Statistisk analys av en genetisk studie av typ 2 diabetes

Transkript

1 Statstsk analys av en genetsk stude av typ dabetes Ingrd Haneklaus U.U.D.M. Project Report :P Examensarbete matematsk statstk, poäng Handledare: Tom Brtton och Holger Luthman, Karolnska Insttutet Examnator: Tom Brtton Februar Department of Mathematcs Uppsala Unversty

2 Sammanfattnng I detta arbete har v använt genetska data från ndvder ett solerat område på Sardnen. För varje ndvd fnns bl.a. genetska data för vssa markörer på kromosomerna, varje markör utmärker en vss plats. V har undersökt hur den genetska faktorn påverkar dabetes och tll dabetes relaterade sjukdomar. Detta har v undersökt med kopplngsanalys. Med hjälp av denna metod kan man se om det fnns någon kopplng mellan sjukdomen och någon av markörerna, d.v.s. om markörens plats genomet har någon påverkan på sjukdomen. Resultaten vsade att det fnns svag kopplng tll vssa områden på några kromosomer. V fann starkast sgnfkans tll ett område på kromosom 5. Men studen vsar också att det är svårt att fnna stark kopplng tll en specell gen hos ndvderna detta datamateral. Abstract In ths master thess we have used genetc data from ndvduals of an solated area of Sardna. For each ndvdual there s data from many markers on the chromosomes, each marker s located on a specfc locus on the chromosome. We have studed how the genetc factor nfluences dabetes and other phenotypes related to dabetes. The analyss was performed usng lnkage analyss. Ths method determnes f there s lnkage between the dsease and any of the markers,.e. f the locus of the marker has any nfluence on the dsease. The analyss showed moderate lnkage to some areas of some of the chromosomes. The most sgnfcant area was located on chromosome 5. The study also showed that t s hard to fnd hghly sgnfcant lnkage to any partcular gene n the present data set.

3 Tack tll Jag vll tacka mna handledare på Karolnska Insttutet Stockholm, Holger Luthman och Ingrd Kockum, för att de hjälpt mg att förstå hur en genetsk stude genomförs. Jag vll även tacka Tom Brtton som har vart mn handledare på Matematska Insttutonen vd Uppsala Unverstet, för att ha hjälpt mg med den matematska delen av arbetet och gett mg väglednng om hur ett examensarbete ska utformas.

4 Innehållsförtecknng Introdukton... 4 Dabetes... 5 Introdukton tll genetk Gener Överkorsnng IBS eller IBD Datamateral Från SAS tll Arexs (flhanterng) Kontroll av data zgenstat SbError... 5 Kopplngsanalys Mappnngsfunktoner Sgnfkanstest Log-odds-rato Allegro Ett exempel Resultat... Blaga - Dagram Blaga - Lnkageformat..44 Referenser.. 46

5 Introdukton Antalet personer som får dabetes ökar hela tden. Det fnns flera orsaker, men en av de mest bdragande är att allt fler lder av övervkt. Övervkten beror sn tur på för mycket fet mat och för lte moton. Det fnns två olka typer av dabetes beroende på vlken ålder sjukdomen bryter ut, typ som även kallas ungdomsdabetes och typ som bryter ut först senare lvet och kallas åldersdabetes. Förutom lvsstl påverkas uppkomsten av dabetes också av ärftlga faktorer, d.v.s. vssa ndvder bär anlag för sjukdomen vlket gör att den lättare bryter ut. Detta arbete syftar tll att undersöka den ärftlga delen av dabetes, d.v.s. vlka gener som påverkar dabetes och hur mycket. I undersöknngen ngår famljer från Sardnen, där mnst ett av barnen vuxen ålder har fått dagnosen typ dabetes. V har tttat på hur syskonpar famljerna har ärvt generna från föräldrarna. I varje cell kroppen fnns kromosompar, varav kallas autosomala. Det :e paret är ett könskromosompar, som bestämmer vlket kön barnet får. Kvnnor har två s.k. X-kromosomer och män har en X-kromosom och en Y-kromosom. På kromosomerna, som är uppbyggda av DNA, fnns generna. Generna bestämmer hur v ska se ut och hur vår kropp ska fungera. Den egenskapen som en gen ger hos en ndvd kallas fenotyp, t.ex. ögonfärg. Hur generna ärvs bestäms under produktonen av könsceller, då sker s.k. överkorsnngar mellan kromosomerna så att varje könscell får vssa gener från ndvdens mamma och andra från ndvdens pappa, vlket gör att könscellerna nte nödvändgtvs blr dentsk med någon av föräldrarnas könsceller. För att se vlka gener som kan ha nverkan på dabetes använde v oss av kopplngsanalys. Med kopplngsanalys kan man se om det fnns en kopplng mellan sjukdomen och en specell gen. V använde en ckeparametrsk metod, som tll skllnad från en parametrsk metod nte kräver vetskap om hur fördelnngen för testet ser ut, och tll hjälp hade v ett genetskt statstskprogram, Allegro. Analyserna som utfördes var enpunktsanalyser, där endast en vss gen analyseras, och flerpunktsanalyser som även använder punkterna runtom den aktuella genen analysen. Undersöknngen har endast nnefattat de autosomala kromosomparen. För att analysera könskromosomerna krävs andra metoder. V har undersökt sex olka fenotyper som alla är kvaltatva. Utöver dabetes utgör dessa fenotyper som sn tur påverkar dabetes. AER hur mycket/lte albumn levern fltrerar ut blodet. htg hur mycket/lte trglycerder (blodfett) det fnns blodet. HT vsar om blodtrycket är högt eller lågt. lhdl hur mycket/lte av det goda kolesterolet som fnns blodet. UR hur mycket/lte urnsyra det fnns urnen. NIDDM vsar om ndvden har dabetes eller nte. Efter att ha undersökt hela genuppsättnngen för ca 77 ndvder för de sex fenotyperna fann v vss kopplng för fem av fenotyperna. På kromosom och httade v kopplng för dabetes (NIDDM). På kromosom 5 gav Allegro kopplng för högt värde på trglycerder (htg). Det fanns även en vss kopplng tll högt trglycerdvärde på kromosom 8. Kopplng tll fenotypen AER fann v på kromosomerna 4, 8 och, och på kromosom fanns det kopplng tll högt blodtryck (HT). V fann ngen kopplng tll fenotypen UR på genomet. 4

