Legionella i bioreningsanläggningar Kartläggning och riskbedömning

Transkript

1 O K T O B E R SMITTSKYDDSINSTITUTETS RAPPORTSERIE NR 3: Legionella i bioreningsanläggningar Kartläggning och riskbedömning AV GÖREL ALLESTAM OCH JONAS LÅNGMARK AVDELNING FÖR PARASITOLOGI, MYKOLOGI OCH VATTEN OCH MILJÖ SMITTSKYDDSINSTITUTET 1

2 Smittskyddsinstitutet är en statlig expertmyndighet som har till uppgift att bevaka det epidemiologiska läget i fråga om smittsamma sjukdomar bland människor och främja skyddet mot sådana sjukdomar. Rapportserien syftar till att sprida information av myndighetens arbets- och forskningsfält. I varje rapport belyses centrala och aktuella frågeställningar inom smittskyddsarbetet. Innehållet i de vetenskapliga rapporter som publiceras ansvarar den enskilde författaren för och ska inte tolkas som ett uttryck för SMI:s allmänna uppfattning. Rapporterna distribueras via Smittskyddsinstitutets webbplats och trycks endast i undantagsfall. Författare: Görel Allestam och Jonas Långmark Smittskyddsinstitutet Avd för Parasitologi, Mykologi och Vatten och Miljö Solna Smittskyddsinstitutet Besöksadress: Nobels väg 18 ISSN-nummer Telefon: SMI-rapport Nr 3:2007 Fax: E-post: smi@smi.ki.se 3:2007T 2

3 Sammanfattning I november 2004 insjuknade en man som arbetade på ett massa- och pappersbruk i norra Sverige i legionärssjuka. Vid smittspårning fann man höga halter av legionellabakterier i en av luftningsbassängerna i bioreningsanläggningen. Tidigare var det inte känt att legionellabakterier kan förekomma och tillväxa i bioreningsanläggningar. Efter upptäckten av Legionella i bioreningsanläggningar inom skogsindustrin har lika höga halter även påvisats i bioreningsanläggningar inom andra branscher, exempelvis i den petrokemiska industrin och i sockerindustrin. Smittskyddsinstitutet, SMI, har i samarbete med Skogsindustrierna kartlagt förekomsten av Legionella inom skogsindustrin på de bruk som har en bioreningsanläggning som installerats för reduktion av organiskt material i avloppsvattnet. Kartläggningen har gjorts vid fem tillfällen under 2005 till 2007 för att ge underlag för riskbedömningar. Totalt finns ca 60 massa- och pappersbruk i landet varav ca två tredjedelar med en extern bioreningsanläggning. Samtliga bruk med en bioreningsanläggning, oavsett typ, ingick i studien. Prov har tagits på vattnet direkt efter kyltorn i anslutning till biorening, efter luftningsbassäng och på bioslam. Analys av Legionella har utförts med en modifiering av den internationella standardmetoden ISO Resultaten har bearbetats utifrån halten av Legionella, frekvensanalys och kända riskfaktorer. För frekvensanalys valdes de anläggningar/bruk som har tagit prov vid samtliga fem provtillfällen. Identifierade riskfaktorer i bioreningsanläggningar Höga halter av Legionella i luftningsbassänger, kyltorn eller bioslam Hög frekvens av positiva prover Höga halter av protozoer Förekomst av Legionella pneumophila serogrupp 1 särskilt Pontiacgruppen Associerade sjukdomsfall Aerosolbildning Spridningsvektorer såsom kyltorn, skrubberanläggningar, vind och hög luftfuktighet Luftningsbassänger Legionella påvisades i cirka hälften av luftningsbassängerna vid varje provtillfälle. Detta var ett förväntat resultat eftersom förutsättningarna för 3:2007T 3

4 tillväxt av legionellabakterierna är mycket gynnsamma i anläggningarna. Koncentrationen av Legionella uppmättes till så höga nivåer som CFU/L (2x10 10 ). Inte någon annanstans har liknande värden tidigare uppmätts. Statistisk bearbetning av data visar inte på någon signifikant säsongsmässig skillnad (P > 0,050) med medianvärdet av antalet legionellabakterier på en nivå av 10 7 CFU/L under alla provperioderna. Två grupper av anläggningar identifierades; den ena (12 anläggningar) där Legionella med höga halter konstaterades vid fyra eller fem tillfällen och den andra (19 anläggningar) med låga halter vid ett eller inget tillfälle. Legionella pneumophila serogrupp 1 som oftast förknippas med sjukdomsfall har verifierats i relativt få luftningsbassänger (11 st), vilket är i överensstämmelse med fynd i andra miljöprover. De tio anläggningarna som varit negativa för Legionella i luftningsbassängerna under hela studieperioden kan möjligen ha gemensamma egenskaper och rekommenderas att studera närmare. Kyltorn vid bioreningsanläggningar Legionella har påvisats vid minst ett tillfälle på 8 av 12 kyltorn vid 10 bruk. Ett kyltorn var positivt vid samtliga provtillfällen. Endast två kyltorn var negativa under hela studieperioden. Slam Legionella i slam påvisades vid ett provtillfälle på 54 % av undersökta bruk. L. pneumophila sg 1 verifierades i slamprov från tre bruk. Inverkan av protozoer Förekomst av amöbor är en klar förutsättning för att legionellabakterier skall kunna etablera sig, överleva och tillväxa i både naturliga som i artificiella miljöer. Höga antal protozoer följdes oftast av höga halter av legionellabakterier. Samband mellan Legionella och amöbor har studerats i 12 anläggningar med höga halter legionellabakterier och 12 legionellafria anläggningar. En signifikant skillnad har observerats mellan dessa två grupper av anläggningar med genomgående upp till 100 ggr högre amöbahalter i de legionellarika anläggningarna. Sjukdomsfall Det har inte rapporterats om något sjukdomsfall där en bioreningsanläggning är bekräftad och fastställd som smittkälla. Både i samband med utredning av utbrott i Norge 2005 och i Frankrike 2004 har man konstaterat höga halter av Legionella i bioreningsanläggningar. Uppföljningsstudier i Frankrike utpekar luftningsbassängerna som smittkälla. Uppgifter finns om att enskilda sjukdomsfall har verifierats i 3:2007T 4

