BEKRÄFTELSE SS 02 82 14 SIS/TK 426 Fastställd 1996-03-13 Datum 2004-12-09 Utgåva 1 Vattenundersökningar Bestämning av akut toxicitet för kräftdjuret Ceriodaphnia dubia Statisk metod Water quality Determination of acute toxicity to the crustean Ceriodapnia dubia Static method Copyright SIS. Reproduction in any form without permission is prohibited.
Efter översyn av rubricerad svenska standard har ansvarig SIS/TK beslutat att det tekniska innehållet i standarden skall fortsätta att gälla som svensk standard. Observera att uppgifter i standarden om handläggande svenskt standardiseringsorgan, adress- och telefonuppgifter m.fl. uppgifter kan ha blivit inaktuella till följd av organisationsförändringar. BST, HSS, IKH, MNC, SMS, STG och TKS finns inte som standardiseringsorgan idag. Deras verksamheter sköts idag av SIS. Detsamma gäller delvis ITS. Aktuella uppgifter beträffande SIS och handläggande SIS/TK framgår av detta försättsblad. Normativa hänvisningar (referenser) som i förekommande fall förtecknas i denna svenska standard kan ha ersatts av ny utgåva, av annan svensk standard eller kan ha upphävts utan att ersättas av annan svensk standard. Uppgifter om gällande svensk standard framgår av SIS Katalog över svensk standard. SIS Förlag AB säljer såväl gällande som tidigare gällande (men numera upphävd) svensk standard. Om det råder oklarhet i något avseende huruvida bekräftad äldre svensk standard bör eller kan tillämpas i en situation kan hänvändelse ske till det verksamhetsområde (SIS/VO) som handlägger standarden. Upplysningar om sakinnehållet i standarden lämnas av SIS, Swedish Standards Institute, telefon 08-555 520 00. Standarder kan beställas hos SIS Förlag AB som även lämnar allmänna upplysningar om svensk och utländsk standard. Postadress: SIS Förlag AB, 118 80 STOCKHOLM Telefon: 08-555 523 10. Telefax: 08-555 523 11 E-post: sis.sales@sis.se. Internet: www.sis.se
Vattenundersökningar Bestämning av akut toxicitet för kraftdjuret Ceriodaphnia dubia Statisk metod Water quality Determination of acute toxicity to the crustean Ceriodaphnia dubia Static method Innehåll o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Orienteering Omfattning Referenser Princip Provningsmiljö Materiel och kemikalier Utförande Bestämningar och beräkningar Precision Provningsrapport Bilaga A Bilaga B Bilaga C Bilaga D Förslag till odlingsmetod för Ceriodaphnia dubia Recept på YTC-foder Exempel på odling av alger till Ceriodaphnia- foder Förslag till provningrapport 0 Orientering Toxiciteten (= giftigheten) hos ett avloppsvatten eller en kemikalie kan variera mycket mellan olika organismer. För att kunna bedöma effekter av utsläpp på den yttre miljön är det därför viktigt att bestämma toxiciteten för olika typer av testorganismer, t.ex. alger, bakterier, evertebrater och vertebrate. 1 Omfattning Denna svenska standard beskriver en metod för bestämning av den akuta toxiciteten för kräftdjuret Ceriodaphnia dubia (Cladocera, Crustacea) hos ett prov av: a) b) c) kemikalier som är lösliga i vatten eller som kan föreligga i stabil suspension i vatten; industriavloppsvatten och kommunala avloppsvatten, behandlade eller obehandlade, efter dekantering eller filtering om detta är motiverat; ytvatten och grundvatten.
