA extraheras med ett kommersiellt kit (Urine DNA Isolation kit, Norgen Biotek Corp.) 2) Insamling av lite urinblandat snö på ett s.k. FTA - kort (GE Healthcare), ett förbehandlat kort där snön får smälta och som därefter läggs ett förseglingsbart fodral. DNA extraheras därefter i enlighet med tillverkarens instruktioner. 15

16 Hittills har vi i nio fall analyserat urinmarkeringar som samlats in med båda metoderna. Med metod 1 fungerade åtta av nio prov på mer än hälften av den 30 analyserade mikrosatellitmarkörerna, vilket var mycket fler än metod 2, då endast ett av nio gav resultat på fler än hälften av markörerna. Denna skillnad i analysframgång återspeglas även i antalet prov som gav tillräcklig information för individ och födelserevirsbestämning. Med metod 1 kunde individ och födelserevir bestämmas i åtta fall, och med metod 2 motsvarande bestämning göras i två fall. Detta är en första indikation på att metod 1 är en bättre insamlingsmetod. Fler urinprov kommer dock att analyseras för att vi ska kunna dra säkrare slutsatser om hur användbart urin-dna i snö är. Under 2014 kommer vi även att testa insamling i vanliga opreparerade 50 ml-rör, följt av förvaring i frys eller rumstemperatur. Insamling i opreparerade behållare innebär en lägre materialkostnad samt skulle innebära användandet av en typ av rör oavsett om provet kommer från spillning eller urin. REFERENSER Kalinowski S.T., Taper M.L. & Marshall T.C Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology 16: Paetkau, D., Calvert, W., Stirling, I. & Strobeck, C Microsatellite analysis of population structure in Canadian polar bears. Molecular Ecology 4: Seddon, J.M Canid-specific primers for molecular sexing using tissue or non-invasive samples. Conservation Genetics 6: Åkesson M (2013) Teknisk rapport över genetiska analyser på varg i Sverige år Rapport till Naturvårdsverket. 16

17 Tabell B1. Insamlingsdata och resultat från samtliga prov som analyserats under 2013 inom ramen för överenskommelsen om DNA-analys på prover från varg mellan Grimsö forskningsstation och Naturvårdsverket (dnr ). I tabellen presenteras insamlingsdata (fynddatum, län, leverantör och prov) samt analysresultat (art, ursprungspopulation, kön, födelserevir och identitet) för alla prov. Under prioritet anges om provet behandlats omgående efter mottagandet (akut) eller löpande enligt med viltskadecenters och länens inbördes prioritering (Normal). M-11-04? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien F Kyn2 M M-11-05? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien F Kyn2 G47-11 SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening LST Spillning SEP ? Screening LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning

18 SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning SEP ? Screening. LST Spillning ULV1303? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien M Sle G ULV1304? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien M Sle G ULV1305? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien M Sle G ULV1306? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien M Sle G ULV1307? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien M Sle G ULV1308? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien M Sle G V3329/13? Normal. SVA Muskel Obestämd VARG1309? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien M Jang6 G VARG1310? Normal SKANDULV Blod Varg Skandinavien F Klot G44-12 SEP AB Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Nora G78-13 SEP AB Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Sku G18-12 SEP AB Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Sku G18-12 V2147/13 AB Normal SVA Vävnad Varg Skandinavien M Dju3 G

19 V2177/13 AB Normal. SVA Vävnad Hund - M - - SEP AC Screening LST Spillning V0299/13 AC Normal SVA Vävnad Varg Skandinavien M Ack G SEP BD Akut LST Spillning Varg Skandinavien M?? SEP BD Akut LST Spillning Varg Finland/Ryssland? (Finland) G23-13 SEP BD Akut LST Spillning Varg Finland/Ryssland? (Finland) G23-13 SEP BD Akut LST Spillning Varg Finland/Ryssland? (Finland) G31-13 SEP BD Akut LST Spillning Varg Finland/Ryssland? (Finland) G23-13 VARG1311 BD Normal SKANDULV Blod Varg Finland/Ryssland F (Finland) G31-13 VARG1312 BD Normal SKANDULV Blod Varg Finland/Ryssland M (Finland) G23-13 SEP E Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ria G43-13 SEP F Akut LST Hår Varg Skandinavien M Dju3 G67-13 SEP F Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Lok2 G65-13 SEP F Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Lok2 G65-13 SEP F Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Lok2 G65-13 SEP F Akut LST Spillning Obestämd - M - - SEP F Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Lok2 G65-13 SEP F Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Has5 G42-13 SEP G Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Has5 G42-13 SEP G Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Has5 G42-13 V2170/13 H Normal SVA Vävnad Varg Skandinavien M Jang5 G4-11 SEP K Screening LST Spillning SEP K Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Sku G SEP M Akut LST Spillning Varg Skandinavien? Skul G1-13 SEP M Normal LST Spillning Räv -? - - SEP M Screening. LST Spillning V0509/13 M Normal SVA Vävnad Varg Skandinavien M Ria G66-13 SEP N Screening LST Hår SEP N Normal LST Spillning Obestämd SEP N Screening LST Spillning