6 Dabetes Dabetes är en av de största folksjukdomarna. I hela världen fnns ca mljoner dabetker. Detta antal kommer trolgtvs att öka, bl.a. beroende på att allt fler blr övervktga. Detta sn tur beror av att v rör oss mndre och att v äter mer fet mat. När sjukdomen först upptäcktes, på 6-talet före Krstus, kallades den honungsurn. Flera hundra år senare fck sjukdomen stt nuvarande namn, dabetes. Det fnns två sorters dabetes, typ och typ. Typ kallas även ungdomsdabetes och brukar bryta ut före 5 års ålder. Typ varanten uppkommer senare lvet. Undersöknngar av enäggstvllngar vsar att typ dabetes är mer ärftlgt än typ. Symtomen på sjukdomen är ökad törst, ökad mängd urn och trötthet. Avmagrng och dmsyn kan också förekomma. Båda formerna av dabetes ger ökad rsk för slaganfall och hjärtattacker. Dabetes kan också leda tll blndhet. Vd typ slutar bukspottkörteln helt att tllverka nsuln, cellerna har förstörts av kroppens eget mmunförsvar. Vd typ har tllverknngen bara mnskat. Insulnet behövs för att transportera socker n kroppens celler. Om det saknas eller fnns för lte nsuln stannar sockret kvar blodet. Detta medför att sockerhalten blodet blr för hög och även att cellerna nte får någon energ. Om cellerna nte får den energ de behöver förbränner de kroppsfett. Då bldas ketoner, vlket kan ge syraförgftnng. Syraförgftnng kan leda tll magont, llamående och kräknngar. För att mnska sockerhalten fltreras sockret ut med urnen och urnen blr söt. (Därav namnet honungsurn.) Namnet dabetes, som betyder rnna genom, kommer av att då sockerhalten blodet når en vss gräns måste det överflödga sockret fltreras bort. Detta sker med urnen. En dabetker som ofta har för mycket socker blodet måste fltrera bort mycket socker och detta ökar mängden urn. Kroppen kan då lknas vd ett rör som vätskan rnner genom. Dabetes kan också bero på att cellerna är nsulnresstenta. Då är cellerna okänslga för nsuln. Insulnet kan nte användas för att transportera n sockret cellerna och p.g.a. detta stger sockerhalten blodet. Med rätt behandlng kan dabetker leva ett normalt lv. Det är vktgt att tllföra kroppen rätt mängd nsuln. Insulnet kan njceras med sprutor eller tas som tabletter. Det är också vktgt att äta rätt. För att hålla blodsockerhalten på en jämn nvå är det bra att äta varerad kost och se tll att sprda ut måltderna över dagen. 5

7 Introdukton tll genetk. Gener Generna fnns på kromosomerna cellens kärna, och är uppbyggda av DNA. Männskan har par autosomala kromosomer, och ett könskromosompar. En kromosom består av två DNA-strängar som är snurrade runt varandra som en spral, även kallad dubbelhelx. Fgur : Två DNA-strängar som är snurrade runt varandra, de bldar på så sätt en dubbelhelx. I varje poston av DNA-strängen fnns en av fyra nukleotder: Guann, Cytosn, Adenn och Tymn (förkortas G, C, A och T). Varje kromosom består av en kromatd och en centromer. Ett kromosompar består av två kromosomer som tllsammans kallas systerkromatder. De två kromatderna är sammankopplade med centromererna. Kromosompar centromer systerkromatder Fgur : Ett kromosompar består av två systerkromatder och en centromer. En kromosom består av ca mljoner nukleotder. En gen, som endast är en lten del av kromosomen, består av ca nukleotder. Genen bestämmer vlka protener som ska bldas cellen. Allel är ett annat namn för en varant av en gen som ger en vss egenskap och varje gen har en väldefnerad plats som kallas lokus. I varje cell kroppen fnns kromosompar. Varje par (förutom könskromosomerna) består av två kromosomer som har samma genetska lokus och struktur, den ena kommer från mamman och den andra kommer från pappan, de två kromosomerna sägs vara homologa. Om en ndvd har lka alleler, för ett vsst lokus, på de båda systerkromatderna säger man att den är homozygot för lokuset, motsatsen kallas 6

8 heterozygot. Ett exempel är genen för ögonfärg. Om ett barn har fått anlag för bruna ögon av mamman och blå ögon från pappan är barnet heterozygot för det lokuset. Om det stället skulle ha fått anlagen för bruna ögon av båda föräldrarna är barnet homozygot. Begreppet genotyp specfcerar genuppsättnngen. Genotypen bestämmer sedan, eventuellt med andra faktorer, ndvdens tllstånd, detta kallas fenotyp. Blå ögon är ett exempel på en fenotyp. Vd varje celldelnng kroppen duplkerar sg krosomerna så att den nya cellen blr en exakt kopa av den gamla cellen, detta kallas mtos.. Överkorsnng Under meosen (se Fgur a), tllverknng av könsceller, paras de homologa kromosomerna hop och duplceras. De bldar ett par med två systerkromatder. De homologa paren samlar hop sg tll s.k. tetrader, ett kromosompar från ndvdens mamma och ett från pappan. Sedan delas de homologa paren upp två nya celler, så att det blr ett kromosompar varje cell. Slutlgen delas även dessa celler upp två nya celler med en kromosom från varje par. Vd varje meos bldas fyra nya könsceller med en enkel kromosomuppsättnng varje cell. Fgur a: Bld på meos (Campbell, 999, sd ) 7

9 Då de homologa kromosomparen bldar en tetrad kan det ske slumpmässga överkorsnngar mellan kromosomparen (se Fgur b). Detta gör att kromosomerna får nya kombnatoner av alleler och att avkommornas könceller nte blr dentska med föräldrarnas. Fgur b: Bld på meos med överkorsnng (Campbell, 999, sd 4) Eventuella överkorsnngar sker under metafasen (metaphase). Gener som lgger nära varandra på kromosomen skljs sällan åt vd överkorsnng, men när avståndet ökar mellan generna ökar också chansen för att det sker en överkorsnng mellan dem. Gener som lgger på olka kromosomer kan ses som oberoende av varandra, d.v.s. sannolkheten för överkorsnng på en kromosom är nte beroende av om det skett en överkorsnng på en annan kromosom. Mer om detta kan t.ex. läsas Gonck L, Wheels M, (996) och Hanes J, Percak-Vance M, (998). 8

10 . IBS eller IBD För varje gen ärver barnen en allel från mamman och en från pappan, tll kromosomerna kromosomparen. Syskonen en famlj kan snsemellan antngen ärva samma allel eller olka alleler från föräldrarna. Vd kopplngsanalys studeras hur allelerna delas av syskonen. Genom att bestämma hur allelerna har ärvts kan man bestämma vlken allel som ger uttryck för en vss fenotyp. I vårt fall har v tttat på hur syskonpar har ärvt sna alleler. Syskon kan dela alleler IBS (Identty- By-State) eller IBD (Identty-By-Descent). Alleler som delas IBS är lka alleler men de kommer nte nödvändgtvs från samma förälder. För att allelen ska vara IBD måste den komma från samma förälder och även från samma kromosom hos den föräldern d.v.s. från samma mor- eller farförälder. En allel som är IBD är även IBS, men det omvända behöver nte gälla. Exemplet Fgur 4 vsar hur syskon kan dela alleler IBS och IBD gvet föräldrarnas genotyper. Män brukar symbolseras med kvadrater och kvnnor med crklar. Famljen Fgur 4 består av mamma, pappa och två söner. IBS eller IBD ab ac. ac ac. ac aa. ac ab 4. bc aa IBS IBD Fgur 4: Ett exempel där v vet föräldrarnas genotyper. Eftersom varje syskon ärver en allel från mamman och en från pappan fnns det fyra olka kombnatoner för hur syskonen kan ha ärvt allelerna. Fguren vsar hur många alleler som ärvts IBS resp IBD för vart och ett av de fyra möjlga syskonkonfguratonerna. Det blr fyra olka kombnatoner för hur syskonen kan ärva allelerna. I första fallet har båda syskonen allelerna a och c, det betyder att båda allelerna delas IBS. Genom att ttta på hur föräldrarna ser ut och att v vet att en allel kommer från mamman och en kommer från pappan kan v se att båda allelerna även delas IBD, vlket kommer av att c-allelen måste komma från pappan och a-allelen måste komma från mamman. I fall delas a-allelen IBS men den kommer nte från samma förälder så den delas nte IBD. Det första barnet har fått a-allelen från mamman och det andra barnet har fått sn a-allel från pappan. Alla ndvder, oavsett om de är släktngar eller nte kan dela, eller alleler IBS. 9