5 Finland. Nya uppgifter som inte var kända vid utredningen av det tidigare omnämnda legionellafallet i norra Sverige gör det troligt att mannen smittades vid bioreningen. Två studier berättar om arbetsrelaterade legionellainfektioner som gett den mildare sjukdomsbilden, kallad pontiacfeber, efter att de rengjort olika behållare vid bioreningsanläggningar. Detta visar att Legionella även förekommer inom andra industrier men framför allt att sjukdomsfall inträffat som kan sättas i samband med Legionella i bioreningsanläggningar. Risken för enskilda sjukdomsfall och utbrott kan alltså inte negligeras. Det är möjligt att aggressiva Legionellabakterier blommar i bassängerna. Förutsättningar för att detta ska ske finns i flera av anläggningarna och kan främst för de tolv som oftast varit positiva och samtidigt uppvisat höga halter av Legionella. Riskbedömning Infektionsdosen är inte känd. Därför är det inte möjligt att ange ett vetenskapligt baserat hälsomässigt säkert gränsvärde. Det är inte heller möjligt att upprätthålla ett gränsvärde som skulle baseras på koncentration av legionellabakterier i miljöprov. I rapporten diskuteras tre aktionsvärden och utifrån dem har en riskbedömning utförts. Riskbedömningen är preliminär och kvalitativ. Vid bedömningen av riskerna med legionellabakterier i luftningsbassängerna har vi också jämfört med risk för att bli smittad av duschvattnet. Utbrott där fler smittats samtidigt sker främst från industriella anläggningar såsom kyltorn, medan totalt fler fall smittas vid duschning i bostaden eller på resa. Vid luftprovtagningar i Frankrike och Norge har Legionella påvisats på upp till 300 m avstånd från luftningsbassängerna. Omfattning och spridning av aerosoler från luftningsbassängerna under olika vind- och luftfuktighetsförhållanden liksom anläggningarnas tekniska utformning är av betydelse för riskbedömning och utarbetande av en praktisk riskhanteringsplan. Mot bakgrunden av fynden från de senaste nordiska undersökningarna indikerar resultaten från denna studie att de luftningsbassänger som innehåller höga koncentrationer av legionellabakterier är en potentiell källa för spridning. I första hand är detta relaterat till arbetsmiljön och i andra hand till den yttre miljön. Inget säkerhetsavstånd har dock kunnat bestämmas. Risken med bioslam bör uppmärksammas både internt på bruken och vid extern hantering. Resultaten av studien indikerar att slammet kan innebära en risk för smittspridning eftersom Legionella har påvisats i mer än hälften 3:2007T 5

6 av slamproverna. Legionella har visat sig överleva de komposteringsprocesser som används vid tillverkning av jord där slammet kan ingå som en del. I avsaknad av en specifik infektionsdos avseende legionellabakterier, exakta data om aerosolbildningen och spridningen, förefaller utarbetning av en riskhanteringsplan inklusive regelbundna kontroller ytterst viktig att utföra. Dessa åtgärder, tillsammans med de skyddsåtgärder som branschen tidigare rekommenderat (se PUA meddelande nr 6, 2005) är egentligen de enda som rimligen kan göras. 3:2007T 6

7 Innehåll Sammanfattning 3 Förord 8 1 Bakgrund 9 2 SYFTE 10 3 LEGIONELLA Sjukdomsbild Epidemiologi Legionellautbrott Enskilda sjukdomsfall associerade till bioreningsanläggningar Legionellautbrott associerade till bioreningsanläggningar Resultat av övriga studier i Norden 15 4 MATERIAL OCH METODER Bioreningsanläggningar Uppläggning av studie Provpunkter Insamling av tekniska faktorer Analysmetoder 18 5 RESULTAT AV KARTLÄGGNING Inledande undersökning 2004 och våren Frekvensanalys av Legionella i luftningssteg Luftningssteg i bioreningen Kyltorn Slam 30 6 ANALYS AV SAMBAND MELLAN PROTOZOER OCH LEGIONELLA Analys av protozoer Analysmetod Resultat aug 2006 mars DISKUSSION Samband mellan protozoer och Legionella Förekomst av legionellabakterier i höga halter Förslag på aktionsvärden för Legionella i luftningsbassänger Serotyper och subtyper Spridningsvektorer 41 8 PRINCIPER OCH VERKTYG FÖR RISKBEDÖMNING OCH RISKHANTERING WHO boken, Legionella and the Prevention of Legionellosis (2007) McCoy (2005) Preventing legionellosis AFS 2005: PRELIMINÄR RISKBEDÖMNING REKOMMENDATIONER SLUTSATSER BILAGA 1. Resultattabeller BILAGA 2. Kompletterande litteraturstudie REFERENSER 79 3:2007T 7

8 Förord Denna kartläggning av Legionella i bioreningsanläggningar har utförts på Smittskyddsinstitutet på uppdrag och i samarbete med Skogsindustrierna i Sverige mellan 2005 till Representanter från de största skogsindustriföretagen har fungerat som referensgrupp. Arbetsmiljöverket, Naturvårdsverket och Socialstyrelsen har hållits underrättade om kartläggningens resultat. Solna, oktober 2007 Görel Allestam Jonas Långmark Till Tage Danielsson Om Sannolikhet :2007T 8

9 1 Bakgrund I november 2004 insjuknade en man som arbetade på ett pappersbruk i norra Sverige i legionärssjuka [7, 9]. Vid smittspårning fann man höga halter av legionellabakterier i en av luftningsbassängerna i bioreningsanläggningen. Även om sambandet inte var klarlagt vid tiden för utredningen så var detta upprinnelsen till en omfattande provtagning och att många frågor ställdes om hur man skulle bedöma riskerna. Centrala och regionala myndigheter informerades om upptäckten på ett samrådsmöte på SMI våren 2005 och i en artikel i Tillsynsnytt [5, 137]. Personal och anläggningskonsulter fick kännedom om förekomsten bland annat via PUAmeddelanden och olika utbildningsinsatser för driftspersonal. Media bevakade frågan intensivt med flera artiklar i dagspressen och facktidskrifter. Smittskyddsinstitutet, SMI, har initierat och fått ett uppdrag av Skogsindustrierna att kartlägga förekomsten av Legionella inom skogsindustrin på de bruk som har en bioreningsanläggning. Under våren 2005 togs prover på flera bruk men utan systematik och därmed inga utvärderingsbara resultat. Under våren 2005 bildades en arbetsgrupp inom skogsindustrin som bedömde att en metodisk undersökning behövde göras. Den första provserien togs i september 2005 och resultaten uppmärksammades på en internationell legionellakonferens i Chicago [6]. Resultaten användes också i en statistisk analys av utvalda tekniska faktorer som värderades i förhållande till legionellaförekomsten i bioreningsanläggningarna [84]. Preliminära slutsatser i den tekniska rapporten ledde i sin tur till en fortsatt kartläggning mellan maj 2006 och mars 2007 med vattenprovtagning och insamling av tekniska data. Någon källa till Legionella har inte hittats i inkommande vatten eller beredningsprocessen i bruk i de enstaka prov som tagits på olika ställen. Någon systematisk undersökning har inte gjorts men Legionella har påvisats i bakvattnet från pappersmaskinerna vid några tillfällen i nivåer på cirka CFU/L. Förekomst och tillväxt av Legionella i luftningssteget i industriella avloppsanläggningar med biorening har inte varit allmänt känt före Endast i en kyltornsbassäng vid en tidigare utredning av ett legionellautbrott har så höga legionellakoncentrationer som i luftningsbassängerna konstaterats. Efter upptäckten av Legionella i bioreningsanläggningar inom skogsindustrin har lika höga halter även påvisats i bioreningsanläggningar inom andra branscher, exempelvis den petrokemiska industrin och inom sockerindustrin. Olika förslag till lösningar och åtgärder har lagts fram vid flera tillfällen: Kan man använda några tillsatsmedel eller förändra kemin i vattnet för att minimera legionellatillväxten? Kan man förändra mikrobiologin i luftningssteget? Går det att täcka över luftningsbassängerna till en rimlig kostnad? 3:2007T 9

