KEMIKALIELÄCKAGET FRÅN TEXTILIER OCH DESS TOXISKA EFFEKT PÅ DAPHNIA MAGNA

Transkript

1 INSTITUTIONEN FÖR BIOLOGI OCH MILJÖVETENSKAP KEMIKALIELÄCKAGET FRÅN TEXTILIER OCH DESS TOXISKA EFFEKT PÅ DAPHNIA MAGNA Ronja Johansson Uppsats för avläggande av naturvetenskaplig kandidatexamen med huvudområdet miljövetenskap 2017, 180 hp Grundnivå

2

3 Sammanfattning Inom textilindustrin används en hel del kemikalier under produktionens gång. Kemikalier används dels i form av pesticider vid odling av naturfibrer men även vid färgning, preservering, olika tvättprocesser samt produktion av själva fibern. Kemikalierna som används i produktion har ofta ingen funktion i den slutgiltiga produkten men kan återfinnas i produkten som föroreningar. Använding av kemikalier sker även för att ge textilierna vissa funktionella egenskaper som t.ex. flamskydd eller antimögelmedel. Dessa kemikalier kan sedan släppa från tyget och överföras till huden. Kemikalier kan lossna under tvätt och färdas med avloppsvattnet till reningsverket. Antingen fastnar de i reningsverksslammet eller åker ut med det renade vattnet i den akvatiska miljön. Syftet med examensarbetet var att undersöka huruvida kemikalieläckaget från textilier har en toxisk effekt på Daphnia magna. För att ta reda på detta utfördes ett akut toxicitetstest på D. magna där immobilisering efter 24 och 48 timmar mättes. Från resultatet skulle EC50-värden tas fram för båda exponeringsperioderna men p.g.a. för hög immobilitet i de negativa kontrollerna var inte detta möjligt. För att besvara frågeställningen om kemikalieläckaget från textilier har en toxisk effekt på D. magna användes resultat från tidigare studier. Dave och Aspegrens studie där 52 textilier testades gav EC50-värden mellan 3,7 och >182 g/l efter 24 timmars exponering. Efter 48 timmar exponering var EC50-värdena mellan <1,0 och >182 g/l. Kemikalieläckaget från textilier kan alltså ha en toxisk effekt på D. magna men denna effekt varierar mycket mellan olika tyger. i

4 Summary The textile industry uses a large amount of chemicals during production. The chemical use includes pesticides during growth of natural fibers, coloring, preservation, different washing processes and production of the fiber itself. These chemicals usually doesn t have a function in the end product but can be found in it as a pollution. Chemicals are also used to give the textiles certain functional properties as for example flame retardant or antimolds. The finished fabric can contain traces of these chemicals which can be released from the textile. The chemicals can be transferred onto the skin from the fabric. The textile can also release chemicals during washing and travel with the sewage water to a sewage treatment plant. Here it can either get stuck in the sewage sludge or go with the cleaned water to the aquatic environment. The purpose of this bachelor s thesis is to examine if the chemical leakage from textiles has a toxic effect on Daphnia magna. To find out if this is in fact the case, an acute toxicity test was performed on D. magna where immobility was observed after 24 and 48 hours. From this EC50-values was to be derived for both exposure periods but because too high immobility was observed in the negative controls this was not possible. To answer the question of whether the chemical leakage has a toxic effect on D. magna, results from past studies were used. Dave and Aspegren s study where 52 textiles were examined, gave EC50-values between 3,7 and >182 g/l after 24 hours of exposure. After 48 hours of exposure the EC50- values were between <1,0 and >182 g/l. This shows that the chemical leakage from textiles can have a toxic effect on D. magna but the level of toxicity can vary a lot between different textiles. ii

5 Förord Detta examensarbete utfördes under andra kvartilen under vårterminen Examensarbetet har utförts inom programmet miljövetenskap med naturvetenskaplig inriktning (NMIL) vid Göteborgs Universitet. Studien har utförts vid institutionen för biologi och miljövetenskap på Göteborgs Universitet och omfattar 15 högskolepoäng. Detta har varit en väldigt lärorik period och jag vill därför tacka alla involverade. Först och främst vill jag tacka min handledare Bethanie Carney Almroth för sitt engagemang, tid och stöd när allt inte gick som det tänkt sig. Utan din hjälp hade detta arbete inte blivit vad det är idag. Jag vill tacka Marie Adamsson för sin vägledning kring hantering av Daphnia magna och för att hon tog sig tid att diskutera möjliga orsaker bakom den höga immobiliteten i mina kontroller. Jag vill även rikta ett tack till Joachim Sturve som varit med och diskuterat utformningen av mitt experiment då min studie skulle bygga vidare på något Joachim och Bethanies masterstudenter gjorde på en ekotoxikologikurs. Tack till Åsa Arrhenius som är förste forskningsingenjör på botanhuset vid Göteborgs Universitet för vägledning i labbet. Jag vill även tacka Lennart Bornmalm som var kursledare på examenskursen för hans vägledning under arbetets gång. Sist men inte minst vill jag rikta ett tack till mina kära klasskamrater, vänner, familj och min pojkvän för stöd under denna stressiga period, utan er hade jag inte klarat det här! Ronja Johansson, Göteborg, maj 2017 iii

6 Innehållsförteckning 1. Inledning EU:s konsumtion av textilier Textilproduktionens olika steg Kemikalielagstiftning Textilavlopp, reningsverk och kemikaliers transportvägar Exponering för kemikalieläckage från textilier Bomull, polyester och nylon Tvättmedel och sköljmedel Daphnia magna Syfte Metod Förberedning av textilkemikalieeluat Akut toxicitetstest på Daphnia magna Positiv kontroll Resultat Positivt kontrolltest Resultat akut toxicitetstest Immobilitet högsta koncentrationen vid akuta toxicitetstestet T-test Tabell 1. T-test immobilitet vid högsta koncentrationen Tolkning av t-test Immobiliseringseffekt från otvättat tyg Pearsons korrelationstest Diskussion Resultat från utfört akut toxicitetstest Möjliga orsaker för ogiltiga kontroller Val av testparametrar Resultatet från studien av direkt exponering Slutsats Källor iv

