Pastöriseringsöverlevande bakterier i leverantörsmjölk

Transkript

1 Branschintern Rapport nr Pastöriseringsöverlevande bakterier i leverantörsmjölk Birgitta Svensson, Kerstin Ekelund, Anders Christiansson Svensk Mjölk Forskning Telefon E-post fornamn.efternamn@svenskmjolk.se

2 Pastöriseringsöverlevande bakterier i leverantörsmjölk Birgitta Svensson, Kerstin Ekelund, Anders Christiansson Sammanfattning Med ökade kundkrav på totalantal bakterier i mjölkpulver (1 per gram) ökar också kravet på mjölkråvarans innehåll av bakterier som överlever pastörisering (<1 per ml). I denna studie undersöktes halten av pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölk från ca 1 leverantörer. Femton leverantörer hade lågt totalantal (< /ml) men högt antal pastöriseringsöverlevande bakterier (>/ml). Den högsta halten efter värmebehandling var 1 /ml. Totalt hade 9% av leverantörerna halter efter värmebehandling på >/ml. Detta indikerar problem med disk av mjölkningsanläggningen. Bakterier isolerades efter värmebehandlingen och typades. Vanligast var coryneforma bakterier (71%), följt av kocker (17%) och resten utgjordes av aeroba sporbildande bakterier (1%). Kockerna och de coryneforma utgör en del av kornas normala hudflora och kommer alltid att finnas i mjölken i halter upp till ca /ml. Endast 7 isolat, av totalt 1, var potentiellt patogena. Dessa kom från olika prov och förekom i låg halt. Ett urval av coryneforma bakterier och kocker testades för värmetolerans, disktålighet och biofilmsbildning. Värmetoleransen visade sig vara så pass hög (D 73.- min) att förändringar i pastörisering på mejeriet inte är en lösning för att avdöda dessa bakterier i mjölken. Disk utfördes i laboratorieskala vid och C (statisk temperatur), med alkaliskt diskmedel med klor och med surt diskmedel. Dosering gjordes enligt rekommendation från diskmedelstillverkarna. De utvalda bakterierna avdödades effektivt av diskmedel i suspension (både alkaliskt med klor och surt diskmedel), men då mjölkrester (1%) fanns med i disklösningen ökade överlevnaden markant. Jämfört med t.ex. Escherichia coli är överlevnaden betydligt bättre för denna typ av bakterier. Bakterierna bildade lätt biofilm. Denna var betydligt mer resistent mot diskmedel än bakterierna i lösning. Även för biofilmen ökade överlevnaden då mjölkrester fanns med i disklösningen. Det alkaliska diskmedlet var effektivare på att få loss biofilmen från ytan än det sura diskmedlet. Här ger kloret också en extra effekt. Surt diskmedel vid låg temperatur gav ett genomgående dåligt resultat. Om man följer de rekommendationer för disk som finns idag med avseende på dosering, disktid, start- och sluttemperatur bör man klara att avdöda de pastöriseringsöverlevande bakterierna. Möjligen kan den rekommenderade sluttemperaturen på C vara något låg. Sköljning av mjölkningsanläggningen innan disk är mycket viktig för att få optimal effekt av diskmedlen. Förekomst av svackor kan medföra att mjölkrester finns kvar i anläggningen även efter försköljning och kan negativt påverka diskeffekten. Biofilmer av bakterier är mycket mer resistenta mot disk än bakterierna i lösning. Det är därför viktigt att förhindra att bakterierna får möjlighet att bilda biofilm. I en anläggning som är ren från mjölkrester finns sämre möjligheter för bakterierna att få fäste.

3 Inledning Ökade kundkrav på mjölkpulver från 5 bakterier per gram pulver till 1 per gram, har gjort det svårt för mejerierna att få fram första klassens pulver. Mjölkråvaran får efter pastörisering inte innehålla mer än 1 bakterier per ml för att klara det nya kravet på pulver. Vissa leverantörer klarar inte att leverera en mjölkråvara med denna kvalitet, trots att totalantalet på mjölken är mycket lågt, <1 per ml. På senare år har få studier gjorts av icke sporbildande bakterier som kan överleva lågpastörisering (7 C i 15 s) på mejeriet. Under - till -talet gjordes flera stora studier av leverantörsmjölkens mikroflora där man även studerade pastöriseringsöverlevande bakterier (Thomas, Druce, Peters, & Griffiths, 197). Vid denna tid skedde stora förändringar tekniskt ute på mjölkgårdarna. Man gick över från handmjölkning till maskinmjölkning, från mjölkning i spann till rörledningar, från flaskhämtning till tankhämtning och nya automatiska disksystem infördes. I studierna av de pastöriseringsöverlevande bakterier fann man att hur man diskade hade stor betydelse för halterna i mjölken (Mackenzie, 1973; Thomas et al., 197). Den värmetoleranta floran består till stor del av organismer som finns på kons hud (Angula, Lorenzo, & Riveiro, 199; Bergey, 19). I de tidigare studierna kan man se att det är samma typ av organismer som återfinns, men vilka som dominerar växlar med disksystem och teknisk utrustning (Thomas et al., 197). Denna flora är inte psykrotrof och kan alltså inte växa till i den kylda mjölken. Däremot kan dessa bakterier etablera sig och växa i en dåligt diskad mjölkningsanläggning. När sedan mjölken passerar genom utrustningen spolas bakterierna med ner i tanken, vilket kan resultera i högt antal värmetoleranta bakterier i mjölken. Sporbildande bakterier förekommer också fast oftast i lägre halter. Här är det mer frågan om kontamination av spenarna från jord eller bäddmaterial och en otillräcklig avtorkningsrutin vid mjölkning. Men även vissa Bacillus-arter har visat sig kunna kolonisera mjölkningsanläggningar som är otillräckligt diskade (Christiansson, Bertilsson, & Svensson, 1999). Då problemet uppstår redan på gårdsnivå så fick Svensk Mjölk i uppdrag att ta reda på om det är vanligt med höga halter av pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölk från svenska leverantörer. I uppdraget ingick att isolera bakterierna och ta reda på vilka typer det rör sig om samt att få ett mått på hur pass värmetåliga dessa bakterier är och vad som krävs för att diska bort dem från anläggningarna. Det bestämdes att samla in tankmjölksprov från ca 1 leverantörer fördelat på de fyra största mejeriföreningarna och isolera bakteriestammar från dessa prov för typning, värmetolerans- och diskförsök. Utförande av projektet Längst bak i rapporten finns en bildbilaga med bilder som illustrerar hur vissa moment utförts. Då det i texten refereras till Bild är det bilderna i denna bilaga som avses. Insamling av prov Leverantörsprov togs ut via mjölkbedömningen från linjer vid mejerier. Totalt togs prov från 93 leverantörer. Samlingsprov togs också ut från de bilar som samlat in mjölken och de silos som mjölken pumpats in i. Proverna skickade kylda till Svensk Mjölk Forskning i Lund och analyserades direkt vid ankomst. Värmebehandling och isolering av pastöriseringsöverlevande bakterier Totalantalet bestämdes genom ingjutning av 1 ml mjölk av spädning 1, 1 och 1 gånger i TGA. Plattorna inkuberades vid 3 C i 3 dygn före avläsning. För att bestämma halten pastöriseringsöverlevande bakterier värmebehandlades mjölkproven först med en metod 3

