Biokemisk analys och separationsteknik

Biokemisk analys och separationsteknik Rening, inmärkning, analys samt användning av en affinitetsligand Institutionen för Bioteknologi Kungliga Tekniska Högskolan Tove Alm Per-Åke Löfdahl Nina Kronqvist Sebastian Grimm Margareta Ramström Caroline Grönwall Cecilia Eriksson Pawel Zajac Mikaela Friedmann Sophia Hober Med ett stort tack till tidigare assar: Malin Andersen, My Hedhammar, Ronny Falk, Mats Lindskog, Anders Andersson,Björn Rehnberg, John Löfblom, Torun Engfeldt, Erik Vernet seppen@biotech.kth.se 1

Introduktion Under de senaste åren har mycket arbete lagts ned på att utveckla storskaliga analysmetoder av nukleinsyror. Med dessa metoder kan man snabbt analysera transkriptions-mönstret i olika celler och jämföra dessa med varandra. Målet med analysmetoderna är att ta reda på vilka gener som är avslagna respektive påslagna i en viss cell under definierade omständigheter. Detta kan ge svar på vilka gener som slås på när en normal cell transformeras till en cancercell eller vad som händer när man behandlar cancercellen med cytostatika. Det är dock känt att mrna nivåerna i en cell inte alltid korrelerar till mängden av det protein som RNAt kodar för. Därför är det av stort intresse att kunna analysera proteininnehållet i en cell på motsvarande sätt. Att utveckla liknande analyssystem för proteiner är dock förknippat med flera tekniska problem. Eftersom det inte finns någon metod för amplifiering av proteiner, som det finns för nukleinsyror, måste detektionssystemen vara mycket känsliga. Dessutom är proteiner normalt mycket känsliga och tål inte lika extrema förhållanden som nukleinsyror. Ett sätt att skapa en detektionsmetod för proteiner är att märka in affinitetsligander med en fluorescerande grupp. Fluoroforen gör att liganden blir synlig och man kan på så vis studera dess inbinding till sitt målprotein. En fluorescerande grupp kan exciteras av fotoner av en karakteristisk våglängd. Då fluoroforen faller tillbaka till sitt grundtillstånd emitteras fotoner av lägre energi, dvs längre våglängd. Det finns många olika fluorescerande grupper, alla med olika spektra, dvs exitations- och emissionsvåglängd. Figur 1 (1) Excitation av en fluorofor genom absorption av ljus. En elektron exciteras till singlettillstånd, S 1 '.(2) Energin från S 1 ' avges delvis och ger ett tillstånd som kallas relaxerad singlet (S 1 ). (3)Elektron går från S 1 till S 0 och emitterar ljus. Denna laboration syftar till att ge er en inblick i hur man går till väga för att producera, rena och inmärka ett protein. Vidare analyseras hur effektiv inmärkningen varit samt hur den biologiska aktiviteten påverkas av de kovalent bundna fluorescerande grupperna. Slutligen kommer ni att använda ert inmärkta protein för att bestämma koncentrationen av IgG i en lösning. 2

Det protein ni kommer att arbeta med kallas för Z. Det härstammar från en bakteriell receptor som heter protein A och sitter på ytan av Stafylokocker. Denna receptor har fem subenheter som alla har affinitet till IgG. En av dessa, B-domänen, har använts som bas för att skapa Z. Skillnaden mellan B och Z är att en glycin i B-domänen har bytts ut mot en alanin. Z är ett relativt litet och mycket stabilt protein som består av 58 aminosyror. Staphylococcal protein A Ss E D A B C X M Signalsekvens Immunoglobulinbindande domäner Förankring i cellväggen Z Figur 2 Schematisk bild av protein A. Domänen består av tre α-helixar och binder IgG med hög affinitet (K d ~ 20 nm). I det proteinkonstrukt ni kommer att arbeta med har Z fuserats med en His 6 -tag för att proteinreningen ska kunna genomföras under denaturerande förhållanden. Detta görs med hjälp av en IMAC-kolonn (IMAC står, som ni säkert minns, för Immobilized Metal Affinity Chromatography). Detta konstrukt finns i två olika versioner, en med en extra cystein som kan utnyttjas för inmärkning samt en variant (vi kommer att kalla den vildtypsvariant) som saknar cystein där de primära aminogrupperna kommer att användas för inmärkningen. His 6 Z -SH His 6 Z Figur 3 Schematisk bild av de två Z-konstruktionerna. Tiolgruppen som kommer att användas för inmärkning symboliseras av SH. Var kommer fluoroforerna att sitta efter inmärkning av vildtyps-varianten? Hälften av grupperna kommer att arbeta med Cys-inmärkning och andra hälften kommer att märka vildtypsproteinet på aminerna. En skillnad med att utnyttja de primära aminerna är att den fluorescerande gruppen kan binda på flera olika ställen i proteinet, inbindningen blir mer ospecifik. Det kan vara en fördel eftersom den fluorescerande signalen blir starkare, samtidigt riskerar man att den mindre riktade inmärkningen stör vid ytan som binder till målproteinet. Ni kommer efter inmärkningen att analysera er produkt med hjälp av masspektrometri och biosensoranalys för att ta reda på effektiviteten av inmärkning och dess påverkan på affiniteten. Det fluorescerande proteinet kommer sedan att användas för att bestämma IgGkoncentrationen i en lösning. Detta görs genom att fästa IgG på en kolonn i en CD-skiva med kapillärer. När ert inmärkta prov sedan appliceras kommer mängden fluoroforer att avspegla antalet IgG som fastnat på kolonnen. Koncentrationen bestäms genom att jämföra ert fluorescensvärde med en standardkurva som skapas vid samma tillfälle med hjälp av ett antal kända IgG-koncentrationer. 3