11 4 Datamateral Materalet kommer från ett vsst solerat område på Sardnen. Området har tlls helt nylgen vart genetskt homogent, d.v.s. solerngen har gjort att det har nte kommt n så mycket nya genetska anlag. Detta gör det lättare att undersöka hur genetska sjukdomar har ärvts. Datamateralet bestod av 496 personer, varav 469 kontrollpersoner. De som nte var kontrollpersoner bestod av famljer. I vår undersöknng har v tttat på hur olka kombnatoner av syskonpar famljerna har ärvt anlag från föräldrarna. I de famljerna fanns det 876 syskon och 5 andra släktngar. Av syskonen hade 775 typ dabetes. Undersöknngen omfattar famljer där mnst ett av barnen som vuxen har fått dagnosen typ dabetes och både föräldrar och mor-farföräldrarna är födda på Sardnen. I materalet fnns endast barnens genuppsättnng, med undantag av några enstaka föräldrar. I beräknngarna används endast de syskon som är sjuka. I materalet fnns förutom värden på alla fenotyper även denttetsnummer, födelseår, längd, vkt och BMI-värdet för ndvden. BMI betyder Body Mass Index och är ett mått som vsar om ndvden är övervktg eller undervktg. Värdet beräknas enlgt: vkt kg längd m BMI > vsar på övervkt. Övervkt har vsat sg vara relaterat tll dabetes, många som har dabetes lder också av fetma. V har valt att endast använda fenotyper med kvaltatva värden, d.v.s. där det går att bestämma om en person är sjuk eller frsk utfrån ett fastställt gränsvärde. Om ndvden är sjuk bestäms sedan beroende på om dennes mätvärde är över eller under gränsvärdet. För vssa fenotyper är ndvden sjuk om värdet överstger gränsvärdet och frsk om värdet underskrder detta, för andra fenotyper gäller det omvända. Värdet står för frsk och för sjuk. Alla fenotyperna har någon trolg påverkan på dabetes, antngen drekt eller ndrekt. Fenotyper: AER hur mycket albumn som njuren släpper ut. Albunm är en stor molekyl, om njuren nte klara av att hålla kvar en så stor molekyl, är fltrerngen dålg och njuren är dålgt skck. Albumnvärdet testas blodet. HT högt blodtryck (hypertenson). Dabetes ökar rsken för högt blodtryck. Vd dabetes höjs blodsockerhalten, för att få ner halten späs blodet ut med vätska och volymen blr större. Detta gör att trycket ökar. lhdl lågt värde av det goda kolesterolet. Lagom mycket kolesterol är bra för kroppen. Kolesterolet fnns cellvägar och cellmembran. Om det fnns för mycket kolesterol blodet kan det leda tll hjärt och kärlsjukdomar. HDL hjälper tll att transportera bort överflödgt kolesterol från cellerna tll levern där det bryts ner. Höga HDL-värden är bra. htg högt trglycerdvärde. Trglycerder är blodfetter som används som bränsle kroppen, för mycket blodfetter ökar rsken för hjärt och kärlsjukdomar. NIDDM dabetes. Om ndvden har dabetes.

12 UR Urnsyra. Urnsyran vsar hur mycket amnosyror det fnns urnen. Mycket amnosyror betyder att njurens fltrerng nte fungerar, d.v.s. att den släpper ut för mycket ämnen. V har gjort analyser för varje fenotyp för sg, d.v.s. en ndvd räknas som sjuk för varje enskld fenotyp oberoende av de andra fenotyperna. 4. Från SAS tll Arexs (flhanterng) Innan själva analysen kördes krävdes en hel del databashanterng. Nedan kommer en kort av beskrvnng av vlka flhanterngsformatoner v utförde. Alla data fanns en SAS-databas, men för att lättare kunna analysera materalet skulle allt läggas n den nya Arexsbasen, från den kan man sedan exportera fler s.k. lnkageformat (se Blaga Lnkageformat). Lnkageformatet behövs för att kunna använda de olka programmen v använt. För att kunna lägga n det Arexsbasen var v först tvungna att ändra formatet. Detta gjordes Excel. Från SAS-basen exporterades datan tll Excel, där v ändrade formatet, som sedan mporterades tll Arexsbasen. V började med att lägga n famljerna och ndvderna, d.v.s. varje famlj fck ett nummer och varje ndvd fck ett personlgt denttetsnummer. Sedan lade v n alla markörer och alla ndvdernas genotyper. Slutlgen mporterade v de fenotyper v valt att använda analysen. Sedan exporterades data Lnkageformat. 4. Kontroll av data För att kontrollera att exporterngen från SAS-format tll Arexs-format blev rätt utförd, så att v fått med all data och att allt hamnat på rätt ställe, använde v zgenstat och SbError. V har också kontrollerat kvalteten på materalet och tagt bort delar som nte nnehåller tllräcklg nformaton för att kunna göra en bra analys. 4.. zgenstat zgenstat använde v för att bl.a. kontrollera att släktskapet stämde famljerna, att barnen hade rätt föräldrar och syskonen verklgen var syskon, d.v.s. att det var teoretskt möjlgt att barnen kan ha en vss genuppsättnng gvet vlka gener föräldrarna har och att syskonen kan dela dessa alleler. V kontrollerade också att varje ndvd har rätt antal alleler. I zgenstat kan man göra ett homozygostetstest, det är ett test som ger förväntade antalet heterozygota respektve homozygota ndvder och det observerade antalet heterozygota och homozygota ndvder, för varje markör. Antalet förväntade homozygota beräknas genom att allelfrekvensen för varje markör kvadreras. Homozygostettestet för kromosom : Observed Expected Observed Expected Marker Homozygotes Homozygotes Heterozygotes Heterozygotes P< DS , 49 5,98,849 DS6 6 8,7 9 6,8,85 DS999 89, ,4,95 ATA4E ,9 4 4,8,79 DS7 45 4,9 4,7,6 DS 7 8, 9 8,7,588 DS 6 57, 69 7,78,487 DS ,6,74,86 Tabell : Utskrft från homozygostetstest för kromosom.