4 utarbetad av ArlaFoods i Götene för att motsvara deras pastör. Ett vattenbad tempererades till 77.5 C. Mjölkprov om 1 ml överfördes till sterila provrör av glas. En termometer sattes i ett referensrör som också innehöll 1 ml mjölk. Samtliga rör sattes ner i vattenbadet samtidigt. Då termometern i referensröret visade 73. C togs tiden 15 sekunder och då ska temperaturen vara uppe i 75 C. Eventuellt kan längre tid behövas. Därefter kyldes rören i kallt vatten och.1 ml av ospätt prov och 1x spätt prov spreds på ytan av BHI-agarplattor (Brain Heart Infusion argar). Plattorna inkuberades vid 3 C i 3 dygn innan de räknades. Ca 5 olika kolonier från varje värmebehandlat leverantörsprov isolerades slumpmässigt och renströks på BHI-agar. Renkulturer förvarades i C i BHI med % glycerol. Tabell 1. Artnamn och stamnummer för de typstammar som använts vid typning av isolaten från värmebehandlad leverantörsmjölk. Samt som jämförelse vid värmeavdödning. Kocker Coryneforma bakterier Bacillus Artnamn Stamnr Artnamn Stamnr Artnamn Stamnr Enterococcus faecalis SMR111 Arthrobacter globiformis SMR91 Bacillus subtilis SMR77 Enterococcus faecium SMR7 Arthrobacter oxydans SMR7 Bacillus amyloliquefaciens SMR75 Streptococcus SMR19 Aurerobacterium SMR5 Bacillus brevis SMR71 termophilus liquefaciens Micrococcus luteus SMR Brevibacterium linens SMR9 Bacillus cereus SMR75 Kocuria varians SMR3 Brevibacterium casei SMR93 Bacillus circulans SMR73 Streptococcus bovis SMR Caseobacter polymorphus SMR95 Bacillus licheniformis SMR7 Leuconostoc cremoris SMR9 Cellulomonas flavigena SMR9 Bacillus megaterium SMR7 Lactococcus lactis SMR Corynebacterium SMR Bacillus mycoides SMR75 flavescens Lactococcus cremoris SMR Corynebacterium bovis SMR9 Bacillus polymyxa SMR79 Deinococcus SMR99 Corynebacterium SMR9 Bacillus pumilus SMR77 vitaeruminis Micrococcus roseus SMR9 Curtobacterium citreum SMR9 Bacillus sphaericus SMR173 Pediococcus SMR17 Microbacterium lacticum SMR Bacillus stearotermophilus SMR19 Pediococcus SMR1 Bacillus thuringiensis SMR75 Metoder för karakterisering av isolat Samtliga isolat studerades i faskontrast-mikroskop efter 1 och 3 dygns inkubering på BHIagar (Bild 1-). Cellform, rörlighet, storlek, formation (t.ex. kedjor, klasar, palissad) och eventuell sporbildning noterades. Koloniutseende på BHI-plattorna och eventuell pigmentering noterades också. Alla isolat Gram-färgades och testades för katalas och oxidas. Isolaten grupperades i kocker, sporbildande Bacillus och coryneforma bakterier och testades på API efter respektive grupp (Bild 5-7). För att välja coryneforma bakterier för API-test grupperades dessa i grupper (I-VII + resten) med avseende på utseende i mikroskop och på BHI-platta. API-Staph användes för kockerna, API 5CHB/E för Bacillus-arter och API- Coryne för de coryneforma bakterierna. Bacillus-isolaten studerades också på blodagarplattor (Bild 3-). Presumtiva mikrokocker och stafylokocker testades för lysostaphin-resistens (FDA, 199). För att fastställa släktskap mellan de olika bakterieisolaten beräknades en likhets-matrix på API-resultaten med hjälp av SYSTAT (SYSTAT, 1999). Denna matrix användes sedan för att skapa dendrogram (släktskapsträd). Kocker behandlades för sig och coryneforma bakterier för sig. Ett urval av typstammar användes som jämförelse vid art/släktes bestämningen (Tabell 1). Utvalda stammar för avdödning Urvalet av stammar för värmebehandling gjordes med hjälp av dendrogramen (Figur 1 och Figur ). De valda stammarna skulle representera så stor spännvidd på bakterierna som möjligt. Samt att få med representanter från alla mejeriföreningarna. Stambeteckningen står

5 till vänster om trädet. I dendrogrammen finns stammar med stor likhet i samma gren, medan stammar som är olika finns i olika grenar. M7 M M1 G3 MLUTEUS M9 U G7 O5 O77 M1 U U7 U5 U U O5 O53 O3 M19 M7 O37 U3 M7 O1 O O U1 O5 O33 KKRISTINAE SMR M71 M1 SMR3 M17 M11 M3 M37 KVARIANS M O1 O73 O1 O7 U3 U33 U35 U3 U3 M3 M35 U79 U,,1,,3,,5,,7 Distances Figur 1. Dendrogram över API-resultat för mikrokockerna. Urval av stammar till avdödningsförsök har gjorts för att få så stort spann som möjligt. API-resultat för typstammar finns med som jämförelse. Dessa betecknas med namn eller SMR-nummer (Tabell 1). SMR9 SMR SMR93 O7 SMR9 SMR5 SMR91 SMR7 SMR9 M U1 SMR9 U G5 O1 M3 SMR M1 G3 O G33 U U O95 O1 M99 G G19 G15 G M1 O11 O U5 M17 M1 M39 U G11 O91 O1 G U51 U3 SMR9 SMR Distances Figur. Dendrogram över API-resultat för utvalda coryneforma bakterier. Urval av stammar till avdödningsförsök har gjorts för att få så stort spann som möjligt. API-resultat för typstammar finns med som jämförelse. Dessa betecknas med SMR-nummer (Tabell 1). 5