7 1. Inledning Det finns textilier gjorda av diverse material och de kan innehålla en hel del olika kemikalier. Under produktionen av en textil används kemikalier för många olika ändamål, dels används kemikalier för färgning, preservering samt vid produktionen av fibrer (Dave & Aspegren, 2010). Vid odling av bomull används pesticider och herbicider. Vid transport och förvaring behandlas bomullen med fungicider och biocider. Får kan bli behandlade med parasiticider för att kontrollera externa parasiter enligt Luongo (2015). Dessa kemikalier kan finnas kvar i råvaran även om de inte finns kvar i slutprodukten i detekterbara mängder. Vid värme- och tvättprocesser kan sedan dessa kemikalier lossna från fibern och riskerar då att hamna i den akvatiska miljön och blir ett föroreningsproblem (Luongo, 2015). Textilindustrin utgör enligt Kant (2012) ett stort föroreningsproblem då det är den mest kemikalieintensiva industrin som finns. Textilindustrin är också den största boven när det gäller förorening av rent vatten om man bortser från jordbruket, skriver Kant. Samma källa skriver även att det i dagsläget produceras mer än 3600 olika färgämnen och 8000 olika kemikalier används i de olika processerna för att tillverka textilier (färgning och tryck inkluderat i dessa processer). Av de färgämnen som används inom textilindustrin globalt innehåller ungefär 40 procent av dessa ämnen organiskt bundet klor, många av dessa har visats vara cancerframkallande (Kant, 2012). Kemikalier kan även finnas i det färdiga tyget och verka som impregnering eller flamskydd. Andra funktioner kemikalier i textilier har är att förhindra att tyget möglar eller blir skrynkligt under långa transporter (Kemikalieinspektionen, u.å.). En del av ämnena som enbart har en funktion under själva tillverkningsprocessen kan ibland återfinnas i den textila slutprodukten i små mängder. Processkemikalierna kan också brytas ner till andra ämnen som stannar i tyget som föroreningar (Kemikalieinspektionen, 2015, s.6). Under tvätt och användning släpper många kemikalier från tyget. Läckaget av kemikalier är intressant då det kan ha effekter på både miljön och mänsklig hälsa (Dave & Aspegren, 2010). Enligt Kemikalieinspektionen (u.å.) kan kläder behandlas med bakteriedödande medel för att motverka dålig lukt. I en del kläder finns allergena ämnen så som krom, formaldehyd och latex. Mjukgörande ftalater kan finnas i kläder med plasttryck eller andra plastdetaljer. Under produktionen av textiler används nonylfenoletoxilat vid olika tvättprocesser. Rester av nonylfenoletoxilat läcker sedan från textilerna vid tvätt enligt Kemikalieinspektionen. Vid nedbrytning av nonylfenoletoxilat bildas det misstänkt hormonstörande ämnet nonylfenol som är toxiskt för vattenlevande organismer. Inom EU är nonylfenoletoxilat förbjudet att använda utom några få undantag men p.g.a. import av textilier från länder utanför EU återfinns ämnet i textiler här ändå (Kemikalieinspektionen, u.å.). Antibakteriella medel, exempelvis triklosan eller silver används bl.a. i sportartiklar av textil för att förhindra bakterietillväxt så att inte textilien luktar illa. Långtidseffekter i vattenmiljön och hudirritation har observerats hos triklosan. Silver är toxiskt för vattenlevande organismer enligt Kemikalieinspektionen (2009). Dimetylfumarat är ett exempel på ett antimögelmedel som kan finnas i möbler och antimögelpåsar som läggs i förpackningarna med textilierna. Dimetylfumarat är förbjudet inom EU sedan Azofärgämnen är en annan typ av 1

8 kemikalier som används i textilindustrin. Vissa azofärgämnen bildar arylaminer när de bryts ner och är därför förbjudna inom EU då arylaminer är cancerframkallande. Azofärgämnen kan även vara allergiframkallande enligt Kemikalieinspektionen (2009). Bly, krom och nickel är exempel på metaller som kan finnas i textilier. Bly används vid färgning men ken även finnas i metalldetaljer på kläder, där även nickel används. Krom används vid garvning av läder (Kemikalieinspektionen, 2009) samt är ett betmedel som används för att fixera färg på tyg (Kant, 2012). Bly kan orsaka långtidseffekter i vattenmiljön och kan påverka utvecklingen av barns hjärnor efter att de ansamlats i kroppen. Sexvärt krom kan leda till cancer och framkalla allergiska reaktioner. Nickel är allergiframkallande (Kemikalieinspektionen, 2009). Användandet av antibakteriella biocider i textilier har sett en betydlig ökning. Det verksamma ämnet i antibakteriella biocider kan frigöras från textilien vid tvätt. Silver, triklosan och triklokarban släpper i stor utsträckning från textilier under tvätt enligt Kemikalieinspektionen (2015b, s.9). Med en ökad användning av antibakteriella biocider kommer även en ökad risk för att bakterierna ska bli resistenta mot dessa ämnen. Utifrån detta finns farhågor om att en resistens mot antibakteriella biocider ska påverka bakteriers resistens mot antibiotika (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.9). Enligt Kemikalieinspekionen (2009) behandlas en del textilier med bromerande flamskyddsmedel såsom hexabromcyklododekan som kan ha långtidseffekter på vattenmiljöer och dessutom är svårnedbrytbart. Vid färgning av syntetfibrer används dispensionsfärger, där en del är allergiframkallande. Formaldehyd är ett ämne med många olika funktioner inom textilindustrin enligt Kemiaklieinspektionen (2009) bl.a. färgfixering, motverkning av skrynklor och krympning samt smutsavvisning. Formaldehyd är allergiframkallande och hudirriterande samt potentiellt cancerframkallande. Enligt kemikalieinspektionen (2009) används olika ftalater som mjukgörande ämne inom textilindustrin. Flertalet av dessa ftalater bedöms vara särskilt farliga och finns med på EU:s kandidatförteckning för tillståndsprövning. Exponering för ftalater kan leda till nedsatt fortplantningsförmåga. I textilier används perfluorerade ämnen som impregneringsmedel. PFOS som är en typ av perfluorerade ämne är förbjudet inom EU (Kemikalieinspektionen, 2009). 1.1 EU:s konsumtion av textilier EU:s konsumtion av textilier har det senaste decenniet ökat markant. Ungefär 80 procent av dessa textilier importeras från länder utanför Europeiska unionen. Import av halvfabrikat till EU förekommer där textilierna sedan produceras färdigt och märks som tillverkade inom EU (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.25). På detta vis får varan märkningen tillverkade i EU även om den del av tillverkningen som är mest kemikalieintensiv kan ha skett utanför unionens gränser. Mer än 80 procent av den kemikalieintensiva textilproduktionen sker alltså utanför EU:s gränser enligt EU-statistik skriver Kemikalieinspektionen. Det årliga genomsnittet för textilkonsumtion per EU-medborgare är 19,1 kg (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.26), i Sverige låg konsumtionen på 14,2 kg textilier 2008 (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.28). Mer än två tredjedelar av den totala textilkonsumtionen består av kläder. Textila 2