2 Referenser ISO 5662-2:1982 Water quality Sampling Part 2: Guidance on sampling techniques ISO 5725:1986 SS 02 81 80 Precision of test methods Determination of repeatability and reproducibility for a standard method by interlaboratory tests Vattenundersökningar Bestämning av rörlighetshämning hos Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) 3 Princip Bestämning av den koncentration av provet som vid 24 h och 48 h exponering immobiliserar 50 % av testorganismerna under de betingelser som definieras i denna standard. Denna koncentration kallas 24-h EC 50 respective 48-h EC 50. En indication på den lägsta koncentration som immobiliserar alla testorganismerna och den högsta koncentrationen som inte immobiliserar någon av testorganismerna är önskvärd och ger värdefall information i de fall 24-h och 48-h EC 50 inte kan bestämmas. Bestämningen kan föregås av en preliminär bestämning som ger ett ungefärligt värde på 24-h eller 48-h EC 50 och ger vägledning för val av lämpligt kcmcentrationsintervall för den egentliga bestämningen. Om metoden används för kemikalier kan den användas för att bestämma om immobiliteten påverkas av en given koncentration (t.ex. 100 mg/1), vid vilken kemikalien är i lösning eller i stabil suspension. 4 Provningsmiljö Utför provningen i ren provningsmiljö. Den omgivande luften skall vara fri från damm och ångor som kan vara toxiska för Ceriodaphnia dubia. Utför provningen antingen vid 20 C eller vid 25 C. Temperatmren får inte variera mer än ± 2 C under provningen. Provningen kan utföras vid normal ljusintensitet för laboratoriearbete och en ljusperiod med 16 h belysning per d. Odlingsforhållanden och toxicitetsvärden som presenteras i denna standard härrör alla från en temperature på (25 ± 2) C, vilken också rekommenderas som standardtemperatur vid provningen. 5 Materiel och kemikalier 5.1 Försöksdjur Ceriodaphnia dubia (Cladocera, Crustacea) av minst tredje generation som erhållits genom partenogenes under specificerade odlingsbetingelser. Ett odlingsförfarande som erfarenhetsmässigt visat sig fungera bra vid kontinuerlig odling beskrivs i bilaga A-C. Försöksdjuren erhålls vid filtrering genom två såll, ett med en maskvidd på 300 µm som fångar upp äldre djur och ett med en maskvidd på 150 µm som fångar upp unga djur. Djuren från det finmaskigare sållet förs över till det spädningsvatten som skall användas vid provningen och förvaras där innan de sätts till provlösningarna. Försöksdjuren bör vara 6 h-24 h gamla, varför två filtreringar behövs i anslutning till provningen. Ange alltid testdjurens ålder vid resultatredovisningen, eftersom djuren tillväxer snabbt och känsligheten kan vara beroende av åldern.
5.2 Spädningsvatten Använd naturligt eller syntetiskt vatten som spädningsvatten. Används ett naturligt sjövatten bör detta filtreras (filter 150 µm) för att ta bort eventuella förekommande zooplaikton. Vid kemikalietestning bör ett syntetiskt vatten användas, identiskt med det vatten som föreslås i SS 02 81 80. Detta är en fördel vid jämförelse med testresultat från liknande tester. Spädningsvattnet skall ha ett ph på 7,8 ± 0,2, en hårdhet på 250 mg/l ± 25 mg/l (uttryckt som CaC0 3 ), en molär Ca/Mg-kvot nära 4 och en oxygenkoncentration över 80 % av luftmättnadsvärdet. Beredning av ovan nämnda spädningsvatten för kemikalietestning kan göras på följande sätt. a) Bered följande lösningar: 1) 2) 3) 4) Kalciumkloridlösning Lös 11,76 g CaC1 2 x 2H 2 O i destillerat eller avjoniserat vatten och späd till 1000 ml. Magnesiumsulfatlösning Los 4,93 g MgSO 4 x 7H 2 O i destillerat eller avjoniserat vatten och späd till 1000 ml. Natriumvätekarbonatlösning Lös 2,59 g NaHCO 3 i destillerat eller avjoniserat vatten och späd till 1000 ml. Kaliumkloridlösning Lös 0,23 g KC1 i destillerat eller avjoniserat vatten och späd till 1000 ml. Blanda 25 ml av var och en av lösningarna (l-4) och späd till 1000 ml med destillerat eller avjoniserat vatten. Lufta det nyblandade vattnet tills oxygenmättnad uppnåtts och ph har stabiliserats. Justera ph, om så är nödvändigt, till 7,8 ± 0,2 med natriumhydroxid eller saltsyra. Vatten som är ph-justerat luftas ej igen. Hårdheten på detta spädningsvatten har beraknats till 250 mg/1 ± 25 mg/l (uttryckt som CaCO 3 ) och den molära Ca/Mg-kvoten är 4. Vid provning av avloppsvatten kan ett vatten som är mindre hårt användas för att bättre överensstämma med svenska miljöförhållanden. För detta ändamål kan man använda ett mjukt vatten (US EPA soft water, enligt EPA/600/4-89/001, March 1989). Beredningen av detta spädningsvatten kan göras på fäljande sätt. 1 Mät upp 19 liter vatten i lämpligt kärl. 2 Tillsätt 0,60 g MgSO 4, 0,96 g NaHCO 3 och 0,040 g KCI till kärlet. 3 Lufta över natten. 4 Tillsatt 0,60 g CaSO 4 x 2H 2 O till 1000 ml vatten. Sätt på omrörning tills kalciumsulfatet är löst, och tillsätt därefter lösningen till spädvattenkärlet med de övriga kemikalierna och blanda väl. 5 Lufta ordentligt i 24 h för att lösa alla kemikalier och uppnå jämvikt. Vatten tillblandat på detta sätt har en hårdhet på 40 mg/l-48 mg/l (uttryckt som CaCO 3 ), Alla kemikalier som används för beredning av spädningsvatten skall vara av hög kvalitet (pro analysi). Använd avjoniserat eller destillerat vatten vid beredningen. Vattnets konduktivitet bör ej överstiga 1 ms/m.