6 Metod för värmeavdödning Kocker Kockerna (U33, U, M1, O5, O, M7, G3, U5, G, samt SMR3) ströks om på BHI-agar och inkuberades vid 3 C i 1.5 dygn. Ca ml BHI-buljong i en 1 ml flaska ympades till svag grumling med bakterier från plattan. Flaskan inkuberades på skak (15 rpm) vid 3 C i ca 1 timmar. Tre x ml utvuxen kultur överfördes till eppendorfrör och centrifugerades vid 1 g ca 5 minuter. Supernatanten hälldes av och bakteriepelleten slammades upp i 1 ml Sörensen-buffert (7mM Na,K-fosfatbuffert, ph 7.). Bakteriesuspensionen poolades ihop i ett rör och centrifugerades igen som ovan. Supernatanten hälldes av och bakterierna slammades upp i 1ml Sörensen-buffert ph 7.. Bakteriehalten (ca cfu/ml) på den färdiga suspensionen bestämdes genom utspädning och ingjutning av 1ml i BHI-agar och användes som nollprov. Samma suspension användes för alla tre testtemperaturerna och förvarades i kylskåp under dagen. Till en 3 ml E-kolv sattes 1 ml Sörensen-buffert, ph 7. och kolven sattes i ett vattenbad och tempererades till. C under omrörning (Bild ). Då lösningen uppnått önskad temperatur tillsattes 1µl av bakteriesuspensionen och klockan startades. Ett 1 ml prov togs ut sterilt vid.5, 1, 5, 1, 15, 3 och minuter. Proven sattes omedelbart till 9 ml spädvatten (spädning 1) i ett rör som stod i isvatten. Proven fick stå där tills tid fanns att späda (- till -) och gjuta in 1ml i BHI-agar (Bild 9). Plattorna inkuberades vid 3 C. Avläsning gjordes efter 3 och 5 dygns inkubering. Motsvarande försök gjordes vid 7. C med provuttag vid.5, 1,, 5, 1, 15 och 3 minuter (för vissa stammar togs prov ut vid tider mellan de angivna) och vid 7.9 C med provuttag vid.5,.5,.75, 1,, 5 och 1 minuter (för vissa stammar togs prov ut vid tider mellan de angivna). Efter avslutat avdödningsförsök gjordes en ny spridning på bakteriesuspensionen som användes för tillsats för att kontrollera att bakterieantalet inte ändrats under tiden försöket genomförts. Coryneforma bakterier De coryneforma bakterierna (G, U, M3, U5, M99, O1, O, U, M1, O7, M, M95 samt SMR) ströks om på BHI-agar och inkuberades vid 3 C i 1.5 dygn. Om bakterieväxten på BHI-plattan var god ympades ca ml BHI-buljong i en 1 ml flaska till svag grumling med bakterier från plattan. Flaskan inkuberades på skak (15 rpm) vid 3 C i ca 1 timmar. Om växten på BHI-plattan var svag ströks en koloni om på Columbia-agar med 5% fårblod (SVA). Bakterierna skördades från plattan genom att hälla på ml Sörensenbuffert och suspendera växten i denna. Tre x ml utvuxen kultur eller ml skörd från platta överfördes till eppendorfrör och centrifugerades vid 1 g ca 5 minuter. Supernatanten hälldes av och bakteriepelleten slammades upp i 1ml Sörensen-buffert. Bakteriesuspensionen poolades ihop i ett rör och centrifugerades igen som ovan. Supernatanten hälldes av och bakterierna slammades upp i 1ml Sörensen-buffert ph 7.. Bakteriehalten (ca cfu/ml) på den färdiga suspensionen bestämdes genom utspädning och ingjutning av 1ml i BHI-agar och användes som nollprov. Samma suspension användes för alla tre testtemperaturerna och förvarades i kylskåp under dagen. Till en 3 ml E-kolv sattes 1 ml Sörensen-buffert, ph 7. och kolven sattes i ett vattenbad och tempererades till ca 7 C under omrörning (temperaturen varierade något för de olika stammarna) (Bild ). Då lösningen uppnått önskad temperatur tillsattes 1µl av bakteriesuspensionen och klockan startades. Ett 1 ml prov togs ut sterilt vid.5,, 1, 15, 3 och 5 minuter. Proven sattes omedelbart till 9 ml spädvatten (spädning 1) i ett rör som stod

7 i isvatten. Proven fick stå där tills tid fanns att späda (- till -) och gjuta in 1ml i BHI-agar (Bild 9). Plattorna inkuberades vid 3 C. Avläsning gjordes efter 3 och 5 dygns inkubering. Motsvarande försök gjordes vid ca 7 C (temperaturen varierade något för de olika stammarna) med provuttag vid.5,, 5, 1, 15, och 3 minuter (för vissa stammar togs prov ut vid tider mellan de angivna) och vid ca C (temperaturen varierade något för de olika stammarna) med provuttag vid.5,.5, 1,, 5 och 1 minuter (för vissa stammar togs prov ut vid tider mellan de angivna). Efter avslutat avdödningsförsök gjordes en ny spridning på bakteriesuspensionen som användes för tillsats för att kontrollera att bakterieantalet inte ändrats under tiden försöket genomförts. Metod för diskning i lösning Testade diskmedel Alkaliskt diskmedel: P3-Asepto flytande (Henkel-Ecolab) (NaOH 5-15%; Na-hypoklorit <5% aktivt klor; nonjonaktiv tensid <1%; organisk kompexbildare 1-5%). Rekommenderad dosering är.5dl/1 l (,5-,75% NaOH) för mjukt vatten och den har använts i försöken (bruksdisklösning). Diskmedlet späddes med sterilt kranvatten. En starttemperatur på >5 C rekommenderas av tillverkaren. I försöken har C använts som högsta temperatur. Rekommenderad sluttemperatur är C och den har använts som en av försökstemperaturerna. Rekommenderad cirkulationstid är -1 minuter. Diskförsöken har gjorts inom 1 minuter. Surt diskmedel: P3-Horolith BA flytande (Henkel-Ecolab) (fosforsyra >3%; nonjoniska tensider <5%; fosfonsyra<5%; stabilisatorer <5%). Rekommenderad dosering är.3 dl/1 l och den har använts i försöken (bruksdisklösning). Diskmedlet späddes med sterilt kranvatten. En starttemperatur på >5 C rekommenderas av tillverkaren. I försöken har C använts som högsta temperatur. Rekommenderad sluttemperatur är C och den har använts i försöken. Rekommenderad cirkulationstid är -1 minuter. Diskförsöken har gjorts inom 1 minuter. För att neutralisera diskmedlen efter behandling användes en neutraliseringsbuffert bestående av.5m Na/K-fosfatbuffert, ph 7. med.5% Na-tiosulfat. Förförsök För att kontrollera, att neutraliseringslösningen kunde neutralisera disklösningarna och att den inte påverkade bakterierna, gjordes ett antal förförsök. 1 ml av bruksdisklösningen (alkalisk respektive sur) sattes till 9 ml neutraliseringslösning. ph testades med ph-sticka. 1ml bakteriesuspension (gjordes för kockerna U33, O5, M1 och coryneforma G, M99, U, M, M95, G5, O59, U53) sattes till 9 ml neutraliseringslösning. Blandningen fick stå på is så länge som man tror att den kommer att stå under avdödningsförsöket. Spädningsserie gjordes i spädvatten och spridning från lämpliga spädningar gjordes på BHI-agar. Bakterier sattes till bruksdisklösning i samma koncentration som vid start av avdödningsförsöket med värme (se ovan). 1 ml överfördes omedelbart efter blandning till 9 ml neutraliseringslösning. Blandningen fick stå på is så länge som man tror att den kommer att stå under avdödningsförsöket. Spädningsserie gjordes i spädvatten och spridning från lämpliga spädningar gjordes på BHI. Detta gjordes för samtliga testorganismer i både alkaliskt och surt diskmedel. Eftersom samtliga bakterier dog av mycket snabbt i försöken med disklösning i rumstemperatur studerades effekten av diskmedel då mjölk finns som bakgrund. En spädningsserie.5, 1,, 5 och 1% standardmjölk i sterilt kranvatten gjordes. Standardmjölk 7