9 material för golv, exempelvis mattor, är den vanligaste hemtextilkonsumtionen, bestående av 38 procent. Detta följs av lakan som utgör 16 procent av hemtextilkonsumtionen. Ungefär 80 procent av klädkonsumtionen består av underkläder, toppar samt kjolar och byxor (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.26). 1.2 Textilproduktionens olika steg Textilproduktionens första steg är produktionen av fibrerna som textilien består av. Det första steget brukar delas in i två olika kategorier beroende på om fibern som tillverkas är naturlig eller artificiell. Bomull, silke och ull är exempel på naturliga fibrer. Artificiella fibrer är antingen regenererad cellulosa eller har ett petrokemiskt ursprung (Luongo, 2015). Fibrerna används sedan för att producera tråd som i sin tur blir tyg. Det finns olika metoder för att göra tyg från tråd/fibrer, bl.a. vävning, stickning, flätning, icke vävningsteknik och tufting. Sen kommer efterbehandlingsprocesserna som involverar flera olika steg, förbehandling, färgning, tryckning och efterbehandling (Kemikalieinspektionen, 2013, s.18). Figur 1. Textilproduktionens olika steg ( Luongo, 2015) 3

10 1.3 Kemikalielagstiftning Kemiska risker för miljön och människan ska förhindras med hjälp av kemikalielagstiftning. De grundläggande kraven för kemikaliekontroll anges av kemikalielagstiftningen men huvudansvaret för kemikaliekontrollen ligger på företaget som distribuerar kemiska varor eller produkter enligt Kemikalieinspektionen (2015b, s.19). EU har gemensamma regler för distribuering av kemiska varor och produkter då dessa kan påverka den fria rörligheten som finns inom EU. Denna harmonisering av regler innebär att enskilda medlemsländer inte kan avvika från EU:s regelverk, varken åt det strängare eller lindrigare hållet utan speciella skäl. Enligt Kemikalieinspektionen (2015b, s.19) finns ingen samlad lagstiftning gällande kemikalier i textilvaror på den europeiska marknaden utan det regleras istället av flera olika regelverk. Det finns regler som begränsar användningen av vissa kemikalier under textiltillverkningen. Inom EU finns det två olika regelverk som reglerar kemiska ämnen, dels EU:s förordning om klassificering, märkning och förpackning av kemiska ämnen och blandningar (CLP) och dels EU:s kemikalieförordning REACH (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.19). Inom REACH finns kandidatförteckningen, som är en lista över särskilt farliga ämnen (SVHC-ämnen). Ämnena som listas i kandidatförteckningen har egenskaper som kan leda till allvarliga och varaktiga effekter både för miljön och människan. Ämnen på kandidatlistan är cancerogena, reproduktionstoxiska, hormonstörande eller framkallar allvarliga allergiska besvär. Dessa särskilt farliga ämnen kan även vara svårnedbrytbara och bioackumulerande enligt Kemikalieinspektionen (2015b, s.21). I kandidatförteckningen listas en del ämnen som kan finnas i textilier bl.a. flera olika ftalater, nonylfenoletoxilater och dess derivat, perfluoroktansulfonat karboxylsyra (PFOA) samt bromerande flamskyddsmedel såsom hexabromocyclododekan och dekabromdifenyleter. Ämnen som uppfyller kriterierna för särskilt farliga ämnen men som inte står i kandidatförteckningen ska identifieras och läggas till i kandidatförteckningen (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.21). REACH-förordningen har en tillståndslista (bilaga XIV) där ämnen i kandidatförteckningen kan läggas till (Kemikalieinspektionen, 2015a). Tillståndskravet i REACH gäller inte om ämnena finns i varor som importeras till EU (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.21). 1.4 Textilavlopp, reningsverk och kemikaliers transportvägar Enligt Sharma et al. (2007) är föroreningen av akvatiska miljöer idag ett vidsträckt problem världen över, men problemet är större i utvecklingsländer på grund av utsläpp av obehandlat eller enbart delvis renat avfallsvatten både från kommuner och industrier. Avfallsvattnet från industrier har större betydelse på grund av dess relativt högre toxicitet i jämförelse med kommunalt avfallsvatten. Det industriella avfallsvattnet bör ses som mer oroande då de har en toxisk effekt på bl.a. plantor, vars uppgift är att rena den akvatiska miljön. Textilindustrin är en av de industrier vars avfallsvatten är bekymmersamt då de släpper ut stora volymer av avfallsvatten i miljön (Sharma et al., 2007). Avlopp från industrier som håller på med textilfärgning och efterbehandlingar på tyger uppskattas vara källan till procent av all världens vattenföroreningar från industrier enligt världsbanken (Kant, 2012). Textilindustrin är ett större problem i utvecklingsländer för att industrin växt snabbare där p.g.a. lägre krav på 4

11 hantering av avfall och billigare arbetskraft (Sharma et al., 2007). Textilavfallsvattnet är en blandning av olika färgämnen och organiska föreningar (Sharma et al., 2007). Textilavfallsvattnet kan även innehålla svavel, nafta, ättiksyra, tvål, nitrater, kypfärger och kromföreningar (Kant, 2012). Kypfärger är ett samlingsnamn för vattenolösliga färgämnen som används vid färgning av cellulosafibrer. Ett exempel på en kypfärg är indigo (Britannica, 1998 & kypfärgning, 2017, 4 maj). Hydrokarbonbaserade mjukgörare, formaldehydbaserade färgämnen samt icke biologiskt nedbrytbara färgkemikalier kan också bidra till avfallsvattnets toxicitet (Kant, 2012). Avfallsvattnet innehåller även höga koncentrationer av tungmetaller (Sharma et al., 2007) så som arsenik, bly, kadmium, koppar, kvicksilver, kobolt och nickel. Allt detta tillsammans med en del hjälpkemikalier gör att avfallsvattnet har en hög toxicitet. Det giftiga avfallsvattnet från textilindustrin släpps ut i miljontals liter från fabriker (Kant, 2012). Kemikalieläckaget som sker vid tvätt av textilierna hamnar i avloppsvattnet som sedan transporteras vidare till reningsverken. Om de ämnen som släpper från textilierna är svårnedbrytbara, och reningsverket inte kan bryta ner dem, finns två möjliga slutstationer för ämnena. Antingen åker de rakt igenom reningsverket och släpps ut i den akvatiska miljön med resten av det renade avloppsvattnet, eller så fastnar ämnena i reningsverksslammet. Reningsverksslammet används ibland på jord (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.36-37), som gödselmedel för jordbruket, främst för att återföra fosfor till marken (Naturskyddsföreningen, 2012). Organismer i markekosystemen kan alltså exponeras för ämnen som släpper från textilier genom att dessa ämnen hamnar i reningsverksslammet som sedan används som gödsel inom jordbruket. Om slammet används som gödsel för ätbara grödor och ämnena som släppt från textilierna tar sig in i grödans ätbara delar kan människan exponeras genom maten (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.36). 1.5 Exponering för kemikalieläckage från textilier Människors exponering för kemikalieläckage från textilier sker främst genom hudkontakt men människor kan även exponeras genom att kemikalier släpper från tyget och blir en del av inomhusdammet som människor sedan kan få i sig genom inandning eller oavsiktlig förtäring. För små barn är den oavsiktliga förtäringen en större exponeringsväg, även oral exponering är aktuell när det gäller små barn då de suger eller tuggar på textilier (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.35). Kemikalier som används inom textilindustrin utgör en fara för människan då de kan absorberas genom huden, kemikalierna kan evaporera till luften som vi sedan andas in (Kant, 2012). Utsläpp från reningsverk som innehåller ämnen som lossnat från tyger utgör ett hot mot sedimentlevande organismer där reningsverk släpper ut det renade vattnet (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.47). Nedsänkta och fritt flytande hydrofyter som levt i vattenmiljöer där utsläpp av textilvattenavfall skett, har helt försvunnit från utsläppsplatsen. Studier har visat att avfallsvattnet från textilindustrin är mycket giftigt för både flora och fauna (Sharma et al., 2007). 5

