Water quality - Determination of the inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Acute toxicity test (ISO 6341:1996) Vattenundersökningar - Bestämning av rörlighetshämning för Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Akut toxicitetstest (ISO 6341:1996) The European standard has the status of a Swedish Standard. This document contains the official English version of. Europastandarden gäller som svensk standard. Detta dokument innehåller den officiella engelska standarden. This standard supersedes the Swedish Standard Denna stndard ersätter SS 02 81 80, utgåva 1. SS 02 81 80, edition 1. This standard specifies a method for determination of the acute toxicity to Daphnia magna Straus of chemical substances, sewage, surface waters or ground waters. The initial concentration which in 24 h or 48 h immobilises 50 % of the exposed Daphnia magna is determined. Standarden beskriver en metod för bestämning av den akuta toxiciteten för Daphnia magna Straus av kemiska ämnen, avloppsvatten, ytvatten eller grundvatten. I testet bestäms den initiala koncentration som inom 24 h eller 48 h gör 50 % av de exponerade Daphnia magna orörliga.
UDC 13.060.00 Descriptors: water, quality, water pollution, tests, water tests, biological tests, determination, toxicity, daphnia English version Water quality - Determination of the inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Acute toxicity test (ISO 6341:1996) Qualité de I eau Détermination de I inhibition de la mobilité de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Essai de toxicité aigu (ISO 6341:1996) Wasserbeschaffenheit Bestimmung der Hemmung der Beweglichkeit von Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Akuter Toxizitäts-Test (ISO 6341:1996) This European Standard was approved by CEN on 1996-01-28. CEN members are bound to comply with the CEN/CENELEC Internal Regualtions which stipulate the conditions for giving this European Standard the status of a national standard without any alteration. Up-to-date lists and bibliographical references concerning such national standards may be obtained on application to the Central Secretariat or to any CEN member. The European Standards exist in three official versions (English, French, German). A version in any other language made by translation under the responsibility of a CEN member into its own language and notified to the Central Secretariat has the same status as the official versions. CEN members are the national standards bodies of Austria, Belgium, Denmark, Finland, France, Germany, Greece, Iceland, Ireland, Italy, Luxembourg, Netherlands, Norway, Portugal, Spain, Sweden, Switzerland and United Kingdom. CEN European Committee for Standardization Comité Européen de Normalisation Europäisches Komitee für Normung Central Secretariat: rue de Stassart 26, B-1050 BRUSSELS
ICS 13.060.00 Nyckelord: vatten, kvalitet, analyser, vattenundersökningar, biologiska tester, bestämning, toxicitet, daphnia Svensk version Vattenundersökningar - Bestämning av rörlighetshämning för Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Akut toxicitetstest (ISO 6341:1996) Qualité de I eau - Determination Water quality - Determination of Wasserbeschaffenheit de I inhibition de la mobilité de the inhibition of mobility of Daphnia Bestimmung der Hemmung der Daphnia magna Straus magna Straus (Cladocera, Beweglichkeit von Daphnia magna (Cladocera, Crustacea) - Essai de Crusfacea) Acute toxicity test Straus (Cladocera, Crustacea) toxicité aigu (ISO 6341:1996 (ISO 6341:1996) Akuter Toxizitäts-Test (ISO 6341:1996) Denna standard är den officiella svenska versionen av EN ISO 6341. För översättningen svarar SIS. Denna europastandard antogs av CEN 1996-01-28. CEN medlemmar är förpliktade att följa CEN/CENELEC interna bestämmelser som anger på vilka villkor denna europastandard i förändrat skick skall ges status av nationell standard. Aktuella förteckningar och bibliografiska referenser rörande sådana nationella standarder kan på begäran erhållas från CENs centralsekretariat eller från någon av CENs medlemmar. Denna Europastandard finns i tre officiella versioner (engelsk, fransk och tysk). En version på något annat språk, översatt under ansvar av en CEN-medlem till sitt eget språk, har samma status som de officiella versionerna. CENs medlemmar är de nationella standardiseringsorganen i Belgien, Danmark, Finland, Frankrike, Grekland, Island, Irland, Italien, Luxemburg, Nederländerna, Norge, Portugal, Schweiz, Spanien, Storbritannien, Sverige, Tyskland och Österrike. CEN European Committee for Standardization Comité Européen de Normalisation Europäisches Komitee für Normung Central Secretariat: rue de Stassart 26, B-1050 BRUSSELS
Page 2 Foreword The text of the International Standard ISO 6341:1996 has been prepared by Technical Committee lso/tc 147 Water quality in collaboration with the Technical Committee CEN/TC 230 Water analysis, the secretariat of which is held by DIN. This European Standard shall be given the status of a national standard, either by publication of an identical text or by endorsement, at the latest by October 1996, and conflicting national standards shall be withdrawn at the latest by October 1996. According to the CEN/CENELEC Internal Regulations, the national standards organizations of the following countries are bound to implement this European Standard: Austria, Belgium, Denmark, Finland, France, Germany, Greece, Iceland, Ireland, Italy, Luxembourg, Netherlands, Norway, Portugal, Spain, Sweden, Switzerland and the United Kingdom. Endorsement notice The text of the International Standard ISO 6341:1996 has been approved by CEN as a European Standard without any modification. NOTE: Normative references to International Standards are listed in Annex 2A (normative).