8 hälldes i en flaska och därefter hälldes mjölken ut och ersattes av motsvarande mängd vatten. Detta mjölkblandade vatten jämfördes sedan med spädningsserien för att finna en nivå som motsvarar ett tömt rör som ej sköljts före diskning..5% motsvarades bäst (Bild 1). Försöken med bakteriesuspension i disklösning gjordes om med.5 och 5% steril standardmjölk i bakgrunden. Det bestämdes att använda 1% standardmjölk som bakgrund i diskförsöken. Diskförsök Diskförsök gjordes med kockerna U33, O5, M1 och coryneforma M95, G, U, M99, O59, G5, M, U53. Bakterierna odlades upp på samma sätt som vid värmeavdödning. De försökstemperaturer som användes var och C. En 3 ml E-kolv med bruksdisklösning (alkalisk eller sur) innehållande 1% steril standardmjölk sattes under omrörning i vattenbadet. Då disklösningen nått rätt temperatur tillsattes 1 ml bakteriesuspension och klockan startades. 1 ml prov togs ut vid 1, 5 och 1 minuter och sattes omedelbart till 9 ml neutraliseringsbuffert (spädning 1) som förvarades i isvatten. Proven späddes därefter med spädvatten (- till -) och 1 ml göts in i BHI-agar. Plattorna inkuberades vid 3 C ca 5 dygn innan de räknades. För några utvalda stammar gjordes försöken med provuttag vid fler tider och fler temperaturer. Med alkaliskt diskmedel testades kock U33 och coryneforma M95 och U vid rumstemperatur,, och 7 C med mjölk i bakgrunden och vid 7 C utan mjölk. Prov togs ut vid.5,.5, 1,, 5, och 1 minuter och behandlades som ovan. Även E. coli SMR7 testades på samma sätt för att få en jämförelse med andra typer av bakterier. Med surt diskmedel testades kockerna O5 och U33 samt coryneforma M95, G, M99 och U vid, och C. Prov togs ut vid.5,.5, 1,, 5 och 1 minuter och behandlades som ovan. Diskförsök med enbart NaOH utfördes vid och C med M95 och U. Halten NaOH i den färdiga disklösningen var.3 %. Försöken genomfördes som ovan men utan tillsats av mjölk. Odling av biofilm För att kontrollera förmåga att bilda biofilm odlades 11 pastöriseringsöverlevande isolat (U33, O5, G, U, M99, M95, M1, M, G5, O59, U53), 3 Bacillus cereus stammar och en Escherichia coli i BHI i en 9-håls mikrotiterplatta vid 3 C i timmar. Mediet hälldes av och 3 µl kristallviolett-lösning ( g/l i % (v/v) metanol) tillsattes och fick dra i 3 minuter. Färgen hälldes ut och brunnarna tvättades sedan 3 gånger försiktigt under rinnande vatten. 3µl etanol tillsattes till brunnarna för att lösa upp eventuell bunden färg och mätning gjordes i spektrofotometer vid 3 och nm. Ju mer färg som bundit desto bättre förmåga att bilda biofilm. Metoden är modifierad från Kolari et al (1). Två kocker, U33 och O5, och coryneforma, M95, M99, U och G valdes för att testa förmåga att bilda biofilm på objektsglas med och utan 1% standardmjölk. Sterila objektsglas lades i petriskålar och 3 ml steril Wirtanen-buljong (LabLemco powder.g; Nutrient broth.g; sukros 5g; glukos 1g; fruktos 1g; 1 ml destillerat vatten (Wirtanen, Husmark, & Mattila-Sandholm, 199)) ympad med.3 ml bakteriesuspension (1 plastinösögla bakterier slammade i 1 ml Wirtanen-buljong) hälldes på. Skålarna inkuberades mörkt vid rumstemperatur i ca 5 dygn. Objektglasen togs upp med hjälp av steril pincett, doppades i sterilt destillerat vatten och torkades av på undersidan innan de färgades med kristallviolett. Efter färgning sköljdes glasen försiktigt med destillerat vatten och fick sedan lufttorka. Den blå färgen visade hur mycket film som bildats på glasen (Bild 11).

9 Metod för diskning av biofilm För diskförsök valdes kockerna U33, M1, O5 och coryneforma M95, M99, G, U (O5, G och U endast utan mjölk). Biofilmerna odlades som ovan. Disk gjordes i glasvannor med omrörning (Bild 1). Vannorna innehöll disklösning av alkaliskt eller surt diskmedel med eller utan 1% steril standardmjölk. Dessa sattes i vattenbad vid C eller C och tempererades ca 1 timme. Två objektsglas sattes ned i varje vanna (en vanna för varje provtagningstid). Vid 1, 5 och 1 minuter togs objektsglas upp med hjälp av steril pincett och lades i 3 ml neutraliseringsbuffert i sterila petriskålar. Därefter svabbades glasen med sterila bomullstops fuktade med spädvatten som därefter sattes i spädvattenrör (Bild 13). Två icke disklösningsbehandlade objektglas med biofilm lades i neutraliseringsbuffert och svabbades som de behandlade och fick utgöra nollprov. En spädningsserie gjordes och ytspridning gjordes på BHI-agarplattor. Dessa inkuberades vid 3 C i 5 dygn innan de avlästes. Antalet cfu beräknades per cm objektglasyta. Biofilmer av M95 och U33 diskades också enbart med NaOH vid 1 och 5 respektive 3 C. Halten NaOH i den färdiga disklösningen var.3%. Försöken utfördes som ovan. Ingen tillsats av mjölk gjordes. Analys av värmeresistenta bakterier i spån Obegagnat och begagnat sågspån samt tankmjölk inhämtades från Alnarps mellangård (SLU). 5 g spån vägdes in i stomacherpåse och 5 g peptonvatten tillsattes. Proven Stomacherbehandlades i 1 minut. 1 ml prov eller 1 ml mjölk överfördes till sterila glasrör och värmebehandlades på samma sätt som mjölkproven i den första provtagningen. På ytan av BHI-agarplattor spreds.1 ml av direkt och spädning 1 från mjölkproven och direkt till spädning för spånproven. Plattorna inkuberades vid 3 C i 3 dygn före avläsning. Ca 5 kolonier plockades från varje prov och jämfördes med tidigare isolat. Resultat och Diskussion Analys av leverantörsprov På våren 1 togs prover in från 93 olika leverantörer (ca 1 linje per varje mejeriförening) och analyserades med avseende på totalantal och pastöriseringsöverlevande bakterier (se Bilaga 1). Enligt amerikanska rekommendationer bör antalet bakterier i mjölken efter lågpastörisering, vid 7 C i 15 sekunder, inte överstiga /ml mjölk ( Ett högre antal tyder på hygienproblem. Av de 93 analyserade mjölkproven hade 7 halter efter värmebehandling på mer än /ml (Tabell ). Tio av dessa hade >1 per ml. Andelen gårdar med förhöjda halter var alltså 9% och 11% hade kraftigt förhöjda halter (>1/ml). Linjen vid Mejeri 1 har procentuellt sett fler leverantörer med halter som överstiger /ml, % jämfört med % för de övriga 3 linjerna. Denna linje skiljer sig markant från de övriga. Fler linjer från varje mejeri skulle behöva undersökas för att se om det är denna linje som utmärker sig eller om det finns en mer systematisk skillnad mellan Mejeri 1:s leverantörer och de övrigas med avseende på pastöriseringsöverlevande bakterier. Förhöjt totalantal (>/ml) förekom hos av leverantörerna (Tabell ). Av dessa hade 1 också > pastöriseringsöverlevande bakterier per ml mjölk. Femton leverantörer hade alltså lågt totalantal (</ml) men högt antal pastöriseringsöverlevande (>/ml) (Tabell ). Dessa utgör 55% av de som hade högt totalantal. Det är tydligt att analys av totalantalet bakterier inte räcker för att finna de leverantörer som har högt antal pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölken. 9