12 Hur mycket av de kemikalierna som påträffas i miljön som kommer från en källa som har med konsumentanvändningen att göra är i dagsläget okänt för de flesta ämnen som har en koppling till textilier och dess produktion. Nonylfenoletoxilaterna är ett undantag, då en viktig källa till exponeringen av nonylfenoletoxilat för den akvatiska miljön har identifierats som tvätt av textilier. Konsumentanvändningen av textilier anses även vara en viktig källa för nonylfenoletoxilats nedbrytningsprodukt nonylfenol i vattenmiljön (Kemikalieinspektionen, 2015b, s.37). Figur 2. Kemikalieläckgets väg från textilier till miljön och människan ( Luongo, 2015) 1.6 Bomull, polyester och nylon Bomull är den textilfiber som är viktigast när det gäller kläder. Bomull anses vara en miljövänlig fiber då den är en naturlig cellulosafiber, som är biologiskt nedbrytbar och kommer från en förnyelsebar källa. Men då bomullsplantor är väldigt utsatta för angrepp från insekter och svampar krävs användning av en hel del pesticider och fungicider vid odlingen av bomull. Innan skörd sprayas bomullsplantan med så kallat avlövningsmedel som är kemikalier vars funktion är att få bladen att falla från plantan så att bomullsfibrerna inte skadas enligt Chen och Davis Burns (2006). Det är också vanligt att bomull bleks innan färgning för att färgen ska bli mer jämn. Bomull har behandlats med formaldehyd för att förbättra tygets förmåga att återhämta sig från skrynklighet. Vid produktion av nylon- och polyesterfibrer är utgångsämnet en polymerlösning som fås från biprodukten av petroleumresurser. Nylon kräver inga efterbehandlingsprocesser, som bomull behöver, efter att fibern formats (Chen & Davis Burns, 2006). 6

13 1.7 Tvättmedel och sköljmedel Ur ett miljöperspektiv är kemikalierna som finns i tvättmedel viktiga dels för att de används i stora kvantiteter men också för att majoriteten av tvättmedelsprodukter når miljön genom avloppsvatten efter användning. Tvättmedelskomponenter ligger bakom en stor del av avloppsvattnets toxicitet. Tvättmedel har visats vara giftigt för vattenlevande organismer (Petterson, et.al., 2000). Efter tvätt kan rester av tvättmedel finnas kvar i textilierna som sedan kan överföra tvättmedelsresterna till huden (Basketter, et.al., 2003). Komponenterna i ett typiskt svenskt tvättmedel är främst ytaktiva ämnen (även kallade tensider), en byggare (zeolite A), dess byggaretillsats (polykarboxylat) samt ett blekmedel (perkarbonat). I tvättmedel finns även enzymer (proteaser), blekmedelsaktiverare (TAED) och parfymer. Sköljmedel består främst av vatten och ytaktiva ämnen (Petterson, et.al., 2000). 1.8 Daphnia magna Daphnia återfinns vanligtvis i färskvattenekosystem. Vid studier av kemikaliers toxicitet rekommenderas Daphnia som testorganism av OECD. Daphnia magna Straus är den testorganism som föredras för ett akut immobilitetstest på Daphnia sp. även om andra Daphniaarter kan vara lämpliga, t.ex. Daphnia pulex. Alla organismer som ska användas för ett visst test bör vara tagna från samma population. OECD rekommenderar starkt att testorganismerna inte är första generationen som fötts på labb för att minska variationen mellan de olika individerna. Testorganismerna bör härstamma från en frisk population av Daphnia som inte visar några tecken på stress. Indikatorer på stress hos Daphnia kan vara bl.a. hög dödlighet, missfärgade djur eller närvaro av hanar (OECD, 2004). Biologiska test används för att värdera skadliga effekter på vattenkvalité, där toxiciteten för kräftdjur, så som Daphnia sp., är en bra art att studera ur ekotoxikologisk synvinkel då de dels är primärkonsumenter och dels utgör en stor del av zooplankton i akvatiska ekosystem (ISO, 2012). 1.9 Syfte Denna studie syftar till att visa på om ämnen som släpper från textilier har en toxisk effekt på Daphnia magna. Syftet med detta arbete var att studera effekterna hos D. magna av kemikalieläckage till vatten från tre olika tyger. Textilierna som testades var sportbyxa, barnhandduk och denimjeans. Effekterna på D. magna studerades vid olika koncentrationer. Även skillnader i toxicitet mellan tvättade och otvättade tyger studerades. 7

