Bioteknisk metodik (1MB412) VT11 - Sammanfattning

Transkript

1 Bioteknisk metodik (1MB412) VT11 - Sammanfattning Per Enström & Eli Burell Innehåll 1 Inledning 1 2 Preparation Arbetsgång för preparation Extraktion Typiska betingelser Specifika problem Osmotisk chock Kolvhomogenisering Mixer Malning Malning med slipmedel Högtryckspress Ultraljud Kulkvarn Grovseparation Grundmekanismer fo r separation Ytterliggare parametrar vid separation Borttagande av partiklar Fa llning Att fo ra ndra ph Att fo ra ndra jonstyrkan Att fo ra ndra lo sningsmedlets polaritet Tva fasfo rdelning Kromatografisk teori Gelkromatografi Teoretiska bottnar Adsorbtionskromatografi Jonbyteskromatografi Hydrofob interaktionskromatografi Affinitetskromatografiska metoder IMAC Fa rga mnesligander Kovalent kromatografi Bioaffinitet Ickespecifika (bredspecifika) adsorbenter och metoder Affinitetsmarko rer

2 INNEHåLL 3 Analys och renhetskontroll Översikt av analysprocedurer Fysikalisk karakterisering Kemisk karakterisering Biologisk karakterisering Kvantitativ proteinanalys Bradford BCA-metoden Biuretmetoden Absorbans vid 280 och 205 nm Extinktionskoefficient Aktivitetsassay Elektroforesteori Mobilitet Fo rträngningsselektrofores Gelelektrofores med porgradient Diskontinuerlig elektrofores Isoelektrisk fokusering SDS-PAGE D-elektrofores Kapilla relektrofores DNA-elektrofores Strukturell och funktionell karakterisering Bindningsjämvikter, interaktioner mellan biopolymerer Ja mviktsdialys Hummel & Dreyer-kromatografi Partiell fyllningselektrofores Fluorescensskillnad Isoterm titreringskalorimetri Filter binding assay Surface Plasmon Resonance Fluorescens Radiationless Energy Transfer Praktiskt bruk Karakterisering av enzymer, enzyminhibering Specifik aktivitet Enzyminhibering Massrelaterade tekniker Masspektroskopi (ng) Sedimentation ( µg) Ljusspridning (> 100 µg) Membraninteraktion Krav pa ett anva ndbart la kemedel The rule of five Studier av membraninteraktion Immobiliserad liposom-kromatografi (ILC)

3 2 PREPARATION 5 Övergripande strategi och framåtblick Buffertlösningar Buffertberedning Sto rningar Flyktiga buffertar och frystorkning Avsaltning och buffertbyte Proteinveckning Termodynamiken hos proteinveckning Observationer av veckningsprocessen, cirkula r dikroism Inledning Det här dokumentet är en sammanfattning av kursen Bioteknisk metodik (1MB412) som hölls av Gunnar Johansson vid Uppsala Universitet vårterminen Sammanfattningen är baserad på föreläsningspresentationer från föreläsaren, föreläsningsanteckningar från Per Enström, Eli Burell och Johan Pettersson, kursboken Exploring Proteins (Price & Nairn) samt övriga mindre resurser. Dokumentet har blivit genomläst och rättat av Gunnar Johansson, avdelningen för biokemi och organisk kemi vid Uppsala Universitet. Vi tar inget ansvar alls för eventuella fel som finns i den här texten, trots att texten är kontrollerad bör du inte utgå ifrån att det som står här är korrekt, dubbelkolla allt. Dokumentet är heller ingen vettig källa. Vi tar heller inget ansvar för eventuella ekonomiska eller personliga förluster som sammanfattningen åsamkat. Eventuell likhet med verkliga personer, levande eller döda, är ett totalt sammanträffande. 2 Preparation 2.1 Arbetsgång för preparation Tillverkning Tillverkning av extrakt fo r vidare separation bo rjar med att man beho ver hitta ett la mpligt utga ngsmaterial. Denna procedur kan ibland involvera molekyla rbiologiskt arbete. Exempel pa arbetssaẗt kan vara att tillverka en plasmid med en gen som uttrycker det protein man a r ute efter, denna plasmid transformeras sedan in i bakterier vilka sedan selekteras. Grovseparation Grovseparationen ga r ut pa att separera det o nskade proteinet fra n restprodukter fra n tillverkningen. Anrikning Vid anrikningen o kar man koncentrationen av det o nskade proteinet pa diverse saẗt. Isolering Isoleringssteget inneba r att man separerar o nskat protein fra n andra saker i sitt prov. Ha r kan man maẗa den specifika aktiviteten, som ges av uppmaẗt aktivitet dividerat med uppmaẗt ma ngd. Eliminering 3