Figur 4 Den tredimensionella strukturen av Z-domänen. De aminosyror som deltar i bindningen till IgG är ritade som bollar (space fill). 4

Laborationen i grova drag: För att minska omfånget på laborationen är målproteinet producerat i förväg. Ni kommer att få en pellet av E. coli celler. Cellerna skall lyseras och proteinet framrenas. Det finns två olika varianter av proteinet, varje grupp kommer endast att jobba med en av varianterna, men resultat skall redovisas för båda. Så häng med på all teori, för de skiljer sig lite åt! Reningen sker med hjälp av en His 6 -tag. SDS-PAGE används för att kontrollera att proteinet är rent och koncentrationen bestäms med UV absorbans. Det renade proteinet skall sedan märkas in med en fluorescerande grupp. Inmärkningen genererar varianter med olika många fluoroforer, dessa separeras med hjälp av HPLC. Masspektrometri används för att bestämma proteinvarianternas massa och på så vis undersöka hur många fluorescerande grupper de respektive varianterna har. De olika fraktionerna från HPLC-reningen skall samlas och frystorkas för vidare analys och användning. Affiniteten för de olika Z varianterna skall ni studera och jämföra på en BIAcore. Slutligen kommer ni att använda ert märkta protein för att koncentrationsbestämma IgG i en, för er, okänd lösning. För att kunna bedöma hur laborationen gått och vilka steg som är kritiska kommer ni att beräkna utbytet över de olika momenten. 5

Dagsplanering Dag 1: Redovisning planering Teorigenomgång Kontrollskrivning Flödesschema Tabell för beräkning av utbyten Buffertar blandas för de kommande momenten. Dag 2: Sönderdelning av de E. coli-celler som producerat proteinet Z. Rening av proteinet med hjälp av IMAC. Detta sker med små sprutkolonner och självdropp, pumpfritt system. Buffertbyte på proteinet med hjälp av en liten gelfiltreringskolonn. Analys av mängden utvunnet protein med hjälp av UV-absorbansmätning. Dag 3: Inmärkning av proteinet med fluorescerande grupp samt buffertbyte. Analys av cellysat och det renade materialet med hjälp av SDS-PAGE. Beräkna teoretiska molekylvikter för oinmärkt och inmärkt protein mha bilagorna. Dag 4 och 5: HPLC-rening av det inmärkta proteinet för att separera olika varianter. Masspektrometrianalys för att ta reda på hur många fluorescerande grupper det sitter på de olika varianterna. Dag 6: Koncentrationsbestämning med hjälp av en Nanodrop-spektrofotometer. Affinitetsstudie av de olika Z-varianterna med hjälp av Surface Plasmon Resonance (SPR, Biacore). Slutmålet med era fluorescensinmärkta proteiner: Bestämning av IgG-koncentration i ett okänt prov med hjälp av ett Gyrosinstrument. Dag 7: Genomgång och diskussion av labbrapporterna. Inför detta tillfälle ska ni vara så gott som färdiga med rapporten. Labstädning. 6

Riktlinjer för rapportskrivning Varje delmoment i denna kurs ska redovisas i en sammanhängande rapport. Därför är det viktigt att rapporten skrivs välstrukturerat, alla moment ska gå att följa. Observera att rapporten ska kunna följas av någon som inte har gjort laborationen och inte har tillgång till labbkompendiet. Laborationerna behandlar de flesta tekniker som ingår i kursen. Genom att förstå teorin bakom laborationerna, och presentera en bra rapport, är mycket vunnet inför den kommande tentaläsningen! För att underlätta kommunikationen har vi skapat en hemsida (www.biotech.kth.se/courses/gru/courselist/3a1112) där bilder från föreläsningar och genomgångar och schema för labb och föreläsningar finns att hämta. På hemsidan kommer även era primärdata från laborationerna samt ytterligare information och svar på vanliga frågor att finnas. Ställa frågor angående laborationen och lämna in den färdiga labbrapporten gör ni bäst genom att maila till: seppen@biotech.kth.se. Labbrapporten vill vi ha i PDFformat. Ni kommer att få tillbaka rapporten med kommentarer via era e-mail adresser (i PDFformat). Endast rapporter i elektroniskt format beaktas. Efter er första inlämning kommer ni att få läsa och kommentera varandras rapporter. Kommentarerna skickas in till seppen@biotech.kth.se enligt labschemat. Efter att ni har tagit hänsyn till de erhållna kommentarerna skickar ni in rapporten igen. Därefter har assarna 2 veckor på sig att rätta era rapporter. Vid retur har ni en vecka på er att lämna in en ny version. Detta gäller efter samtliga returer. Var noga att följa de anvisningar ni fått vid retur, för att rättningsprocessen ska bli så kort som möjligt för alla inblandade. Läs igenom hela rapporten innan den lämnas in, och se till att de olika avsnitten utgör en bra helhet. Nedan följer de avsnitt som rapporten skall innehålla. Introduktion Här beskrivs tillvägagångssättet och målet med laborationen, i korta ordalag. Båda inmärkningsmetoderna ska behandlas i introduktion och diskussion. Material och metoder Här beskrivs det praktiska i laborationen. Utförande, kemikalier, material och apparater ska redovisas. Med hjälp av material och metoder ska momenten kunna upprepas utan att den ursprungliga labbmanualen behövs. Viktiga parametrar för att kunna genomföra t.ex. ett proteinreningsmoment är flöde, buffertsammansättning, ph, fraktionsvolymer. Detta ska inte vara en direkt kopia av labbpeket. Använd egna ord! Här skall inte teori bakom försöken, resultat eller diskussion tas upp. Resultat Här sammanfattas resultaten och primärdata redovisas. Underlag för resultat (diagram, eventuella gelbilder m.m.) skall redovisas i form av numrerade bilagor. Referenser till dessa bilagor skall finnas i resultatavsnittet. Alla beräkningar skall redovisas tydligt, vara lätta att följa, innehålla enheter samt förklaringar till varifrån primärdata och konstanter är tagna. Alla mängder ska anges i gram. Beräkningarna kan gärna redovisas i form av en bilaga. Tänk också på att använda lämpligt antal värdesiffror i resultatdelen. 7