13 P-värdet är beräknat med Pearsons -test, som testar antalet heterozygota mot antalet homozygota. Testet har utförts enlgt Pearsons -test (se Kap 5. om Sgnfkanstest), nu är N antalet heterozygota + antalet homozygota, d.v.s. antalet ndvder, och R är antalet homozygota ndvder. p är här andelen förväntade homozygota, vlket ger ett p-värde med sgnfkans enlgt fördelnngen med en frhetsgrad. För vssa markörer fanns det ett stort bortfall, d.v.s. att det saknas mätvärden från många ndvder. Eftersom det är svårt att göra bra analyser för dessa markörer tog v bort dem ur materalet. De markörer som hade data för färre än 86 ndvder, % av det största antalet ndvder, togs bort. V tog även bort markörer med ett p<,, ty dessa markörer har nte sgnfkanta fördelnngar för homozygota och heterozygota. 4.. SbError SbError är ett annat program som kan användas för att kontrollera så att famljestrukturerna stämmer, d.v.s. att det föräldrarna teoretskt sett kan vara föräldrar tll barnen gvet barnens genotyper. Programmet beräknar antalet alleler som syskonen delar IBD och jämför sedan med det förväntade antalet alleler. Detta kan göras för ett stort antal markörer. Teststatstkan är approxmatvt normalfördelad under nollhypotesen, d.v.s. ngen kopplng (se Kap 5 om Kopplngsanalys). Låt Z vara det observerade antalet alleler delade IBD. E(Z) är då väntevärdet och Var(Z) är varansen vlket ger att teststorheten är: T Z E( Z) Var( Z) Detta gör att man kan beräkna p-värdet och upptäcka sgnfkans med normalfördelnngen. För att få största tllförltlghet är det bäst med oberoende markörer, men då markörerna ofta är beroende (d.v.s. de lgger på samma kromosom) kan man lösa problemet genom att använda avstånden mellan markörerna. Avstånden måste vara omgjorda tll rekombnatonsfaktorer (se Kap 5. om Mappnngsfunktoner). Syskon som delar alla alleler antas vara homozygota tvllngar. V httade två tvllngpar vårt materal. För varje par tog v bort en ndvd, detta p.g.a. att båda ndvderna har exakt samma genuppsättnng och om båda skulle vara med skulle det ge en överrepresentaton för de generna.

14 5 Kopplngsanalys Kopplngsanalys används för att se hur två lokus är kopplade tll varandra. Om de två lokusen som ska analyseras lgger på olka kromosomer är de nte kopplade, d.v.s. det är lka stor sannolkhet att allelerna på lokusen har ärvts från samma förälder som att den ena kommer från mamman och att den andra kommer från pappan. Om lokusen stället lgger nära varandra är det större sannolkhet att allelerna kommer från samma förälder, d.v.s. kopplngen mellan två lokus ökar ju mndre avståndet är mellan dem. För att kunna utföra en kopplngsanalys måste avståndet, m, mellan två lokus bestämmas. Avståndet defneras som det förväntade antalet överkorsnngar mellan dem under meosen. Avståndet mäts Morgan, en Morgan defneras som det avstånd som ger förväntad överkorsnng. Markörer används för att räkna överkorsnngar. Varje markör fnns vd ett vsst lokus på kromosomen, och utgör en del av DNA-strängen som är lätt att känna gen. Sedan kan man ttta på om det skett några överkorsnngar mellan två markörer. Detta ser man genom att ttta på om den ena markören kommer från mamman och den andra kommer från pappan. Då har det skett ett udda antal överkorsnngar mellan markörerna. Om det är ett jämt antal överkorsnngar ser det ut som den är ckerekombnant. En kromosom som det nte skett några överkorsnngar på kallas ckerekombnant. Den är dentsk med den ena förälderns ena kromosom. Om kromosomen är rekombnant har det skett mnst en överkorsnng. Fgur 5 vsar sklnaden mellan en rekombnant och en ckerekombnant kromosom (mellan två markörer). Ickerekombnant - Rekombnant Markör Markör Ickrekombnant kromosom Rekombnant kromosom Fgur 5: Blden vsar delar av kromosomer mellan två markörer. Den grå färgen symbolserar att den delen kommer från ndvdens pappa och den vta delen vsar att den kommer från mamman. På den rekombnanta kromosomen har det skett en överkorsnng, d.v.s. den första markören kommer från mamman och den andra kommer från pappan. Alla överkorsnngar sker mellan kromosomer som nte är systerkromatder (se Fgur 6), d.v.s. vd meosen måste överkorsnngar ske mellan mammans och pappans kromosomer och nte mellan pappans två homologa duplcerade kromosomer eller mammans kromosomer. Det betyder att antalet överkorsnngar på ett kromosompar är lka med antalet överkorsnngar på hela tetraden.

15 En Tetrad 4 systerkromatder systerkromatder Fgur 6: Två homologa duplcerade kromosomer (se meos Fgur a) ger två kromosompar som tllsammans bldar en tetrad. Eventuella överkorsnngar kommer nte att ske mellan systerkromatder, d.v.s. nte mellan kromatd och kromatd eller kromatd och kromatd 4. En överkorsnng kan stället ske mellan t.ex. kromatd och kromatd. Om det nte sker någon överkorsnng kommer alla nya könsceller vara ckerekombnanta. Ingen överkorsnng Markör Markör Fgur 7: Vd varje meos bldas fyra könsceller, om det nte skett någon överkorsnng kommer delarna mellan de två aktuella markörerna antngen helt komma från pappan eller helt från mamman. Grått symbloserar att delen kommer från pappan och vtt från mamman. Det ger fyra ckerekombnanta kromosomer. Två stycken som kommer från pappa och två som kommer från mamma (se Fgur 7). Om det stället sker ett udda antal överkorsnngar, måste den ena systerkromatden paren ha ett udda antal och den andra ha ett jämt antal. Det ger att hälften av kromosomerna blr rekombnanta och den andra hälften blr ckerekombnanta. Sannolkheten att få en 4

16 rekombnant kromosom är då ½. Fgur 8 llustrerar hur det kan se ut då det sker en överkorsnng. Udda antal överkorsnngar Markör Markör Fgur 8: Här har det skett en överkorsnng. Det ger att det blr två rekombnanta kromosomer och två ckerekombnanta. Vd varje meos bldas då två rekombnanta och två ckerekombnanta. Om det sker ett jämt antal överkorsnngar så blr alla kromosomerna antngen rekombnanta eller alla ckerekombnanta (se Fgur 9a och Fgur 9b), båda varanterna är lka sannolka så sannolkheten för att få en rekombnant kromosom är även detta fall ½. Jämt antal överkorsnngar - alla rekombnanta Markör Markör Fgur 9a: Här har det skett två överkorsnngar, alla kromosomer är rekombnanta. 5

17 Jämt antal överkorsnngar - alla ckerekombnanta Markör Markör Fgur 9b: Här har det skett fyra överkorsnngar, alla är ckerekombnanta. I exemplet (Fgur 9b) där alla blr ckerekombnanta har det skett fyra överkorsnngar, men markör och markör på varje kromosom kommer fortfarande från samma förälder, de är därför ckerekombnanta för dessa markörer. Om det sker mnst en överkorsnng mellan två lokus är sannolkheten för rekombnaton ½. Alltså är sannolkheten att få en rekombnatant könscell ½. Detta ger att rekombnatonsfaktorn, som är sannolkheten för rekombnaton, kan beräknas enlgt (Sham P.,998, sd 54): = p där p är sannolkheten för mnst en överkorsnng. Kan även skrvas om med p = -p : = p där p är sannolkheten för att det nte sker någon överkorsnng. Sannolkheten för att det ska ske en överkorsnng växer med avståndet. Avståndet mellan två markörer kan skattas med hjälp av mappnngsfunktoner. 5. Mappnngsfunktoner Mappnngsfunktoner gör om avståndet mellan lokus tll rekombnatonsfaktorn. Det fnns flera olka mappnngsfunktoner. De bygger på samma rekombnatonsfaktor, men har olka värden på p. En är Morgans mappnngsfunkton. (Sham P., 998, sd 54). Den kan användas för små avstånd, <m</, där m är avståndet mellan två lokus mätt Morgan. Den bygger på att det endast sker en överkorsnng ntervallet, och att sannolkheten mnskar med avståndet. Avståndet m är det förväntade antalet överkorsnngar på en kromatd. En överkorsnng på en kromatd ger två överkorsnngar på hela tetraden, ty vd överkorsnng måste två kromatder 6