4 2 PREPARATION I elimineringssteget tar man bort eventuella fo roreningar i provet fo r att fa en sa ren slutprodukt som mo jligt. Stabilisering Om proteinet skall lagras eller distribueras beho ver det stabiliseras pa na got saẗt sa att det inte fo rorenas eller bryts ner under tiden. 2.2 Extraktion Val av lyseringsmetod kan baseras pa pris, tillga ng, risker, regelverk etc. Vissa metoder kan rentav vara skadliga fo r det som ska renas fram eller fo rsva ra senare reningsteg. Extraktion a r no dva ndig fo r att kunna fa fram det eftertraktade a mnet och inneba r att de celler eller va vnader som inneha ller och producerar a mnet ma ste fo rsto ras. Fo r att skydda a mnet som ska extraheras ma ste man ta ha nsyn till den miljo som den befinner sig i innan, under och efter extraktionsprocessen Typiska betingelser Typiska betingelser innefattar ph, reduktion och oxidation, tungmetaller samt hja lpfaktorer. Ett neutralt ph a r no dva ndigt fo r att skydda proteinet fra n denaturering da det liknar den intracellula ra miljo n. Antioxidanter eller reduktionsmedel kan vara no dva ndiga fo r att vidare emulera en intracellula r miljo. I vissa fall kra vs en syrefattig miljo fo r att skydda proteiner, speciellt om ursprungscellen a r anaerob. Tungmetaller har en tendens att binda till aktiva ytor hos enzymer. Detta kan motverkas genom att tillsaẗta komplexbindare som fa ngar upp dessa joner. Hja lpfaktorer sa som sna lla metalljoner och ko-faktorer kan vara en no dva ndig tillsats fo r att beha lla den tidigare miljo n eller aktiviteten hos ett enzym Specifika problem Da muskelva vnad bryts ned kan en kraftig ph-sa nkning ske da en okontrollerad glykolys uppsta r. Vid nedbrytning och so nderdelning av vaẍtdelar kan det bildas klibbiga polyfenoler som kan absorbera proteiner och fo rsva ra eller omo jliggo ra senare rening. Dessa kan motverkas med hja lp av antioxidanter. Bakterier kan vid nedbrytning la cka nukleinsyror som orsakar viskositetsproblem samt proteaser som kan skada eftertraktade protein. Inhibitorer kan anva ndas fo r att motverka proteaserna men o verdriven anva ndning kan skada det egna proteinet. Ja stceller har cellva gg som skyddar cellerna. Denna kan brytas med med hja lp av toulenautolys da r toulen anva nds fo r att skapa en emulsion som lo ser upp delar av cellva ggen. Da refter bryts de a tersta ende delarna ned av intracellula ra proteiner. Ammoniakautolys kan anva ndas fo r att lo sa upp cellmembranet men innefattar en viss risk fo r att denaturera proteiner Osmotisk chock Denna metod involverar inte na gon mekanisk a verkan pa provet. Celler lyseras da vatten snabbt stro mmar in i cellen och o verskrider cellmembranets fo rma ga att ha lla samman mot det interna trycket. Oftast tillsaẗts en lyseringbuffert som destabiliserar cellmembranet. Metoden fungerar sa mre pa celler med cellva gg men detta problem kan a tga rdas med cellva ggsnedbrytande proteiner. 4

5 2 PREPARATION Kolvhomogenisering Celler lyseras av skjuvkrafter (geometrisk transformation vid fast volym) da de befinner sig i ett litet mellanrum mellan en fast yta och en kolv i ro relse. Enligt fluidmekaniska regler a r ro relsen hos molekyler intill en yta fo rsumbart sma och kan betraktas som stillasta ende trots att fluiden i o vrigt a r i ro relse. Krafter riktade a t motsatta ha ll sliter so nder cellerna Mixer Denna metod inneba r att celler sla s so nder av roterade knivblad. Metoden fungerar da ligt gentemot encelliga organismer sa som bakterier, ja st och svampar Malning Malningsmetoder kan variera men en vanlig sa dan a r mortel och mortelstoẗ da r celler helt enkelt krossas Malning med slipmedel Fungerar i grund pa samma saẗt som malning men da r tillsatt slipmedel bidrar till krossandet av sma celler Högtryckspress En cellsuspension placeras i en kammare med ho gt tryck och pressas sedan igenom en liten valvo ppning mot en ha rd yta. Skjuvningskrafter och krocken mot den ha rda ytan fo rsto r cellerna. Metoden la mpar sig vanligtvis inte fo r stora volymer (a ven om det finns vissa tilla mpningar fo r detta) Ultraljud Ho gfrekventa vibrationer (20 50 khz, ultraljud) genereras i lo sningen med hja lp av sonder. Dessa vibrationer a stadkommer sta ende va gor som leder till kavitation 1 och kollisioner som leder till so nderdelning av celler Kulkvarn En beha llare fylls med metallkulor och prov. Vibrationer fa r metallkulorna att sla mot varandra och mal so nder provet. 2.3 Grovseparation utrustning som anva nds. Detta steg kallas ibland fo r work-up Grundmekanismer fo r separation Skillnad i vandringshastighet under inverkan fra n ett yttre fa lt. Elektrofores Sedimentation Skillnad i fo rdelning mellan tva eller flera faser. 1 Uppkomsten av gasfyllda ha lrum i vaẗskor orsakat la gt tryck. Bildas da det lokala trycker hamnar under a ngtrycket fo r vaẗskan. 5