Följande resultat skall redovisas i rapporten: Flödesschema Tabell med utbyten Kromatogram efter IMAC rening: y-axeln Abs, x-axeln ml. Mängden renat protein efter IMAC, anges i gram. Här antar vi att utbytet över IMACkolonnen är 100%. Relatera även den utvunna mängden till odlingsvolymen (g/liter odling). SDS-PAGE som visar utgångsmaterial och renhet. Mängden utvunnet protein efter buffertbyte samt beräkning av utbytet över SECsteget. Detta ska sedan relateras till odlingsvolymen (g/liter odling). Hur mycket protein hade ni fått om ni gått vidare med hela mängden? Tolkning av SDS-PAGE gelen. Kromatogram från HPLC reningen. Redovisa den uppskattade mängden utvunnet material från de olika topparna. Specificera topparna. Det ska vara möjligt och enkelt att se vilken topp i vilken bilaga ni diskuterar i rapporten. Mängden utvunnet protein efter inmärkning, SEC och HPLC, beräknat med hjälp av koncentrationsbestämningen från Nanodrop-mätningarna och HPLC-diagrammet. Här beräknas utbytet sammantaget över de tre stegen. Detta för att ni inte har någon information om delstegen. Även här ska ni relatera siffrorna till odlingsvolymen (g/liter odling). Hur mycket inmärkt protein hade ni fått om ni gått vidare med hela mängden? Tolka MS-spektrana genom att jämföra massan för topparna (m/z) med den teoretiska massan för proteinerna och den kopplade fluoroforen. Det ska vara möjligt och enkelt att se vilken topp i vilken bilaga ni diskuterar i rapporten. Redovisning och tolkning av Biacore-data. Beskriv kurvorna och vad man kan utläsa ur dem. Plotta jämviktrespons mot koncentration så att det nya diagrammet visar skillnaderna mellan de inmärkta och oinmärkta Z-varianterna. Glöm inte att hänvisa till bilaga med primärdata! Redovisa standardkurva samt erhållet koncentrationsvärde för den okända IgGlösningen. Beskriv analysmetoden och Z s roll i upplägget. Som sista uppgift i resultatdelen ska ni redovisa hur stor odling ni skulle behöva om ni med detta protokoll ska rena fram 10 mg enkelinmärkt protein. Diskussion Här ska alla resultat kommenteras och slutsatser dras. Exempel på punkter som hör hemma i diskussionen är: Vilket var utbytet i de olika stegen? I vilket steg förlorades mest material? Varför? Blev resultatet det ni förväntade er? Gick något fel? Varför? Kan några slutsatser dras om hur inmärkningen påverkat ert protein? Fördelar respektive nackdelar med de olika inmärknigsmetoderna. Varför har de olika metoderna använts? Fördelar/brister med de olika metoderna. Kompletterar de varandra? Jämför speciellt de olika koncentrationsbestämningsmetoderna som använts. Har ni fått rimliga värden? Utvärdering av laborationen. Här ges synpunkter på hela labbkursen. Ge gärna förslag inför kommande kursomgångar. 8

Tänk på att snabb och precis presentation av inhämtad kunskap är A och O för fläskiga patent i akademin och en snabb klättring till industritoppar. Alltså, gör er labbrapport snabbt och bra och ni kommer att bli rikligt belönade i er senare karriär. Lycka till! Sveriges framtid hänger på er. 9