Förvara spädningsvatten i väl rengjorda glaskärl. Spädningsvattnet bör inte förvaras under en längre period än 14 d vid rumstemperatur på grund av risken för eventuell tillväxt av bakterier, alger etc. Vidare bör förvaringskärlet vara övertäckt och skyddas mot ljus. Spädningsvattnet måste ha en sådan kvalitet att immobiliteten hos Ceriodaphnia dubia inte överstiger 10 % efter 48 h. 5.3 Referenskemikalie Kaliumdikromat (K 2 Cr 2 O 7 ) och/eller natiumpentaklorfenolat (Cl 5 C 6 ONa) av hög renhet renhet (pro analysi) Iakttag försiktighet vid användning av båda kemikalierna, eftersom de är skadliga vid hudkontakt och inandning. Skölj ordentligt med vatten vid eventuell hudkontakt med ämnena! 5.4 Utrustning Allt material som under provning och odling av försöksdjuren kommer i kontakt med provvattnet eller odlingsvattnet ska vara kemiskt inert, dvs material från vilket ingen utlösning till vattnet sker. 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.4.6 Klimatkammare eller termostaterat rum Termograf eller annan Iämplig registreringsapparat för temperatur Oxygenmätare Stereolupp Mätare för salthalt eller konduktivitet ph-meter 5.4.7 Provkärl Lämplig storlek på provbägare är 25 ml-30 ml beroende på stereoluppens synfält och lämplig provvolym är 15 ml. Provkärlen kan vara antingen av glas eller inert plast (t.ex. polystyren). Alla provkärl skall vara kemiskt väl diskade och sköljda minst två gånger i avjoniserat eller destillerat vatten. 5.4.8 Pasteurpipetter med gummituta. För hantering av försöksdjur. 6 Utförande 6.1 Förvaring och behandling av prover 6.1.1 Avloppsvatten För provtagning, provförvaring och behandling av avloppsvatten för provning hänvisas till Naturvårdsverkets Allmänna Råd 89:5 Biologisk kemisk karakterisering av industriavloppsvatten. Provtagning skall som regel omfatta 7 (eventuellt 5) flödesstyrt uttagna dygnsprover. Påbörja provningen så snart som möjligt, dock senast inom 6 h efter provtagningsperiodens slut. Kyl ner del av dygnsprov som avses blandas till veckoprov till +4 C och förvara mörkt vid denna temperatur fram till blandningstillfället (max 7 d). Starta provningen inom 6 h eller frys samlingsprovet. I de fall där provningen inte kan startas inom 6 h kan provet kylas ned på provtagningsplatsen, förvaras i kyla (+4 C) och provningen startas inom 48 h eller frysas direkt efter provtagning. För frysta prover (< -20 C) bör provningen startas inom 2 månader från provtagningsdatum.
6.1.2 Kemikalier och produkter Definiera kemikalier och produkter som skall provas till ursprung och innehåll, så att arbetshygieniska och provningstekniska aspekter kan beaktas. Flyktighet, vattenlöslighet, syra-bas-egenskaper (pk a -värde) och reducerande eller oxiderande egenskaper bör beaktas vid beredning av provlösningar och i relation till syftet med provningen. 6.1.2.1 Beredning av stamlösningar Bered stamlösningar av provet genom att lösa en känd mängd av provet i en känd mängd vatten (provningsmedium, destillerat eller avjoniserat vatten) i en glasbehållare. Bered stamlösningar i samband med provningen utom i de fall stabiliteten av provämnet är känd och inte förändras med tiden. Provämnen som är svårlösliga i vatten kan lösas direkt i spädningsvatten (högsta testkoncentration) med hjälp av ultrasonikering eller genom tillsats av lösningsmedel. Högsta använda koncentration lösningsmedel får inte överstiga 0,1 ml/l, och två kontroller, en utan lösningsmedel, och en med högsta använda koncentration av lösningsmedlet skall användas vid provningen. Eftersom koncentrationerna av icke stabila ämnen och i vatten svårlösliga ämnen kan förändras under provningen, är det inte möjligt att rekornmendera någon enhetlig metod för beredning av stamlösningar av ämnen som är svårlösliga i vatten. 6.1.2.2 Beredning av provlösningar Bered provlösningarna genom att tillsätta kända mängder av stamlösning till spädningsvattnet. I de fall stamlösningen bereds med avjoniserat eller destillerat vatten bör inte koncentrationen stamlösning överstiga 10 ml/1. Vid testning av avloppsvatten späds detta till lämplig koncentrationsserie efter eventuell dekantering, filtering eller luftning för att öka oxygenhalten. Kontrollera att oxygenhalten inte understiger 40 % av luftmättnadsvärdet och att ph ligger mellan 6,0 och 8,0 i högsta provkoncentrationen. Lufta vattnet före provningen om oxygenhalten understiger 40 % och justera ph med utspädd saltsyra eller natriumhydroxid om så erfordras. Redovisa alla behandlingar av provet i samband med beredning av provlösningar i provningsrapporten. 6.2 Provning 6.2.1 Allmänt Provningen görs genom att provet eller stamlösningen av provet och spädningsvatten blandas i lämpliga koncentrationer och placeras i provkärlen. Till dessa sätts unga (6 h-24 h gamla) Ceriodaphnia dubia. Efter 24 h och 48 h registreras hur många djur som är orörliga/döda. Med vetskap om detta beräknas provets EC 50. 6.2.2 Preliminary provning Val av lämpliga koncentrationer kan göras genom en preliminär provning. Vid denna används ett så brett intervall koncentrationer att den förväntade koncentrationen för 0 % effekt och 100 % effekt kan bestämmas. Utifrån detta bestäms den geometriska serie koncentrationer som bör ge 0 % effekt i lägsta koncentrationen, 100 % effekt i högsta koncentrationen, och mellan 0 % effekt och 100 % effekt i minst två mellanliggande koncentrationer efter både 24 h och 48 h.