6 2 PREPARATION Utfa llning Satsvis adsorption Tva fasfo rdelning Kromatografiska metoder Ytterliggare parametrar vid separation Vissa kemiska parametrar kan utnyttjas fo r att fa en mer specifikseparation. Dessa kemiska parametrar a r fra mst kovalenta bindningar och affinitet. Metoder som anva nder sig av kovalenta bindningar utnyttjar Cys-grupper i proteiner. Dessa kan bilda reversibla disulfidbryggor och bindas till en matris fo r att sedan lo sas upp och elueras. IMAC anva nder sig flitigt av His-metallkomplex fo r att fa nga upp proteiner. Proteiner kan modifieras med en His-svans som drastiskt o kar affiniteten till immobiliserade metalljoner. Dessa affinitetsbaserade metoder a r sa rskilt effektivt fo r proteiner. I de fall man inte vet na gonting om proteinets storlek, form eller laddning kan man separera med av seende pa funktionella egenskaper. Man fa ngar upp proteiner som utfo r en specifik handling Borttagande av partiklar Vid extraktion uppsta r det oundvikligen oo nskade restpartiklar fra n lyserade celler. Stora cellrester (sa som membran, cellva ggar och organeller) kan separeras fra n laẗtare molekyler genom centrifugering. Partiklar och a mnen som inte sedimenterar (sa som fett) kan filtreras bort med finmaskig va v. Fo r att filtrera bort partiklar pa molekyla r niva kan man anva nda sig av membranfilter. Membranfilter a r tunna polymerskikt med sma porer som tilla ter uppfa ngsten av mikroorganismer eller stora molekyler. Anva ndningen av dessa filtreringsmetoder fungerar ba st pa sma volymer. Det finns alltid en o verha ngande risk att membranen blir igenta ppta Fa llning Proteiner befinner sig i lo st tillsta nd pa grund av de interaktioner som finns mellan protein och lo sningsmedel. Genom att sto ra dessa kan man fra mja interaktioner mellan proteiner och ge upphov till icke-lo sliga proteinaggregat. De vanligaste metoderna som kan anva ndas fo r att fa proteinfa llningar a r att a ndra pa ph, att o ka jonstyrkan samt att a ndra pa polariteten hos lo sningsa mnet. Genom att anva nda sig av upprepade fa llningssteg kan man isolera proteiner utan att beho va denaturera. Det a r dessutom mo jligt att mellan steg byta fokus och utfo ra en fa llning med avseende pa nya egenskaper. Det uppsta r inga problem na r skalan fo ra ndras och fa llning har da rfo r goda industriella tilla mpningar och a r praktisk fo r tidig separation Att fo ra ndra ph Aminosyror samt karboxyl- och sidogrupper bidrar till proteinets totala laddning. Genom att fo ra ndra lo sningens ph kan man pa verka tillsta ndet hos dessa grupper. Vid den isoelektriska punkten har molekylen en nettoladdning pa noll men sidogrupper kan fortfarande ba ra pa en laddning som a r skild fra n noll. I detta tillsta nd a r de repellerande elektrostatiska krafterna mellan proteiner minimala vilket fra mjar aggregatbildning 6

7 2 PREPARATION och fa llning. Da fa tal proteiner delar pi (isoelektrisk punkt) a r det mo jligt att rena bort icke o nskva rda proteiner med denna metod Att fo ra ndra jonstyrkan Genom att tillsaẗta salter sa som ammoniumsulfat kan man minska koncentrationen vattenmolekyler som a r tillga ngliga fo r de laddade grupperna hos ett protein. Interaktioner mellan dessa grupper och vatten ansvarar huvudsakligen fo r proteinets lo slighet. De a tersta ende hydrofobiska delarna leder till o kad protein-proteininteraktion och fra mjar fa llning. Proteinkoncentrationen spelar således också en ganska stor roll. Ma ngden salt som kra vs fo r att fa lla ut ett protein beror pa hur den yttre ytan av proteinet ser ut. Man kan tack vare detta fa lla ut specifika protein med hja lp av noga koncentrationer av salt. Skulle koncentrationen av salt vara under en specifik gra ns kommer proteinet inte att fa llas ut. Det tidigare na mna a mnet ammoniumsulfat a r mycket la mpligt fo r denna typ av fa llning och anva nds flitigt. Tillsats av detta salt leder da remot till en densitetso kning som sta r i proportion till koncentrationen vilket go r att efterfo ljande centrifugering kan fo rsva ras. Ammoniumsulfat a r en svag syra och kan pa verka ph i den lo sning som den tillsaẗts till. Anva ndningen av salter kan antingen leda till att man sta rker eller fo rsvagar hydrofobiska interaktioner och som fo ljd sannolikheten fo r att fa llning sker. HP O4 2, NH+ 4 etc. sta rkerproteinstrukturen och interaktionen med vatten. ClO4, SCN etc. fo rsvagar proteinstruktur, interaktionen med vatten och kan rentav vara denaturerande Att fo ra ndra lo sningsmedlets polaritet Genom att tillsaẗta lo sningsmedel som etanol, aceton eller organiska lo sningsmedel kan man sa nkta den relativia permitiviteten i lo sningen och pa sa saẗt o ka elektrostatiska interaktioner mellan proteiner. Anva ndningen av organiska lo sningsmedel leder till la ga kostnader och mo jligheten fo r a teranva ndning av lo sningsmedlet. Man lo per da remot en mycket sto rre risk fo r att denaturera proteininneha llet. Opola ra delar av organsika molekyler kan penetrera proteinstrukturer och bryta upp tetria rstruktur. Organiska polymerer inneba r en mindre risk fo r denaturering a n rena lo sningsmedel men a r mycket dyrt. Anva ndningen av denna metod kan leda till problem med kromatografiska steg eftera t da viskositeten fo ra ndras. Polymererna a r dessutom sva ra att separera fra n proteiner pa grund av en likande karakta r storleksma ssigt. Opolo ra sidokedjor hos organsika polymerer a r i regel fo r korta fo r att orsaka denaturering Tva fasfo rdelning I en koncentrerad vattenlo sning av tva olika polymerer kan dessa vid vissa koncentrationsfo rha llanden bilda tva faser trots att de i vanliga fall skulle befinna sig i en enda fas. Faserna skiljer sig i polaritet och andelen polymerer i fel fas beror pa polymerernas la ngd. Tva vanliga polymerer som anva nds a r dextran och polyetylenglukol. Proteiner kommer ansamlas i den fas som har na rmast polaritet. Fo r att visualisera hur inneha llet i faserna varierar med koncentration anva nder man sig av en graf, se figur 1. Da man blandar tva olika polymerlo sningar med sa dan koncentration att man kommer ovanfo r binodialen kommer man att hamna la ngs en tva faslinje. De olika polymererna kommer nu att separerar till tva olika faser med sammansaẗtning enligt noderna mellan tva faslinjerna och binodialen. 7