Dag 1) Teorigenomgång, förhör och buffertblandning Första tillfället inleds med ett litet kontrollförhör på labbkompendiet samt säkerhetsföreskrifterna. Ni ska sedan gruppvis göra ett flödesschema över hela laborationen samt en tabell för beräkning av utbyten över de olika stegen. Dessutom ska proteinreningsuppgiften redovisas. KOM VÄL FÖRBEREDD!!! TA MED LABBROCK!!! Preparation av buffertar PBS, ph 7,2-7,4 (Fosfatbuffrad salin; 10 mm fosfat, 154 mm NaCl) 1) Blanda 100 ml 1 x PBS från en 10 x PBS-lösning, ph 7,2-7,4 5 mm NH 4 Ac, ph 5,5 1) Blanda 100 ml 5 mm NH 4 Ac från en 5 M NH 4 Ac-lösning (fyll ej upp 100 ml från början). 2) Ev. kalibrera ph-metern. 3) Ställ ph till 5,5 Efter denna dag ska ni ha: Gjort ett flödesschema för hela laborationen där alla moment samt provtagningar finns utmärkta. Märk även ut vid vilka steg ni ska göra utbytesberäkningar. Detta flödesschema kommer att underlätta för er att följa alla moment under labbens gång, och den ska bifogas i labbrapporten. Gjort en tabell för beräkning av utbyte över de olika stegen samt sammanlagt över hela laborationen. Denna ska bifogas i labbrapporten. Dag 2) IMAC-rening av odlat protein, buffertbyte samt koncentrationsbestämning His 6 -Z respektive His 6 -Cys-Z har odlats i 50 ml TSB (Tryptic Soy Broth) innehållande jästextrakt och kanamycin på skak i 37 C. Odlingen inducerades med IPTG vid OD 600 1 och flyttades till 25 C. Efter 18 timmar på skak i 25 C togs ett 25 µl cellprov ut för senare analys och därefter centrifugerades cellerna ner. Pelleten löstes sedan upp i ca 10 ml lysisbuffert (6 M Guanidium hydroklorid, ph 8,0) och suspensionen frystes in. På laborationsdagen tinades cellsuspensionen och till de celler som producerat His 6 -Cys-Z tillsattes β-merkaptoetanol till en slutkoncentration av 10 mm. Båda cellvarianterna inkuberades därefter i 2 timmar under omrörning i 37 C. IMAC-rening Här skall du rena Z och bli av med de övriga proteinerna från E. coli cellerna. Histidiner kan binda till tvåvärda joner, så med hjälp av His 6 taggen kan du binda upp Z på en IMAC kolonn som exempelvis innehåller cobolt-joner (Co 2+ ). I en His 6 tagg sitter sex histidiner i rad vilket 10

gör att proteinet binder ganska hårt till matrisen. Man kan alltså tvätta ordentligt utan att proteinet lossnar. Detta gör reningsmetoden selektiv. Tryck aldrig på med tummen för att öka flödet i kolonnen det medför bara att matrisen packas hårdare och flödet minskar! 1) Sönderdela DNAt med hjälp av att föra provet upp och ner genom en kanyl för att sänka viskositeten. 2) Späd proteinlösningen till 20 ml med lysisbuffert (6M Gua-HCl, ph 8.0). 3) För över provet till ett SS-34-rör. Märk röret genom att skriva på en tejpbit - gör en liten flik på tejpen så att den går lätt att ta bort! 4) Centrifugera i SS-34 alt. JA 17-rotorn: 11000xg, 10 min, 4 C. 5) För över supernatanten (innehållande proteinerna) till ett 50 ml-rör. Avdöda celler i pelleten genom att tillsätta Desidos. 6) Filtrera proteinlösningen med 1,2 µm sprutfilter. 7) Filtrera proteinlösningen med 0,45 µm sprutfilter. 8) Öppna IMAC-kolonnen (Talon-Co 2+ matris) och häll av vätskan. 9) Pulsa kolonnen enligt nedanstående (Låt varje buffert rinna igenom innan du sätter till nästa. Tryck ej på med tummen!) 10 ml lysisbuffert 10 ml elueringsbuffert (8 M Urea, ph 5,0) 10 ml lysisbuffert 10 ml elueringsbuffert 10) Jämvikta kolonnen med 25 ml lysisbuffert, använd gärna hävert. 11) Ladda provet på kolonnen. 12) Tvätta med 25 ml lysisbuffert. 13) Eluera proteinet med 7 x 1 ml elueringsbuffert. 14) Pulsa kolonnen enligt punkt 8. 15) Tvätta kolonnen med 10 ml avjonat vatten. 16) Tvätta kolonnen med 5 ml 20 % EtOH och för på ytterligare 1 ml precis innan kolonnen försluts. Kolonnen förvaras i EtOH i kylskåp. 17) Tvätta slangarna med vatten (även på utsidan naturligtvis) Koncentrationsbestämning Bland det klurigaste som finns i biokemins underbara värld är koncentrations-bestämning. Så enkelt i teorin, men desto värre i praktiken. Här använder vi UV-absorbans för att uppskatta mängden protein. Detta steg är viktigt för att efterföljande analyser ska bli korrekta, så var nogranna med pipetteringen och välj rätt blank! Extinktionskoefficienten för ert protein kan ni hitta i en bilaga till denna manual. Den information som finns där är framtagen med hjälp av en mycket användbar hemsida. http://www.expasy.org/tools/protparam.html. Gå gärna in på denna hemsida och titta! Koncentrationsbestämning eluerat protein 1) Mät Abs 280nm på de eluerade proteinfraktionerna. Mät den mest koncentrerade fraktionen extra noggrant, gör eventuellt en spädning av en delmängd av provet så att absorbansen hamnar inom spektrofotometerns noggrannhetsområde 0,1<Abs<1. 2) Ta ut 8µl av den mest koncentrerade fraktionen till ett nytt rör och spara för gelanalys nästa dag. 11

