Evaluation of a new microarray method for genotyping of HLA-DQ2 and HLA-DQ8 for investigation of celiac disease

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15hp Vt 2012 Evaluation of a new microarray method for genotyping of HLA-DQ2 and HLA-DQ8 for investigation of celiac disease Karin Hidman Handledare: Per Bjellerup, Mandana Shikhagaie Vuic, Kerstin Nützman Klinisk Mikrobiologi, Laboratoriemedicin Västmanland

ABSTRACT Celiac disease (CD) is an autoimmune disease, induced by an immune mediated reaction in the small intestine after ingestion of gluten and related prolamines. There is a strong genetic linkage and most important are the genes that encodes for HLA-DQ2 and HLA-DQ8. The European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) has developed new guidelines for investigation of CD in children and adolescents, which include genotyping for HLA-DQ2 and HLA-DQ8. Therefore, the clinical microbiological laboratory in Västmanland wants to introduce a method for analysis of these genes. Microarray is a newly developed method for determination of the alleles HLA-DQA1 and HLA-DQB1 that encodes for the α- and β-subunits of the HLA-molecules. The method was verified for accuracy and repeatability, and also two extraction methods were compared. Samples from blood donors and laboratory personnel were analysed for HLA-DQ and tissue transglutaminase antibodies (anti-ttg), and two families were investigated according to the ESPGHAN guidelines. 48.3 % of the blood donors were positive for HLA-DQ2 and/or HLA- DQ8 and 30.4 % of the laboratory personnel, were positive for HLA-DQ2 or HLA-DQ8. Those who were tested for anti-ttg had no antibody response. Genotyping for HLA-DQ2 and HLA-DQ8 is a simple way to exclude CD, but it can also be used to confirm diagnosis in patients with symptoms and high anti-ttg levels and thus avoiding a biopsy. The results in the accuracy and repeatability tests showed that the microarray is a reliable method for detection of the HLA-DQ2 and HLA-DQ8 genes associated with CD. KEYWORDS Validation, gluten, MHC Class II, in vitro diagnostics, hybridization method 2

INTRODUKTION Celiaki är en livslång autoimmun sjukdom som framkallas av en immunmedierad reaktion i tunntarmen vid intag av gluten och liknande prolaminer. Sjukdomen uppstår hos genetiskt disponerade individer och den enda behandlingen är en glutenfri diet. Symtomen och deras svårighetsgrad varierar mycket mellan olika patienter och kan innebära både lokala symtom från tarmen, till exempel diarré, kroniska buksmärtor, kronisk förstoppning och uppsvälldhet, och systemiska symtom som viktminskning, tillväxthämning, försenad pubertet, järnbristanemi, osteoporos och hudutslag [1,2]. Ökad förekomst av celiaki finns hos patienter med andra autoimmuna sjukdomar, till exempel diabetes typ1, autoimmun tyroideasjukdom och autoimmun leversjukdom [1]. Studier visar även på något förhöjd risk för utveckling av vissa typer av cancer i samband med celiaki under det första året efter att diagnosen har bekräftats [3,4]. I Sverige har prevalensen av celiaki ökat sedan början av 1980-talet. Det tror man beror på att den rekommenderade åldern för introduktion av gluten ändrades från 4 till 6 månader, samtidigt som mängden gluten i maten ökade [5]. I en svensk studie där 2,5-åringar screenades för celiakispecifika antikroppar, upptäcktes celiaki hos 1,3 % av barnen, medan 0,7 % hade fått diagnosen bekräftad innan studien startade [6]. I en annan studie där man undersökte vuxna i åldern 25-74 år hade 0,1 % fått diagnosen bekräftad tidigare, och den totala prevalensen var 0,5 % [7]. European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) har nyligen tagit fram nya riktlinjer för utredning och diagnos av celiaki hos barn och ungdomar [1]. De tidigare riktlinjerna från 1990 är inte längre aktuella eftersom forskning och utveckling av nya tekniker har ökat kunskapen om sjukdomen och gjort det möjligt att analysera fler faktorer som kan påverka sjukdomsutvecklingen. De nya riktlinjerna grundar sig på evidensuttalanden från en grupp experter som har gett upphov till rekommendationer om vilka som bör testas för celiaki och vilka undersökningar som bör ingå i det diagnostiska arbetet. Den nuvarande rekommendationen innebär undersökning av celiakispecifika antikroppar, genotypning för HLA-DQ2 och HLA-DQ8 och tunntarmsbiopsi. Beroende på om barnet har symtom eller inte och om det finns andra riskfaktorer, till exempel en nära släkting med celiaki eller att barnet har en annan autoimmun sjukdom, så prioriteras undersökningarna på olika sätt. Hur utredningen går vidare beror på vad resultaten visar i varje individuellt fall. Hos vissa individer kan tunntarmsbiopsi uteslutas helt. 3