10 Tabell. Fördelning av proven i olika kategorier baserat på halt pastöriseringsöverlevande bakterier och totalantal, uppdelat på de olika mejerierna och totalt. Mejeri 1 Mejeri Mejeri 3 Mejeri Totalt Antal undersökta leverantörsprov Antal med </ml av pastöriseringsöverlevande bakterier Antal med -<5/ml Antal med 5-<1/ml Antal med >1/ml 5 11 Antal med högt totalantal > /ml Antal med högt på båda > /ml/>/ml Lågt totalantal/hög halt pastöriseringsöverlevande >/ml Högt totalantal/låg halt pastöriseringsöverlevande </ml Våren 3 togs nya prov in från 11 av leverantörerna som hade >5 bakterier per ml efter värmebehandling 1 (resultatet redovisas ej). Samtliga hade fortfarande högt antal bakterier efter värmebehandling. Några hade till och med högre antal än vid det första provtagningstillfället. Detta tyder på att om man fått en etablering av pastöriseringsöverlevande bakterier så måste man vidtaga särskilda åtgärder för att bli av med problemet. Om man inte gör detta så snarare förvärras det med tiden. Karaktärisering av isolat Från de 93 leverantörsproven isolerades 1 olika bakteriestammar. Isolat togs från samtliga prov där denna typ av bakterier förekom för att se om det fanns någon skillnad i bakterieflora mellan gårdar som hade höga respektive låga halter pastöriseringsöverlevande bakterier. Isolaten karakteriserades genom mikroskopering, katalas- och oxidastest, Gram-färgning, utseende på blodagar, lysostaphin-resistens och API. Av isolaten fanns 17% vara kocker, 1% sporbildande Bacillus-arter och 71% coryneforma bakterier (Tabell 3; Bilaga 1). Bland isolaten från Mejeri 1:s leverantörer fanns något fler sporbildande Bacillus än hos de övriga. Det var vanligare att samtliga isolat var coryneforma från leverantörsmjölk med högt antal pastöriseringsöverlevande bakterier än från mjölk med lågt antal (Fisher exact test, p=.5) Kockerna dominerades av katalas-positiva isolat och de flesta identifierades efter analys med API till släktena Micrococcus och Kocuria, men även en del icke-patogena Staphylococcus spp. hittades. Dessa utgör en del av kons normala hudflora. Det inbördes släktskapet mellan mikrokockerna illustreras i Figur 1 genom ett dendrogram baserat på APIdata. Mikrokockerna är oftast gula och växer tjockt på BHI-agarplattorna (Bild 1). I mikroskop är de stora och runda och bildar par eller sitter ihop och. Isolaten från Mejeri 3:s leverantörer avvek något genom att fler av kockerna var katalas-negativa alltså av släktena Streptococcus, Lactococcus eller Enterococcus (Bilaga 1). Även en del av dessa kan finnas 1

11 naturligt på kons hud. Dessa växer mycket tunnare på plattorna än mikrokockerna och formerar sig i kedjor eller par i mikroskop. De kan även vara litet ovala i formen i kedjorna. Bland de sporbildande bakterierna dominerade arterna Bacillus licheniformis och Bacillus pumilus. B. licheniformis har ett karaktäristiskt utseende på agarplatta genom att först vara slemmig och sedan torr och hopskrumpen (Bild ). B. pumilus har på blodagar en grönaktig ton på hemolysen (Bild 3), men det finns även andra Bacillus-arter som kan uppvisa grön hemolys. Båda dessa arter är vanliga i kons omgivning. De finns i jord, bäddmaterial och i foder och hamnar i mjölken främst genom att sporerna fastnar på kons spenar då hon ligger ner. Även de övriga Bacillus-arterna som hittades är vanliga i kons omgivning (Bilaga 1). B. licheniformis tillhör de mer värmetåliga av Bacillus-arterna och är känd som kontaminant vid pulvertillverkning (Ronimus, Parker, Turner, Poudel, Rückert, & Morgan, 3). Denna bakterieart har varit inblandad i ett dödsfall orsakat av felbehandling av välling (Salkinoja- Salonen, Vuorio, Andersson, Kämpfer, Andersson, Honkanen-Buzalski et al., 1999). Toxinet som var orsak till dödsfallet är besläktat med det emetiska toxinet hos Bacillus cereus (orsakar kräkning). Även vissa B. pumilus stammar kan bilda liknande toxiner (våra resultat). Tabell 3. Antal isolat och fördelning på olika bakteriegrupper från leverantörer som levererar till de olika mejerierna Antal isolat Kocker (%) Bacillus (%) Coryneforma (%) Mejeri (17) (19) (3) Mejeri (17) ( 5) (77) Mejeri (1) 1 (1) 3 (7) Mejeri 9 17 (1) ( 9) 7 (73) Totalt 1 71 (17) 5 (1) 3 (71) De coryneforma bakterierna utgjordes främst av Microbacterium/Cellulomonas spp. Vi har inte haft möjlighet att särskilja vilket släkte de tillhör. Mest troligt är dock släktet Microbacterium då dessa är en vanlig typ av bakterier på hud och har tidigare isolerats från mjölk. Cellulomonas är bakterier som bryter ned cellulosa och dessa skulle kunna finnas i bäddmaterial som t.ex. sågspån. Släktskapet mellan de coryneforma isolaten kan ses i dendrogrammet i Figur. De coryneforma bakterierna är liksom mikrokockerna ofta gula, men de växer tunnare på BHI-plattorna (Bild ). Bakteriemassan är blank och litet halvt genomskinlig. I mikroskop är de coryneforma oftast små. I unga kulturer (1 dygn) är bakterierna längre än i något äldre (3 dygn). Det finns särskilt i de yngre kulturerna ofta både långa och korta celler i samma preparat när man tittar i mikroskop. Det gör att även renkulturer kan upplevas som orena. Ofta ser man bakterier som två och två bildar ett V. Detta är typiskt för många coryneforma bakteriers sätt att dela på sig. Vissa av de coryneforma växer mycket tunt på plattorna och ser i mikroskop ut som kinesiska tecken eller som ballongdjur och de enskilda bakterierna är mycket större än för de coryneforma som ger en gul och kraftigare växt på platta. Endast 7 av 1 isolat var potentiella patogener. Dessa var av arten Arcanobacterium haemolyticum enligt API-analysen. Bakterier inom släktet Arcanobacterium har varit orsak till mastiter (Milne, Barrett, Fitzpatrick, & Biggs, ). De 7 isolaten kom alla från olika mjölkprov och inom respektive mjölkprov fanns endast ett isolat som var presumtivt Arcanobacterium så halten av dem var sannolikt låg. Dessutom hade 5 av proven låga halter, <1/ml, av pastöriseringsöverlevande bakterier. Troligen beror deras närvaro inte på mastit, med tanke på den låga halten. Avsikten med karakteriseringen var dels att fastställa vad det var för typer av bakterier som dominerar i värmebehandlade mjölkprov. Genom att veta vilka bakterier det rör sig om kan man även dra slutsatser om var de kommer i från och även om var man kan sätta in åtgärder 11