Buffertbyte med gelfiltrering (SEC) Det är inte optimalt att förvara proteinet i elueringsbufferten (varför?). Här skall du därför använda SEC, Size Exclusion Chromatography, för att byta buffert till PBS. Denna metod används för att separera molekyler med avseende på storlek. De stora molekylerna tar den snabbaste och bredaste vägen ut. De små molekylerna tar sig in i porerna på partiklarna. Vägen blir både längre och krångligare varför dessa kommer ut ur kolonnen sist. 1) Jämvikta kolonnen (NAP-10) med 15 ml 1xPBS, ph 7,2-7,4, låt all vätska rinna igenom. 2) Tillsätt 1 ml proteinprov från den mest koncentrerade fraktionen till kolonnen, låt kolonnen återigen rinna klart. I det fall provvolymen är mindre än 1ml: tillsätt prov, låt kolonnen rinna klart, tillsätt den mängd 1xPBS som krävs för att V=1 ml och låt kolonnen rinna klart. 3) Eluera provet med 1,5 ml 1xPBS till eppendorfrör. Märk röret! 4) Ta ut 8 µl till ett nytt rör och spara för gelanalys nästa dag. 5) Jämvikta kolonnen med 5 ml 1xPBS, ph 7,2-7,4. Fyll på med 1xPBS och stäng kolonnen, den skall återanvändas dag 3. Märk din kolonn med gruppnamn så att varje grupp får sin kolonn dag 3. 6) Tvätta slangarna med vatten och 20% EtOH. Koncentrationsbestämning buffertbytt protein Mät absorbansen vid 280 nm på det buffertbytta provet. Gör eventuellt en spädning av en delmängd av provet så att absorbansen hamnar inom spektrofotometerns noggranhetsområde (0,1<Abs<1,0). Kylförvaring av alla prov! Märk rören ordentligt! Efter denna dag ska ni ha: Ritat ett kromatogram för IMAC-reningen med hjälp av er uppmätta absorbans. Räknat ut mängden framrenat protein efter IMAC rening (som här antas vara lika med mängden producerat protein). Glöm inte att alla fraktioner ska vara med i denna beräkning! Räknat ut mängden framrenat protein efter gelfiltrering. Räknat ut hur stor volym ni behöver använda till inmärkningen följande dag. Räknat ut utbytet över gelfiltreringskolonnen. Glöm inte att ni gick vidare med en delmängd av provet! Tagit ut prover för SDS-PAGE analys: efter IMAC (från fraktionen med högst koncentration) efter SEC 12

Dag 3) Inmärkning av protein Inmärkning av protein med fluorofor Möjligheten att kovalent koppla molekyler till proteiner används ofta för att därigenom t.ex. binda proteinet till en fast yta eller som i detta fall, för att kunna detektera proteinet. Vanligast är att man utnyttjar proteinets primära aminer eller cysteiner. I denna laboration ingår två olika kopplingskemier. Du kommer bara utföra en av dem, men se till att lära dig båda, det kan vara både nyttigt och skoj... Fluoroforen Cy5 NHS. MW=753 Da Alt 1. Koppling till amin med Cy5 på Zwt 1) Ta ut 50 nmol His 6 -Zwt. 2) Provet ska spädas i en 1 M Natriumbikarbonatbuffert till 0,1 M för att höja ph till 9,3. Späd med PBS, ph 7,2-7,4 till 400 ul. 3) Lös upp fluoroforen i 210 µl PBS. OBS! Fyra grupper kommer att dela på en vial med fluorofor! 4) Tillsätt 50 µl Cy5 till proteinet. Vänd försiktigt på röret några gånger, tills färgen blandats ordentligt. Kläd röret i folie för att skydda fluoroforen mot ljus. Inkubera i RT och vänd, försiktigt, på röret ungefär var femte minut. 5) Låt proteinet märkas in i 30 min. 6) Separera proteinet från överskott av fluorofor samt byte till en mer lämplig (varför?) buffert: Jämvikta NAP10-kolonn med 15 ml 5 mm NH 4 Ac, ph 5,5 7) Tillsätt provet till kolonnen, låt rinna klart. Tillsätt ytterligare NH 4 Ac till en totalvolym om 1 ml, låt rinna klart. 8) Eluera med 1 ml av 5 mm NH 4 Ac till folieklätt rör. Märk röret! Kolonnen behöver inte tvättas efter detta steg, den skall slängas. 9) Frys provet vid 80 C i 30 min. 10) Frystorka till nästa dag. 13