14 2. Metod 2.1 Förberedning av textilkemikalieeluat Totalt testades tre olika tyger, samma som Joachim Sturve och Bethanie Carney Almroth, båda docenter vid Göteborgs Universitet, använt i tidigare ekotoxikologiska studier som genomfördes av masterstudenter. Tanken var att kunna jämföra kemikalieläckaget från textiliers toxicitet för olika arter. Sportbyxor (Polyester 95 %, nylon 5 %), mönstrad barnhandduk (100 % bomull) och svarta och blåa denimjeans (100 % bomull) valdes då de är vanligt förekommande på den svenska marknaden. Hälften av alla tygtyper tvättades en gång med Ariel actilift tvättmedel. Rekommenderad dos användes på standardprogrammet 40 grader i tvättmaskin. Tygerna klipptes i små kvadrater, uppskattningsvis 1x1 cm. Färgskillnader togs hänsyn till för jeans och handukstygerna för att få en jämn distribution av kemikalier från de olika färgerna. De klippta tygbitarna (2x5g per textiltyp) distribuerades i sex olika tvåliters glasflaskor som fylldes med en liter ADaM-vatten, även kallat Aachener Daphnien Medium (för recept se Klüttgen, Dülmer, Engels & Ratte, 1994). En sjunde tvåliters glasflaska fylldes med enbart en liter ADaM-vatten. Flaskorna ställdes sedan på en skakmaskin en vecka, under veckan skakades flaskorna manuellt tre gånger. Eluaten och ADaM-vattnet filtrerades sedan med Munktell analytiskt filterpapper till sju olika enlitersflaskor. Eluatstamlösningarna som fås kan då sägas ha en koncentration på 10g/L om mängden textil i ADaM-vattnet som eluaten är gjorda på skrivs som en koncentration. En spädningsserie gjordes med spädningsfaktor 2,5 på alla de otvättade textiliernas eluat. Detta upprepades fem gånger. Spädningen gjordes för att få sex olika koncentrationer av eluaten vilka behövdes för immobilitetstestet med Daphnia magna för att kunna beräkna ett EC50-värde från resultatet. EC50 är den koncentration där 50 procent av de exponerade D. magna blivit immobiliserade efter en viss exponeringstid (OECD, 2004). Koncentrationerna av varje eluat som erhölls var 10 g/l, 4 g/l, 1,6 g/l, 0,64 g/l, 0,256 g/l samt 0,1024 g/l. Två petriskålar fylldes med 50 ml vardera av varje koncentration. 2.2 Akut toxicitetstest på Daphnia magna Testorganismerna togs från Daphnia magna kulturen som finns vid Institutionen för biologi och miljövetenskap vid Göteborgs Universitet i Botaniska trädgården i Göteborg. Denna D. magna-odling härstammar från en vild population tagen från en sjö i Bohuslän 1979 och sköts idag av Marie Adamsson. D. magna yngre än 24 timmar tagna från samma population exponerades för de olika koncentrationerna (10 g/l, 4 g/l, 1,6 g/l, 0,64 g/l, 0,256 g/l och 0,1024 g/l) av de tre olika eluaten gjorda på de otvättade tygen. Två negativa kontroller för varje typ av eluat gjort på det otvättade tyget gjordes där två petriskålar fylldes med 50 ml ADaM-vatten. D. magna exponerades enbart för den högsta koncentrationen av det otvättade tygernas eluat (10 g/l) p.g.a. tidsbrist. Till dessa petriskålar gjordes också två negativa kontroller. Sedan tillsattes 10 D. magna i varje petriskål. I samband med testet utfördes även kontrolltest där D. magna enbart exponerades för ADaM-vatten. Exponeringen skedde under 48 timmar vid rumstemperatur, där immobilitet mättes efter 24 och 48 timmar. EC50 för 24 och 48 8

15 timmar bestämdes. Som statistiskt test utfördes ett two tailed two sampled t-test i excel för att undersöka möjliga samband mellan den observerade immobiliteten vid exponering för den högsta koncentrationen av de olika tygerna samt kontrollerna. För det akuta immobilitetstestet där en koncentrationsserie av de tre olika textilkemikalieeluaten testades, utfördes ett two tailed Pearsons korrelationstest i statistikprogrammet SPSS. 2.3 Positiv kontroll En positiv kontroll utfördes där Daphnia magna exponerades för fem olika koncentrationer av koppar(ii)kloriddihydrat löst i ADAM-vatten. De olika koncentrationerna av koppar som D. magna exponerades för var 256 µg/l, 64 µg/l, 16 µg/l, 4 µg/l samt 1 µg/l. För varje koncentration placerades 50 ml vardera i två olika petriskålar med 10 D. magna (0-24 h) i varje. Det går inte att mäta upp en så liten mängd koppar(ii)kloriddihydrat som behövs för att göra en kopparstamlösning med koncentration 256 µg/l. För att förenkla spädningen av stamlösningen beräknades mängden koppar(ii)kloriddihydrat som behövdes för att göra en kopparstamlösning med koncentrationen 25,6 mg/l (2,56 mg Cu/100 ml = 6,92 mg CuCl2*2 H2O/100 ml). Då 6,92 mg är för specifikt för att mäta upp på en våg gjordes en 5 gånger starkare lösning som sedan späddes ut. För att få 150 ml kopparstamlösning med koncentrationen 256 µg/l blandades 150 µl kopparstamlösning med koncentrationen 25,6 mg/l med 149,85 ml ADaM-vatten. Två petriskålar fylldes med 50 ml vardera av kopparlösning med koncentration 256 µg/l. Resterande 50 ml späddes till 200 ml med koncentrationen 64 µg/l. En koncentrationsserie gjordes med 100 ml vardera av koncentrationerna 256 µg/l, 64 µg/l, 16 µg/l, 4 µg/l och 1 µg/l. 3. Resultat 3.1 Positivt kontrolltest De positiva kontrolltest som utfördes innan testet med kemikalieeluaten gav problematiska resultat med för hög immobilitet i de negativa kontrollerna med ADaMvatten. På grund av detta kunde inte resultatet från de positiva kontrollerna användas. Därmed gick det inte heller att beräkna ett EC50-värde för exponering av kopparlösningen på Daphnia magna. Inga positiva kontroller utfördes i samband med det akuta toxisitetstestet där kemikalieeluaten testades av denna anledning. 3.2 Resultat akut toxicitetstest Då immobiliteten i alla kontrollerna var för hög för att resultatet skulle räknas som giltigt är orsaken bakom immobiliteten i hela resultatet okänt. Det är oklart om immobiliseringseffekten i petriskålarna med testsubstans var till följd av exponering för eluaten, eller om immobiliseringen berodde på samma felkälla som låg bakom immobiliseringen i de negativa kontrollerna. Detta gjorde det också omöjligt att beräkna EC50-värden för effekten av de olika tygernas läckage på Daphnia magna. Ingen 9