10 2 SYFTE Denna kartläggning har gjorts för att undersöka omfattningen av Legionella i bioreningsanläggningar och ge underlag för en riskbedömning. Syftet med analyser av protozoer (amöbor) i denna studie var att undersöka betydelsen av sambandet mellan antalet legionellabakterier och protozoer främst i olika reningssteg i de moderna anläggningarna. 3 LEGIONELLA Fakta om legionellabakterien återfinns i Bilaga 2 Kompletterande litteraturstudie. 3.1 Sjukdomsbild Legionella orsakar framför allt lunginflammation, legionärssjuka, men andra organsystem kan också påverkas. Inkubationstiden är mellan 2-10 dagar, men längre tider har rapporterats. Insjuknandet är akut med hög feber, ofta tillsammans med magsymtom och förvirring. Efter ett par dagar ses omfattande förändringar på lungröntgenbilden och patientens tillstånd kan förvärras trots korrekt behandling. Mottagligheten för att insjukna ökar för dem som har ett försvagat immunförsvar, ofta i kombination med underliggande sjukdomar. Äldre män, rökare, och de som har hög alkoholkonsumtion är andra riskgrupper, medan barn sällan drabbas antal personer män kvinnor < >90 åldersgrupper Åldersfördelning. Rapporterade legionellafall i Sverige mellan Det är en hög dödlighet i legionellainfektion, 6 till 21 procent av patienterna avlider i sin legionellainfektion och många patienter har en lång och besvärlig konvalescens. Kliniskt kan man inte säkert skilja legionärssjuka från lunginflammation som har orsakats av andra bakterier utan det krävs 3:2007T 10

11 laboratorieanalys för att ställa en säker diagnos. Man måste också, när prov skickas till laboratoriet, specifikt fråga efter legionellaanalys. Legionella kan också orsaka pontiacfeber som är en lindrigare, självläkande sjukdom, där symptomen påminner om influensa. Inkubationstiden för pontiacfeber är från några timmar till 2 dygn. På röntgen syns inga lungförändringar. Tillfrisknandet sker spontant inom 2 till 5 dygn. De personer som insjuknar i pontiacfeber är oftast personer utan bakomliggande sjukdomar. Serologisk analys är ofta den enda laboratorietest som ger utslag vid pontiacfeber. (Utdrag ur rapporten Legionella i vatteninstallationer 2006) [8]. 3.2 Epidemiologi Från 35 länder i Europa förväntas cirka 6000 legionellafall komma att rapporteras under de senaste 10 åren enligt färska uppgifter från European Working Group for Legionella Infections, EWGLI [71]. Under samma period har totalt 959 svenska legionellafall rapporterats till SMIs epidemiologiska avdelning, av vilka hälften har smittats i Sverige. Mörkertalet anses vara stort, det egentliga antalet insjuknade är upp till 10 gånger det rapporterade. 3.3 Legionellautbrott Sveriges hittills största legionellautbrott skedde i Västerås 1979 med 68 legionellafall. Smittan spreds via friskluftintaget som var placerat endast några meter från ett kyltorn på taket av ett varuhus. Många passerade luftventilerna utan att ha den minsta misstanke om att luften var smittad av legionellabakterier. Det andra kyltornsrelaterade utbrottet i Sverige inträffade i Lidköping Det var mycket hög luftfuktighet och en kraftig pålandsvind från Vänern under utbrottet som skedde under några sensommardagar när 32 personer insjuknade i legionärssjuka [10]. Efter utbrottet i Lidköping har många industrier infört behandling av olika processoch kyltornsvatten och startat kontrollprogram för Legionella. Världens största legionellautbrott inträffade i Murcia, Spanien 2001 då över 700 personer smittades från kyltorn Enskilda sjukdomsfall associerade till bioreningsanläggningar Hittills har man inte rapporterat om något sjukdomsfall där en bioreningsanläggning är bekräftad och fastställd som smittkälla. Det finns dock två fall i Finland som är arbetsrelaterade. Båda männen som insjuknade höll på med ett underhållsarbete. 3:2007T 11

12 Den första fick kvarstående vatten från luftningsbassängen över sig när han bytte slangar på en av pumparna. Den andra utförde ett arbete på ett avstånd av ca 150 m och inandades aerosoler från luftningsbassängen. Smittkällan är bekräftad för båda fallen [77]. I Sverige, vid utredningen av legionellafallet i norra Sverige 2004, påvisades Legionella i duschvattnet på arbetsplatsen men inte i hemmet och i bioreningsanläggningen. Senare gjordes en vidaretypning av legionellaisolat från patienten och miljön för att klarlägga det epidemiologiska sambandet. Isolat från patienten och luftningsbassängen har typats till Legionella pneumophila serogrupp 1, subgrupp Benidorm som ingår i Pontiacgruppen. Genotypning visade identitet mellan ett isolat från bassängen och från patienten. Ingen likhet fanns mellan dessa isolat och de legionellabakterier som isolerades från personalduschen på arbetsplatsen (L. pn. sg 4). En reservation till resultatet gavs i en kommentar från laboratoriet som utfört typningarna, om att en viss legionellastam kan vara spridd i ett vattensystem eller i ett större geografiskt område och att man därför bör väga in kliniska och epidemiologiska förhållanden vid bedömning av misstänkta smittkällor. Detta var en av orsakerna till att man inte kunde fastställa smittkällan med säkerhet. För att ytterligare undersöka sambandet har SMI gjort en jämförelse av bandmönstret från samtliga genotypningar av isolat från fallet som typats till L. pneumophila sg 1, subgrupp Benidorm. Det visade sig att bandmönstret av legionellabakterierna från luftningssteget och från legionellafallet i norra Sverige 2004 inte liknar något annat legionellaisolat som dittills hade isolerats från andra platser, vilket indikerar att smittan inte skedde någon annanstans (se dendogram nedan, rad 12-13). 3:2007T 12