Sida 2 Provläsningsexemplar / Preview Förord Den internationella standarden ISO 6341:1996 har utarbetats av den tekniska kommittén ISO/TC 147 Water quality i samarbete med CEN/TC 230 Water analysis, vars secretariat hålls av DIN. Denna europeiska standard skall ges status av nationell standard, antingen genom att publicera en identisk text eller genom ikraftsättning senast oktober 1996, och motstridande nationella standarder skall dras in senast oktober 1996. Enligt CEN/CENELEC interna bestämmelser anmodas följande länder att anta denna europeiska standard: Belgien, Danmark, Finland, Frankrike, Grekland, Island, Irland, Italien, Luxemburg, Nederländerna, Norge, Portugal, Schweiz, Spanien, Storbritannien, Sverige, Tyskland och Österrike. Ikraftsättningsnotering Texten i den internationella standarden ISO 6341:1996 är godkänd av CEN som en europastandard utan någon ändring. ANMÄRKNING: Bindande referenser till internationella publikationer finns i bilaga ZA (bindande).
Page 3 Water quality Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Acute toxicity test 1 Scope This International Standard describes a method for the determination of the acute toxicity to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) of a) b) c) 2 chemical substances which are soluble under the conditions of the test, or can be maintained as a stable suspension or dispersion under the conditions of the test; industrial or sewage effluents, treated or untreated, after recantation, filtration or centrifugation if necessary; surface or ground waters. Normative references The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this International Standard. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the possibility of applying the most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain registers of currently valid International Standards. ISO 5667-2:1991, Water quality Sampling Part 2: Guidance on sampling techniques. ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. ISO 5813:1983, Water quality Determination of dissolved oxygen Iodometric method. ISO 5814:1990, Water quality Determination of dissolved oxygen Electrochemical probe method. 3 Principle Determination of the initial concentration (that is, the concentration present at the beginning of the test) which, in 24 h, immobilizes 50 % of exposed Daphnia magna, under the conditions defined in this International Standard. This concentration, known as the effective initial inhibitory concentration, is designated 24 h EC50 i. If possible and if necessary, the initial concentration which immobilizes 50 % of the exposed Daphnia magna in 48 h can also be determined. This concentration is designated 48 h EC50 i. An indication of the lowest concentration tested which immobilizes all the Daphnia magna and the highest concentration tested which does not immobilize any of the Daphnia magna is desirable and provides useful information in cases where the 24 h EC50 i and, where appropriate, the 48 h EC50 i cannot be determined. The test is carried out in one or two stages: a preliminary test which determines the range of concentrations to be tested in the final toxicity test and gives an approximate value of the 24 h EC50 i, and, where appropriate, the 48 h EC50 i ;
Sida 3 Vattenundersökningar - Bestämning av rörlighetshämning för Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Akut toxicitetstest 1 Omfattning Denna Internationell Standard beskriver en metod för att bestämma den akuta toxiciteten för Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) av a) kemiska substanser som är lösliga under de villkor som råder under testet eller kan hållas i stabil suspension eller dispersion under de förhållanden som råder vid testet; b) industriella eller kommunala avloppsvatten, behandlade eller obehandlade, efter dekantering, filtering eller centrifugering vid behov; c) yt- eller grundvatten. 2 Normativa referenser Nedan uppräknade standarder innehåller föreskrifter som när de åberopas i texten även gäller för denna internationella standard. När standarden publicerades, var de angivna utgåvorna giltiga. Alla standarder är föremål för revidering. Parter uppmanas att vid överenskommelser om denna internationella standard att om möjligt använda de senaste utgåvorna av de standarder som anges nedan. Medlemmar av IEC och ISO kan förteckningar över giltiga internationella standarder. ISO 5667-2:1991, Water quality Sampling Part 2: Guidance on sampling techniques. ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 2: Basic method for the determinaiton of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. ISO 5813:1983, Water quality Determination of dissolved oxygen Iodometric method. ISO 5814:1990, Water quality Determination of dissolved oxygen Electrochemical probe method. 3 Princip Bestämning av den initiala koncentrationen (d.v.s. den concentration som råder vid testets start) som, inom 24 h, gör 50 % av de exponerade Daphnia magna orörliga, under de förhållanden som definierats i denna Internationella Standard. Denna koncentration, benämnd effektiv initial hämningskoncentration, betecknas 24 h - EC50 i. Om det är möjligt och det anses nödvändigt, kan man också bestämma den initiala koncentrationen som gör 50 % av de exponerade Daphnia magna orörliga efter 48 h. Denna koncentration betecknas 48 h - EC50 i. En indication på den lägsta testade koncentration som gör samtliga Daphnia magna orörliga och den högsta testade koncentration som inte gör någon Daphnia magna orörlig, är önskvärd och ger användbar information i de fall då 24 h - EC50 i och när det är lämpligt, 48 h - EC50 i inte kan bestämmas. Testet genomförs i ett eller två steg: ett preliminärt test som avgör det koncenrationsintervall som skall testas i det slutliga toxicitetstestet och ger ett approximativt värde på 24 h - EC50 i och när det är lämpligt, 48 h - EC50 i ;
Page 4 Provläsningsexemplar / Preview a definitive test, conducted when the approximate value given by the preliminary test is not sufficient, which permits calculation of the 24 h EC50 i and 48 h EC50 i and determines concentrations corresponding to 0 % and 100 % immobilization. If the method described in this International Standard is used for chemical substances, a limit test can be performed at 100 mg/i or at a lower concentration, at which the substance is soluble or is in stable dispersion under the conditions of the test (see 8.5). Analysis of these substances should be conducted as soon as possible. If these analyses show that, for each concentration tested, the standard deviation of the concentrations measured during the test, randomly varying, is not greater than 20 % of the mean, the median inhibitory concentrations may be calculated from the means of the measurements rather than from the initial concentrations; they are then designated 24 h EC50 and, where appropriate, 48 h EC50. 4 Test environment The storage of the solutions and the exposure of organisms as described in this International Standard shall be carried out either in the dark or under a 16 h/8 h light/dark photoperiod. The testing atmosphere shall be at 20 C ± 2 C and free from vapours or dusts toxic to Daphnia magna. Photo-degradable chemicals shall be tested in the dark. 5 Reagents and materials 5.1 Test organism: Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacean), at least third generation, obtained by acyclical parthenogenesis under specified breeding conditions. The animals used for the test shall be less than 24 h old. Transfer gravid females to vessels with fresh dilution water and collect newly released neonates within 24 h. Since the sensitivity of Daphnia magna to toxicants is age-dependent and source-dependent, the age and source of the Daphnia magna culture shall be indicated in the test report. 5.2 Dilution water Dissolve known quantities of reagents of recognized analytical grade in ground water, distilled water or deionized water of at least equivalent purity, having a maximum conductance of 10 µs/cm. The dilution water thus prepared shall have a ph of 7,8 ± 0,2, a hardness of 250 mg/i ± 25 mg/i (expressed as CaCO 3 ), a molar Ca/Mg ratio close to 4:1 and a dissolved oxygen concentration above 7 mg/i. Natural waters with ph and hardness characteristics similar to dilution water may be used for culturing. As an example, the preparation of water meeting these requirements is described below: a) Prepare the following solutions: 1) Calcium chloride solution Dissolve 11,76 g of calcium chloride dihydrate (CaC1 2 2H 2 O) in distilled or deionized water and dilute to 1 Iitre. 2) Magnesium sulfate solution Dissolve 4,93 g of magnesium sulfate heptahydrate deionized water and dilute to 1 Iitre. 3) Sodium bicarbonate solution Dissolve 2,59 g of sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) in distilled or deionized water and dilute to 1 Iitre. 