12 för att bli av med dem. De flesta isolaten visade sig tillhöra den normala hudfloran man hittar hos kor. Man kan inte bli av med dessa bakterier helt eftersom de utgör en stor del av kons normala hudflora. I halter upp till /ml är det helt normalt att de förekommer i mjölken. Vid högre halter har dessa bakterier fått möjlighet att etablera sig och växa till i mjölkningsutrustningen. Detta extra tillskott är möjligt att bli av med genom att ha en diskrutin som avlägsnar bakterierna från utrustningen. Karakteriseringen var också nödvändig för att kunna välja representativa stammar av olika bakteriegrupper för test av värmekänslighet och diskmedelskänslighet och förmåga att bilda biofilmer. Värmeavdödning För värmeavdödning valdes 9 kocker och 1 coryneforma bakterier. Några kom från gårdar med högt antal och några från gårdar med lågt antal pastöriseringsöverlevande bakterier för att se om det fanns någon skillnad i värmetålighet mellan dem. Testtemperaturerna har lagts runt temperaturen för lågpastörisering (7 C) för att se om det var möjligt att ändra på tid eller temperatur för att minska antalet bakterier i mjölken efter pastörisering. D- och z-värden beräknades för respektive isolat då så var möjligt. D-värdet är den tid vid en given temperatur som krävs för att avdöda 9% av en bakteriepopulation. Z-värdet är det antal grader som måste läggas till för att minska D-värdet med 9%. Kockerna värmebehandlades vid 3, 7 och 73 C (Tabell ). D-värdena vid 3 C låg mellan.1 och 9 minuter, vid 7 C mellan <.1 och 7 minuter och vid 73 C mellan <.1 och 1. minuter. Exempel på avdödningskurva visas i Figur 3. Mikrokockerna var mer värmetåliga än den stafylokock (G) som testades. M1 och O5 kom från gårdar med högt antal pastöriseringsöverlevande bakterier, men var inte mer värmetåliga än U33 och U som kom från gårdar med lågt antal (Tabell ). Tabell. D-värden och z-värden för kocker vid avdödning med värme i Sörensens-buffert. Stam nummer D-värde (min), C D-värde (min) 7, C D-värde (min) 7,9 C Z-värde ( C) U U M O O i.u. i.u. M i.u. i.u. G i.u. i.u. U5.79 i.u. i.u. i.u. G.1 i.u. i.u. i.u. SMR i.u. inte utfört De coryneforma bakterierna beräknades vara mer värmetåliga än kockerna och värmebehandlades därför vid högre temperatur. Den höga temperaturen gjorde att det var svårt att hålla exakt samma temperatur för alla isolaten, därför varierar temperaturen för värmebehandlingen något mellan isolaten (Tabell 5). Vid ca 9 C uppmättes D-värden på mellan 13 och 1 minuter, vid ca 73 C låg D-värdena på.7-.5 minuter och vid ca C uppmättes D-värden på.3-7 minuter. Exempel på avdödningskurva visas i Figur 3. Liksom för kockerna sågs ingen markant skillnad i värmetålighet mellan Microbacterium/ Cellulomonas-isolat från gårdar med högt antal pastöriseringsöverlevande bakterier (M3, 1

13 U5, M99, M95) jämfört med motsvarande isolat från gårdar med lågt antal (G, O1, O, U, M1, M) (Tabell 5). O7 var mindre värmetålig än de övriga coryneforma bakterierna. U (Arcanobacterium) uppvisade hög värmetålighet. Tabell 5. D- och z-värden för coryneforma bakterier vid avdödning med värme i Sörensens-buffert. Stam nummer Temperatur ( C) D-värde (min) Temperatur ( C) D-värde (min) Temperatur ( C) D-värde (min) z-värde ( C) SMR G U M U M O O U M O M M De uppmätta D- och z-värdena visar att det inte går att öka temperaturen eller tiden vid lågpastörisering på mejeriet för att minska antalet värmetoleranta bakterier utan att påverka smak och kvalitet på produkterna. För att bli av med problemet i produkterna måste antalet pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölken minskas redan på gården. Kock U33 Coryneform M99 1 1, C 7, C 7,9 C 7, C 75 C C Figur 3. Exempel på avdödningskurvor för en kock och en coryneform bakterie. Avdödningen är utför i buffert under omrörning vid olika temperaturer. Diskförsök i lösning För diskförsök valdes 3 kocker och coryneforma stammar bland de tidigare värmebehandlade isolaten. Diskmedlen som testades var P3-Asepto flytande (Henkel-Ecolab), alkaliskt diskmedel som även innehåller klor och P3-Horolith BA flytande (Henkel-Ecolab), surt diskmedel. Diskmedlen doserades enligt tillverkarens rekommendationer. De temperaturer som valdes var och C för att avspegla rekommenderad slut- och starttemperatur. Tyvärr fanns ingen möjlighet att ändra temperaturen under diskförloppet för att motsvara vad som händer i mjölkningsanläggningen, utan all disk har skett vid konstant temperatur. 13

14 Corynefom M95 med mjölk Kock U33 med mjölk 5 1 alk C alk C surt C surt C 5 1 alk C alk C surt C surt C Coryneform G med mjölk 5 1 alk C alk C surt C surt C Coryneform U med mjölk 5 1 alk C alk C surt C surt C Kock O5 med mjölk Coryneform M99 med mjölk 5 1 alk C alk C surt C surt C 5 1 alk C alk C surt C surt C Coryneform O59 med mjölk 5 1 alk C alk C surt C surt C Kock M1 med mjölk 5 1 alk C alk C surt C surt C Coryneform G5 med mjölk 5 1 alk C alk C surt C surt C Coryneform M med mjölk 5 1 alk C alk C surt C surt C Coryneform U53 med mjölk 5 1 alk C alk C surt C surt C NaOH utan m jölk 5 1 M95 C M95 C U C U C Figur. Diskförförsök i lösning med alkaliskt diskmedel med klor och surt diskmedel. För två stammar har även disk med enbart,3% NaOH utförts. 1