Celiaki är en multifaktoriell sjukdom, men det finns en stark genetisk koppling. De viktigaste generna är de som kodar för HLA-DQ2 och HLA-DQ8. Undersökning av dessa gener är en viktig del vid utredning av celiaki, eftersom förekomst av molekylerna ökar risken för sjukdomsutveckling samtidigt som sjukdomen kan uteslutas om generna inte finns. Men även om en person uttrycker HLA-DQ2 eller HLA-DQ8 behöver det inte betyda att sjukdomen uppstår, alltså är förekomsten av HLA-DQ2 eller HLA-DQ8 nödvändigt men inte tillräckligt för att orsaka sjukdom [1]. Generna för molekylerna finns i HLA-lokus på kromosom 6, där generna för MHC-molekylerna ligger. HLA-DQ är av MHC klass II typ och har som uppgift att ta upp peptider från omgivningen och presentera de för T-hjälparceller som ett led i det adaptiva immunförsvaret. MHC klass II-molekylerna är uppbyggda av två aminosyrakedjor, en α- och en β-kedja, som båda består av två domäner. Den yttre domänen på respektive kedja bildar tillsammans en ficka där MHC-heterodimeren binder och presenterar peptider för T-hjälparcellerna. Gluten, som är den viktigaste miljöfaktorn vid celiaki, består av olika undergrupper av proteinerna gliadin och glutenin, och har därmed ett högt innehåll av aminosyrorna glutamin och prolin. Det höga prolininnehållet gör att gastrointestinala enzymer har svårt att bryta ner gluten. Det enda enzymet som specifikt bryter ner gluten är prolylendopeptidas, som klyver peptidbindningen vid C-terminalen av prolin och ger ostabila peptider som lätt kan brytas ner [2]. Närmast tarmens lumen finns ett epitellager som består av enterocyter. Enterocyternas funktion är att bilda en fysisk barriär mot främmande ämnen i tarmen och utföra det selektiva upptaget av näringsämnen. Vid celiaki är den fysiska barriären mer permeabel eftersom tight junctions är mindre regelbundna och tarmens yta minskar drastiskt. I en tunntarmsbiopsi syns de här förändringarna som villiatrofi, hyperplasi i kryptorna och infiltration av lymfocyter i lamina propria. Enterocyterna, som normalt bildar ett enkelskiktat cylinderepitel, är tillplattade och epitelet är pseudostratified [1]. Dessa förändringar leder till ett ökat upptag av glutenpeptider, vilket ökar möjligheten för antigenpresentation och T-cellsvar. Förändringarna kan bero på en kombination av flera olika mekanismer, en teori är att förhållandet mellan celldelning och differentiering av enterocyterna förändras så att cellerna förlorar sin funktion, i kombination med genetiska variationer och ökade nivåer av IFN-γ och TNF-α [2]. HLA-DQ2 och HLA-DQ8 binder framförallt negativt laddade aminosyror, men eftersom den naturliga formen av gluten saknar negativt laddade aminosyror så binder de dåligt till molekylerna. Vävnadstransglutaminas (ttg) är ett enzym som finns intracellulärt i hela 4