Alt 2. Reduktion + koppling till tiol med Cy5 maleimide på ZCys Cysteininnehållande proteiner bildar lätt dimerer genom att tiolgrupperna oxideras till disulfider. När man använder tiolbaserad kopplingskemi är det viktigt att se till att det finns fria tioler! Här används TCEP (Tris-2-carboxethyl-phosphine) för att reducera disulfiderna. Det är viktigt att alla lösningar hålls så fria från luft som möjligt i närvaro av syre fungerar inte reaktionen optimalt. 1) Ta ut 50 nmol His 6 -Z-Cys och späd till en totalvolym av 400 µl i PBS, ph 7,2-7,4. 2) Väg upp 10 mg TCEP (M W 286,7 g/mol) och gör en 50 mm stamlösning i avluftad PBS. (1 lösning till 4 grupper). Dragskåp! 3) Tillsätt 50 µl TCEP 50mM (50x molärt överskott) till proteinet. 4) Låt proteinet reduceras i 10 min i rumstemperatur. 5) Lös under tiden upp en vial Cy5 maleimide (0,25 mg) i 55 µl DMF (dimetylformamid). Dragskåp! 6) Tillsätt 25 µl Cy5-maleimide lösning till det reducerade proteinet. Kläd röret med folie för att skydda fluoroforen mot ljus. 7) Låt proteinet märkas in i 37 C 1h. 8) Späd provet till en totalvolym av 1 ml i PBS, ph 7,2-7,4. 9) Jämvikta NAP10-kolonn med 15 ml 5 mm NH 4 Ac, ph 5,5. 14

10) Tillsätt 1 ml prov för att separera proteinet från överskott av fluorofor. 11) Eluera med 1,5 ml av 5 mm NH 4 Ac till folieklätt rör. Märk röret! Kolonnen behöver inte tvättas efter detta steg, den skall slängas. 12) Frys provet vid 80 C i 30 min. 13) Frystorka till nästa dag. SDS-PAGE-analys Ni använder SDS-PAGE för att kontrollera att reningen har gått bra och för att jämföra koncentrationsbestämning på gel med den från absorbansmätning. Ni skall jämföra hur många olika proteiner provet innehåller före och efter IMAC-reningen och även kontrollera att målproteinet finns kvar efter buffertbytet. Polyakrylamidgel-elektrofores är en metod som används för att separera proteiner efter storlek. SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) är en detergent som används för att denaturera proteiner och förse dem med negativa laddningar. Den förvärvade laddningen är proportionell mot antalet aminosyror. Då ett elektriskt fält läggs mellan elektroderna kommer proteinerna i gelen vandra mot den positiva elektroden. Proteiner av olika storlek kommer ha olika lätt att ta sig genom polyakrylamidgelen. I motsats till SEC, där man också separerar proteinerna med avseende på hydrodynamisk storlek, använder man här den laddning som proteinerna har efter SDS-behandling för att separera dem, genom att lägga en spänning över gelen. Instrument: PhastSystem för gelelektrofores, Amersham Biosciences 1. Molekylviktsmarkören innehåller proteiner med storlekarna 14, 20.1, 30, 45, 66 och 97 kda. Koncentrationen av varje protein i blandningen är 1µg/µl. 2. De prover som ska analyseras är: Cellpellet (från assarna) IMAC renat protein (från fraktionen med högst koncentration) SEC renat protein Molekylviktsmarkör 3. Wt-konstruktet: Blanda 8 µl IMAC resp. SEC renade proteinproverna med 5xRED så att slutkoncentrationen blir 1xRED 4. Cys-konstruktet: Blanda 8 µl IMAC resp. SEC renade proteinproverna med 5xOX så att slutkoncentrationen blir 1xOX 5. Lös upp cellpelleten i 25 µl 5xRED + 25 µl vatten. 6. Värm proven i 95 C i 5 min, spinn ned 15 s. 15

7. Ladda 1 µl av varje prov (cellpellet, IMAC-renat spädd 5x, SEC-renat spädd 5x, samt markör) på gelen (20% homogen gel) Skriv upp provordningen! 8. Kör gelelektrofores enligt förprogrammerat protokoll. 9. Efter avslutad elektroforeskörning, färga in gelen med Coomassie blue i framkallningsenheten. 10. Uppskatta koncentrationen på proteinet (genom att jämföra intensiteterna på gelen) och jämför med absorbansmätningen. 11. Förvara Phast-proverna i kylskåp. Märk rören! Efter denna dag ska ni ha: Räknat ut vilka olika molekylvikter ni kan förvänta er efter inmärkningen (till er hjälp har ni molekylvikterna i bilagor). Veta varför man ibland reducerar provet före inmärkning. Förstått var man finner primära aminogrupper i ett protein. Hur många har Z? Förstått hur Coomassie infärgning fungerar. Förstått hur SDS-PAGE fungerar Analyserat era prover med hjälp av SDS-PAGE. Är provet rent? Ni ska även ha uppskattat proteinkoncentrationen med hjälp av gelen. Stämmer de två olika värdena ni har fått fram för koncentration överens? 16