15 En neutraliseringsbuffert gjordes för att neutralisera disklösningen direkt efter provuttag från kolven. Detta är nödvändigt eftersom diskmedlet annars skulle fortsätta att ha en hämmande effekt på bakterierna även på plattorna i de minst utspädda proven och man skulle få ett helt felaktigt resultat. Neutraliseringsbufferten hade i sig själv ingen effekt på bakterierna enligt de förförsök som gjordes. Ett förförsök visade att alla stammarna utom en (M95) dog mer eller mindre omedelbart då de sattes till disklösningen i rumstemperatur. Tester gjordes med tillsats av mjölk som skulle motsvara den mängd mjölk som kan finnas i anläggningen om ingen eller dålig försköljning gjorts. En bättre överlevnad uppnåddes och det beslutades att 1% mjölk skulle tillsättas till disklösningen för diskförsök med värme. För samtliga teststammar gjordes disk med alkaliskt och surt diskmedel vid och C med provuttag vid 1, 5 och 1 minuter. Försöken visar att både alkaliskt och surt diskmedel reducerar antalet bakterier med - logenheter inom 1 minuter vid båda temperaturerna för de flesta stammarna (Figur ). För U och U53 var reduktionen lägre än för de övriga vid C i alkaliskt diskmedel, 1 respektive 3 logenheter. Ett förvånande resultat var att för samtliga stammar utom O5 hade det alkaliska diskmedlet med klor bättre effekt på bakterierna vid C än vid C. Ett avdödningsförsök gjordes med M95 och U med enbart natriumhydroxid i motsvarande koncentration som i det alkaliska diskmedlet vid och C. Natriumhydroxiden hade enbart effekt på M95 vid C. Så den avdödande effekten man såg med diskmedlet beror förmodligen på kloret. Hypokloriten i klordiskmedel kan omvandlas på två olika sätt, i det ena fallet bildas en aktiv substans som är bakteriedödande och i det andra fallet bildas en inaktiv substans. Det är möjligt att det bildas mer av den aktiva substansen vid C än vid och att det är därför man ser en större effekt av kloret vid den lägre temperaturen. Men efter -1 minuter har man ändå fått en bra reduktion av antalet bakterier. Det sura diskmedlet hade däremot i samtliga fall en bättre effekt vid den högre temperaturen. Två coryneforma bakterier (M95 och U) och en kock (U33) valdes ut för mer detaljerade diskförsök med alkaliskt diskmedel med klor och mjölkrester i disklösningen. Prov togs ut vid fler tidpunkter och effekt vid fyra olika temperaturer (rumstemperatur, C, C och 7 C) studerades. Vid 7 C gjordes även försök utan mjölk i bakgrunden med M95 och U33. Resultaten redovisas i Figur 5. för de två coryneforma bakterier var avdödningen effektivast vid och C. Medan C hade sämst effekt för kocken. Både M95 och U33 avdödades effektivt då mjölk inte fanns med i bakgrunden. Som jämförelse gjordes ett motsvarande diskförsök med Escherichia coli (Figur 5). E. coli bakterierna var betydligt känsligare för diskmedlet än de pastöriseringsöverlevande bakterierna oberoende av temperatur. Mer detaljerade diskförsök gjordes även med surt diskmedel och med mjölk i disklösningen (Figur ). Försöken gjordes vid, och 7 C. Samtliga testade bakteriestammar avdödades effektivast vid högre temperatur. De coryneforma bakterierna M95, M99 och U var något mindre känsliga vid C än de övriga. Slutsatserna man kan dra är att försköljning är viktigt eftersom mjölkrester i diskvattnet ökar överlevnaden hos bakterierna. Dålig montering av rörledningar med svackor som följd bidrar också till att öka halten mjölkrester i diskvattnet även om försköljning gjorts. Om man följer de rekommendationer som finns vad gäller dosering, temperatur och tid för disk så bör man klara att avdöda denna typ av bakterier så länge de befinner sig i lösning. Även om temperaturen på diskvattnet sjunker under cirkuleringen. Underhållvärmning kan behövas för att vattentemperaturen inte ska sjunka allt för mycket. I våra försök har vi inte haft möjlighet att variera temperaturen under försökets gång för att motsvara den avsvalning av vattnet som sker under cirkulationsdisk i mjölkningsanläggningen. 15

16 Coryneform M95 alkaliskt diskmedel med mjölk 1 rumstemp C C 7 C 7 C-mjölk Kock U33 alkaliskt diskmedel med mjölk 1 rumstemp C C 7 C 7 C-mjölk Coryneform U alkaliskt diskmedel med mjölk 1 rumstemp C C 7 C Escherichia coli SMR7 alkaliskt diskmedel med mjölk rumstemp C C 7 C 1 Figur 5. Diskförsök i lösning med alkaliskt diskmedel med klor. E. coli har tagits med som jämförelse till de mer tåliga pastöriseringsöverlevande bakterierna. För M95 och U33 gjordes även försök utan tillsats av mjölk. Diskförsök med biofilmer De bakterier som användes i diskförsöken testades för förmåga att bilda biofilm. Samtliga bildade film. Två kocker (U33 och M1) och två coryneforma bakterier (M95 och M99) valdes för avdödning av biofilm. Avdödning skedde vid och C med och utan mjölk i 1

17 Coryneform M95 surt diskmedel med mjölk Coryneform G surt diskmedel med mjölk C C 7 C C C C 1 1 Kock O5 surt diskmedel med mjölk Coryneform M99 surt diskmedel med mjölk C C 7 C C C 7 C 1 1 Kock U33 surt diskmedel med mjölk Coryneform U surt diskmedel med mjölk C C 7 C C C 7 C 1 1 Figur. Diskförsök i lösning med surt diskmedel. disklösning och med både alkaliskt och surt diskmedel. För ytterligare en kock (O5) och två coryneforma (G och U) gjordes diskförsök utan mjölk. Biofilm odlades på objektsglas i särskilt slembildande medium. Alla prov gjordes som dubbelprov för att minska variationen mellan olika glas. Glasen lades i neutraliseringsbuffert efter behandling i diskmedlen och 17

18 Biofilm kock U33 utan mjölk Biofilm kock U33 1% mjölk 7 7 log cfu/cm 5 3 alk 1, C alk 3. C sur 1. C sur 3, C log cfu/cm 5 3 alk 1, C alk. C sur 1. C sur, C Tid minuter Biofilm kock M1 utan m jölk Biofilm kock M1 1% mjölk log cfu/cm alk 1, C alk. C sur 1. C sur, C log cfu/cm alk 1, C alk. C sur 1. C sur, C Biofilm coryneform M95 utan mjölk Biofilm coryneform M95 1% mjölk log cfu/cm alk 1, C alk. C sur 1. C sur, C log cfu/cm alk 1, C alk. C sur 1. C sur, C Biofilm coryneform M99 utan mjölk Biofilm coryneform M99 1% mjölk log cfu/cm alk 1,5 C alk, C sur 1.5 C sur. C Log cfu/cm alk 1,5 C alk. C sur 1.5 C sur, C Figur 7. Diskförsök med biofilm med alkaliskt diskmedel med klor och surt diskmedel, med och utan tillsats av 1% mjölk till disklösningen. 1

19 Biofilm kock O5 utan mjölk log cfu/cm alk 1, C alk 3. C sur 1. C sur 3, C 5 1 Biofilm coryneform G utan mjölk log cfu/cm alk 1, C alk.7 C sur 1. C sur,7 C 5 1 Biofilm coryneform U utan mjölk log cfu/cm alk 1, C alk. C sur 1. C sur, C 5 1 Figur. Diskförsök med biofilm med alkaliskt diskmedel med klor och surt diskmedel utan tillsats av mjölk till disklösningen. svabbades sedan med fuktade sterila bomullstops. Resultaten uttrycks som cfu/cm. I Figur 7, och 9 visas resultaten av försöken. Biofilmerna av samtliga bakterier överlevde disk bättre än bakterierna i lösning. En reduktion på -log uppmättes på 1 minuter för alkaliskt diskmedel med klor utan mjölk i disklösningen vid 1 C, och vid C var reduktionen -log på 5 minuter (Figur 7 och ). Då mjölk fanns med i disklösningen nåddes bara en reduktion på 1-3-log på 1 minuter vid 1 C, medan alkaliskt diskmedel vid den högre temperaturen ( C) hade nästan samma avdödande effekt som utan mjölk. Surt diskmedel vid låg temperatur var genomgående sämre på att avdöda biofilm än alkaliskt diskmedel med klor eller surt vid högre temperatur (Figur 7 och ). Reduktionen för det sura diskmedlet vid 1 C utan mjölk var -5-log på 1 minuter och med mjölk 1-3-log på 1 minuter. Vid den högre temperaturen ( C) nåddes en bra reduktion av antalet bakterier både utan mjölk (-log på 1 minut) och med mjölk (-log på 5 minuter). Men vid diskning med surt diskmedel satt biofilmen fortfarande kvar på glaset 19