kroppen. Normalt förekommer det i en inaktiv form, men aktiveras när en vävnadsskada uppstår. När naturligt gluten presenteras för CD4+ T-celler stimuleras produktionen av IFN-γ, som i sin tur stimulerar uttrycket av HLA-DQ. Det blir en självförstärkande loop som ger en lokal vävnadsskada. Då frisätts ttg som kan modifiera glutenpeptiderna genom deamidering, då glutamin som är oladdat omvandlas till glutaminsyra som är negativt laddat. Då kommer glutenpeptiderna att passa bättre till bindningsstället på HLA-DQ2 och HLA-DQ8 vilket leder till ökade nivåer av glutenspecifika CD4+ T-celler [2,8]. Antikroppar mot ttg är en av de celiakispecifika antikroppar som analyseras först hos barn och ungdomar som har symtom och misstänks ha celiaki. Endomysium-antikroppar (EMA) och antikroppar mot deamiderade gliadinpeptider (DGP) kan analyseras senare i utredningen om behov finns. Antikropparna är av IgA-klass, men om patienten har IgA-brist kan även antikroppar av IgG-klass analyseras. Hos barn och ungdomar som har symtom och hög koncentration av anti-ttg kan diagnos ställas utan att en tunntarmsbiopsi behöver göras. Då tas istället fler laboratorietester (EMA och HLA-DQ) för att bekräfta diagnosen [1]. HLA-DQ2 och HLA-DQ8 kodas av gener som är kombinationer av allelerna HLA-DQA1 och HLA-DQB1, som kodar för α- respektive β-kedjorna. HLA-DQ2 bildas av allelerna HLA-DQA1*0501 eller -DQA1*0201 och HLA-DQB1*0201 eller -DQB1*0202, och HLA- DQ8 bildas av allelerna HLA-DQA1*0301 och HLA-DQB1*0302 [2]. En stor del av normalbefolkningen uttrycker HLA-DQ2 utan att utveckla celiaki, men antalet varierar mellan olika studier, från 25 % [2] till 30-40 % [1]. I en studie på celiakipatienter som är födda i Sverige mellan 1970 och 1991 såg man att 92 % av patienterna bär på generna för HLA-DQ2 (allelerna HLA-DQA1*0501 och HLA-DQB1*02). I kontrollgruppen, som bestod av blodgivare, hade 22 % HLA-DQ2-generna. Av de 11 (8,1 %) i patientgruppen som inte hade HLA-DQ2, hade 6 (4,4 %) generna för HLA-DQ8 och resten hade mer ovanliga kombinationer av allelerna [5]. Det finns två genetiska varianter av HLA-DQ2. Den ena varianten, HLA-DQ2.5 (med allelerna DQA1*0501 och DQB1*0201) predisponerar för celiaki, medan den andra varianten, HLA-DQ2.2 (med allelerna DQA1*0201 och DQB1*0202) inte gör det. Skillnaden beror på att de olika allelerna ger olika bindningsegenskaper vilket gör att antigenpresentationen och därmed T-cellsvaret blir olika starkt beroende på vilken HLA-DQ2 variant som cellen uttrycker. HLA-DQ2.5 binder med hög affinitet till de flesta glutenpeptiderna medan HLA-DQ2.2 endast binder med hög affinitet till de glutenpeptider som saknar aminosyran prolin i den peptidbindande positionen P3. Det gör att celler som uttrycker HLA-DQ2.5 kan presentera fler peptider för T-cellerna och ger då ett starkare T- 5

cellsvar än celler som uttrycker HLA-DQ2.2. Därmed ökar risken för att en immunologisk reaktion sker och att sjukdomen uppstår [9]. I och med att de nya riktlinjerna, för att utreda och ställa diagnos avseende celiaki, rekommenderar undersökning av generna för HLA-DQ2 och HLA-DQ8, framförallt för att kunna utesluta celiaki, så vill laboratoriet införa en metod för detta i rutinarbetet. Metoden, som är ny, baseras på en microarray-teknik för in vitro-bestämning av allelerna HLA-DQA1 och HLA-DQB1. DNA från patientens leukocyter extraheras och amplifieras med PCR. Amplifieringsprodukten märks samtidigt in med ett fluorescerande färgämne och inkuberas sedan på objektsglas märkta med fasta prober, formade som microspots, som motsvarar de olika HLA-DQ-allelerna som ska undersökas. Om amplifieringsprodukten är komplementär till någon av proberna sker en inbindning som detekteras genom att fluorescensen från amplifieringsprodukterna mäts med en microarray-skanner. De alleler som kan detekteras med metoden är DQA1*02, DQA1*02/*0301, DQA1*03, DQA1*0302/*03, DQA1*05, DQB1*02 och DQB1*02/*0302. För att få införa en ny analys i rutinarbetet ska laboratoriet alltid utföra en verifiering och/eller validering av metoden. I det här arbetet gjordes en verifiering av microarraymetoden där riktigheten och repeterbarheten kontrollerades och två extraktionsmetoder jämfördes. Förekomsten av generna för HLA-DQ2 och HLA-DQ8 studerades hos blodgivare och laboratoriepersonal, och en jämförelse gjordes på blodgivare mot förekomsten av antikroppar mot ttg. Två familjer utreddes enligt rekommendationerna från ESPGHAN, i den ena familjen har ett barn sedan tidigare fått diagnosen celiaki bekräftad och i den andra familjen misstänks mamman ha celiaki. MATERIAL OCH METOD Material För att extrahera DNA användes två metoder, en robotextraktion och en manuell extraktion. För robotextraktionen användes instrumentet NorDiag Bullet, 8 tip config (NorDiag) tillsammans med programvaran Lirix software version 2.2.37 och Bullet Blood DNA 50 kit (NorDiag). Övrigt material som behövdes till instrumentet var reagenstråg, NorDiag Bullet filtertippar, djupbrunnsplatta för extraktion i 96-brunnsformat och 96 well multiply-pcr plate (Sarstedt). Eluatet fördes över till RNas- och DNasfria Microtubes 0,5ml (Sarstedt). 6