4) Potassium chloride solution Dissolve 0,23 g of potassium chloride (KCI) in distilled or deionized water and dilute to 1 Iitre. b) Mix 25 ml of each of the four solutions 1) to 4) and complete the total volume to 1 Iitre with distilled or deionized water. The dilution water shall be aerated until the dissolved oxygen concentration has reached saturation and the ph has stabilized. If necessary, adjust the ph to 7,8 ± 0,2 by adding sodium hydroxide (NaOH) solution or hydrochloric acid (HCI) solution. The dilution water prepared in this way shall not be further aerated before use. NOTE 1 If the test is performed for purposes necessitating the use of a dilution water with characteristics differing from those described above, mention should be made in the test report of the main characteristics of the synthetic dilution water used. 5.3 Potassium bichromate analytical grade
Sida 4 Provläsningsexemplar / Preview ett slutligt test, utförs när det approximativa värdet som erhållits i det preliminära testet inte är tillräckligt för att tillåta beräkning av 24 h - EC50 i, och 48 h - EC50 i, och bestämma koncentrationer motsvarande 0 % och 100 % rörlighet. Om metoden som beskrivs i denna Internationella Standard används för kemiska substanser, kan ett begränsningstest utföras vid 100 mg/l eller vid en lägre koncentration, där ämnet är lösligt eller är i stabil dispersion under testförhållandena (se 8.5). Analys av dessa substanser skall utföras så snart som möjligt. Om dessa analyser visar att, för varje testad koncentration är standardavvikelsen för de uppmätta koncentrationerna under testet, slumpmässigt varierande och inte större än 20 % av medelvärdet, så kan de mediana hämningskoncentrationerna beräknas från mätningarnas medelvärden hellre än från de initiala koncentrationerna; de betecknas då 24 h - EC50 och i förekommande fall, 48 h - EC50. 4 Provmiljö Förvaring av lösningarna och exponeringen av organismerna som beskrivs i denna Internationella Standard skall utföras antingen i mörker eller vid en 16h/8h ljus/mörker fotoperiod. Omgivningstemperaturen skall vara 20 C ± 2 C och luften fri från ångor och damm som är giftiga för Daphnia magna. Fotonedbrytbara kemikalier skall testas i mörker. 5 Reagens och material 5.1 Test organism: Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacean), av åtminstone tredje generationen erhållen genom acyklisk partogenes under specificerade odlingsförhållanden. De djur som används vid testet skall vara mindre än 24 h gamla. Överför gravida honor till kärl med färskt spädningsvatten och samla upp nyss födda ungar inom 24 h. Eftersom Daphnia magnas känslighet för gifter är åldersberoende och ursprungsberoende, skall ålder och ursprung för Daphnia magna kulturen anges i rapporten Naturliga vatten med ph och hårdhetsvärden liknande det för spädningsvattnet får användas vid odling. Beredning av vatten som meter dessa krav beskrivs nedan som exempel. a) Bered följande lösningar: 1) Kalciumkloridlösning Lös 11,76 g av kalciumkloriddihydrat ten och späd till 1 liter. 2) Magnesiumsulfatlösning Lös 4,93 g av magnesiumsulfat-heptahydrat vatten och späd till 1 liter. 3) Natriumbikarbonatlösning Lös 2,59 g av natriumbikarbonat (NaHCO 3 ) i destillerat eller avjoniserat vatten och späd till 1 liter. 4) Kaliumkloridlösning Lös 0,23 g av kaliumklorid (KCl) i destillerat eller avjoniserat vatten och späd till 1 liter. b) Blanda 25 ml av värdera fyra lösningarna 1) till 4) och fyll upp volymen till 1 liter med destillerat eller avjoniserat vatten. Spädningsvattnet skall luftas tills den lösta syrekoncentrationen har nått mättnad och ph har stabiliserats. Vid behov, justera ph till 7,8 ± 0,2 genom att tillsätta natriumhydroxid (NaOH) lösning eller saltyra (HCl) lösning. Det på detta sätt beredda spädningsvattnet skall inte luftas mera före användning. ANMÄRKNING 1 om testet utförs med syften som kräver användning av spädningsvatten med karakteristika som avviker från de som beskrivits ovan, skall detta nämnas i testrapporten för huvudkarakteristika hos det använda syntetiska spädningsvattnet. 5.3 Kaliumdikromat tisk kvalitet. 5.2 Spädningsvatten Lös kända mängder av reagens av erkänd analytisk kvalitet i grundvatten, destillerat vatten eller avjoniserat vatten av åtminstone likvärdig renhet, med en maximal konduktivitet av 10 µs/cm. Det sålunda beredda spädningsvattnet, skall ha ett ph på 7,8 ± 0,2, en hårdhet på 250 mg/l ± 25 mg/l (uttryckt som CaCO 3 ), ett molförhållande Ca/Mg nära 4:1 och en löst syrekoncentration över 7 mg/l.