16 immobilitet observerades i de petriskålar där D. magna exponerades för högsta koncentrationen av kemikalieläckaget från jeanstyget, både det tvättade och det otvättade. Immobiliteten i petriskålarna där D. magna exponerades för högsta koncentrationen av kemikalieläckaget från handdukstyget som var otvättat var även det väldigt lågt. Inga immobila individer observerades efter 24 timmar och endast två av 20 var immobila efter 48 timmar. Detta tyder på att det eventuellt fanns något som släppte från dessa tyger till vattnet som D. magna saknade i kontrollerna med ADaM-vatten. Resultaten i Figur 3 visar en högre standardavvikelse för de tvättade tygerna än för de otvättade tygerna. Från Figur 4 kan inget tydligt samband mellan exponeringskoncentration av sportbyxeluatet och antal immoiliserade D. magna utläsas. Figur 5 visar ett samband där immobiliseringseffekten minskar med ökad exponerings koncentration. Det går dock inte att säkerställa att de beror på exponeringen för de olika eluaten då resultaten är ogiltiga. 3.3 Immobilitet högsta koncentrationen vid akuta toxicitetstestet Figur 3: Medelvärde för immobilitet hos Daphnia magna vid exponering för högsta koncentrationen (10 g/l) av textilkemikalieeluat efter 24 och 48 timmar med error bars baserade på standardavvikelsen. Immobiliteten i de negativa kontrollerna var 60 procent efter 24 timmar och 97,5 procent efter 48 timmar. Resultatet är därför ogiltigt då immobiliteten i de negativa kontrollerna inte får överskrida 10 procent 10

17 3.4 T-test Tabell 1. T-test immobilitet vid högsta koncentrationen Tabellen visar p-värden från oparat two tailed two sampled t-test utförda i excel. Om p-värdet visar på en signifikans är medelvärdena för de två testade variablerna olika. p-värde 24 timmar p-värde 48 timmar Kontroll vs sport tvättat 0,0565 0,0955 Kontroll vs jeans tvättat 0,0059** *** Kontroll vs handduk tvättat 0,0136* 0,0955 Kontroll vs sport otvättat 0,2929 0,0955 Kontroll vs jeans otvättat 0,0082** 0,0028** Kontroll vs handduk otvättat 0,0082** 0,0034** Sport tvättat vs sport otvättat 0,1548 0,1835 Jeans tvättat vs jeans otvättat *** *** Handduk tvättat vs handduk otvättat 0,4226 0,2724 * Om p<0,05 är det signifikant på signifikansnivån 0,05, markerat med gul i tabellen. ** Om p<0,01 är det signifikant på signifikansnivån 0,01, markerat med grönt i tabellen. *** De fall när p-värde inte gått att beräkna har markerats med rött. 3.5 Tolkning av t-test T-testet visade på en signifikant skillnad i medelvärde mellan de negativa kontrollerna och det tvättade jeanstyget efter 24 timmars exponering (p=0,0059). Denna skillnad beror på den höga immobiliteten i de negativa kontrollerna, då jeanstyget inte uppvisade någon immobilitet vid högsta koncentrationen. Det gick inte att beräkna ett p-värde med hjälp av t-test för eventuell skillnad mellan de negativa kontrollerna och det tvättade jeanstyget efter 48 timmars exponering. T-testet visade på en signifikant skillnad i medelvärde mellan de negativa kontrollerna och det tvättade handdukstyget efter 24 timmars exponering (p=0,0136), dock enbart på signifikansnivån Denna skillnad grundar sig främst i den höga immobiliteten i de negativa kontrollerna då enbart t-testet visade på en signifikant skillnad i medelvärde mellan de negativa kontrollerna och det otvättade jeanstyget efter både 24 (p=0,0082) och 48 (p=0,0028) timmars exponering. Denna skillnad beror på den höga immobiliteten i de negativa kontrollerna, då jeanstyget inte uppvisade någon immobilitet vid högsta koncentrationen. 11

18 T-testet visade på en signifikant skillnad i medelvärde mellan de negativa kontrollerna och det otvättade handdukstyget efter både 24 (p=0,0082) och 48 (p=0,0034) timmars exponering. Denna skillnad beror på den höga immobiliteten i de negativa kontrollerna, då handdukstyget inte uppvisade någon immobilitet vid högsta koncentrationen efter 24 timmar och endast två Daphnia magna var immobiliserade efter 48 timmars exponering. Det gick inte att beräkna ett p-värde med hjälp av t-test för eventuell skillnad mellan det tvättade och otvättade jeanstyget. 3.6 Immobiliseringseffekt från otvättat tyg Figur 4: Immobilitet hos Daphnia magna vid exponering för olika koncentrationer av eluat gjorda på det otvättade sportbyxtyget efter 24 och 48 timmar. Immobiliteten i de negativa kontrollerna var 40 procent efter 24 timmars exponering och 90 procent efter 48 timmars exponering. Resultatet är därför ogiltigt då immobiliteten i de negativa kontrollerna inte får överskrida 10 procent 12

19 Figur 5: Immobilitet hos Daphnia magna vid exponering för olika koncentrationer av eluat gjorda på det otvättade jeanstyget efter 24 och 48 timmar. Immobiliteten i de negativa kontrollerna var 50 procent efter 24 timmars exponering och 95 procent efter 48 timmars exponering. Resultatet är därför ogiltigt då immobiliteten i de negativa kontrollerna inte får överskrida 10 procent Figur 6: Immobilitet hos Daphnia magna vid exponering för olika koncentrationer av eluat gjorda på det otvättade handdukstyget efter 24 och 48 timmar. Immobiliteten i de negativa kontrollerna var 35 procent efter 24 timmars exponering och 75 procent efter 48 timmars exponering. Resultatet är därför ogiltigt då immobiliteten i de negativa kontrollerna inte får överskrida 10 procent 13