Vid den manuella extraktionen användes instrumentet QuickGene-Mini80 (Fujifilm) och QuickGene DNA whole blood kit S (Fujifilm), men istället för de uppsamlingsrör som ingick i kitet så användes eppendorfrör. Till PCR och hybridisering användes EUROArray HLA- DQ2/DQ8 kit (Euroimmun). PCR utfördes på Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler i RNas- och DNasfria PCR-rör 0,2 ml medan hybridisering utfördes på Titerplane reagent tray for EUROArray slides (Euroimmun). Tvättbuffertarna blandades av Wash reagent 1 och Wash reagent 2 (Euroimmun). För avläsning av hybridiseringsglasen användes Microarray Scanner (Euroimmun) och programvaran EUROArrayScan software. Provmaterial DNA extraherades ur helblod från EDTA-rör. Fem kända prover, som verifierats av företaget, analyserades för att kontrollera metodens riktighet. Två av proverna var positiva för HLA-DQ2 (MV27 och MV32), två var positiva för HLA-DQ8 (MV35 och MV103) och en var positiv för både HLA-DQ2 och HLA-DQ8 (MV120). Prover från totalt 60 blodgivare och 23 personer på laboratoriet analyserades. På blodgivarna togs ett extra 3 ml EDTA-rör innan själva tappningen påbörjades och på laboratoriepersonalen togs ett 3 ml EDTA-rör venöst. De 20 första proverna från blodgivare extraherades med två olika metoder för att kontrollera att extraktionsroboten som redan används på laboratoriet även fungerar till den nya metoden. På resten av blodgivarna togs även ett 3 ml gelrör för undersökning av antikroppar mot ttg. Repeterbarheten hos metoden testades genom att ett prov som var positivt för HLA-DQ2 analyserades om i triplikat, ett prov som var positivt för HLA-DQ8 och ett som var positivt för både HLA-DQ2 och HLA-DQ8 analyserades om i duplikat, under en analysomgång. PBS användes som negativ kontroll och analyserades på ett objektsglas i varje analysomgång för att provsvaren skulle godkännas. Den följde med från extraktionen och genom alla analyssteg, och behandlades på samma sätt som proverna. I varje enskild analys finns även inbyggda kontroller i duplikat. Två positiva kontroller visar om PCR har fungerat så att ett amplifierat DNA finns i provet. Det finns två kontroller för kontaminering av provet, en av kontrollerna ska ge signal för att resultatet ska godkännas men om båda kontrollerna ger signal så har provet korsreagerat med ett intilliggande prov och måste analyseras om. Även två kontroller för hybridisering och tvätt finns med, där den ena kontrollen ska ge en starkare signal om dessa steg har fungerat. Kontroller i hörnen är nödvändiga för att skannern ska kunna läsa av positionerna på glasen. 7

I arbetet räknades alla provresultat som negativa eller positiva för HLA-DQ2 och/eller HLA-DQ8. De negativa resultaten delades inte upp i delresultat, utan alla negativa varianter räknades som en grupp. Ingen etisk prövning behövde göras eftersom användande av avkodat provmaterial från blodgivare för verifiering av metoder är en etablerad rutin på laboratoriet. Detsamma gällde för provmaterial från laboratoriepersonalen som deltog. Resultaten för de två familjerna ingick i ordinarie klinisk utredning men var avkodade i detta arbete. Extraktion med Bullet Blood DNA 50 kit DNA extraherades med hjälp av extraktionsroboten Bullet Blood DNA 50 kit (NorDiag) enligt företagets instruktioner. Eluaten pipetterades över till Microtubes 0,5 ml (Sarstedt) för förvaring. Metoden baseras på BUGS n BEADS Technology (NorDiag) som separerar DNA från cellerna med hjälp av magnetiska kulor som är ytbehandlade så att de binder DNA. Först lyseras celler så att nukleinsyrorna frisätts. Sedan tillsätts de magnetiska kulorna tillsammans med en bindningsbuffert som gör att nukleinsyrorna binder till ytan på kulorna. Genom magnetisk separation tvättas sedan supernatanten bort och kvar blir ett renat DNA. Extraktion med QuickGene DNA whole blood kit S Den manuella extraktionen utfördes med QuickGene DNA whole blood kit S (Fujifilm) enligt instruktionerna från företaget, men med vissa modifieringar. Vid elueringen tillsattes 100 µl elueringsbuffert istället för 200 µl och eppendorfrör användes istället för uppsamlingsrören i kitet. I den här metoden används separationsrör med ett 80 µm poröst polymermembran som fångar upp nukleinsyrorna. QuickGene-Mini80 (Fujifilm) bildar ett lufttryck som pressar vätskan genom membranet och efter tvätt kan ett rent DNA elueras. Polymerase Chain Reaction (PCR), hybridisering och avläsning För att amplifiera proverna kördes PCR på 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems) enligt instruktionsboken för EUROArray HLA-DQ2/DQ8 kit (Euroimmun). Hybridiseringen utfördes på EUROArray Slides, som ingår i EUROArray HLA-DQ2/DQ8 kit (Euroimmun), och glasen skannades enligt företagets instruktioner. Inkubationen är en så kallad TITERPLANE Technique (Euroimmun) då man använder objektsglas med Microarray BIOCHIP, som består av enkelsträngade DNA-prober med olika sekvenser i 8