13 Dendrogram. Genotypning av Legionella pneumophila sg 1, subtyp Benidorm. Samtliga isolat av denna subtyp som typats på Akademiska sjukhuset, Uppsala. Banden representerar olika DNA-fraktioner vilka är ett exakt verktyg för urskiljning av olika genotyper av en bakteriell art och används för att fastställa epidemiologiska samband. 1-4 Isolat frånduschvatten vid smittspårning från 4 olika städer - Singlar 5 Isolat från luftningsbassäng på pappersbruket i norra Sverige Singel 6-10 Isolat från patient och miljö vid legionellautbrottet i Lidköping Identitet 11 Isolat från miljöprov vid legionellautbrottet i Lidköping - Singel Isolat från patient och luftningsbassäng i pappersbruket i norra Sverige 2004 Identitet 14 Isolat från luftningsbassäng i pappersbruket i norra Sverige 2004 Singel Vår bedömning är att mannen på pappersbruket i norra Sverige hade smittats av aerosolerna från luftningsbassängen. Uppgiften om att mannen endast befunnit sig på 100 meters avstånd och därmed troligen inte kunde vara smittad från bioreningen bedömer vi, med dagens kunskap, inte vara hållbar. I luftprovtagningarna i Frankrike, Finland och Norge har man detekterat Legionella på ett avstånd av ca 200 m från bioreningen [25, 79, 90]. Detta styrker vår bedömning (se nedan 3.5). 3:2007T 13

14 3.5 Legionellautbrott associerade till bioreningsanläggningar Norge 2005 I maj 2005 insjuknade 55 personer i legionärssjuka med 10 dödsfall. De smittade bodde i Sarpsborg och Fredrikstad. Medelåldern var 69 år vilket var högre i detta utbrott jämfört med andra. Flera av de insjuknade bodde mer än 15 km från den misstänkta skrubberanläggningen vid Borregaard. L. pneumophila sg 1 isolerades från åtta patienter, ett kyltorn, skrubber B1, och älven Glomma 300 m nedströms. Alla isolat från patienterna var identiska vid genotypning med isolaten från skrubber och älven, medan isolatet från kyltorn var helt skilt från de övriga [101, 102]. I november samma år insjuknade ytterligare tre personer varav två var bosatta i Sarpsborg och en i Fredriksstad. Den senare hade varit i Sarpsborgområdet under inkubationstiden. Hos alla tre kunde samma variant av L. pneumophila sg 1 som var aktuell i maj 2005 påvisas - den s.k utbrottsstammen. Samtidigt togs prov på skrubber, som var negativ och bioreningsanläggningen som visade på höga halter av utbrottsstammen i luftningsbassängerna. Det ansågs dock att smittomöjligheten från bioreningsanläggningen var relativt liten. Ytterligare legionellafall har hittats retroaktivt och i augusti 2005 bland bosatta i området under en intensivare övervakning av legionellafall men utan att kunna binda dem till samma smittkälla [12]. Frankrike 2004 Under 3 månader, från november 2003 till februari 2004 insjuknade 86 personer, med 18 dödsfall, som kunde spåras till samma smittkälla - en petrokemisk industri, som numera är nerlagd, i Lens, Pas-de-Calais. Här gjordes en omfattande provtagning från miljön och ett kyltorn fastställdes som smittkälla. L. pneumophila sg 1 isolerades från patienter och olika källor i miljön som kyltorn och luftningsbassänger på industrins reningsanläggning. Genotypning av L. pneumophila sg 1 visade på identitet från dessa ställen. Kyltornet stängdes och sanerades. Under tiden kyltornet var avstängt inträffade nya sjukdomsfall [100]. Innan utbrottet fick bioreningsanläggningen leverans av mycket slam från en kommunal reningsanläggning och en av chaufförerna insjuknade. En luftprovtagning gjordes under januari till mars 2004 från fem kyltorn och en luftningsbassäng från ovannämnda industri. Från luftningsbassängerna gjordes en provtagning med luftarna igång och en när luftarna stod still. Inga odlingsbara legionellabakterier påvisades i prov från kyltorn, men vid mikroskopering var alla utom ett positivt. Författarna redovisar dock ett anmärkningsvärt ( remarkabel ) resultat. Odlingsbara legionellabakterier påvisades i samma halter som med mikroskopering i prov direkt från luftningsbassängen och 270 m nedanför i vindriktningen. Detta under förutsättning att luftningen var påkopplad, utan luftning var prov bara positivt direkt ovanför luftningsbassängen. Författarna konkluderar vidare att de genom luftprovtagningen har kunnat säkerställa luftningsbassängen som smittkälla för utbrottet [90]. 3:2007T 14