20 3.7 Pearsons korrelationstest Pearsonkorrelationen mellan den observerade immobiliteten efter 24 timmars exponering och koncentrationen av sportbyxeluat var -0,0005 där p=0,999. Pearsonkorrelationen mellan den observerade immobiliteten efter 48 timmars exponering och koncentrationen av sportbyxeluat var -0,043 där p=0,883. Pearsonkorrelationen mellan den observerade immobiliteten efter 24 timmars exponering och koncentrationen av jeanseluat var -0,640 där p=0,025. Pearsonkorrelationen mellan den observerade immobiliteten efter 48 timmars exponering och koncentrationen av jeanseluat var -0,886 där p=0,0001. Pearsonkorrelationen mellan den observerade immobiliteten efter 24 timmars exponering och koncentrationen av handdukseluat var -0,463 där p=0,129. Pearsonkorrelationen mellan den observerade immobiliteten efter 48 timmars exponering och koncentrationen av handdukseluat var -0,825 där p=0,001. Inget förhållande mellan exponeringskoncentrationen av det otvättade sporteluatet och immobiliteten vid denna exponering gick att finna. Exponeringskoncentrationen har ett negativt förhållande till den observerade immobiliteten hos Daphnia magna då de exponerades för det otvättade jeanstyget, både efter 24 (r= -0,640, p=0,025) och 48 (r= - 0,886, p=0,0001) timmars exponering. Förhållandet efter 24 timmars exponering är dock bara signifikant på en 0,05 signifikansnivå medan förhållandet vid 48 timmars exponering även är signifikant på en 0,01 signifikansnivå. Inget förhållande mellan exponeringskoncentrationen av det otvättade handdukseluatet och immobiliteten vid denna exponering efter 24 timmars exponering gick att finna. Efter 48 timmar exponering fanns ett negativt förhållande (r= -0,825, p=0,001) mellan exponeringskoncentrationen av handdukseluatet och immobiliteten vid denna exponering. Även vid de test där relation mellan variablerna gått att säkerställa kan inte detta sägas med säkerhet p.g.a. den höga immobiliteten i de negativa kontrollerna vilka har ogiltigförklarat hela resultatet. 4. Diskussion 4.1 Resultat från utfört akut toxicitetstest I Figur 3 ses en stor standardavvikelse för replikaten både för sporttyget och handdukstyget något som skulle kunna tyda på att Daphnia magna i ett replikat i båda fallen kan ha blivit immobiliserade p.g.a. en faktor som inte har med eluaten att göra. En möjlig förklaring är att ett replikat för båda tygerna blivit kontaminerade av något som är mer toxiskt för D. magna. En annan möjlighet är den mänskliga faktorn och att D. magna i ett av replikaten tagit skada vid experimentets utförande. I Figur 3 kan utläsas att ingen immobilisering vid exponering av jeanseluat vid koncentrationen 10 g/l skedde, något som tyder på att läckaget från jeanstyget inte är toxiskt för D. magna vid denna koncentration. Detta är fullt möjligt men behöver inte betyda att tyget inte släpper ämnen som är giftiga för D. magna utan skulle kunna innebära att D. magna behöver exponeras för en högre koncentration av jeanseluatet för att en akut toxisk effekt ska kunna observeras. Studerar man EC50 värdena från Dave och Aspegrens studie (2010) fås ett intervall med koncentrationer för olika tyger som har en 14

21 50 procentig toxisk effekt på D. magna. Intervallet ligger mellan 3,7 och >182 för 24 timmars exponering och mellan <1,0 och >182 för 48 timmars exponering. Vid granskning av de olika EC50-värdena framgår det att 17 av 52 testade textilier hade en effekt på 50 procent av testsubjekten efter 48 timmar vid en koncentration som var 10 g/l. Samma siffra för 24 timmars exponering är 8 av 52. Detta indikerar att testkoncentrationerna i denna studie kan vara för låga för ge en akut toxisk effekt på D. magna även om testet hade varit giltigt. Skulle testet göras om bör högre koncentrationer än de som användes i detta försök inkluderas. Det tvättade sporttyget visar en lägre immobilisering än det otvättade, se Figur 3, men eftersom kontrollerna visade för hög dödlighet går det inte att avgöra om denna skillnad är signifikant eller inte. Om de immobiliserade Daphnia magna beror på eluatet skulle det indikera att kemikalier släppt från sporttyget vid tvätt och att tyget efter det innehållit färre toxiska ämnen. Tvätt verkar ha motsatt effekt på handdukstyget, då fler immobiliserade D. magna fanns vid exponering av det tvättade än det otvättade handdukstyget. Om denna effekt beror på exponeringen för handdukseluatet indikerar det att handdukstyget tagit upp toxiska ämnen från tvätten som sedan släppt från tyget när eluatet gjordes. Ingen skillnad kan utläsas mellan det tvättade och otvättade jeanstyget vilket tyder på att jeanstyget inte tagit upp kemikalier som har en toxisk effekt på D. magna under tvätten så som handdukstyget eventuellt gjort. Från Figur 4 kan inget tydligt samband mellan exponerings koncentration av sportbyxeluatet och antal immobiliserade Daphnia magna utläsas. Detta kan innebära att immobiliseringen i petriskålarna där D. magna exponerades för sportbyxeluatet inte beror på exponeringen för eluatet utan effekten beror på samma orsak som immobiliseringen som sågs i de negativa kontrollerna. Alternativt kan det vara så att inget samband går att urskilja för sportbyxeluatet för att det finns två olika effekter. Den ena effekten är immobiliseringen i de negativa kontrollerna och de låga koncentrationerna och den andra är en faktisk effekt från sportbyxeluatet. Att det finns något som ger en immobiliseringseffekt i de låga koncentrationerna och i de negativa kontrollerna stämmer överens med resulteten för de andra eluaten. Båda de andra eluaten med otvättade tyger visar på ett samband där immobiliseringseffekten är högre vid lägre koncentrationer, se Figur 5 och 6. Att sportbyxtyget skulle visa en immobiliseringseffekt vid lägst koncentration är även rimligt då sportkläder behandlas med antibakteriella medel, så som silver, som visats vara toxiskt för vattenlevande organismer (Kemikalieinspektionen, 2009). Immobiliseringen i Figur 4 är väldigt varierande över de olika koncentrationerna vilket tyder på att någon felkälla som t.ex. skada vid utförandet av experimentet skett vid en del av koncentrationerna. Figur 5 är intressant då den visar på ett motsatt samband mellan exponerings koncentration och antal immobiliserade, antalet immobiliserade ökade med minskad exponeringskoncentration. Detta tyder på en av två saker. Alternativ ett är att petriskålarna har blivit ihopblandade och sambandet egentligen är det motsatta. Detta alternativ är inte troligt då petriskålarna fylldes på efterhand när spädningsserien gjordes och märktes med koncentration direkt. Alternativ två är att något som släppte från jeanstyget gjorde att Daphnia magna trivdes bättre i vattnet med kemikalieläckage från jeans än de gjorde i kontrollerna med ADaM-vatten. Detta är ett väldigt oväntat resultat då ADaM-vatten är ett artificiellt färskvatten specifikt gjort för att användas som medium för zooplankton kulturer i laboratorier. ADaM-vatten ska garantera framgångsrik långvarig uppfödning samt hög fitness hos zooplanktonen (Klüttgen et al., 1994). 15