mikroskopiska fläckar som är placerade på bestämda platser på glaset. Varje glas har fem testfält och i varje fält är det 48 DNA-fläckar. DNA-proberna finns i duplikat för varje PCR produkt av allelerna för HLA-DQ2 och HLA-DQ8 som kan finnas i provet samt för alla kontroller. Om amplifieringsprodukten från patientens DNA passar till proben binds de komplementära delarna till varandra och detekteras genom mätning av fluorescensen. RESULTAT När objektsglasen har lästs av i skannern visas provresultaten på datorn, som Figur 1 visar. Om provet är positivt i microspotsen som innehåller allelerna DQA1*05, DQB1*02 och DQB1*02/*0302 så har patienten generna för HLA-DQ2 och om provet är positivt i microspotsen som innehåller allelerna DQA1*02/*0301, DQA1*03 och DQB1*02/*0302 så har patienten generna för HLA-DQ8. Det kan bli åtta olika resultat, positivt för HLA-DQ2, positivt för HLA-DQ8 eller positivt för både HLA-DQ2 och HLA-DQ8, samt fem olika varianter av negativt resultat, där allelerna saknas helt eller där alleler för någon av molekylernas α- eller β-kedja finns med. För att kontrollera riktigheten hos metoden testades fem kända prover som företaget har verifierat. Med vår metod stämde resultaten överrens med det som företaget hade angett. När DNA, som extraherats med två olika metoder, jämfördes blev alla resultat identiska och de tre positiva prover som analyserades om för att testa repeterbarheten hos metoden blev identiska med de första resultaten. Av de 60 blodgivare som testades hade 48,3 % generna för HLA-DQ2 och/eller HLA-DQ8. De flesta i gruppen var positiva för enbart en av generna, 13 (21,7 %) hade generna för HLA- DQ2 och 15 (25,0 %) hade generna för HLA-DQ8. Endast en blodgivare (1,7 %) var positiv för båda generna. De blodgivare som testades för antikroppar mot ttg hade alla negativa antikroppssvar. Hos laboratoriepersonalen, totalt 23 stycken, var 30,4 % positiva för någon av generna. 4 (17,4 %) hade generna för HLA-DQ2 och 3 (13,0 %) hade generna för HLA-DQ8. Ingen hade generna för båda molekylerna. I familj 1, där ett barn sedan tidigare hade fått diagnosen celiaki bekräftad, undersöktes HLA-DQ och anti-ttg hos föräldrarna, barnet med bekräftad diagnos och ett syskon. Pappan 9

och båda barnen hade generna för HLA-DQ2 men mamman var negativ. Alla i familjen var negativa för anti-ttg. I familj 2, där mamman misstänks ha celiaki, testades mamman och barnen för HLA-DQ och antikroppar mot ttg. Mamman hade generna för HLA-DQ2 och ett anti-ttg som var 6 gånger över det normala värdet. Två av barnen var positiva för HLA-DQ2 och en var negativ. Alla barnen var negativa för ttg. Figur 1. Bilden som visas på datorn efter avläsning av glasen. Provet är positivt för HLA-DQ2 (allelerna DQA1*05, DQB1*02 och DQB1*02/*0302) och HLA-DQ8 (allelerna DQA1*02/*0301, DQA1*03 och DQB1*02/*0302). Alla kontroller är godkända. DISKUSSION Celiaki är en mycket komplex sjukdom med många påverkande faktorer, och även om det har gjorts och fortfarande görs mycket forskning inom området så vet man inte säkert vad det är som gör att vissa individer får sjukdomen och andra inte. Men det finns en genetisk koppling, och enligt de nya rekommendationerna från ESPGHAN ska undersökning av dessa gener ingå i utredningen i de fall då man misstänker celiaki. En ny metod för genotypning av HLA-DQ2 och HLA-DQ8 skulle införas på laboratoriet för ovannämnda syfte. En verifiering av metoden gjordes för att testa tillförlitligheten innan den infördes i rutinarbetet. Metoden baseras på en microarray-teknik för bestämning av 10