15 3.6 Resultat av övriga studier i Norden Legionellaförekomst, luftprovtagning och seroprevalens i Norge En uppföljning har gjorts av utbrottet i Sarpsborg/Fredriksstad i Norge 2005 då legionellabakterier spreds via en luftskrubberanläggning vid en cellulosaförädlingsindustri i Sarpsborg och 55 personer insjuknade. Luftskrubberanläggningen var placerad nära bioreningsanläggningar och man ville undersöka hur långt legionellabakterierna kunde spridas från luftningsbassängerna. Under september till december 2006 utfördes luftprovtagningar under bestämda väder- och vindförhållanden vid fabriken. Resultaten visar att legionellabakterierna kan spridas i begränsad omfattning upp till 200 meter från bassängerna. Utbrottsstammen har inte påvisats i luftproverna men många andra legionellavarianter har konstaterats. Luftprovtagningen utfördes först med två olika utrustningar för ansamling i vätska, SKC Biosampler och SASS 2000 PLUS. Utbytet var 26 gånger större med SASS 2000 PLUS som därför användes i de senare provtagningarna. Parallellt togs prov med MAS-100 och STA-204 för ansamling direkt på agarplattor. Analyserna har utförts med mip realtids-pcr och odling. Verifiering av legionellaisolat har först gjorts med 16S rrnasekvensering och de som identifierades till L. pneumophila serogrupperades med latexagglutinationstest (dryspot, Oxoid). Odlingsbara legionellabakterier påvisades i de högsta halterna direkt ovanför bassängerna (max 3300 CFU/m 3 ) och i minskande halter upp till ett avstånd på 180 m. PCR-positiva prover överensstämde inte helt med de odlingsbara, vilket är känt från andra studier, men kunde påvisas upp till 160 m från bassängerna i en höjd av 64 m.ö.h. Slutsatser i rapporten: L. pneumophila sg 1 påvisades inte i luften vid Borregaard. Samma genetiska klon av L. pneumophila är identifierad bland L. pn. isolaten från luft Legionella spp är påvisat upp till 200 m från luftningsbassängerna [25]. En detaljerad bakgrundsbeskrivning om modell för luftspridning och utrustning återfinns i en separat rapport [26]. En annan uppföljningsstudie av totalt 1017 blodprov har gjorts under 2006 med en epidemiologisk kontroll av antikroppshalten (seroprevalens) hos anställda på Borregaard (213), blodgivare i Sarpsborg (150) och Fredriksstad (248) och en kontrollgrupp av blodgivare i Oslo (406). Preliminära resultat visar att åtta personer (2 %) i respektive kontrollgrupp hade positiva antikroppshalter medan nio anställda (4,2 %) var positiva. De positiva i kontrollgruppen från Sarpsborg/Fredriksstad bodde nära Borregaard och de positiva bland de anställda (förutom en) arbetade inom en omkrets av 250 m från skrubber och luftningsbassänger. Detta visar att de 3:2007T 15

16 anställda och boende närmast Borregaard blivit exponerade men inte insjuknat för legionellabakterier från fabriken [146]. Legionellaförekomst, luftprovtagning och seroprevalens i Finland I Finland har man studerat bioreningsanläggningar vid 15 pappersbruk och tre kommunala reningsverk. Odlingsbara legionellabakterier har påvisats i 11 pappersbruk men inte i de undersökta kommunala anläggningarna. Samma höga nivåer som uppmätts i de svenska anläggningarna har även påvisats här 1,9 x 10 9 CFU/L [18]. Preliminära resultat av en undersökning av antikroppshalten visade att 35 av 257 (13,6%) anställda på pappersbruk hade signifikant förhöjda antikroppsnivåer mot L. pneumophila eller L. species, men inga i kontrollgruppen som bestod av 35 kontorsanställda på bruken. Luftprovtagning 1 och 10 m nedanför bassängerna var positiv få gånger med odling. Längre bort kunde legionellabakterier konstateras med mikroskopering. Andningsskydd har nu införts på bruken. Fall av legionärssjuka har uppkommit bland anställda som arbetade nära anläggningarna. Påverkan på allmänhet utanför bör studeras. En luftprovtagning har utförts med en personlig utrustning (Button, CIP 10M) och av större volymer med provtagning i vätska (Anderson, BioSampler). Odlingsbara legionellabakterier påvisades nära bassängen på 1 och 10 m avstånd men med mikroskopering kunde Legionella påvisas upp till 200 m från bassängerna [79]. Legionellaförekomst i övrig industri I ett företag inom sockerindustrin har Legionella påvisats regelbundet i 60 % av deras bioreningsanläggningar vid provtagningar under 2 års tid. Halterna motsvarar de som uppmätts i skogsindustrins anläggningar [23]. Även i bioreningsanläggningar inom svensk petrokemisk industri har Legionella påvisats i höga halter, (Smittskyddsinstitutets provunderlag), [100]. 4 MATERIAL OCH METODER 4.1 Bioreningsanläggningar Den biologiska reningsprocessen på det industriella avloppsvattnet har införts för att bryta ner organiskt material mätt som BOD 7 och COD som är ett mått på biologisk respektive kemisk syreförbrukning. Mikroorganismer utnyttjar näringen i vattnet för sin tillväxt. Cellerna och grövre partiklar avskiljs som slam genom sedimentering. De mest effektiva nedbrytningsprocesserna är syrekrävande och syre sätts till genom luftning, dvs. aerob rening. Anaerob rening förekommer också men är inte lika effektiv. COD-halten på skogsindustrins avloppsvatten är avsevärt högre än på kommunalt avloppsvatten. 3:2007T 16

17 4.2 Uppläggning av studie Totalt finns ca 60 massa- och pappersbruk i landet varav ca två tredjedelar med en extern bioreningsanläggning. Samtliga bruk med en bioreningsanläggning, oavsett typ, ingick i studien. Två har en gemensam rening med ett närliggande bruk och ett bruk deltog bara vid sista provtillfället med sin nyanlagda anläggning. Två bruk föll bort, ett på grund av nerläggning och det andra för att de bara hade en pilotanläggning igång. Ett bruk från Norge valde att delta från maj Några bruk har två linjer som båda redovisas separat i rapporten. Därför är antalet undersökta bioreningsanläggningar fler än antalet bruk. 4.3 Provpunkter För analys av Legionella valdes provpunkterna efter kyltorn, efter luftningssteg och på bioslammet som presumtiva kritiska punkter i september Ett prov på 500 ml togs vid 4 tillfällen under en förmiddag i en steril flaska. Ur dessa fyra prov gjordes sedan ett samlingsprov (4x 100 ml) på SMI för analys. Avvattnat slam togs i en ren plastburk samtidigt med vattenproven. Vid den uppföljande provtagningen under maj 2006 till mars 2007 togs endast prov efter kyltorn och efter luftningssteget. För analys av protozoer och Legionella togs prov på fem utvalda bruk med moderna anläggningar. Som extra provpunkter valdes de olika stegen i den luftade delen av anläggningen, vilka kunde variera från bruk till bruk. 4.4 Insamling av tekniska faktorer Data om tekniska faktorer samlades in vid de fem provtillfällena enligt en utarbetad checklista. Dessa data har bearbetats av Skogsindustrierna. 3:2007T 17