6.2.3 Utförande I provningen skall ingå ett så stort antal koncentrationer att partiell effekt (mellan 0 % och 100 % dödlighet/orörlighet) förekommer i minst två koncentrationer. Detta erhålls oftast genom att använda en geometrisk serie koncentrationer med spädfaktorn 0,5 (kvoten av två närliggande koncentrationer = 2). Precisionen vid provningen kan i vissa fall, för prover med snävt dos-respons-samband, ökas genom att använda en högre spädfaktor (lägre kvot) enligt nedan. Kvot = 2,0: serie 100; 50; 25; 12,5; 6,3; 3,1; 1,6 osv Kvot = 1,8: serie 100; 56; 31; 17; 9,5; 5,3; 2,9;1,6 osv Kvot = 1,5: serie 100; 67; 44; 30; 20; 13; 8,7; 5,8 osv. Den definitiva provningen måste inte föregås av en preliminär provning om antalet koncentrationer är tillräckligt stort (se ovan). Detta förfaringssätt sparar i många fall tid, vilket är viktigt vid provning av avloppsvatten och andra prover med begränsad hållbarhet. Använd fyra provkärl (25 ml-30 ml) med 15 ml provlösning per koncentration. Sätt till varje provlösning fem (6-24) h gamla djur, vilket innebär att 20 djur används per koncentration. Vid varje provning skall dessutom ingå en kontroll (koncentration = 0) bestående av 4 provkärl med spädningsvatten och 5 djur per bägare. I de fall något lösningsmedel använts för att lösa upp ett provämne i vatten skall en extra kontroll med spädningsvatten och den högsta använda halten lösningsmedel ingå i provningen. Mät salthalt eller konduktivitet, ph och oxygenhalt vid provningens början och avslutning (tid 48 h) i spädningsvattnet och högsta provkoncentration. Om uppmätta värden i spädningsvatten och högsta provkoncentration avviker markant utförs mätningar även i lägre koncentrationer. Om problem uppstår med alltför små volymer vid mätningarna kan hopslagning av vattnet i provbägare med samma koncentration (replikat) tillåtas, under förutsättning att försiktighet iakttages, så att oxygenvärdet ej förändras. Alternativt kan extra bägare utan djur användas enbart för dessa mätningar. Avläs antal döda/orörliga djur efter 24 h och 48 h. En lätt omskakning av bägaren kan göras vid tveksamma fall, när ett djur ligger stilla men ger svaga livstecken. Djur som efter denna omskakning är orörliga i mer an 15 s registreras som orörliga. 6.3 Konditionstest Konditionen hos Ceriodaphnia dubia kan variera mellan olika populationer och även tidsmässigt inom samma population. För att testa konditionen på försöksdjuren skall känsligheten mot en referenssubstans bestämmas med jämmna mellanrum. Detta kan göras samtidigt som man testar provet (proverna) eller med en fastställd frekvens (varje vecka, månad, kvartal). Lämpliga referenssubstanser är kaliumdikromat (K 2 Cr 2 O7) och natriumpentaklorfenolat (C1 5 C 6 ONa). Om känsligheten avviker från tidigare erhållna resultat och/eller litteraturvärden enligt (8) skall orsaken härtill utredas genom att odlingsbetingelser och odlingsrutiner ses över. 7 Bestämningar och beräkningar Använd uppmätta effekter i de olika koncentrationerna vid provningen för beräkning av ett EC 50. 7.1 Giltighet Resultaten kan anses giltiga under förutsättning att följande krav är uppfyllda: 1 Andelen orörliga/döda i kontroll(er) har ej överstigit 10 %