Page 5 6 Apparatus Ordinary laboratory apparatus, and in particular the following, 6.1 Dissolved-oxygen measuring apparatus, 6.2 Test containers, of chemically inert material and of sufficient capacity (for example glass test tubes or beakers). Before use, the test containers shall be carefully washed then rinsed, first with distilled water and then with the dilution water (5.2). At the end of the test, the containers shall be emptied, rinsed with water to eliminate any trace of the test solution and then dried. 7 Treatment and preparation of samples 7.1 Special precautions for sampling and transportation of samples of water or effluent For the sampling of water or effluent, refer to the general procedure specified in ISO 5667-2. Bottles shall be completely filled to exclude air. The toxicity test shall be carried out as soon as possible, within 6 h of collection. If this time interval cannot be observed, cool the sample (+ 4 C) at the place of collection. In this case, the sample shall be ana- Iysed within 48 h after collection. NOTE 2 If testing cannot be carried out within 48 h, the sample may be frozen for testing within 2 months of collection, 7.2 Preparation of solutions of substances to be tested 7.2.1 Preparation of stock solutions The stock solutions of the substances to be tested shall be prepared by dissolving a known quantity of the substance to be tested in a specified volume of dilution water (5.2), deionized water or distilled water in a glass container. They shall be prepared at the moment of use unless the substance in solution is known to be stable, in which case the stock solution may be prepared up to 2 days in advance of testing. Stock solutions of substances which are poorly soluble in water may be solubilized or dispersed directly in the medium by suitable means using ultrasonic devices or solvents of low toxicity to Daphnia magna. Solvents should be used only when the EC50 is greater than the volubility of the test substance, If a solvent is used, the concentration of the solvent in the final test solution shall not exceed 0,1 ml/i, and two control solutions, one with no solvent, the other with the maximum concentration of solvent, shall be included in the test. No single procedure for the preparation of stock solutions of poorly soluble substances can be recommended due to the differing nature of chemicals. 7.2.2 Preparation of test solutions The test solutions shall be prepared (see 8.1) by adding the stock solutions or effluent samples (7.2.1) to the dilution water (5.2) in specified quantities. If the stock solutions are prepared in deionized or distilled water, it is recommended not to add more than 10 ml of stock solution per Iitre of dilution water. 8 Procedure 8.1 General Place increasing volumes of the test solution (7.2.2), or effluent or water sample (7.1), in a series of test containers (6.2) and add the dilution water (5.2) so as to obtain the desired concentrations for the test. Place the Daphnia magna in the test containers so that the total number of Daphnia magna per container does not exceed 20, and the density of Daphnia magna per container does not exceed 5 Daphnia magna per 10 ml of solution. For each series of tests, prepare a control having a volume of dilution water (5.2) equal to the volume of the test solutions and introduce the same number of Daphnia magna as in the test solutions. If a solvent is used to solubilize or disperse substances, prepare a second control with the dilution water containing the solvent at the maximum concentration used (i.e. not greater than 0,1 ml/i). Animals must not be fed during the test and vessels must be maintained at a temperature of 20 C ± 2 C. At the end of the test period of 24 h (and where appropriate 48 h), count the mobile Daphnia magna in each container. Those which are not able to swim after gentle agitation of the liquid for 15 s shall be considered to be immobilized, even if they can still move their antennae. Determine the concentration range giving 0 % to 100 % immobilization and note anomalies in the behaviour of the Daphnia magna.
