Umeå universitet Biomedicinska Analytikerprogrammet Koncentrationsbestämning med hjälp av spädningsteknik och spektrofotometri Årskull: Laborationsrapport i Grundläggande laboratorievetenskap, termin 1 Laborationsdatum: Inlämnad: Godkänd: Handledare:
Introduktion Bakgrunden till laboration 4 är att bekanta sig med spektrofotometri (anpassad till mikroplattor) samt att utöva seriespädning och att träna på pipettering. Principen vid användning av en spektrofotometer (se bilaga 1) inhämtas vid laborationstillfället genom att läsa manualen för spektrofotometern (Multiscan plus). Syftet med laborationen är att bestämma koncentrationen av en lösning KMnO4. Detta görs med hjälp av spädningsteknik och spektrofotometrisk avläsning. Därefter beräknas koncentrationen med hjälp av en standardkurva baserad på mätdata av en känd standardlösning där den linjära regressionen visas. Material & Metod Materialet som användes vid laborationen var KMnO4 standardlösning med känd koncentration 10 mm och KMnO4 lösning med okänd koncentration. Först gjordes en riskbedömning på kaliumpermanganat, KMnO4 innan laborationen startade. En första seriespädning gjordes (i 6 brunnar) av standardlösningen (10 mm KMnO4). Detta gjordes i en mikroplatta med 96 brunnar och flat botten. Seriespädning utfördes genom att 100 µl avjoniserat vatten tillsattes i de 6 brunnarna. Sedan togs 100 µl av standardlösningen och tillsattes i den första brunnen. 100 µl av blandningen i den första brunnen överfördes till brunn nr 2. Denna procedur upprepades till resten av brunnarna. Seriespädningarna avlästes i spektrofotometern (Multiscan plus, labsystems, Helsinki, Finland) med våglängden 540 nm. Detta gjordes för att identifiera det koncentrationsintervall som lämpade sig för att använda i en standardkurva. De två absorbansvärdena för de brunnarna med högst koncentration bedömdes osäkra och därför gjordes en ny seriespädning med fler spädningssteg. Denna gång gjordes seriespädningen på 10 st brunnar i triplikat med standardlösningen. Samtidigt mättes en okänd lösning (i ena fallet med spädningen 1:2 och i det andra fallet 1:4) upp i 5 brunnar. Därefter avlästes de nya absorbansvärdena i spektrofotometern. 2
Resultat Tabell 1. Absorbansvärden för olika koncentrationer av KMnO 4 standardlösningen vid våglängden 540 nm, serie 1. Koncentration Abs Abs Abs (mm) 540 nm Medelvärde 2,500 1,228 1,226 1,222 1,225 1,250 0,647 0,655 0,643 0,648 0,625 0,345 0,341 0,347 0,344 0,313 0,200 0,192 0,199 0,197 0,156 0,115 0,114 0,114 0,114 0,078 0,084 0,073 0,078 0,078 0,078 0,061 0,064 0,055 0,060 0,039 0,053 0,048 0,052 0,051 Tabell 2. Mätvärden för seriespädning av standardlösningen (10 mm KMnO4) vid våglängden 540 nm, serie 2. Standarslösning Konc. (mm) Abs. Abs. Abs. Medelvärde 2,500 1,282 1,255 1,263 1,267 1,250 0,645 0,644 0,656 0,648 0,625 0,366 0,363 0,352 0,360 0,313 0,201 0,192 0,210 0,201 0,156 0,125 0,118 0,131 0,125 0,078 0,055 0,080 0,094 0,076 0,039 0,083 0,051 0,069 0,068 0,020 0,056 0,048 0,063 0,056 Tabell 3. Absorbansvärden på okänt prov med spädning 1:2. Beräknad koncentration avser ospätt prov. Abs Konc (mm) 0,719 2,846 0,693 2,737 0,725 2,871 0,724 2,867 0,709 2,804 Medelvärde 2,825 Stdav 0,05 3