Dag 4 & 5) HPLC-rening av inmärkt protein och masspektrometri Nu skall ni studera hur inmärkningen av proteinet har gått. Här använder vi Reversed Phase HPLC (High Performance Liquid Chromatography) för att separera proteiner med avseende på hydrofobicitet. Instrument: HP 1090, Hewlett-Packard Kolonnmatris: Reversed Phase polystyren/divinylbensen Lösningsmedel: A 0,1 % TFA-H 2 O B 0,1 % TFA-acetronitril Gradient: 25% B, 0-5 min 25-45% B, 5-40 min 45-100% B, 40-41 min 100% B, 41-46 min 100-25% B, 46-47 min 25% B 47-50 min Detektion vid λ = 220 nm och λ = 280 nm, samt registrering av absorbansspektra för topparna. 1) Lös upp det frystorkade, inmärkta proteinet i 75 µl 0,1% TFA-acetonitril + 225 µl 0.1% TFA-H 2 O. 2) Filtrera provet genom ett 0,45 µm filter. 3) Ta ut 220 µl och sätt till en HPLC-vial, kontrollera att det inte är någon luftbubbla i botten. 4) Injicera provet och starta gradienten (injektionsvolymen är 200 µl). 5) Följ separationen på datorskärmen och samla upp toppar i mikrocentrifugrör. Märk rören med retentionstid och namn. Notera vilka toppar som innehåller inmärkt protein. Spara kromatogram, spektra för topparna samt den integrerade topparean. Dessa data får ni sedan som pdf-filer via hemsidan. 6) Välj ut fraktioner till MS-analys. Masspektrometri (MS) Med masspektrometri kan molekylers massa bestämmas mycket noggrant. Här använder vi MS för att via proteinets massa beräkna hur många fluorescerande grupper vi har lyckats koppla på. I labben joniseras proteinerna med matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI). Först blandas provet med en matris, en lösning innehållande en organisk syra som absorberar ljus i UV-området. Blandningen läggs på en s.k. MALDI-target, en platta av t.ex. stål. När vätskan evaporerar kristalliseras provmolekylerna och matrisen. Plattan sätts därefter in i masspektrometern. Där beskjuts provet med intensiva, korta laserpulser. Prov- och matrismolekylerna lämnar target (desorberas), energiöverföring sker mellan matris- och analytmolekyler vilket leder till jonisering. 17

Jonerna accelereras i ett elektriskt fält, och får därmed en hastighet som beror av massa-överladdning (m/z). Genom att mäta tiden det tar för jonerna att passera genom ett flygrör fram till detektorn kan man bestämma m/z. Denna typ av massanalysator kallas för time-of-flight (TOF) MS. Då vi använder MALDIn kommer vi främst att få enkelladdade joner. Den teoretiska massan för ert protein kan ni hitta längst bak i denna labbmanual. Även här har informationen tagits fram genom hemsidan: http://www.expasy.org/tools/protparam.html. Gå gärna in på denna hemsida och titta! Olika modifieringar av proteinsekvensen kan naturligtvis ske. Vid produktion i E.coli klyvs formylmetioninet bort. Det händer även att peptidkedjan går sönder. För att ni lättare ska kunna tolka spektra och de vikter ni har fått fram finns även en lista på aminosyrornas vikt som bilaga. Spektra från era analyserade proteiner kommer att finnas tillgängliga på kursens hemsida. Instrument: Bruker Biflex IV MALDI-TOF masspektrometer Material: Proverna från HPLC-reningen En mättad lösning av α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Oinmärkta och inmärkta fraktioner från HPLC-reningen kommer att analyseras med MS. Blanda 1 µl av ert prov med 1 µl CHCA, er matris. Pipettera över 1 µl av blandningen på MALDI-targeten. Låt torka! Nu är det dags att köra MS. Er labbledare kommer att instruera er vidare i hur ni använder instrumentet. Efter denna dag ska ni ha: Ha en teori om hur många varianter inmärkt/oinmärkt protein ni har fått. Veta vad man detekterar vid 220 respektive 280 nm. Tolka MS-spektrana genom att relatera massan för de otransformerade topparna (m/z) med den teoretiska massan för proteinerna och den kopplade fluoroforen. Förklara vad som bidrar till molekylvikten för proteinerna från de olika MS topparna och dra slutsatser från detta. Dragit slutsatser om vad som har eluerats ut i de olika topparna under HPLC-reningen. Stämmer data med vad som förväntades i teorin? Valt vilka toppar som ni ska frystorka till BiaCoren. Veta hur ni beräknar koncentrationen av inmärkt och oinmärkt protein med Nanodropspektrofotometern. 18