8 2 PREPARATION Figur 1: Diagram över tvåfasfördelning, den böjda linjen kallas binodial, de diagonala linjerna kallas tvåfaslinjer och punkterna där dessa linjer möts kallas noder. 2.4 Kromatografisk teori Kromatografi a r en teknik som kan anva ndas fo r att separera eller identifiera proteiner. Alla kromatografiska metoder bygger pa att proteinet ro r sig i en mobil fas och hindras i sitt framfo rande olika mycket av en stationa r. Det finns en del olika parametrar man kan separera pa med hja lp av kromatografi; storlek, laddning eller polaritet. Det kromatografiska arbetssaẗtet a r oftast Provtillsats Lo sningen med det efterso kta proteinet tillstaẗts till kolonnen. Tvättning En buffert eller liknande anva nds fo r att tvaẗta bort rester som inte fastnat i kolonnen. Eluering Ett konkurrerande a mne i lo sning tillsaẗts till kolonnnen, detta go r att det efterso kta proteinet lossnar fra n den stationa ra fasen och elueras ut Gelkromatografi Gelkromatografi a r en kromatografisk metod som separerar proteiner baserat pa storlek. Den bygger pa att sma molekyler ga r in i den fasta fasens gelkulor matrisen medan de sto rre undviker dem och ista llet ga r rakt emellan dem, detta leder till att de sto rre molekylerna kommer ut fo rst medan mindre tar la ngre tid pa dig att vandra genom kolonnen. Ett antal olika matriser fo r gelfiltrering finns med olika stora porer, dessa go r det mo jligt att separera just det protein man har fra n resten av lo sningen. En la mplig ma ngd prov a r 3% av kolonnvolymen. Upplo sningen hos matrisen ges av R = 2S W 1 + W 2 (2.1) där S är avståndet mellan två toppar och W är bredden på de respektive topparna. 8

9 2 PREPARATION Teoretiska bottnar Teoretiska bottnar a r ett saẗt att utva rdera prestandan hos en kolonn. Tusen teoretiska bottnar motsvarar den upplo sning som man skulle fa om man ko rde tusen riktiga tva fasfo rdelningar med samma upptra dande Adsorbtionskromatografi Adsorbtionskromatografi a r en bina r teknik da r na got antingen a r helt bundet till den stationa ra fasen eller ocksa helt lo st i lo sningen. Na r man har tvaẗtat kolonnen efter att sitt prov har bundit till den stationa ra fasen eluerar man ut det protein man vill ha Jonbyteskromatografi Det finns tva typer av jonbyteskolonner, anjonbytare och katjonbytare. Tekniken fungerar sa att den stationa ra fasen inneha ller laddade grupper, proteiner tillsaẗts sedan tillsammans med en la g saltkoncentration och ett specifikt ph som go r att proteinet man vill separera fa r en motsatt laddning mot den fasta fasen. Det finns starka och svaga jonbytare, detta refererar till dess fo rma ga att beha lla laddning vid ph-fo ra ndringar; starka jonbytare ha ller sin laddning i hela ph- intervallet. Vid eluering kan man sedan a ndra saltkoncentration fo r att konkurrera ut proteinet eller ph fo r att a ndra proteinets laddning och sa ledes fa det att sla ppa. Isokratisk eluering La mpar sig ba st fo r separation av tva va ldigt lika komponenter, men tar la ng tid. Stegvis eluering Ger klumpar av eluerade komponenter, ger ett ho gt throughput men a r ka nslig fo r felaktiga fo ra ndringar i stegen. Gradient eluering Ger en ho gre throughput men komponenter har fortfarande en unik plats i kromatogramet Hydrofob interaktionskromatografi Den hydrofobiska kromattografin anva nder sig av proteiners hydrofobicitet fo r bindning till den stationa ra fasen. Vid ho g jonstyrka i lo sningen kommer proteinerna att binda till den stationa ra fasen och sedan elueras vid sa nkning av jonstyrkan hos elueringsbufferten. 2.5 Affinitetskromatografiska metoder Affinitetskromatografi bygger pa affiniteten mellan ett protein och ett annat a mne och anva nds sa ledes fra mst fo r att separera ett protein fra n icke o nskva rda produkter fra n en extraktion. Denna affinitet avser den sammanslagna effekten fra n flertalet svaga interaktioner mellan korrekt placerade atomer i en struktur. Affinitetskromatografiska metoder har sa llan ho g upplo sning tack vare de la nga interaktionstiderna (upp till flera timmar). Det a r vanligt att man anva nder sig av stegvis uppfa ngning och eluering. Metoderna la mpar sig fo r enzymer och proteiner som anva nder sig av laddade ligander. Att o ka antalet kompetetiva ligander pa skyndar inte disassociationsprocessen men kan fo rhindra att proteinet a terassocierar med ligander. 9