18 byta segment med varandra. Det ger att det förväntade antalet överkorsnngar på hela tetraden är m. Och detta sn tur ger att p = -m. = p = m Om det är längre avstånd mellan lokusen kan man använda sg av Haldane s funkton. Den bygger på att överkorsnngar sker enlgt en Possonprocess med ntenstet, d.v.s. att det genomsntt sker en överkorsnng per enhet. Possonprocessen har nget mnne, så för varje punkt på kromosomen är det lka stor sannolkhet för överkorsnng, oberoende vad som hänt nnan. Mappnngsavståndet, m, är defnerat som det förväntade antalet överkorsnngar per kromatd, vlket ger att det förväntade antalet överkorsnngar per kromosompar är m. Det ger: p = m! = e e m m e = p m = och nversen m = ln. För att enkelt kunna beräkna antalet överkorsnngar måste föräldrarna vara nformatva, d.v.s. de måste vara dubbelt heterozygota för det lokus som ska undersökas. Dubbelt heterozygot a b c d 4 ab cd 4 ad 4 Fgur : Exemplet vsar en famlj med mor- och farföräldrar, mamma, pappa och en son. Föräldrarna är dubbelt heterozygota, d.v.s. de har nte lka alleler på någon utav platserna. Bokstäverna anger tllståndet vd en markör och sffrorna tllståndet vd en annan markör. I exemplet Fgur är föräldrarna dubbelt heterozygota. Bokstäverna står för första allelen och sffrorna står för nästa allel. I det här fallet är det lätt att se vlka alleler som kommer från vlken förälder. Om mamman stället hade haft a och -alleler på båda sna kromosomer kan det vara svårt att bestämma vlken av dessa alleler som barnet fått. Och det blr ännu svårare om även pappen har lka alleler. Då måste man ttta på de olka möjlga sätten som barnet kan 7

19 ha ärvt allelerna, den ena från mamman och den andra från pappan. I exemplet har det, vd bldandet av mammans könsceller, skett en överkorsnng mellan mormors och morfars kromosomer. Detta ger att barnet, från mamman, får anlag både från mormor och morfar, medans barnet endast får anlagen från farfar från pappas sda. 5. Sgnfkanstest Vd kopplngsanalys är nollhypotesen, H, att det nte fnns någon kopplng. Med detta menas att aktuell markör lgger långt från alla sjukdomsrelaterade gener, d.v.s. att det nte fnns någon kopplng mellan markören och sjukdomslokuset. Under H gäller att, rekombnatonsfaktorn = = ½. För att vsa på kopplng måste vara sgnfkant mndre än ½. fnns ntervallet [, ½]. Detta följer av att om det är långt mellan lokusen som ska undersökas är det lka stor sannolkhet att det skett en överkorsnng som att det nte skett en överkorsnng. Vlket ger att det största värdet för är ½. Och då avståndet är mndre mellan lokusen mnskar p.g.a. att sannolkheten för att det ska ske en överkorsnng mnskar med avståndet. Det fnns olka metoder för att beräkna sgnfkans. Om man från materalet kan beräkna antalet rekombnanta och antalet ckerekombnanta kan man kontrollera nollhypotesen genom att använda rekombnatonsfrekvensen, som är en skattnng av (Sham P., 998 sd 6). Rekombnatonsfrekvensen, f, är andelen observerade rekombnanta ndvder, vlket ger att f = R/N. R är antalet rekombnanta och N är antalet ndvder. Ju mndre f blr ju mndre sannolkt är det att H är sann. Under ett vsst värde på f, som beror på sgnfkansnvån, förkastas H. En annan metod är Pearsons -test. Testet kan användas vd en undersöknng med n oberoende försök, där varje försök kan utfalla på r olka sätt med resp. sannolkhet p, p,, p r. En hypotes H kan sedan sättas upp för att undersöka sannolkheterna. Som teststorhet används (Blom G., 998, sd 6): T = r x np np Testet är enkelsdgt och har r- frhetsgrader, vlket ger att H förkastas om T > (r-). Testet kan användas för att kontrollera andelen rekombnanta. I det fallet är r =, x R, x N R och p p ½ eftersom ½. Teststatstkan är: T = R N N R N N N = N R N För R/N < ½ gäller sgnfkans enlgt ()-fördelnngen. (Andelen rekombnanta bör aldrg överstga ½. Om detta sker kan det vara något fel på antngen beräknngarna eller på materalet.) Pearsons -test använde v för att kontrollera att andelen homozygota ndvder vårt materel stämde överens med det förväntade antalet homozygota. (se Kap 4.. om zgenstat). 8

20 5. Log-odds-rato Ett annat sätt att testa sgnfkans vad gäller rekombnant och ckerekombnant är att använda lkelhooden. Med lkelhooden kan man sedan defnera en LOD-funkton (log-odds-rato), som används vd kopplngsanalys. Låt R (antalet rekombnanta) vara en stokastsk varabel. Rekombnaton sker med sannolkheten och försöket upprepas N oberoende gånger vlket ger att R Bn(N, ). Lkelhooden blr då: N R L = R N R Detta ger log-lkelhoodfunktonen : N ln L = + R ln N R ln R ln För nollhypotesen gäller att = = ½, det ger L = ln N L = ln + N ln/ R Och för ML-skattnngen, då ˆ = R/N ˆ N R R ln L = + R ln N R ln R N N ln ˆ Då < ½ gäller att ln L ˆ ln L är asymptotskt -fördelad med frhetsgrad (Sham P., 998, sd 64). Lkelhoodfunktonen kan sedan användas för att ta fram en LOD-funktonen, som är en loglkelhoodkvot. Av tradton används -logartmen. Den defneras som: ˆ z = log L x = log L ˆ x L x L log där x motsvarar en vss poston, lokus, på kromosomen. Det lokuset jämförs sedan med nollhypotesen då = = ½, d.v.s. ngen kopplng. Då LOD-värden för flera famljer beräknas brukar man säga att det fnns kopplng mellan sjukdomslokuset och den undersökta postonen om z(x)> (Nyholt D.R., ). Detta är endast en tumregel för hur man ska tolka LOD-värden, det fnns olka sgnfkansnvåer beroende på vad man analyserar. Här används andelen rekombnanta och ckerekombnanta för att ta fram ett LOD-värde, men man kan även beräkna det med hjälp av hur barnen famljer delar alleler IBD. Om man har tllgång tll syskon eller andra släktrelatoner kan man använda sg av en bättre analysmetod. Då v gjort våra beräknngar har v använt hur syskonparen famljen delar alleler IBD. (För att en allel ska delas IBD måste båda syskonen ha denna allel och den måste komma från samma förälder och även från samma kromosom hos den föräldern.) 9