Dag 6) Biosensoranalys av proteinernas affinitet och Gyrolab-körning Biacore Biacore är ett optiskt biosensorinstrument som baseras på SPR (Surface Plasmon Resonance) vilket möjliggör detektion av biomolekyler samtidigt som man åskådligör bindningen mellan två eller flera molekyler. Detta sker i realtid utan använding av inmärkning. Man kan detektera proteiner, peptider, nukleotider, fettsyror och även små, organiska molekyler, exempelvis olika läkemedelskandidater. Ni ska använda Biacore för att studera hur inmärkt och icke-inmärkt Z binder in till sitt målprotein, IgG. IgG har bundits in på en dextrantäckt guldyta. Målet med analysen är att detektera eventuella skillnader mellan de två inmärkta varianterna samt oinmärkt Z med avseende på affinitet till IgG. 1) Börja med att lösa upp det frystorkade provet i 150 µl 1*HBS (5 mm Hepes, 150 mm NaCl, 3,4 mm EDTA, 0,005% P20), ph 7,2-7,4. 2) Bestäm proteinkoncentrationen på era prover genom att mäta absorbansen vid 280 nm. Cy5-fluoroforen absorberar ljus både vid 220 nm och 280 nm vilket får till följd att en spektrofotometrisk koncentrationsbestämning av inmärkt protein vid dessa våglängder kommer att bli felaktig. Ett sätt att lösa problemet är att uppskatta fluoroforkoncentrationen i provet genom absorbansmätning även vid 650 nm (där endast fluoroforen och inte proteinet absorberar) och använda detta för att korrigera den apparenta proteinkoncentrationen. Absorbansen kommer därför mätas både vid 280 nm (A 280 nm tot ) och 650 nm (A 650 nm Cy5 ) och proteinets absorbans vid 280 nm (A 280 nm prot ) beräknas utifrån: A 280 nm tot = A 280 nm prot + A 280 nm Cy5 (1) A 280 nm Cy5 = 0.05 x A 650 nm Cy5 (2) (1) + (2) => A 280 nm prot = A 280 nm tot - 0.05 x A 650 nm Cy5 A 280 nm prot kan därefter användas för att beräkna proteinkoncentrationen i provet. Spektrofotometern som används är en så kallad Nanodrop, där absorbansen mäts direkt i en applicerad provdroppe. De främsta fördelarna med instrumentet är att ingen kyvett behövs samt att en väldigt liten provvolym behövs. Strålgången vid mätningen är 1 mm, tänk på det vid beräkningar med Lambert-Beers lag. 3) Gör spädningar av provet till 1 µm, 500 nm, 250 nm och 125 nm i en total mängd av 500 µl (om koncentrationen är för låg kan provet spädas till mindre volym, dock behövs minst 250 µ) av vardera koncentration i eppendorfrör. Proverna ska spädas med 1*HBS. Filtrera det första provet i varje spädningsserie och gör sedan vidare spädningar. För över proven till vialer. 4) Docka in chipet om det inte är indockat och kör Prime (tvättar systemet med 1*HBS) 5) Titta igenom programmet och skriv in var man ska sätta proverna. 19

6) Starta Biacoren. Det kan vara svårt att utifrån sensorgrammen bestämma om det är någon skillnad mellan de fyra olika proverna. Ett sensorgram för varje variant med koncentrationer kommer att finnas på hemsidan. Utifrån dessa sensorgram ska ni plotta jämviktrespons mot koncentration så att det nya diagrammet visar skillnaderna mellan de inmärkta och oinmärkta Z-varianterna. Se bild: R U 1µM 500nM 250nM 125nM Time [sec] R U Variant A Variant B 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 log [C] 20

Gyrolab Workstation Gyrolab-teknik används bland annat i klinisk forskning, som exempelvis vid detektion av biomarkörer i plasmaprover. Ni ska här skapa en standardkurva av IgG och därefter koncentrationsbestämma IgG-innehållet i ett okänt prov med hjälp av Gyrolab-teknologi. Gyrolab-teknologi är utvecklad för detektion av biomolekyler i CD-skivor. Genom olika varianter av sandwich assays kan fluorescensinmärkta molekyler fångas in på 15 nl små kolonner, inkapslade i en plastskiva av CD-format, och detekteras med en så kallad Laser Induced Fluorescence detector (LIF detector). Vätskor förs till kolonnerna i en kombination av kapillär- och centrifugalkraft vilket gör att upp till 112 prover kan behandlas identiskt och analyseras simultant. Teknikens fördelar gentemot till exempel traditionell ELISA i plattor är att den är mycket snabb (en timme jämfört med en-två dagar), den är reproducerbar och den har ett bredare detetktionsspann än traditionell ELISA. Den skiva vi kommer att använda har volymsdefinieringskammare på 200 nl i anslutning till varje kolonn, se figur nedan: Figure 5 Schematisk bild av en av skivans 104 strukturer Märk ut: A. Inlet B. Volymsdefinieringskammare C. Hydrofoba stop D. Kolonn E. Gemensam kanal F. Överflödig vätskas kanal 1. Gör en spädningsserie med fem spädningar av det kända IgG-provet ni fått från labbassarna. Provet har en koncentration på 0,1 mg/ml. Som spädningsvätska används 1xPBS-T (PBS med 0.1% Tween20), filtrerad med 0,45µm-filter. De fem koncentrationerna är 1 µg/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml samt 62,5 ng/ml. 2. Späd ert inmärkta Z-prov 1:10 i PBS-T 3. Placera 50 µl av vardera spädning, 15 µl av ert inmärkta Z samt 50 µl av ert okända prov i en 96-hålsplatta. Anteckna hur proverna placerats. 4. Centrifugera plattorna i en platt-centrifug, 2000 rpm 2 min. 5. Starta Gyrolabben. 21

Efter denna dag ska ni ha: Bestämt mängd protein i de framrenade HPLC-topparna Räknat ut utbytet för inmärkning, SEC och HPLC. Då ni saknar information mellan dessa delsteg räknar vi på dessa som ett. Spekulera gärna kring hur eventuella förluster är fördelade över de olika delstegen. Relaterat utbytet till odlingsvolym (g/liter odling). Ritat diagram med responsen i Biacoren plottad mot koncentrationen av Z-variant. Glöm inte att skaffa data på den andra varianten också. Vilken parameter är viktigast för att denna analys ska vara pålitlig. Påverkar inmärkningen affiniteten? Om ja, hur? Glöm inte att skaffa data på den andra varianten också. Jämföra kurvornas utseende med varandra. Har ni nått mättnadsnivå? Ritat en standardkurva med Totala Integrerade Volymen fluorescens plottad mot IgGkoncentrationen för standardproverna. Koncentrationsbestäm det okända provet med hjälp av kurvan. 22