20 SEP N Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ria G66-13 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Gös G2-13 SEP O Normal LST Spillning Räv -? - - SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M DE5 G86-11 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Rot2 G7-13 SEP O Screening LST Spillning SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Sku G17-12 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Sku G17-12 SEP O Screening LST Spillning SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M DE6 G63-13 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien? DE6 G63-13 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M DE6 G63-13 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien F DE4 G1-08 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Kyf2 G SEP O Screening LST Spillning SEP O Screening LST Spillning SEP O Screening LST Spillning SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Skul G1-13 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Sku G17-12 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Dju3 G28-12 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Lin G3-12 SEP O Normal LST Spillning Varg Skandinavien F DE4 G1-08 SEP O Screening LST Spillning V2719/13 O Normal SVA Vävnad Varg Skandinavien M Dju3 G SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ack G32-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ack G32-12 SEP S Normal LST Spillning Obestämd SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Amä1 G85-11 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Klg G32-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Kyn2 G

21 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Snd3 G76-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Löv2 G63-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G11-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Löv2 G63-12 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Löv2 G63-12 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Snd2 G41-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Amä2 G33-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Amä2 G34-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Snd3 G70-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Snd3 G71-13 SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ack G77-13 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang3 G28-09 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Grä1 G9-09 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang3 G28-09 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Bratt G62-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Ack G12-09 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Grä1 G9-09 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Snd2 G41-12 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Bratt G62-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Bratt G62-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Kyn2 G SEP S Normal LST Blod Hund - M

22 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang3 G28-09 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Bratt G62-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Grä1 G9-09 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Bratt G62-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang3 G28-09 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Bratt G62-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Grä1 G9-09 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Bratt G55-11 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Hlg1 G10-06 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Jang6 G SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G13-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G11-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G35-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Jang6 G12-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G13-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Fäsn G36-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien?? G37-13 SEP S Normal LST Spillning Obestämd SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M?? SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Kyn2 G6-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Löv2 G18-10 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Kyn2 G47-10 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Obestämd SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Äpp G13-10 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Sku G88-13 SEP S Normal LST Hår Obestämd SEP S Normal LST Spillning Obestämd

23 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Kyn2 G47-10 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ful1 G11-11 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ful1 G11-11 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Sku G48-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Sku G20-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Kyn2 G47-10 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Löv2 G18-10 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Gla2 G56-11 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Gla3 G18-13 SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Obestämd SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Eid G49-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Eid G49-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Ny5 M SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G13-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G50-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Jang6 G51-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Ny5 M SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Trå G72-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Trå G72-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Gal M SEP S Normal LST Spillning Hund - F - - SEP S Akut LST Spillning Varg Skandinavien M Dju3 G SEP S Screening LST Spillning

24 SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Snd2 G41-12 SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G11-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ack G32-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Grä1 G9-09 SEP S Normal LST Spillning Obestämd SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Z G39-11 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Gla2 G56-11 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ful1 G27-12 SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Dju3 G91-13 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Fur M SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Fur M SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Klot G44-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Gal M SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Kyn2 G49-11 SEP S Screening LST Spillning

25 SEP S Screening LST Spillning SEP S Screening LST Blod SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Löv2 G63-12 SEP S Normal LST Blod Varg Skandinavien??? SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Bratt G55-11 SEP S Normal LST Blod Obestämd SEP S Normal LST Blod Obestämd SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien??? SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G11-13 SEP S Screening LST Spillning SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G11-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Bratt G55-11 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Löv2 G63-12 SEP S Normal LST Blod Varg Skandinavien M Jang6 G11-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Bratt G55-11 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Gal M SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Löv2 G63-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G11-13 SEP S Normal LST Blod Varg Skandinavien M Löv2 G63-12 SEP S Normal LST Spillning Räv - M - - SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Ull1 G SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G11-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Löv2 G63-12 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Jang6 G11-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Kyn2 G SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien? Bratt G19-13 SEP S Normal LST Löpblod Varg Skandinavien? Kyn2 G49-11 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Kyn2 G49-11 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien F Bratt G19-13 SEP S Normal LST Spillning Varg Skandinavien M Gal M