22 Figur 6 visar ett väldigt utspritt resultat gällande effekt från koncentrationsserien. Daphnia magna uppvisade en lägre immobilitet vid exponering av högsta koncentrationen av handdukseluatet. Även den näst högsta koncentrationen verkar ha minskat immobiliteten hos D. magna i testet. Det möjliga sambandet mellan minskade immobilitet vid ökad koncentration av handukseluat är dock betydligt mindre tydligt för handdukstyget än för jeanstyget. Det är alltså möjligt att även handdukstyget släppt ifrån sig något som D. magna saknade i ADaM-vattnet. En annan möjlighet är att alla petriskålarna var kontaminerade trots försiktighetsåtgärden med avsköljning innan försökets utförande och att något som fanns i eluatet från jeans och handdukstyget interagerat med det kontaminerande ämnet och på så sätt minskat effekten på D. magna. En långsökt mne tänkbar förklaring kan även vara att ett ämne som släppt från jeans och handdukseluatet liknar kontaminationsämnet i struktur och egenskaper och på så vis konkurrerat med kontaminationsämnet om att tas upp av D. magna. Om ämnet som släppte från jeans- och handdukstyget var mindre toxiskt än kontamineringsämnet skulle det förklara sambandet mellan exponeringskoncentration och immobilitet som ses i Figur 5. Det skulle även förklara varför den högsta och näst högsta koncentrationen av handdukseluatet gav en lägre immobilitet som ses i Figur 6. Detta är dock inte sannolikt. 4.2 Möjliga orsaker för ogiltiga kontroller För att ett akuttoxicitetstest ska räknas som giltigt krävs även att den upplösta syrekoncentrationen i både kontrollerna och testkärlen är 3 mg/l vid testets slut (OECD, 2004). Den upplösta syrekoncentrationen mättes inte, varken innan, under eller efter försökets slut, vilket innebär att detta kan vara felkällan baom varför så hög immobilitet observerades i kontrollerna. Men eftersom ingen immobilitet observerades i petriskålarna där Daphnia magna exponerades för högsta koncentrationen av jeanstygets eluat, se Figur 6, måste det i så fall finnas något som gjort att den lösta syrekoncentrationen var betydligt lägre i kontrollerna än i petriskålarna med jeanstygets eluat. Då jeanseluatet innehåller ADaM-vatten och läckaget av kemikalier samt fibrer från tyget som varit tillräckligt små för att ta sig igenom filtret borde det inte finnas något i dessa petriskålar som tillför syre till eluatet. Något annat som kan ha påverkat immobiliteten i kontrollerna är ph. Enligt OECD bör ph ligga mellan 6 och 9 och bör inte variera mer än 1,5 enheter i något test (OECD, 2004). Om ph har förändrats i de negativa kontrollerna till något där Daphnia magna påverkas men detta inte skett i petriskålarna med eluat, skulle detta kunna vara källan till den höga immobiliteten i de negativa kontrollerna. Det är dock mer troligt att ph skulle vara på en nivå där D. magna inte trivs i eluatet där något utöver ADaM-vatten lagts till. För att ph ska ändras måste det antingen finnas en källa för vätejoner eller något som binder till sig vätejoner. ADaM-vattnet är dels specifikt gjort för att vara ett bra medium för D. magna (Klüttgen et al., 1994) och dels taget från samma källa som det ADaM-vatten som D. magna kulturen på Göteborgs Universitet lever i. Något som kan ha påverkat immobiliteten i de negativa kontrollerna är temperaturen. Enligt OECD:s guide för akuttoxicitetstest på Daphnia sp. (2004) bör testtemperaturen hålla sig inom C. Då testet utfördes vid rumstemperatur, något som valdes då OECD guiden (2004) även rekommenderar att testet utförs under liknande omständigheter som odlingen hålls vid gällande temperatur, ljus och medium, kan det antas ha legat ungefär runt denna 16

23 temperatur. Det mest troliga om temperaturen påverkat immobiliteten i de negativa kontrollerna är då att ADaM-vattnet blivit uppvärmt av solen som lyst in i rummet där petriskålarna låg. Detta borde dock ha haft en jämn effekt på immobiliteten i alla petriskålarna vilket göra denna anledning mindre trolig. Temperaturen i några av de senare negativa kontrollerna som gjordes i försöket kan dock ha påverkats av ytterligare en faktor. Allt medium som användes till D. magna under försöket kom från glasflaskor som stått i kylen nyligen utom några av de senare kontrollerna där ADaM-vattnet togs av en behållare med ADaM-vatten som stått ute i rumstemperatur hela tiden. Detta innebär med att det finns ytterligare en felkälla där några av de senare kontrollerna inte har stått på skak i en vecka så som eluatet gjorde. Kontaminering till följd av smutsig utrustning är en annan möjlig orsak bakom den höga immobiliteten i de negativa kontrollerna. Detta är osannolikt då enbart de negativa kontrollerna och de lägre koncentrationerna av eluat skulle vara kontaminerade för att förklara det givna resultatet. Då den oväntade immobiliteten observerades främst på de negativa kontrollerna och några av petriskålarna med lägre koncentration av eluat. Kontaminering av bara dessa petriskålar är inte så troligt då inget har gjorts annorlunda med dem än de andra. Allt som använts i försöket är även taget från samma ställen vilket gör det mindre troligt med en kontaminering av alla negativa kontroller men inte i någon av petriskålarna med högre koncentrationer. Generellt sett mådde Daphnia magna i allmänhet bättre i någon av testsubstanserna än de gjorde i de negativa kontrollerna. Utifrån detta hade det dock varit möjligt att alla var kontaminerade men att det som de var kontaminerade med interagerade med något som släppte från handduks- och jeanstyget som inte fanns i sportbyxtyget. Detta eftersom sportbyxtyget var det enda tyget som inte hade något uttydbart möjligt samband mellan exponeringskoncentration och immobilitet i proverna, se Figur 4. Kontaminering är även mindre troligt då den mest sannolika källan till kontaminering skulle vara att petriskålarna inte var riktigt rena. Alla petriskålar sköljdes av med avjoniserat vatten innan försökets start för att minska risken för kontaminering från orena petriskålar. Detta gjordes på grund av de tidigare problemen med hög immobilitet då petriskålarna misstänktes vara anledningen bakom den höga immobiliteten efter att ett kontrolltest efter 24 timmar visade accepterar immobilitet när petriskålarna togs från en annan låda än de andra gångerna. Det finns dock andra möjliga kontamineringskällor än petriskålarna, t.ex. hade det material som användes för att mäta upp allt och späda testsubstansen till rätt koncentrationer inte varit helt rena. För att förklara att de negativa kontrollerna påverkades är det då troligast att enbart den mätcylinder som användes för att mäta upp 50 ml av ADaM-vatten var kontaminerad men då de negativa kontrollerna haft för hög immobilitet i flera omgångar är detta inte sannolikt. Något annat som kan ha påverkat resultatet är att experimentet utfördes av en person utan större labbvana. Detta kan ha gjort att Daphnia magna inte hanterats på bästa sätt och att fler D. magna än vad som är vanligt vid det här testet dog på grund av skador de fått under testets utförande. Det är dock osannolikt att skador är orsaken till all immobilitet som observerades i de negativa kontrollerna då ingen immobilitet observerades i flera petriskålar med testsubstans i. Om felhantering lett till hög immobilitet borde det vara mer jämnt fördelat mellan alla petriskålar. Alternativt haft en större påverkan i de första petriskålarna som 17