allelerna för HLA-DQ2 och HLA-DQ8. De tester som gjordes var kontroll av riktigheten och repeterbarheten hos metoden, en jämförelse mellan två olika extraktionsmetoder, en jämförelse mellan förekomsten av HLA-DQ och antikroppar mot ttg samt utredning av två familjer genom att följa rekommendationerna från ESPGHAN. I det här arbetet räknades alla provresultat som negativa eller positiva för HLA-DQ2 och/eller HLA-DQ8 eftersom det inte är kliniskt relevant om patienten endast har en α- eller β-kedja. Därför delades inte de negativa resultaten upp i delresultat, utan alla negativa varianter räknades som en grupp. Allelerna DQA1*02 och DQA1*0302/*03 är inte kopplade till celiaki, men finns med i analysen för att man med säkerhet ska kunna bestämma DQA1*0301, som kodar för α-kedjan på HLA-DQ8. Med detta blir metoden mer specifik. I riktighets- och repeterbarhetstesterna blev resultaten som det var förväntat, proverna från företaget fick samma resultat med vår metod som de hade angett och de prover som analyserades om i duplikat och triplikat fick identiska svar varje gång. Även i jämförelsen mellan de två extraktionsmetoderna blev resultaten identiska, vilket betyder att den extraktionsrobot som redan står på laboratoriet även kan användas till den nya analysen. Efter att ha kontrollerat detta och sett att det fungerar anses metoden vara tillförlitlig och kan införas i rutinarbetet på laboratoriet. En större andel av blodgivarna (48,3 %) hade någon av generna för HLA-DQ2 och/eller HLA-DQ8 jämfört med laboratoriepersonalen (30,4 %). Förekomsten av generna för HLA- DQ2 motsvarade ungefär vad som har setts i tidigare studier [2,5]. Det är svårt att hitta studier som har undersökt förekomsten av generna för HLA-DQ8 och därför kan inte förekomsten av dessa gener jämföras. En anledning till att fler studier gjorts kring HLA-DQ2 kan vara att de molekylerna är vanligare än HLA-DQ8, och att sambandet mellan HLA-DQ2-generna och celiaki är starkare [5]. De regionala skillnader som påvisats [10] och skillnader som påvisats mellan olika länder [11] är en anledning till att förekomsten av generna skiljer sig åt i olika studier, och den högre prevalensen av celiaki som har setts hos barn [6], jämfört med vuxna individer [7], skulle kunna vara ett bevis på att prevalensen har ökat de senaste årtiondena. Eftersom alla blodgivare var negativa för anti-ttg kunde ingen slutsats om sambandet mellan förekomsten av generna och antikroppssvaret tas. Alla prover avidentifierades innan analys, så inga slutsatser kunde heller tas med avseende på ålder, kön och koppling till symtom som överrensstämmer med celiaki. Men sambandet mellan anti-ttg och celiaki har tidigare studerats [12] då man har sett att de individer som har ett högt anti-ttg oftast har celiaki, och om inget antikroppssvar finns så har man inte sjukdomen. Det är en anledning till varför undersökning av generna för HLA-DQ inte är det första alternativet vid utredning av 11

celiaki, utan endast de som är positiva för anti-ttg behöver en utvidgad utredning, med bland annat genotypning, för att bekräfta diagnosen. De nya riktlinjerna från ESPGHAN rekommenderar att antikroppar mot ttg och totalt serum-iga analyseras som ett första steg vid misstanke om celiaki hos barn och ungdomar. Om anti-ttg är negativt kan celiaki vanligtvis uteslutas. Men undantag förekommer vid IgAbrist, hos barn som är mindre än 2 år eller om personen har svåra symtom eller en annan autoimmun sjukdom, i dessa fall ska utredningen utvidgas. Om anti-ttg är positivt, men med värden som är mindre än 10 gånger högre än det normala måste en biopsi utföras för att diagnosen ska kunna säkerställas, men om det är positivt med värden som är 10 gånger eller mer över det normala kan man istället gå vidare med antikroppstest för EMA och genotypning av HLA-DQ [1]. På det här sättet kan biopsier undvikas i flera fall, vilket underlättar diagnostiken för både patienten och personal, eftersom en biopsi-undersökning ofta är obehaglig och kräver mer tid och resurser än blodprovstagning. Två familjer utreddes enligt rekommendationerna från ESPGHAN. I familj 1 hade ett barn sedan tidigare fått diagnosen celiaki bekräftad. Eftersom personer som har nära släktingar med celiaki, också har en genetiskt ökad risk att utveckla sjukdomen, rekommenderas undersökning av generna för HLA-DQ2 och HLA-DQ8, samt antikroppstest för ttg om genotypningen är positiv [1]. Dessa analyser utfördes på barnets föräldrar, syskon och barnet själv. Det visade sig att pappan och båda barnen har generna för HLA-DQ2 medan mamman är negativ. Alla i familjen var negativa för anti-ttg. Barnet med bekräftad celiaki har inget antikroppssvar eftersom en glutenfri diet följs. Undersökning av anti-ttg används för att följa upp patienten och målet är att antikroppssvaret blir negativt, vilket är ett bevis på att behandlingen följs och fungerar. Vid en eventuell vidare utredning av pappan och syskonet är en tunntarmsbiopsi nödvändig för att ställa diagnos eftersom ingen av dem har symtom. Hos mamman kan celiaki uteslutas eftersom hon inte har generna som kopplas till sjukdomen. I familj 2 har mamman diffusa besvär som man inte har hittat orsaken till och ett av hennes barn har symtom som överrensstämmer med celiaki. En misstanke om att celiaki kan vara orsak till problemen finns och en undersökning av mamman och hennes tre barn utfördes. Det visade sig att två av barnen har generna för HLA-DQ2 men eftersom alla var negativa för anti-ttg så kan celiaki uteslutas. Men för barnet med symtom rekommenderas en vidare utredning då man undersöker om en annan sjukdom med liknande symtom är orsaken, till exempel laktosintolerans eller komjölksallergi. Mamman i familjen, som har generna för HLA-DQ2 och ett anti-ttg som är 6 gånger över det normala, behöver genomgå en tunntarmsbiopsi för att säkerställa diagnosen. 12