10 2 PREPARATION IMAC IMAC sta r fo r Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography och anva nder sig av immobiliserade metalljoner kopplade till den fasta fasen fo r att fa nga upp proteiner som har ho g affinitet till dessa metalljoner. Uppbyggnaden hos en immobiliserad ligand a r fo ljande: Matris Skaft Kelat Metalljon (ligand). Da r skaftet (spacer) inte a r en no dva ndig del av uppsta llningen. Dessa a r la nga flexibla kolkedjor som tilla ter ligander att na in till bindningsplatser som ligger skyddade i fickor eller fa ror. Det a r a ven mo jligt fo r dessa skaft att sta rka affiniteten mellan ligand och protein tack vare icke-specifik interaktion mellan kolkedjan och hydrofoba ytor som finns na ra bindningsplatsen. Kelat inneba r att tva eller fler atomer (eller funktionella grupper) binder till och koordinerar en central jon som ofta a r en metalljon. Metalljoner som ofta anva nds a r Ni 2+ och Cu 2+ som har ho g affinitet till His-grupper samt F e 3+ som har ho g affinitet till fosfatgrupper. De fo rstna mna a r popula ra da man enkelt kan ma rka ett protein med en His-svans besta ende av en kedja His-grupper. Denna svans o kar affiniteten avseva rt och pa verkar sa llan funktionen hos ett protein Fa rga mnesligander Immobiliserade kommersiella fa rga mnen binds till kolonnmatriser. Affiniteten bygger pa ba de joninteraktioner och hydrofoba interaktioner. Liganderna liknar oftast naturliga ligander till de protein som de har affinitet till. Fo rdelen med denna metod a r att det finns ett stort antal olika fa rga mnen med olika strukturer och go r att man kan finna en fa rgligand som kan leda till separering av det protein som man so ker. De kommersiella fa rga mnen som finns a r dessutom naturligt klibbiga och multifunktionella. En del av dessa a r icke-specifika och kan binda till en sto rre grupp av proteiner men de flesta är specifika och binder till en väldigt liten grupp av proteiner Kovalent kromatografi Denna metod bygger på bildandet av disulfider mellan fast fas och proteinet. Dessa reversibla kovalenta kopplingar gör att de lämpar sig för kromatografi. En viktig princip är tiol-disulfidutbyte. Då ett protein har bildat kovanlenta bindingar med den fasta fasen kan man använda sig av aktiverade tioler för att proteinet då aktiverade tioler lätt kan utföra en substitutionsreaktion. Det kan däremot uppstå problematik om det redan finns tioler i ens prov. Metoden kan även användas för att immobilisera proteiner till en yta och på så sätt skapa en proteinreaktor i kolonn eller membranform Bioaffinitet Bioaffinitet bygger pa den affinitet som finns naturligt mellan biomolekyler och dess ligander. Exempel pa denna typ av naturlig affinitet a r: enzymer och deras motsvarande inhibitorer eller ko-faktorer; receptorer och tillho rande ligander; lektiner och tillho rande sockerarter samt antikroppar och tillho rade antigener. Genom att immobilisera en av biomolekylerna (vanligtvis inhibitor, ligand, socker eller antikropp) kan man tack vare affiniteten fa nga upp matchande molekyler med varierande specificitet fo r att sedan eluera med kompetetiva molekyler som fo rdelaktigen binder svagare till biomolekylen a n den immobiliserande motsvarigheten. 10

11 3 ANALYS OCH RENHETSKONTROLL I de fall man arbetar med antikroppar finns det risk att proteinet denatureras vid elueringssteget da man anva nder sig av la gt ph och ho ga saltkoncentrationer Ickespecifika (bredspecifika) adsorbenter och metoder Bredspecifik affinitetskromatografi kan anva ndas som ett tidigt separeringssteg av ra lysat da r man utan sto rre problem kan reducera antalet proteiner i en lo sning fra n till omkring 50. Denna typ av adsorbenter a r la mpliga fo r proteiner som har starkt laddade ligander (sa som ATP, ADP, NADH och fosfoglycerat). En sa dan bredspecifik metod a r att anva nda sig av AMP-bindning. Denna molekyl fungerar som handtag fo r en stor grupp biomolekyler. Man kan exempelvis sedan eluera med ATP för att desorbera proteiner som utnyttjar just ATP Affinitetsmarko rer Genom att modifiera sitt protein med affinitetsmarko rer kan man effektivisera och fo renkla reningssteg som anva nder sig av affinitetskromatografi. Dessa marko rer ma ste uppfylla fo ljande krav: Marko ren ma ste vara en peptidsekvens sa att den kan kopplas till en del av proteinet. Bindningen mellan marko ren och den fasta fasen ma ste vara reversibel. Marko ren fa r inte sto ra proteinets naturliga funktion: den får inte påverka veckningen av proteinet, eller gå att klyva bort. 3 Analys och renhetskontroll 3.1 Översikt av analysprocedurer Fysikalisk karakterisering Fysikalisk karakterisering ga r ut pa att karakterisera proteinet baserat pa dess fysikaliska egenskaper, sa som massa, storlek, laddningsegenskaper eller spektrala egenskaper. De spektrala egenskaperna a r absorbans, fluorescens, cirkula r dikroism, IR och NMR Kemisk karakterisering Likt fysikalisk karakterisering analyseras proteinerna ha r pa dess kemiska egenskaper. Dessa egenskaper a r protein- eller nukleinsyraskevens, aminosyrasammansaẗtning, ma ngd av olika socker i en polysackarid eller identifiering av speciella kemiska strukturer Biologisk karakterisering De biologiska faktorer man kan karakterisera efter a r enzymers aktivitets- och inhiberingsmo nster, interaktion med ligander eller andra makromolekyler samt in vivo-effekter. Ett brutalt exempel pa dessa a r LD 50 -besta mning av ormgiftstoxiner pa mo ss. 11