18 4.5 Analysmetoder Legionella Legionella tillhör familjen Legionellaceae och är Gram-negativa, aeroba, icke sporbildande bakterier som kräver L-cystein-HCl och järnsalter för tillväxt. Kvantitativ analys sker vanligen med membranfiltrering enligt standardmetod ISO på duschvatten och andra typer av vattenprov där partikelhalten är låg (ISO ) [1]. Provet syrabehandlas under 5 minuter i en buffert med ph 2,2 för att minska överväxt eller inhibition av naturligt förekommande bakterier på växt av Legionella. Både bakterier och mögelsvampar kan störa legionellatillväxten. På prov med högt partikulärt material eller med förväntat höga bakteriehalter gjordes en kombinerad förbehandling med inaktivering i värme följt av syrabehandling (ISO 11731) [2]. Ytspridning har sedan skett på en selektiv legionellaagar GVPC agar (BCYE agar med tillsats av antibiotika supplement GVPC, biomérieux) från en serie med 10-faldiga spädningar. Preliminär avläsning gjordes efter 3-5 dygn med en slutlig avläsning efter 7-10 dygns inkubering vid 36 ± 1 C. Verifering av misstänkt Legionella gjordes enligt standardmetoden med kontroll av växt på cysteinfritt agarmedium. Minimikritererier för Legionella species (L. spp) enligt metoden var signifikant koloniutseende på selektiv legionellaagar och avsaknad av växt på cysteinfri agar. Serotypning Vidare gjordes en serologisk gruppering till L. pneumophila sg 1, L. pneumophila sg 2-14 och L. species med DRYSpot (Oxoid). Vid immunisering med hela bakterier reagerar människor och djur med att bilda antikroppar mot ytstrukturer (epitoper) som varierar mellan olika arter och undergrupper. En klassificering kan sedan ske i olika serogrupper. I gruppen L. species ingår de vanligast förekommande legionellaarterna förutom L pneumophila som har setts i samband med sjukdom (L. longbeachae 1 och 2, L. bozemanii 1 och 2, L. jordanis, L. micdadei och L. anisa). Vissa arter, som L. bozemanii, L. anisa L. dumoffi, L. gormanii, har även förmåga att ge en blåvit autofluorescens vid belysning med UVlampa som är ytterligare ett kriterium som kan användas vid detektion och verifiering. Subtypning enligt Dresdenpanelen För att visa på en sjukdomsframkallande förmåga hos legionellabakterien har en subtypning utförts på de isolat som typats till L. pneumophila sg 1 i prov från luftningsbassänger och slam. Subtypningen har gjorts enligt Dresdenpanelen för att detektera en markör som [61] kallas MAb 3/1 och som visar på en sjukdomsframkallande förmåga hos legionellabakterien [62]. De fyra undergrupperna Knoxville, Philadelphia, Benidorm och Allentown/France är positiva för Mab3/1 som benämns Pontiacgruppen. Pontiacgruppen har förekommit i samband med de flesta större utbrott [81]. Ett externt laboratorium har anlitats för denna analys. 3:2007T 18

19 Figur 1. Flödesschema för monoklonal subtypning av of Legionella pneumophila sg 1 enligt Dresden Panelen (Helbig et.al 2002) Kvalitetssäkring av analysmetoder SMI är ackrediterad för legionellaanalyser med SWEDAC nr Inom vår verksamhet har vi deltagit i ett externt kvalitetsprogram som organiserats av Health Protection Agency sedan I England har de krav på deltagande för de laboratorier som analyserar Legionella i vatten. Flera åtgärder är vidtagna för att säkerställa våra resultat. Värmebehandling i kombination med syrabehandling har utförts på samtliga prov från luftningssteg och slam. Under studiens gång visade det sig att prov från kyltorn liknade de övriga i bakteriesammansättning och karaktär. Omsättning med kombinerad värme och syrabehandling av alla kyltornsprov har därför gjorts under det första provtillfället i september Då påvisades Legionella i ytterligare två kyltornsprov. I prov från bioreningsanläggningar har det alltså visat sig vara helt nödvändigt med en kraftfull förbehandling av provet för att minimera utväxt av övriga mikroorganismer som avsevärt försvårar analysen. Trots det kan detektionsgränsen variera från det ena tillfället till det andra på samma provpunkt. Utan störande bakgrundsväxt var detektionsgränsen CFU/L men kunde försämras 100 gånger mer för vissa prov. I resultattabellerna anges mindre än detektionsgränsen, exempelvis < när Legionella inte kunde påvisas. Reproducerbarhet Test för spridningen utfördes i augusti Slumpmässigt utvalda prov som representerade vattenprov från luftningsbassänger och bioslam fördelades i tre underprov. För varje underprov gjordes en spädningsserie. Legionellahalter 3:2007T 19

20 bestämdes efter avräkning av kolonier på två parallella agarplattor (medelvärde) per spädningsserie. Analysen utfördes på sammanlagt 9 st vattenprov (27 underprov) och 7 st slamprov (21 underprov). Spridningen mellan tre spädningsserier (tre underprov) varierade mellan 13 % och 20 % för vattenprov och mellan 23 % och 43 % för slamprov. Noggrannhet Test för noggrannhet utfördes på 11 prov från luftningsbassänger. För varje prov gjordes 3 spädningsserier. Legionellahalter bestämdes efter avräkning av kolonier på två parallella agarplattor (medelvärde) per spädningsserie. Spridningen mellan tre parallella spädningar varierade mellan 6 % och 13 % i 8 prov samt mellan 14 % och 19 % i tre prov. Resultaten jämfördes med de resultat som erhållits enligt ISO metoden och som utsvarades i denna studie. I 3 av 11 prov var legionellahalter lägre (17, 11 och 8 %), i 3 prov var halter av legionellabakterier högre jämfört med ISO metoden (5, 6 och 7 %). I 5 prov av 11 var legionellahalter lika (skillnaden mindre än 5 %). Tvålabsjämförelse Prov har skickats från ett bruk för en två-labsjämförelse mellan SMI och ett annat laboratorium. I nio av nitton prov överensstämde inte resultaten då det visade sig att SMI kunde påvisa Legionella men inte det andra laboratoriet. Förbehandling av prov I arbetsgruppen ställdes frågor om SMI:s metod för bestämning av legionellabakterier i miljöprov kunde leda till en överskattning av antalet legionellabakterier i proven. Speciellt riktades frågor mot förbehandling av proven med uppvärmning och syrabehandling. Man undrade om denna behandling kunde orsaka förstörelse av amöbaceller som då kunde släppa ut legionellabakterier. För att svara på denna fråga har SMI i maj 2006 utfört en kontrollanalys av prov från olika steg i två bruk (ett bruk dittills legionellapositivt samt ett legionellanegativt ). Dessa prov har behandlats på tre olika sett: formalinfixering (standard procedur för analyser med molekylärbiologiska metoder) värmebehandling och formalinfixering värmebehandling, syrabehandling och formalinfixering. Formalinfixering avdödar men förstör inte celler på något sätt. Den används för att behålla cellernas intakta form och t.o.m. frysa formen, utseende och fysiologisk status för senare undersökningar. Antalet legionellabakterier bestämdes innan formalinfixering. Samtliga prov med de olika behandlingarna har analyserats i minst tre paralleller. 3:2007T 20