20 även om bakterierna var döda. När man diskade med alkaliskt diskmedel med klor lossnade filmen däremot från glaset. För att ta reda på om det är kloret eller natriumhydroxiden i det alkaliska diskmedlet som får filmen att lossna gjordes diskförsök med biofilm av coryneform M95 och kock U33 med enbart natriumhydroxid. Båda biofilmerna fanns kvar som rester på glasen efter behandling. Resterna av M95 upplevdes som mer slemmig än U33. Detta kan bero på lysering av M95. Avdödningen av U33 var 1-log på 1 minuter vid 1 C och 3-log på 1 minuter vid 3 C (Figur 9). För M95 var avdödningen 3-log på 1 minuter vid 1 C och -log på 5 minuter vid 5 C (Figur 9). Detta stämmer med att M95 verkar lysera i större utsträckning än U33. Resultaten tyder också på att det behövs någon form av oxiderande ämne som klor för att avlägsna biofilmer från ytan vid disk. Biofilm kock U33 NaOH Biofilm coryneform M95 NaOH log cfu/m Tid (min) 1 C 3 C log cfu/m Tid (min) 1 C 5 C Figur 9. Diskförsök med biofilm med enbart NaOH. Ingen tillsats av mjölk har skett. Försöken visar att om man följer de rekommendationer som finns avseende dosering, temperatur och tid så klarar man att avdöda även biofilmer, förutsatt att disklösningen kommer åt biofilmen. Möjligen kan den rekommenderade sluttemperaturen på C vara i underkant. Man bör därför ha så hög starttemperaur som möjligt för att temperaturen under cirkulationsdisken inte ska sjunka alltför lågt. I den fältundersökning Svensk Mjölk gjort fann man att gårdar med hög starttemperatur, underhållsvärme och hög sluttemperatur (>5 C) vid disk genomgående hade lägre halter pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölken (Christiansson, Svensson, Ekelund, Gyllenswärd & Andersson, 3). Någon form av oxiderande ämne behövs också i disklösningen för att avlägsna biofilmer från ytorna i anläggningen. De litet olika effekterna som det sura och alkaliska diskmedlet har på bakterierna indikerar också att det är bra med växeldisk. Mjölkrester ger en ökad överlevnad, vilket indikerar att försköljning för att minska mjölkrester i anläggningen vid disk är viktig. I våra försök har disken skett vid statisk temperatur och utan någon mekanisk effekt, men det ger ändå en bild av vad denna typ av bakterier kan tänkas tåla. Det skulle ändå vara önskvärt att göra försök där påverkan av både temperatursänkningen och den mekaniska effekten kan mätas. Värmeresistenta bakterier i spån Prov på obegagnat och begagnat spån, samt tankmjölk togs in från Alnarps mellangård för att se om de pastöriseringsöverlevande bakterierna var vanliga i spån. Antalet bakterier efter värmebehandling av mjölken var 3/ml. I det obegagnade spånet hittades bara Bacillusarter efter värmebehandling. I begagnat spån hittades mest kocker, men även coryneforma bakterier och sporbildande Bacillus fanns i det begagnade spånet efter värmebehandling. I mjölken hittades enbart coryneforma bakterier. Resultatet stödjer att kockerna och de coryneforma bakterierna inte främst kommer från strömaterialet, utan kommer från kon. Dominansen av kocker i det begagnade spånet tyder på att dessa är mest

21 konkurrenskraftiga bland de pastöriseringsöverlevande bakterierna i förhållande till alla de andra bakterier som förekommer i den miljön. Att de coryneforma bakterierna dominerar i mjölken efter värmebehandling tyder på att man selekterar för dessa i mjölkningsanläggningen. Slutsatser Av de undersökta leverantörerna hade 9% förhöjda halter av pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölken. Den termotoleranta floran dominerades av coryneforma bakterier. Om man följer de rekommendationer för disk som finns idag med avseende på dosering, disktid, start- och sluttemperatur bör man klara att avdöda de pastöriseringsöverlevande bakterierna. Möjligen kan den rekommenderade sluttemperaturen på C vara något låg. Sköljning av mjölkningsanläggningen innan disk är mycket viktig för att få optimal effekt av diskmedlen. Förekomst av svackor kan medföra att mjölkrester finns kvar i anläggningen även efter försköljning och kan negativt påverka diskeffekten. Biofilmer av bakterier är mycket mer resistenta mot disk än bakterierna i lösning. Det är därför viktigt att förhindra att bakterierna får möjlighet att bilda biofilm. I en anläggning som är ren från mjölkrester finns sämre möjligheter för bakterierna att få fäste. Tack Vi riktar ett tack till de personer som hjälpt till med insamling av prov från gårdarna. Och till referensgruppen för givande diskussioner. 1

22 Referenser Angula, L., Lorenzo, A., & Riveiro, M. (199). Isolation and identification of thermoduric flora of raw cow s milk from the Province of Pontevedera. Modern Microbiological Methods for Dairy Products., International Dairy Federation Special Issue No. 91, 1-1. Bergey (19). Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, Vol..: Williams & Wilkins. Christiansson, A., Bertilsson, J., & Svensson, B. (1999). Bacillus cereus spores in raw milk: Factors affecting the contamination of milk during the grazing period. Journal of Dairy Science,, Christiansson, A., Svensson, B., Ekelund, K., Gyllenswärd, M. & Andersson, I. 3. Förekomst av pastöriseringsöverlevande bakterier i leverantörmjölk - en fältstudie. Svensk Mjölk Forskning Rapport nr. 731-I. FDA (199). Bacteriological Analytical Manual. Kolari, M., Nuutinen, J., & Salkinoja-Salonen, M. S. (1). Mechanisms of biofilm formation in paper machine by Bacillus species: the role of Deinococcus geothermalis. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 7, Mackenzie, E. (1973). Thermoduric and psychrotrophic organisms on poorly cleansed milking plants and farm bulk milk tanks. Journal of Applied Bacteriology, 3, Milne, M., Barrett, D. C., Fitzpatrick, J. L., & Biggs, A. M. (). Prevalence and aetiology of clinical mastitis on dairy farms in Devon. Veterinary Record, 151, 1-3. Ronimus, R. S., Parker, L. E., Turner, N., Poudel, S., Rückert, A., & Morgan, H. W. (3). A RAPD-based comparison of thermophilic bacilli from milk powders. International Journal of Food Microbiology, 5, 5-1. Salkinoja-Salonen, M. S., Vuorio, R., Andersson, M. A., Kämpfer, P., Andersson, M. C., Honkanen-Buzalski, T., & Scoging, A. C. (1999). Toxigenic strains of Bacillus licheniformis related to food poisoning. Applied and Environmental Microbiology, 5, SYSTAT, Statistics I, Version SPSS, Inc, Chicago IL. Thomas, S. B., Druce, R. G., Peters, G. J., & Griffiths, D. G. (197). Incidence and significans of thermoduric bacteria in farm milk supplies: A reappraisal and review. Journal of Applied Bacteriology, 3, 5-9. Wirtanen, G., Husmark, U., & Mattila-Sandholm, T. (199). Microbial evaluation of the biotransfer potetial from surfaces with Bacillus biofilms after rinsing and cleaning procedures in closed food processing systems. Journal of Food Protection, 59,