21 Alleldelnngen för, resp alleler IBD är under nollhypotesen P, P, P = (.5,.5,.5). Låt x, x, x vara de observerade antalet syskonpar med respektve antal alleler IBD, då blr de skattade sannolkheterna för andelen delade alleler Pˆ, Pˆ, Pˆ x n, x n, x n där n x x. Då beräknas LOD-värden på följande sätt: x L Pˆ, ˆ, ˆ P P LOD log L P, P, P L log x L n, x n, x.5,.5,.5 n Om v t.ex. har ett datamateral där antalet syskonpar är, x =, x = och x =6, ger det att Pˆ, Pˆ, Pˆ.,.,. 6. Enlgt Hanes J., Percak-Vance M., 998, sd 84 blr därför: 6 log,,,6 LOD,8,5,5,5 6 LOD-värdet blr större för markörer nära sjukdomslokuset, d.v.s. där det fnns kopplng mellan sjukdomen och markören. Det blr så eftersom alla ndvder som undersöks är sjuka och om merparten ndvder har samma allel vd en vss markör är det trolgt att sjukdomsgenen lgger nära markören. I vårt materal har v bara barnens genotyper. Detta medför att det exakta antalet alleler som delas IBD nte alltd kan beräknas, utan stället måste skattas. LOD-funktonen går att använda även fast nte all nformaton om föräldrarna fnns. Från barnens genuppsättnng kan man ta fram alla möjlga kombnatoner av genuppsättnngar som föräldrarna kan ha. Sedan beräknar man sannolkheten för rekombnaton hos barnen, beroende på föräldrarnas genotyp. Bayes sats kan användas för att beräkna sannolkheterna för föräldrarnas olka varanter av genotyper gvet barnens genotyper. Bayes sats (Blom G., 984, sd 6): B pb A pa p B Aj p A j p A B p A B. p j P A B, som är sannolkheten för att föräldrarna ser ut på ett vsst sätt gvet barnens genotyper, beräknas eftersom v nte vet hur föräldrarna ser ut. PA B beräknas med Bayes sats, där P B A j lätt beräknas eftersom barnen ärver, oberoende av varandra, en allel från vardera föräldern och detta görs med samma sannolkhet för båda föräldrarna. med hela populatonens allelfrekvenser för alla möjlga A. Ett enkelt exempel för att llustrera: PA skattas

22 Bayes Sats?? Fgur : Ett exempel där v vet vlka alleler barnen har vd en vss markör, men v vet nte hur föräldrarna ser ut. V använder Bayes sats för att beräkna sannolkheten för att föräldrarnas alleler ser ut på ett vsst sätt. I Fgur har barn allel och och barn har allel och. Antag att det bara fnns tre möjlga alleler för det här lokuset och att allelfrekvenserna för dessa alleler är. för allel,. för allel och.5 för allel. Det fnns då två olka varanter på genuppsättnnger som föräldrarna kan ha, antngen har den ena allel på båda kromosomerna och den andra allel och, eller så har den ena föräldern allele och och den andra har och. Första fallet (m=-, p=-) betecknas här A och det andra fallet (m=-, p=-) A och B = (b =-, b =-). Det har ngen nverkan om v byter plats på m och p, d.v.s. det spelar ngen roll vlken av föräldrarna som har vlka alleler bara det fnns möjlghet att barnen kan ha de bestämda allelerna. p p p p A pm, p,,,,5, 8 B A,, p b b m p 4 A pm, p,,,,5, 6 4 B A,, p b b m p 6 pb A och pb A blr olka p.g.a. att då A gäller vet v nte vlken av mammans -alleler som barnen har fått, det enda v vet är att de har fått en -allel från mamman och en utav pappans alleler. Då stället A gäller vet v att barn måste ha fått -allelen av pappan och - allelen från mamman och att barn har fått allel från mamman och allel från pappan. V kan nu beräkna sannolkheten för att m=- och p=- betngat på hur barnen ser ut. B A pa 4,8 pb A p 4,8 6,6 p p A B A Sannolkheten att föräldrarna ser ut på det här sättet gvet barnens genotyper är alltså /.

23 V summerar sedan antalet alleler som delas IBD för de olka föräldramöjlgheterna, vktar med A, och p A B vlket ger andelen alleler som delas IBD. Dessa andelar kan sedan användas för att beräkna LOD-värdet för famljen. Med stora och många famljer kan det bl svårt att beräkna LOD-värdet för hand, därför använde v ett program som heter Allegro.

24 6 Allegro För utförandet av kopplngsanalysen har v använt det genetska statestkprogrammet Allegro. Programmet beräknade kopplng för 85 markörer utsprdda på kromosompar tll. Könskrosomerna har v nte tagt med analysen, eftersom dessa kromosomer kräver en specell analys. Följande presentaton är baserad på Gudbjartsson D., Jonasson K., Frgge M., Kong A. Allegro är ett program som är utvecklat för att klara av genetska statstska analyser, det är snabbt och kräver nte så mycket mnne. Det är baserat på samma funktoner som GeneHunter (se men algortmerna har förbättrats och metoderna är snabbare. Allegro kan beräkna LOD-värden, (log-odds-rato), dels parametrska och dels LOD-värden baserade på hur allelerna delas IBD. För att kunna beräkna parametrska LODvärden krävs att det fnns en modell, d.v.s. att man har vetskap om hur fördelnngen för testet ser ut. Det är nte alltd fallet och då kan man använda en ckeparametrsk metod. V har använt den ckeparametrska metoden, som är baserad på hur allelerna delas IBD. Programmet klarar av stora och många famljer och kan även använda många markörer. En arvsvektor, v, beräknas för att se hur generna ärvts från föräldrarna tll barnen. Arvsvektorn, v, beräknas för varje markör. Vektorn har längd m, där m står för nonfounders, vårt fall barnen, och består endast av :or och :or. Varje ndvd har två alleler för varje markör, en från mamman och en från pappan. De första två sffrorna avser första ndvden, nästa två avser ndvd nummer två o.s.v.. Om pappans allel kommer från farfar står det på första platsen, och om den kommer från farmor står det en :a, på andra platsen kan man läsa av från vlken av mammans föräldrar allelen kommer, d.v.s. det står om allelen kommer från morfar och om den kommer från mormor. Ett exempel: Släktträd cd ab gh ef ac fh ah ch Barn Barn Fgur : Släktträdet ger nformaton om vlka alleler de tre generatonerna har och hur de har ärvt. (Fyrkanter är män och crklarna är kvnnor.) I släktträdet ovan (Fgur ) fnns fullständg nformaton om genotyperna för mor-farföräldrar, föräldrar och barn. I det här fallet blr arvsvektorn för barnen:

25 v = (,,, ) De två första postonerna v står för det vänstra barnet och de två ssta för det högra barnet. Första sffran är eftersom allel a kommer från farmor. Andra sffran är eftersom den allelen kommer från morfar. För det andra barnet kommer c från farfar (ger ) och h från morfar (ger ). Antalet alleler som syskonen delar IBD kan lätt beräknas med hjälp av v, om syskonen har samma sffra på samma poston (första eller andra) delar de den allelen IBD. I Fgur delar barnen allel IBD. Det fnns olka sätt Allegro att dela upp syskonen grupper för att beräkna IBD. En varant som v har använt är att dela upp dem par, v tar med alla syskonpar där båda syskonen är sjuka. Då det fnns tre eller fler syskon som är sjuka kommer varje syskon att vara med flera syskonparkombnatoner. För senare analys måste man ha en scorngfunkton, för paruppdelnngen gäller: S = S v pq par p, q V summerar över alla par (p,q) med sjuka syskon en vss famlj. är antalet alleler som delas IBD av syskon p och q. Spar ger då antalet alleler som alla de olka syskonparkombnatoner famljen delar IBD. I exemplet ovan delar syskonparet allel IBD, d.v.s. allelen som betecknats med ett h. S par beräknas för varje vektor v. En ndvd får antngen sn mormors eller sn morfars allel från mamman med 5 % chans vardera. De olka syskon ärver alleler oberoende av varandra. Chansen att två syskon fått sn mammas allel från samma morförälder är således,5. Exakt samma resonemang gäller för S IBD Bn n, p,5. pappans gen. Detta gör att pq Om antalet IBD-delade alleler blr större än det förväntade kan man msstänka att det fnns en kopplng med sjukdomen vd den markören, eftersom alla är sjuka. d.v.s. om många ndvder har samma allel vd en vss markör och dessa ndvder också är sjuka är det trolgt att en sjukdomsallel lgger nära markören. På så sätt kan man koppla en sjukdom tll en plats på genomet. Det fnns många olka typer av kopplngsanalyser. V har använt enpunkts- och flerpunktsanalyser. Vd enpunktsanalyser analyseras endast en markör åt gången, men det är egentlgen en tvåpunktsanalys eftersom man då analyserar både markören och sjukdomslokuset. Flerpunktsanalysen tar även med de markörerna som lgger runt den aktuella markören beräknngarna. För flerpunktsanalysen defneras NPL (non-parametrc lnkage): NPL = Där Z = och S Z p v g k Z v, Z = v S pq 4

26 summerar över alla famljer och S S par för famlj. är väntevärdet för S och är standardavvkelsen. Z är det förväntade värdet av Z och Z är den standardserade formen av S. (Med standardserad form menas att Z har väntevärde och standardavvkelse.) summeras över alla vektorer v. syskon för varje famlj. V har dock valt att vkta alla famljer lka, d.v.s. v har satt för alla famljer. är en vkt som kan beräknas med avseende på antalet sjuka Eftersom antalet alleler varje syskonpar delar IBD, S pq, är lkafördelade Bn n, p,5 under nollhypotesen och parvs oberoende (hur många IBD ett syskonpar delar är oberoende av hur många ett annat syskonpar av de sjuka syskonen delar, även om de har en gemensam ndvd) gäller: = E S par = E S p q = E p, q p, q = Var S par = Var S p q = p, q p = antalet syskonpar / S p q,, VarS p q, q, = antalet syskonpar * n * p = antalet syskonpar, = antalet syskonpar * n * p * (-p) Z I exemplet Fgur fnns det två syskon som är sjuka famljen, d.v.s. ett syskonpar. Vlket ger att = och För att beräkna Z behövs pv g k som är sannolkheten för en vss arvsvektor v för en famlj gvet en vss genotyp g k vd lokus k. pv g k kan beräknas med hjälp av Bayes sats enlgt: pv p g k v pv g k pg k v pg k för alla v, där n är antalet syskon. p g k v kan beräknas med hjälp av allelfrekvenserna enlgt: Detta gäller eftersom pv n p f g k v a där f avser founder (föräldrarna) och a står för allel nummer och är allelfrekvensen för de olka allelerna. Summatonen går över alla möjlga alleluppsättngar som föräldrarna kan ha. Sannolkheten för att föräldrarna och barnen har just de allelerna vd detta lokus som vsas Fgur gvet arvsvektorn v kan således beräknas enlgt: p f g k v a a c f h. Denna beräknng blev enkel eftersom v vet vlka alleler föräldrarna har. Om v nte vetat detta hade det blvt flera termer att summera hop. 5

27 Om IBD nformatonen är komplett, d.v.s. man har all nformaton om hur syskonen delar allelerna IBD, är Z = Z och NPL är under nollhypotesen approxmatvt normalfördelat med väntevärde och varans. Men då man nte vet allt om IBD delnngen blr varansen mndre än (Gudbjartsson D., Jonasson K., Frgge M., Kong A.). Genom att nföra lnjära- och exponentella sannolkhetsmodeller för arvsvektorn v kan man lösa problemet med att man nte säkert vet varansen. Modellerna ger snarlka NPL värden. Den lnjära modellen ser ut på följande sätt: p = v c S v Och den exponentella modellen beräknas enlgt: S v p v = cr exp där r () är en normalserngskonstant som ser tll att p ( ) =. Och c är är sannolkheten för arvsvektorn v under nollhypotesen som är n v, där är antalet syskon famlj. Detta följer av att under nollhypotesen har alla v-vektorer samma sannolkhet och det fnns n olka vektorer. är en faktor som vsar den genetska effekten, den är under nollhypotesen. Den vsar hur alleldelnngen ser ut. Postvt värde på, som betyder att fler alleler delas IBD än förväntat, gör att v-vektorer med många IBD får stor sannolkhet. Negatvt värde, som sn tur betyder att det är färre IBD än förväntat, gör stället att vektorer med många IBD får lten sannolkhet. I våra beräknngar har v valt att använda den lnjära modellen. Allegro beräknar LOD-värden enlgt: LOD = log p g ˆ = pg pv v g p v ˆ pv v g p v pv v g p v ˆ pv g c log log v = pv g pv ˆ p g log p g log log c v ˆ Med den lnjära modellen kan LOD-funktonen skrvas: n 6

28 LOD = log ˆ Z ˆ är det som maxmerar pg som defneras av: p g = pg vpv När v maxmeras måste p v vara satsferat för samtlga famljer och samtlga v eftersom alla arvsvektorer måste vara möjlga. Detta kan bland begränsa skattnngen ˆ som annars skulle kunna bl. LOD-värdet för gvet lokus är -fördelade med en frhetsgrad. För att bestämma sgnfkans har v använt följande gränser: Nomnell kopplng ( p<.5) LOD>=.5875 Suggestve kopplng (p<.74) LOD>=. Sgnfkant kopplng (p<.) LOD>=.6 p-värdena ovan har valts enlgt Lander E och Kruglyak L, 995, där hänsyn har tagts tll att många test på genomet utförs smultant. En motverng för hur LOD-värdena erhållts följer nedan. Eftersom testet endast är sgnfkant då < <,5 har det endast en svans, så under nollhypotesen gäller att ln * LOD är -fördelad med sannolkheten ½ och med sannolkheten ½ (Nyholt D.R., ). LOD-värdet för respektve p-värde beräknas med PLOD * ln * LOD. Då p-värdet är,74 blr P x *,74, och det sn tur ger att 48 x,48, 9985 P. Från -fördelnngen fås att x =, och LODvärdet kan sedan beräknas:, LOD,999, ln Det är vktgt att kontrollera tecknet på. Om den är negatv betyder det att det är mndre alleldelnng än förväntat, men det kan ge höga värden på LOD utan att det tyder på kopplng. 6. Ett exempel För att göra beräknngarna enkla använder v endast en famlj. I famljen fnns det fyra syskon och tre av syskonen är sjuka (har dabetes). Barnens genuppsättnng ser för en vss markör ut på följande sätt (Barnen markerade med grått är sjuka): 7