21 Lägsta antal amöbor (enbart formalinfixering) detekterades i kyltorn från bruk 11 (4500 celler/ml). I övriga reningssteg var antalet amöbor högre. Samma bild kan ses efter de två andra förbehandlingarsmetoderna (Tabell 2). 3:2007T 21

22 Tabell 2. Analys av protozoer med olika förbehandling av proven. Anatal protozoer /ml Värmebehandling Värmebehandling Formalinfixering Formalinfixering Syrabehandling Formalinfixering Kod nr 11 Medel ± 1 SA CV [%] Medel ± 1 SA CV [%] Medel ± 1 SA CV [%] Legionella CFU/L Kyltorn <10 4 Utg.efter klorat Selektor Luftningssteg Kod nr Kyltorn 1 Kyltorn 2 < 150 < 150 <10 5 <10 6 Biofilmsbärare V14 A < 150 <10 6 Slamåterföring V14C < 150 <10 6 Luftad damm V16A < 150 <10 5 Anm. CV (coefficient variation) = Relativ standardavvikelse. [1 SA/medel x 100) I proven från bruk nr 35 kunde varken legionellabakterier eller amöbor detekteras (detektionsgräns 150 objekt/ml). Statistisk analys av resultaten av olika förbehandlingar (Rank Sum test och pair t- test SigmaStat 3.1) visade ingen signifikant skillnad (P > 0,050) avseende antal protozoer. Obehandlade och värmebehandlade prov gav t.o.m. något lägre värden avseende legionellahalter jämfört med fullt förbehandlade prov. Detta kunde dock inte statistiskt säkerhetställas. SMI:s metod för bestämning av legionellabakterier i miljöprov gav inte en överskattning av antalet legionellabakterier i proven eftersom resultaten visar att provbehandlingarna inte förstörde amöbacellerna eller dess delar. 3:2007T 22

23 5 RESULTAT AV KARTLÄGGNING Inledande undersökning 2004 och våren 2005 I samband med smittspårning vid pappersbruket i norra Sverige, december 2004, uppmättes CFU/L i det första provet från luftningssteget. Strax efter togs ett omprov i samma provpunkt (luftning 2) för att verifiera fyndet som då visade på CFU/L. Oregelbundna prov från luftningssteg före studieperioden och mellan provtagningstillfällena redovisas separat (Tabell 2, Bilaga 1). Av 19 provtagningsställen som representerade 13 bruk var två bruk negativa. I de övriga konstaterades Legionella i halter mellan och CFU/L. Dessa spridda provtagningar har inte gett några utvärderingsbara resultat. Men det enskilda bruket som känner till förutsättningarna runt provtagningen kan ha nytta av analysresultaten. I uppläggning av studien avsnitt 4.2 och 4.3 förklaras skillnaden i provtagning under september 2005 och vid uppföljning under maj 2006 till mars Nedan redovisas samtliga resultat gällande kartläggning från september 2005 till mars Resultaten sammanställs efter provpunkterna; luftningssteg i bioreningen, kyltorn och slam och inleds med en analys av hur många tillfällen som Legionella påvisats i luftningssteget. 5.2 Frekvensanalys av Legionella i luftningssteg Sammanställda resultat visas i Tabell 3 (Bilaga 1). För frekvensanalys valdes 41 anläggningar/bruk som har tagit prov vid samtliga fem provtillfällen. Vidare har resultaten grupperats efter antal tillfällen (0-5) där Legionella har förekommit. I åtta anläggningar på sju bruk har Legionella förekommit vid samtliga fem tillfällen (Figur 2A). 3:2007T 23

24 10 11 Sep 2005 (1) Legionella CFU/L [log 10 ] Maj 2006 (2) Aug 2006 (3) Nov 2006 (4) Mar 2007 (5) * * * * * * * * * * * * Kod nr Figur 2A. Bioreningsanläggningar där Legionella har påvisats vid samtliga tillfällen. * L. pneumophila sg 1 I denna grupp har L. pneumophila sg 1 påvisats mest frekvent, sammanlagt i cirka 30 % av samtliga prov. Det är denna grupp som genomgående har de högsta värdena (>10 8 CFU/L). Gemensamt för denna grupp är konstanta höga halter och hög frekvens av L. pneumophila sg 1 vilket alltså indikerar ett system där legionellabakterien har mycket goda tillväxtmöjligheter. Generellt sett finns mindre andel prov med riktigt höga värden i gruppen med frekvensen 4 av 5 positiva anläggningar. I två prov på två bruk återfanns L. pneumophila sg 1 (12,5 %) (Figur 2B) Legionella CFU/L [log 10 ] Sep 2005 (1) Maj 2006 (2) Aug 2006 (3) Nov 2006 (4) Mar 2007 (5) * * Kod nr Figur 2B. Bioreningsanläggningar där Legionella har påvisats vid 4/5 tillfällen. * L. pneumophila sg 1 I de två grupperna med tre respektive två positiva av fem provtagningstillfällen var hög halt och förekomst av L. pneumophila sg 1 mindre uttryckt (Figur 1 och 2, Bilaga 1). 3:2007T 24

25 I gruppen med nio anläggningar där Legionella endast påvisats vid ett tillfälle var halterna jämförelsevis lägre. (Figur 2C) Legionella CFU/L [log 10 ] mar 07 nov 06 aug 06 aug 06 sep 05 nov 06 sep 05 sep 05 aug 06 Kod nr Figur 2C. Bioreningsanläggningar där Legionella har påvisats vid 1/5 tillfällen. Av de anläggningar som ingick i frekvensanalysen har tio varit negativa under hela perioden. För en utvärdering av de tekniska faktorerna rekommenderas att anläggningarna i grupperna med den högsta andelen positiva prov (5/5 och 4/5) jämförs med grupperna med låg andel positiva prov (1/5 och 0/5). Jämförelsen skulle också kunna belysa varför en anläggning alltid har varit positiv medan en annan aldrig har haft Legionella. Med den sammanlagda bedömningen av resultat från kartläggning och värdering av tekniska faktorer kan en mer ingående riskbedömning utifrån typ av anläggning sedan göras. 3:2007T 25