12 3 ANALYS OCH RENHETSKONTROLL 3.2 Kvantitativ proteinanalys Kvantitativ proteinanalys anva nds da man vill analysera hur mycket av ett sa rskilt protein som finns i ett visst prov Bradford Fa rga mnet Coomassive Brilliant Blue G-250 (CBBG-250) kan binda till aminogrupper i sidokedjorna pa proteiner. Da detta ha nder a ndrar fa rga mnet fa rg fra n brunt till bla tt, denna fa rgskiftning kan sedan maẗas vid 595 nm. Eftersom olika proteiner har olika ma nga aminogrupper beror maẗva rdet pa vilket protein man arbetar med. Bradfordmetoden har ho gre ka nslighet a n Biuret, men har nackdelen att den a r individuell fo r varje protein BCA-metoden Cu 2+ -joner bildar komplex med peptidbindningarna och reduceras till Cu +. I na rvaro av BCA-reagenset bildar dessa Cu + -joner ett lila komplex med BCA som sedan kan detekteras vid 562 nm. Detta a r en va ldigt ka nslig metod och man bo r vara sa ker pa att glukos, NH 4 + eller EDTA inte finns i lo sningen da detta sto r fa rgutvecklingen Biuretmetoden Biuretmetoden inneba r att kopparjoner bildar komplex med peptidbindningarna. Dessa komplex a r fa rgade och absorbansen kan maẗas vid 540 nm. Metoden a r ganska pa litlig men inte alls sa rskilt ka nslig, stora ma ngder beho vs fo r att na got resultat skall fa s Absorbans vid 280 och 205 nm Proteiner absorberar UV-stra lning vid 280 nm, detta beror pa tyrosin-, tryptofan- och cysteinineha llet. Vet man extinktionskoefficienten fo r proteinet kan man baserat pa absorbansen ra kna ut den absoluta proteinkoncentrationen. Absrobansmetoden pa verkar inte proteinet alls, vilket kan vara anva ndbart da man beho ver fortsaẗta arbeta pa proteinet. Absorbans vid 205 nm anva nds fo r detektion av peptidbindningar, ofta i proteiner vars tyrosin-, tryptofan- och cysteinhalt a r la g. Fo r att fa ut en absolutkoncentration av protein kan man go ra maẗningar vid ba de 205 och 280 nm och applicera fo ljande formel A 205 (1mg ml 1 ) = A 280 A 205. (3.1) Absorbansen ges av Lambert-Beers lag: A = ε c l (3.2) där A är absorbansen, ε är extinktionskoefficienten, c är koncentrationen och l är strålgångens längd i spektrofotometern Extinktionskoefficient Extinktionskoefficienten fo r ett protein eller annan substans absorberar eller bryter ljus vid en given va gla ngd, per massenhet. Extinktionskoefficienten vid 280 nm kan uppskattas baserat pa inneha llet av aromatiska enheter enligt 12

13 3 ANALYS OCH RENHETSKONTROLL ε prot = 1280 N T yr N T rp + 60 N Cys. (3.3) Ekvationen ovan är baserad på att alla cysteingrupper är involverade i disulfidbryggor Aktivitetsassay I en aktivitetsassay analyserar man den katalytiska aktiviteten i ett prov. Metoden har en ganska ho g specificitet da man so ker efter ett speciellt enzym. Ka nsligheten beror bland annat pa den fo rva ntade ma ngden enzym i lo sningen. Metoden a r relativt enkel; helst utfo rs den som en realtidsaẗning i en spektrofotometer da r man kan analysera ma ngden av substrat eller produkt fo r att pa sa saẗt de hur enzymet jobbar. Substratet man va ljer kan antingen vara specifikt fo r enzymet i fra ga, antingen en konstgjord substans eller en a kta biologisk molekyl, eller specifikt fo r en sto rre grupp, exempelvis fa rgat kasein eller albumin som a r substrat fo r i princip alla proteaser. Om det varken ga r att detektera ma ngden substrat eller produkt kan man ko ra en kopplad reaktion direkt efter, da ga ller det att det fo rsta steget a r hastighetsbegra nsande sa att detektionsreaktionen inte pa verkar det faktiska resultatet. Det a r a ven mo jligt att ko ra en andra reaktion da den fo rsta na tt ett steady state, denna metod go r att man inte kan maẗa aktiviteten under pa ga ende katalysering. Produkten av den andra reaktionen bo r vara sa dan att den ga r att detektera pa na got saẗt. Realtidsassay Kan endast ko ra ett prov i taget Avslo jar om reaktioner a r linja r eller inte Slutpunktsassay Kan ko ra ma nga prov parallellt No dva ndigt om en andra reaktion skall utfo ras Ma ste kontrolleras sa att reaktionen na tt stabilt la ge 3.3 Elektroforesteori Elektrofores anva nds fo r separation och analys av proteiner och anva nder sig av laddning eller storlek som separationsparameter. Elektrofores kan ko ras antingen denaturerande eller ickedenaturerande. Elektrofores har ma nga likheter med kromatografi men anva nder sig bland annat av ett elektriskt fa lt ista llet fo r ett flo de. De flesta elektroforesko rningar go rs i na rvaro av en marko r som utgo r en referens, detta beho vs eftersom det bara a r relativa avsta nd man kan avla sa, de absoluta avsta nden och va rdena beror pa ma nga faktorer sa som tid, spa nning, mm Mobilitet Mobiliteten definieras som u = v/e (3.4) där v är hastigheten och E är fältstyrka. I en fri lo sning a r mobiliteten proportionell mot Z/R, da r Z a r elektisk laddning och R a r den hydrodynamiska radien hos jonen i fra ga. Mobiliteten pa verkas ocksa i praktiken av jonstyrkan. 13