Tabell 4. Mätvärden på okänt prov (spädning 1:4). Observera: koncentration avser ospätt prov. Okänt prov Abs Konc. 0,389 2,809 0,386 2,785 0,376 2,703 0,385 2,777 0,382 2,752 Medelvärde 0,384 2,765 Stdav 0,040 1,4 Absorbansen 540 nm 1,2 1,0 y = 0,478x + 0,0388 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Konc. (mm) 3,0 Figur 1. Standardkurva för standarlösning KMnO4 med linjär trendlinje och ekvation till tabell 1. 4
1,4 1,2 y = 0,4875x + 0,0466 1 Absorbans 540 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Konc. mm Figur 2. Standardkurva för standarlösning KMnO4 med linjär trendlinje och ekvation till tabell 2. Formeln som användes vid beräknandet av den okända koncentrationen var ekvationen som skapades utifrån de linjära trendlinjer som baserades på standardkurvorna (se figur 1 respektive 2). Resultaten utifrån de två olika spädningarna (se tabell 3 samt 4) blev 2,83 mm respektive 2,77 mm. Diskussion Resultaten på koncentrationen av den okända lösningen vi fick blev 2,83 mm respektive 2,77 mm. Dessa två skiljer sig aningen ifrån varandra. Vi bedömer skillnaden som obetydlig. Skillnaderna skulle kunna bero på den mänskliga faktorn. I Johannas mätserie var det ett värde (brunn C8) som blev märkligt lågt se tabell 2, standardlösning 1. Detta påverkar självklart medelvärdet för den spädningen och därmed även standardkurvans ekvation. Våra R2 värden på standardkurvan blev 0,9995 respektive 0,9998. Vilket visar att punkterna i de båda diagrammen har ett väldigt bra linjärt samband. Därmed drar vi slutsatsen att värdet på våra koncentrationer av den okända lösningen borde vara tillförlitliga. 5
Som felkälla kan även pipetteringen räknas (mänskliga faktorn) då spektrofotometrin ej visar samma absorbans för samma koncentrations värden, vilket det borde göra. Detta var dock ingenting som i större grad påverkade resultaten då ett genomsnittligt värde användes för standardkurvan. Referenser 1 Bild, bilaga 1: http://intranet.chem.umu.se/utbildning/grundkurserbasic/kemib_vt09/shared%20documents/tema%203.pdf 2 Riskbedömning, pärm vid laborationssalarna, Umeå Universitet Bilaga 1 Figur 1. Principskiss Spektrofotometer (1) 6
Bilaga 2 Riskbedömning av KMnO4 (2) På vilket sätt är kemikalien farlig? Kemikalien klassas som farlig produkt. Den är hälsoskadlig och oxiderande. Anses som ett starkt oxidationsmedel och man bör därför undvika kontakt med reduktionsmedel. Farosymbolen är O+X. Kemikalien är farlig vid förtäring och risk för allvarlig ögonskada finns vid kontakt. Kemikalien är brandfarlig i kontakt med brännbara ämnen. Hantering av kemikalien/ skyddsutrustning? Ögonskydd och skyddshandskar ska användas vid risk för direktkontakt eller stänk. Dammfilter kan behövas. Skyddsåtgärder Arbete ska utföras i dragskåp eller ventilerade utrymmen. Håll locket stängt och undvik att kemikalien kommer i kontakt med luft. Vid inandning av kemikalien ska frisk luft, vila och värme tillämpas. Skölj näsa/mun/svalg och kontakta läkare. Vid hudkontakt ska kläder (som utsatts för kemikalien) tas av och huden tvättas med tvål och vatten. Vid ögonstänk ska ögonen genast sköljas med vatten (minst 15 min), håll ögonen vidöppna och uppsök läkare. Vid förtäring ska kräkning undvikas. Drick vatten/mjölk/grädde och uppsök läkare. Avfallshantering Sopa försiktigt ihop kemikalien och samla upp den. Gör rent med vatten. 7