Det finns flera metoder som kan användas för undersökning av generna för HLA-DQ. Vanligast är olika varianter av PCR och kombinationer med ytterligare detektionssteg, till exempel med gelelektrofores. En ny molekylärbiologisk metod som tagits fram är realtids- PCR med smältkurvsanalys [13] där DNA, som extraheras från helblod, amplifieras med realtids-pcr och undersöks genom mätning av fluorescensen från ett färgämne som byggs in i alla dubbelsträngade DNA. Efter PCR hettas proverna upp till 97 C, då dubbelsträngat DNA smälter, och samtidigt minskar fluorescensen kraftigt. Instrumentet registrerar fluorescensminskningen och visar den som smälttoppar i en smältkurvsgraf, där varje topp motsvarar smälttemperaturen för varje DNA-produkt. Metoden är snabb och lätt att utföra, själva analysen tar mindre än 2 timmar om extraktionstiden inte räknas med, och det krävs få reagens och mindre hantering av prover och reagens. Den är bra vid tillfällen då få specifika alleler ska identifieras och den har hög sensitivitet och specificitet jämfört med andra PCRmetoder. Primers och mastermix kan förberedas i förväg och frysas så att endast DNA behöver tillsättas, vilket underlättar hanteringen [13]. Microarray är en enkel metod som kan användas på vilket kliniskt laboratorium som helst, till skillnad mot realtids-pcr med smältkurvsanalys som måste köras på ett molekylärbiologiskt laboratorium, eftersom den är mycket känsligare för kontaminering. Microarray har en inkuberingstid på 1 timme efter PCR, då DNA binds till proberna på objektsglasen. Därefter tvättas och skannas glasen vilket tar från ungefär 5 minuter och uppåt beroende på hur många glas som hybridiseras samtidigt. En smältkurvsanalys kan skrivas ut direkt efter att PCR är klar och proverna har hettats upp tillräckligt. Innan PCR ska proverna extraheras från helblod, men det antas ta lika lång tid oberoende av vilken analysmetod som används. Provsvaren från microarray är lätta att svara ut eftersom programvaran som tillhör skannern automatiskt tolkar resultaten. Men med smältkurvsanalys krävs en längre upplärningstid och mer kunskap för att kunna tolka och svara ut resultaten eftersom kurvorna inte tolkas automatiskt i datorn. En annan skillnad mellan metoderna är att microarray har bestämda alleler som kan detekteras, men i realtids-pcr med smältkurvsanalys finns en större möjlighet att välja vilka alleler som ska ingå i analysen. Microarray kan till exempel inte skilja på HLA-DQ2.2 och HLA-DQ2.5, men i en smältkurvsanalys är det möjligt om rätt primers och mastermix används. Om DNA-koncentrationen är för låg, mindre än 10 ng/µl, kan inte microarray detektera fluorescensen, vilket kan ge falskt negativa provsvar. Höga DNA-koncentrationer, upp till 200 ng/µl, ger inte falskt positiva eller negativa signaler, men företaget vet inte vad som händer om koncentrationen är högre än 200 ng/µl. Men det är ovanligt att så höga koncentrationer uppnås, så det anses inte vara något problem i praktiken. 13