14 3 ANALYS OCH RENHETSKONTROLL Fo rträngningsselektrofores Fo r att fa sitt prov va ldigt koncentrerat till ett litet omra de i en elektroforesgel kan man anva nda sig av fo rträngningsselektrofores. Det inneba r att provet omges av tva omra den av ett ledande ho gmobilt omra de och ett efterfo ljande la gmobilt omra de, detta leder till att molekyler fra n provet kommer att koncentreras till ett skarpt omra de mellan de ha r omra den. Detta sker genom att alla faser ro r sig lika snabbt, vilket leder till att fa ltstyrkan i det fra mre omra det kommer att bli la gre, detta leder i sin tur till att eventuella komponenter fra n mittenomra det som kommer in (eller redan a r) i det fra mre omra det kommer att ro ra sig la ngsammare och a terga till mittenfasen. Fo r att ytterliggare spearera kan en»spacer«tillsaẗtas i mellandelen Gelelektrofores med porgradient Om man vill separera proteiner med avseende pa storlek kan man anva nda sig av gelelektrofores med porgradient. Denna gel a r uppbyggd med en gradvis o kande polymerhalt, vilket leder till mindre och mindre porer i migrationsriktningen. Ha r a r laddningen endast till fo r att transportera proteinet genom gelen Diskontinuerlig elektrofores Diskontinuerlig elektrofores a r uppbyggd av tva geler. En stacking gel med la g polymerhalt da r provet a r koncentrerat med fo rskjutningselektrofores. Da refter ga r provet in i en separationsgel da r komponentenra i provet migrerar som diskreta zoner Isoelektrisk fokusering Fo r att separera proteiner med avseende pa ph anva nder man sig av isoelektrisk fokusering. I gelen kommer det att vara en ph-gradient med la gt ph vid den positiva anoden. De amfolytiska a mnena med negativ laddning kommer att migrera in i la gre ph tills de har na tt den isoelektrisk punkten, pa liknande saẗt kommer de positivt laddade komponenterna att migrera till den negativt laddade katoden. Metoden a r va ldigt exakt och kan separera proteiner som har va ldigt lika isoelektrisk punkt SDS-PAGE Vid preparation av proteinprov fo r ko rning med SDS-PAGE tillsaẗter man SDS (natriumdodecylsulfat) till lo sningen, detta kommer bilda miceller i vattnen som denaturerar proteinet. SDS klarar dock inte av att denaturera disulfidbryggor, pa grund av detta brukar ett reduceringsa mne tillsaẗtas som bryter ner a ven dessa. Da refter kommer dodecylsulfatjonerna att ineragera med proteinet och binda ungefa r en jon pa varannan aminosyra. Detta ger en enhetlig laddning o ver hela proteinet, baserat pa dess la ngd. Provet ko rs sedan genom en gel o ver en spa nning, detta kommer att separera proteinerna pa la ngd D-elektrofores En 2D-elektrofores a r en kombination av isoelektrisk fokusering och SDS-PAGE. Fo rst ko rs en isoelektrisk fokusering pa en kort remsa av gel, denna fa sts sedan pa toppen av en SDS-PAGE- gel fo r en andra dimension. Pa detta saẗt fa r man en karta o ver alla proteiner separerat pa ph och la ngd. 14

15 4 STRUKTURELL OCH FUNKTIONELL KARAKTERISERING Kapilla relektrofores Kapilla relektrofores fungerar som annan elektrofores, men i och med att sma (mindre a n 100 µm i diameter) kapilla rer av kvartsglas anva nds kan man ha ett ba rarfritt system. Eftersom det a r sa liten volym kra vs mycket sma provma ngder. La g stro mstyrka go r a ven att man kan ha va ldigt ho g fa ltstyrka utan att det blir ho g va rmeutveckling, na got som leder till att ko rtiderna blir va ldigt korta DNA-elektrofores Sma DNA-molekyler pa mindre a n 20 kb ga r att storleksseparera, men a r de sto rre a n sa blir det problem med att molekylen»ormar«sig fram. Man kan dock fa dessa stora DNA-molekyler att vandra genom matrisen genom att pulsera sa att molekylen sicksackar fram genom mediet. Omorienteringen som sker vid varje pulsskifte tar olika la ng tid beroende pa hur stor molekylen a r. 4 Strukturell och funktionell karakterisering 4.1 Bindningsjämvikter, interaktioner mellan biopolymerer Ja mviktsdialys Ja mviktsdialys kan anva ndas fo r att underso ka bindningsparametrar fo r ett protein och tillho rande ligand. Ett dialysmembran fo rses med ha l som tilla ter globula ra molekyler med en massa under 20 kda passera. Denna gra ns kan man a ndra pa genom att bearbeta membranet med diverse mekaniska och kemiska metoder. Fo rutsatt att proteinet har en massa ovanfo r membrangra nsen kommer den samt dess komplex med ligander inte kunna passera. Vid ja mnvikt kan man utfo ra maẗningar pa ba da sidor om membranet fo r att underso ka koncentrationen av fri ligand och fra n detta bera kna parametrar av intresse. Vid ja mnvikt ga ller det att: [L total ] = [L fri ] på den sidan som inte innehåller protein. [L total ] = [L fri ] + [L bunden ] på den sidan som innehåller protein. [L total ] ligandsida = [L total ] proteinsida Detta go r att man genom skillnaden i total koncentrationen av fri ligand kan bera kna hur mycket av liganden som har bundits till proteinet Hummel & Dreyer-kromatografi I denna gelkromatografimetod ja mviktas en kolonn med en ligandtyp vid en specifik koncentration. Da refter tillsaẗts en lo sning besta ende av samma ligand vid samma koncentration samt ett protein som binder till liganden. I denna lo sning har inte alla protein kopplats till ligander. Provet fa r vandra igenom kolonnen. Proteinet kommer vandra snabbare a n liganden och stoẗer sa ledes kontinuerligt pa obundna ligander som den kan binda till. Na r proteinet va l la mnar kolonnen kommer den att ba ra med sig ett o verskott av ligander som kan maẗas. Detta o verskott motsvarar ma ngden protein. Efter ligandtoppen kommer man fa en minskning i ligandkoncentration som motsvarar den ligandma ngd som tidigare toppen antagit. Det finns tva saẗt som man kan utfo ra denna metod pa. Man kan antingen la ta ligandzonen migrera i na rvaro av protein eller la ta proteinzonen vandra i na rvaro av ligand. 15