Sida 5 6 Apparatur Vanlig laboratorieutrustning, och speciellt följande. 6.1 Apparatur för mätning av löst syre. 6.2 Test kärl, av kemiskt inert material och med tillräcklig volym (till exempel provrör eller bägare av glas). 7 Behandling och preparering av prover 7.1 Särskilda föreskrifter för provtagning och transport av vatten- och utsläppsprover För provtagning av vatten och utsläpp, hänvisas till de allmänna tillvägagångssätt som specificeras i ISO 5667-2. Flaskor skall fyllas helt för att utestänga luft. Toxicitetstestet skall utföras så snart som möjligt, helst inom 6 h efter provtagning. Om detta tidsintervall inte kan klaras, kyls provet (+ 4 C) vid provtagningsplatsen. I så fall skall provet analyseras inom 48 h efter provtagning ANMÄRKNING 2 Om testning inte kan utföras inom 48 h, får provet frysas för att testas inom två månader efter provtagning. 7.2 Beredning av Iösningar av ämnen som ska testas 7.2.1 Beredning av stamlösningar Stamlösningar av ämnen som ska testas skall beredas genom lösning av en känd mängd av ämnet som skall testas i en specificerad volym av spädningsvatten (5.2), avjoniserat vatten eller destillerat vatten i ett glaskärl. De skall beredas vid användningstillfället såvida inte ämnet i lösning är känt för att vara stabilt, i så fall kan stamlösningen beredas upp till 2 dagar i förväg innan testning. Stamlösningar av ämnen som är svårlösliga i vatten kan upplösas eller dispergeras direkt i mediet genom användning av lämpliga medel som ultraljudutrustning eller lösningsmedel med låg toxicitet för Daphnia magna. Lösningsmedel skall endast användas när EC50 är större än testsubstansens löslighet. Om ett lösningsmedel används får inte koncentrationen av lösningsmedlet överstiga 0,1 ml/l i den slutliga testlösningen, och två kontrollösningar inkluderas i testet, en utan lösningsmedel och den andra med den högst använda koncentration av lösningsmedel. Inget enstaka tillvägagångssätt för beredning av stamlösningar av svårlösliga ämnen kan rekommenderas beroende på kemikaliernas olika egenskaper. 7.2.2 Beredning av testlösningar Testlösningarna skall beredas (se 8.1) genom tillsats av stamlösningar eller utsläppsprover (7.2.1) i spädningsvatten (5.2) i specificerade mängder. Om stamlösningarna är beredda i avjoniserat eller destillerat vatten, rekommenderas att man inte tillsätter mer än 10 ml stamlösning per liter spädningsvatten. 8 Tillvägagångssätt 8.1 Allmänt Placera ökande volymer av testlösningen (7.2.2), eller utsläpps- eller vattenprov (7.1), i en serie av testkärl (6.2) och tillsätt spädningsvatten (5.2) så att önskade koncentrationer för testet erhålls. Placera Daphnia magna i testkärlen så att det totala antalet Daphnia magna per kärl inte överstiger 20, och tätheten av Daphnia magna per kärl inte överstiger 5 Daphnia magna per 10 ml lösning. För varje testserie bereds en kontroll som har samma volym av spädningsvatten (5.2) som volymen av testlösningar och tillsätt samma antal Daphnia magna som i testlösningarna. Om ett lösningsmedel används för att upplösa eller dispergera provämnet, bereds en andra kontroll med spädningsvattnet innehållande lösningsmedlet vid den högsta använda koncentrationen (d.v.s. inte högre än 0,1 ml/l) Djuren får inte matas under testet och kärlen måste hållas vid en temperature av 20 C ± 2 C. Vid slutet av testperioden på 24 h (och om det är lämpligt 48 h), räknas de rörliga Daphnia magna i varje kärl. De som inte kan simma efter en lätt skakning av vätskan under 15 s skall anses vara orörliga, även om de fortfarande kan röra sina antenner. Bestäm koncentrationsintervallet mellan 0 % till 100 % orörlighet och notera avvikelser i beteende hos Daphnia magna.