26 5.3 Luftningssteg i bioreningen Resultaten av analys på samtliga provpunkter från luftningsstegen ses i Tabell 1 (Bilaga 1). Under hela undersökningsperioden togs 401 prov på sammanlagt 61 olika provtagningsställen från 44 bruk. Antal provtagningsställen varierade beroende på antal anläggningar som bruken hade skickat prov från. Antalet legionellabakterier varierade kraftigt från till CFU/L. Detektionsgränsen varierade från till vid något tillfälle. I följande figurer redovisas resultaten för positiva och negativa anläggningar i fallande trend efter alla undersökningstillfällen. Under september 2005 var 25 av 45 bioreningsanläggningar positiva för Legionella (Figur 3A). L. pneumophila sg 1 verifierades i tre anläggningar medan sg 2-14 dominerade Legionella Legionella efter luftningssteget efter - Mars - september positiva 25 (56%); n =45 positiva = 20 (44 %); n = Legionella CFU/L Figur 3A. Fallande halt av Legionella i luftningssteget september :2007T 26

27 Under maj 2006 var 14 av 45 bioreningsanläggningar positiva för Legionella (Figur 3B). L. pneumophila sg 1 verifierades i två anläggningar medan sg 2-14 dominerade positiva 14 (31%); n = 45 Legionella efter luftningssteg - maj 2006 Legionella CFU/L Figur 3B. Fallande halt av Legionella i luftningssteget maj 2006 Under augusti 2006 var 25 av 46 bioreningsanläggningar positiva för Legionella (Figur 3C). L. pneumophila sg 1 verifierades i sju anläggningar medan sg 2-14 dominerade positiva 25 (54%); n = 46 Legionella efter luftningssteg - augusti Legionella CFU/L Figur 3C. Fallande halt av Legionella i luftningssteget augusti :2007T 27

28 Under november 2006 var 21av 47 bioreningsanläggningar positiva för Legionella (Figur 3D). L. pneumophila sg 1 verifierades i en enda anläggning medan sg 2-14 dominerade Legionella efter luftningssteg - november 2006 positiva 21 (45%); n = 47 Legionella CFU/L Figur 3D. Fallande halt av Legionella i luftningssteget november 2006 Under mars 2007 var 20 av 47 bioreningsanläggningar positiva för Legionella (Figur 3E). L. pneumophila sg 1 verifierades i sex anläggningar medan sg 2-14 dominerade positiva 20 (43%); n = 47 Legionella efter luftningssteg - mars Legionella CFU/L Figur 3E. Fallande halt av Legionella i bioreningsanläggningar mars :2007T 28

29 Tabell 1. Översiktstabell av Legionella i luftningssteg Sept 2005 Maj 2006 Aug 2006 Nov 2006 Mars 2006 Σ Provtagningsställen Positiva Σ Anläggningar Positiva L. pneumophila sg 1 verifierad i I Tabell 2 (Bilaga 1) återfinns också resultat av prover som tagits mellan december 2004 och december 2006 utanför studiens provperiod och på andra provpunkter samt utökad analys inom luftningssteget. Det var bara två bruk som hade en lång provserie tagen vid olika provtagningstillfällen. För det ena bruket har ett av elva prov varit negativt med legionellahalter varierande mellan CFU/L. I det andra bruket visade tre prov innan studien relativt höga halter. Efter åtgärder vid kyltornet påvisades inga legionellabakterier under hela studieperioden på detta bruk (se nedan under kyltorn). Tio bruk har varit negativa under hela perioden. På två bruk har bara 1 prov tagits och därför har de inte inkluderats i gruppen som alltid varit negativa. Sammanfattningsvis har L. pneumophila sg 1 verifierats i 11 luftningssteg. Statistisk bearbetning av data (Rank Sum test; t-test SigmaStat 3.1) visar inte på någon signifikant säsongsmässig skillnad (P > 0,050) med ett medianvärde på 10 7 legionellabakterier per liter för alla provperioderna. 5.4 Kyltorn Under hela studieperioden togs prov på 12 kyltorn vid 10 bruk. Fyra av bruken tog enstaka prover även utanför denna period. Legionella har påvisats vid minst ett tillfälle på 8 av 12 kyltorn. Ett kyltorn på ett bruk var positivt vid samtliga provtillfällen. Endast två bruk var negativa under hela studieperioden. I ett av kyltornen på ett bruk påvisades Legionella vid två tillfällen under våren 2005 och i september Efter att flera åtgärder vidtogs såsom mekanisk rengöring, att viss vattencirkulering stoppades, ett trumrensgaller installerades samt åtgärder mot bräddning och kyltornskontaminering av bioslam, så kunde Legionella inte längre påvisas i detta kyltorn. Det andra kyltornet på detta bruk var negativt vid samtliga provtillfällen. 3:2007T 29

30 L. pneumophila sg 2-14 dominerade medan L. pneumophila sg 1 inte kunde påvisas vid något tillfälle i kyltornen (Tabell 4 och 5, Bilaga 1). De anläggningar där L. pneumophila sg 1 hittills har påvisats i luftningssteget saknar dessutom kyltorn. 5.5 Slam Slamprov togs på sammanlagt 39 bruk. Totalt var drygt hälften av bruken positiva (54 %) och hade varierande halter mellan 1000 till CFU/g, våtvikt (median ). De flesta bruken tog prov vid ett tillfälle medan två av bruken tog prov vid 3-5 tillfällen. Vid ett bruk togs fem prov under våren - hösten 2005 och alla prov utom ett var positiva för Legionella. Slamprov från det andra bruket var positivt vid tre tillfällen. L. pneumophila sg 1 verifierades i slamprov från tre bruk (Tabell 6, Bilaga 1) 6 ANALYS AV SAMBAND MELLAN PROTOZOER OCH LEGIONELLA 6.1 Analys av protozoer Huvudsyfte med analyser av protozoer (amöbor) i denna studie var att se i vilken utsträckning samband mellan antalet legionellabakterier och protozoer existerar samt att undersöka detta samband i flera steg i några moderna anläggningar. För utvidgad analys valdes fem bruk. Undersökningarna utfördes i augusti och november 2006 samt i mars Prov för analys för protozoa har formalinfixerats efter ankomst för vidareanalys. Resultaten är sammanställda i (Tabell 7, Bilaga 1) samt här i Figur 3A F. 6.2 Analysmetod Totala antalet (TDC = Total Dapi Count) av protozoer bestämdes genom avräkning i epifluorescensmikroskopi. Större provvolymer (upp till 1 ml) filtrerades och mindre volymer ( μl) sattes direkt på objektglas och färgades sedan med en fluorokrom (DAPI). Det genetiska materialet DNA och RNA, i både döda och levande mikroorganismer, infärgas och ger en blåfärgning vid belysning med UV ljus. Olika mikroorganismer kan på detta sätt synliggöras, räknas och karakteriseras (storlek, form och innehåll). Detektionsgräns varierade (mellan 150 och 300 celler/ml) beroende på antalet avräknade mikroskopiska synfält, provolym och objektiv som användes vid avräkningen. 3:2007T 30