29 ??,,,, Fgur : Ett exempel där v endast vet vlka alleler barnen har. Tre av de fyra syskonen har dabetes. Barnen markerade med grått är sjuka. Allelfrekvenserna hela populatonen för allel, allel resp allel antas vara =,, =, och =, och,4 för övrga alleler. För att barnen ska kunna se ut på det här sättet kan v anta att föräldrarna har följande alleler vd markören: x, x,,,,, Fgur 4: För att barnen ska kunna ha de alleler de har kan v anta att föräldrarna och mor- och farföräldrarna ser ut som fguren. x symbolserar att mormor kan ha vlken allel som helst. De olka genptyperna för barnen är - och -, detta medför att ena föräldern måste ha en etta och den andra måste ha allel och. V kan då, utan nskränknng, anta att :an kommer från farfar och :an från morfar och :an från mormor (se Fgur 4). Farmor kan då ha en godtycklg allel v lokuset. Detta ger att det fnns två sätt på vlket föräldrarna kan se ut. Antngen har farmor en -allel eller så har hon nte -allelen (d.v.s. vlken som helst av de andra allelerna). Eftersom det är tre av syskonen som är sjuka famljen kommer arvsvektorn att nnehålla sex element. De två första sffrorna avser första barnet, där första sffran är om allelen kommer från farfar och om den kommer från farmor, andra sffran talar om varfrån den andra allel kommer, från morfar eller mormor. Nästa två sffror talar om vlka alleler som det andra barnet har ärvt. Och de två ssta sffrorna avser det ssta barnet. Om farmor har -allelen fnns det åtta möjlga arvsvektorer. 8

30 v v v v v v v v ,,,,,,,,,,,,,,,, Då v är gvet är g helt bestämt så när som på föräldrarna och deras genuppsättnng. p g v kan då beräknas med populatonsallelfrekvenserna. För det här alternatvet är p g v. a Och om farmor har en annan allel än allel fnns endast möjlg v-vektor: v,, 9 p g v Och det ger a Genom att ttta på arvsvektorerna v v kan S bestämmas. Om v t.ex. tttar på par v arvsvektorn ser v att syskon och syskon delar allel IBD. Detta kan utläsas av att båda syskonen har en :a på första platsen som betyder att båda har ärvt den allelen från farfar, syskon har sedan en :a för den andra allelen och syskon har en :a, det betyder att de nte delar den allelen IBD. På samma sätt kan man avläsa att syskon och syskon delar alleler IBD och att syskon och syskon delar allel IBD. Vlket ger att S par v. V kan sedan utföra lknande beräknngar för samtlga v och får då att: S v 4 S S S S S S S S par par par par par par par par par v v v4 v5 v6 v7 4 v8 v Sedan beräknar v väntevärde och varans för S par : n * p * antal _ syskonpar *,5* n * p * q * antalet _ syskonpar *,5*,5* 9

31 Fortsättnngsvs beräknar v genom att maxmera v ˆ p g = g vpv V har valt att använda den lnjära modellen, som säger att p v = där eftersom det endast är en famlj och syskon famljen. Detta ger att: p g = g vpv v p = 64 p. v S par c, c eftersom det fnns tre sjuka n För att fnna ˆ som maxmerar 8 64 pg räcker att maxmera termer som nnehåller ˆ, d.v.s.. V sätter sedan n allelfrekvenserna uttrycket och får då 4 *,. Vlket ger att pg maxmeras av stora. Dock måste p v ˆ för alla v, detta ger en övre begränsnng på ˆ. Kravet att v ˆ uppfyllt för alla v då det är uppfyllt för det mnsta mnsta p S par v ˆ ˆ v vlket ger att ˆ p är S par v. I det här exemplet är det, och eftersom det ska vara en övre begränsnng gäller att ˆ. Lod-värdet beräknas sedan med den lnjära modellen, LOD = log ˆZ 9 S Z p, där Z v Och p v g v gz j v p g v j p g v par v För alternatvet då farmor har -allelen blr, då,...,8,6 pv g 8. Och då hon har en annan allel gäller, då 9:,588

32 ,594,,54 8 g v p Detta ger: 4, ,588 Z,65 Nu kan v beräkna LOD-värdet: 47, *,65 log LOD Eftersom LOD-värdet är större än noll tyder det på att det fnns vss kopplng tll mellan sjukdomslokuset och den aktuella markören. Gvetvs kan man nte dra några säkra slutsatser då beräknngarna endast sker med en famlj. I examensarbetet har v gjort på motsvarande sätt, men med många famljer. I dessa fall blr skattnngen verklgen det värde som maxmerar lkelhooden och randvlkoret att ˆ v p gäller då för detta. ˆ

33 7 Resultat En sammanställnng av LOD-värden från Allegro gjorde v form av dagram (se Blaga - Dagram). För att lättare kunna ttta på resultaten har v delat upp de sex fenotyperna två grupper med tre varje grupp. På varje dagram fnns alltså tre fenotyper. Ena gruppen är: AER Njurens albumnfltrerng HT högt blodtryck, htg höga trglyserdvärden och den andra är: lhdl-låga värden av det goda kolesterolet NIDDM-dabetes UR-urnsyra. För varje fenotyp har v gjort både enpunktsanalyser och flerpunktsanalyser. De prckade kurvorna vsar enpunktsanlyserna, varje punkt är en markör, och de heldragna lnjerna är flerpunktsanalyser. LOD-värdesskalan fnns på y-axeln och x-axeln vsar kromosomens längd mätt cm (cent Morgan). V har valt att redovsa LOD-värden beräknade med den lnjära modellen och med lka vkter för alla famljer. För att begränsa antalet dagram har v endast med de fenotyper och kromosomer som har uppvsat vss kopplng. Det är ntressant att ttta på de markörer där både enpunkts och flerpunktsanalysen vsar på kopplng. Oftast ger enpunktsanalysen ett högre värde. Om LOD-värdet är högt en punkt enpunktsanalysen och noll de runt om bör man undersöka detta värde, det kan vara så att den genetska faktorn,, är negatv. Då är antalet alleler delade IBD mndre än förväntat och då gäller nte kopplng. För fenotypen htg (se Blaga, Dagram 6) har v funnt det högsta LOD-värdet nämlgen.4, d.v.s. nästan suggestv kopplng, som är resultatet från enpunktsanalysen. Man kan också se att flerpunktsanalysen ger nästan lka högt värde. Detta tllsammans med att markörerna närheten vsar höga LOD-värden styrker resultatet om kopplng mellan markören och höga trglyserdvärden. I dagrammet kan man även se att kromosom 5 har en längd på 8 cm och att den aktuella markören lgger på 5. cm. I Tabell nedan fnns en sammanställnng av vlka fenotyper v funnt kopplng för. I dagrammen (se Blaga - Dagram) kan man även se var på kromosomen markörerna fnns. Fenotyp Kromosom Markör LOD ˆ AER 4 D4S644,48,77 D4S65,895,77 8 GATAB6,4,6984 DS,677,77 GGAA9H,7464,77 DS5,499,77 6 D6S4,,96 HT DS9,6,4469