Begränsningen med microarray är att endast 10 objektsglas kan tvättas i samma tvättbuffertar innan de måste bytas ut. Några andra viktiga saker att tänka på med microarray-metoden är att när tvättbuffertarna blandas måste lösningarna vara rumstempererade och tillsättas i rätt ordning, enligt instruktionerna, för att undvika grumlighet. När proverna sätts till objektsglasen är omvänd pipettering att föredra för att undvika luftbubblor på glasen och det är viktigt att tiderna hålls vid hybridiseringen och tvätten. Allt detta är viktigt för att analysresultaten ska bli pålitliga. En jämförelse av den diagnostiska sensitiviteten och specificiteten för serologiska tester (antikroppar mot DGP, anti-ttg och EMA), jämfört med genotypning av HLA-DQ, har gjorts [14]. De patienter som studerats är under utredning för celiaki och har genomgått en biopsiundersökning som visade histologiska förändringar som förbättrats efter att kosten ändrats till en glutenfri diet. Mätning av anti-ttg och EMA, var och en för sig eller tillsammans, har högst sensitivitet (81 %) av antikroppstesterna men det är ingen större skillnad i specificiteten, som är hög (>96 %) för alla antikroppstester som jämfördes. Med HLA-DQ-genotypning är alla som har celiaki positiva för någon av generna (100 % sensitivitet) medan de som inte har generna är friska (100 % negativt prediktivt värde). Specificiteten för genotypningen är endast 57 % [14], men detta stämmer väl överrens med det som tidigare har konstaterats, att HLA- DQ2 och/eller HLA-DQ8 är nödvändigt för utvecklingen av celiaki och att frånvaro av generna utesluter sjukdomen, samtidigt som ett positivt resultat inte är tillräckligt för att ställa diagnos [1]. En kombination av antikroppstester och genotypning ger samma resultat som om testerna skulle användas var och en för sig [14]. Hos en patient, med symtom som överrensstämmer med celiaki, ska en diagnos kunna ställas utan att en biopsi-undersökning är nödvändig genom att undersöka förekomsten av generna för HLA-DQ2 och HLA-DQ8. Genotypning för HLA-DQ2 och HLA-DQ8 har två viktiga funktioner i utredningen av celiaki. Framförallt är det ett enkelt sätt att utesluta celiaki om generna inte finns. Men det är också ett bra sätt att bekräfta diagnosen, hos patienter som har symtom som överrensstämmer med celiaki och ett positivt anti-ttg, eftersom man vill undvika obehagliga biopsiundersökningar. Microarray-metoden som ska införas på laboratoriet har testats med avseende på riktighet och repeterbarhet och är utifrån dessa tester tillförlitlig för att användas för ovan nämnda syfte. 14

REFERENSER [1] Husby S, et al. European society for pediatric gastroenterology, hepatology, and nutrition guidelines for the diagnosis of coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2012;54:136-60 [2] Monsuur AJ, Wijmenga C. Understanding the molecular basis of celiac disease: What genetic studies reveal. Ann Med 2006;38:578-91 [3] Goldacre MJ, et al. Cancer in patients with ulcerative colitis, Crohn s disease and coeliac disease: record linkage study. Eur J Gastroenterol Hepatol 2008;20:297-304 [4] Askling J, et al. Cancer incidence in a population-based cohort of individuals hospitalized with celiac disease or dermatitis herpetiformis. Gastroenterology 2002;123:1428-35 [5] Ploski R, Ascher H, Sollid LM. HLA genotypes and the increased incidence of celiac disease in Sweden. Scand J Gastroenterol 1996;31:1092-7 [6] Carlsson AK, et al. Serological screening for celiac disease in healthy 2.5-year-old children in Sweden. Pediatrics 2001;107:42-5 [7] Ivarsson A, et al. High prevalence of undiagnosed celiac disease in adults: a Swedish population-based study. J Intern Med 1999;245:63-8 [8] Tjon JM, van Bergen J, Koning F. Celiac disease: how complicated can it get? Immunogenetics 2010;62:641-51 [9] Vader W, et al. The HLA-DQ2 gene dose effect in celiac disease is directly related to the magnitude and breadth of gluten-specific T cell responses. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:12390-5 [10] Olsson C, et al. Regional variation in celiac disease risk within Sweden revealed by the nationwide prospective incidence register. Acta Paediatr 2009;98:337-42 15

[11] Margaritte-Jeannin P, et al. HLA-DQ relative risks for coeliac disease in European populations: a study of the European genetics cluster on coeliac disease. Tissue Antigens 2004;63:562-7 [12] Lock RJ, et al. Is immunoglobulin A anti-tissue transglutaminase antibody a reliable serological marker of celiac disease? Eur J Gastroenterol Hepatol 2004;16:467-70 [13] Profaizer T, Eckels D, Delgado JC. Celiac disease and HLA typing using real-time PCR with melting curve analysis. Tissue Antigens 2011;78:31-7 [14] Hadithi M, et al. Accuracy of serologic tests and HLA-DQ typing for diagnosing celiac disease. Ann Intern Med 2007;147:294-302 ACKNOWLEDGEMENT Först skulle jag vilja tacka Karin Delborn-Höök för att jag fick möjlighet att göra mitt examensarbete på Klinisk Mikrobiologi vid Västmanlands sjukhus Västerås. Tack till Mandana Shikhagaie Vuic och Kerstin Nützman för introduktion i det laborativa arbetet, och till Per Bjellerup för intressanta diskussioner och värdefulla synpunkter på min rapport. Alla har varit ett stort stöd under arbetets gång. Jag vill också tacka min familj som har varit ett enormt stöd under hela studietiden! 16