16 4 STRUKTURELL OCH FUNKTIONELL KARAKTERISERING Partiell fyllningselektrofores Fo r att separera tva enantiomerer kan man anva nda sig av elektrofores i samband med partiell fyllningsteknik. Detta inneba r att man ko r en sa kallad enquotensselektor a t motsatt ha ll. Selektorn a r specifik mot en enationmer och kan fa nga upp denna. Det leder till en fo rdro jning i dess vandringshastighet genom gelen och sa ledes till en separation mellan enantiomerer. Det finns ett antal problem kopplade till denna metod. Ett problem a r att vandringshastigheten inte a r ja mn och det a r sva rt att bera kna den genomsnittliga vandringskastigheten. Det a r a ven mo jligt fo r selektorn att ro ra pa sig men retentionen som uppsta r hos liganden a r endast beroende pa ma ngden selektor som finns, inte hur den a r fo rdelad i gelen Fluorescensskillnad Det är möjligt att med hjälp av förändringen i fluorescens mäta andelen protein som har bundit till en ligand. Jämfört med absorbans är fluorescens mycket känsligare när det kommer till komplexbildning och är mer användbart när man studerar proteinligandkomplex. Den ökade känsligheten härstammar från det faktum att fluorescens har ett mycket större omfång gällande stabiliserande energier Isoterm titreringskalorimetri När en ligand binder till ett protein sker en förändring i entalpin. Denna förändring kan mätas med känslig utrustning. Genom att använda sig av dessa mätresultat kan man få information om bindningsparametrar och interaktion. Vanligtvis har man två små kammare. En kammare är en adiabatisk kammare med mätutrustning och fungerar som referenskammare. I den andra har man ett proteinprov, en omrörare, en värmemätare och temperaturjusteringsutrustning. Ligand tillsätts med hjälp av en mikroinjektor och påverkar temperaturen i kärlet. Mängen värme som tillförs fungerar som mätdata. Denna mängd värme fås från skillnaden mellan provkammare och referenskammare Filter binding assay I denna metod har man en komponent vanligtvis den större som är adsorberad till någon typ av stödyta eller filter. Den fria komponenten markeras med en fluorescens eller radioaktivitet. Det är därefter möjligt att mäta andelen fri komponent som binder till den adsorberade. Det går att mäta kinetiska konstanter med denna metod. En vanlig kombination är protein och markerade DNA-kedjor. I detta fall används nitrocellulosapapper som inte binder DNA tack vare sin laddning Surface Plasmon Resonance SPR används vanligen för att mäta adsorpionen på en plan metallyta. Denna yta är i många fall av guld eller silver och ligger som grund för en stor del av de lab-on-a-chipteknologier som finns tillgängliga. Surface Plasmons (SP) som även kallas plasmon polaritons är ytgående elektromagnetiska vågor som rör sig i parallellt med ytan. Tack vare dess ytgående natur är den ytterst känslig för förändringar av denna yta (exempelvis adsorption av ämnen). Det är möjligt att excitera och påverka SP genom att belysa en tunn yta med laserljus. Vanligtvis totalreflekteras detta ljus. När ämnen adsoberar till ytan kommer det att leda till en förändring i SPs och som följd även de vinklar relaterade till totalreflektion. 16

17 4 STRUKTURELL OCH FUNKTIONELL KARAKTERISERING Det finns även metoder som är kopplade till vilka väglängder (färger) som reflekteras från en påverkad yta. 4.2 Fluorescens Fluorescens bo rjar med att absorption av ljusenergi o verfo r en molekyl/grupp till ett ho gre energitillsta nd. A terga ngen till grundtillsta ndet sker genom a terutsa ndning av ljus, energin kan ocksa avges som enbart va rme eller leda till att molekylen omvandlas. Det exciterade tillsta ndet varar en va ldigt kort stund. Molekylerna uppvisar specifika emissions-och excitationsspektra som sedan kan analyseras (emission är ofta mest intressant, eftersom excitation liknar absorbansspektra) Radiationless Energy Transfer RET inneba r en typ av resonans mellan olika kromoforer, emissionspektrumet hos donatorn o verlappar med excitationsspektrumet hos acceptorn. Detta kan exempelvis anva ndas fo r enzymaktivitetsmaẗningar. Om en viss substans fluorescensresonansenergi o verfo rs till en na rliggande substans kommer ingen fluorescens att uppmaẗas, om da remot ett enzym fo ra ndrar den fo rsta substansen pa na got saẗt kommer dess spektrum inte la ngre att o verlappa med den na rliggande substansen och fluorescens kommer sa ledes att kunna uppmaẗas Praktiskt bruk Fluorescens kan anva ndas fo r detektion och koncentrationsmaẗning med en ka nslighet ga nger sto rre a n absorbans och med selektivitet pa ba de emission och excitation. Fluorescensinma rkning kan anva ndas pa proteiner, aminosyror och socker fo r att analysera egenfluorescens. Om omgivningen hos en fluorescerande grupp fo ra ndras kan interaktioner fo ljas med hja lp av fluorescens. 4.3 Karakterisering av enzymer, enzyminhibering Specifik aktivitet Den specifika aktiviteten avser ett enzyms aktivitet under specifika betingelser. Parametrar som är av intresse är K M och K cat då dessa kvantitativa parametrar tillåter jämförelse mellan olika enzym eller substrat. Jämförelserna används ofta inom läkemedelsindustrin Enzyminhibering Enzymer kan inhiberas av molekyler som binder med specificitet mot biomolekylen och sänker aktiviteten på två olika sätt: kompetetivt och icke-kompetetivt. Ett enzym binder övergångstillståndet hårdare än substrat och produkt vilket gör att inhibitorer som liknar övergångstillståndet är mer effektiva för att slå ut ett enzym. Kompetetiv inhibering innebär att inhibitormolekylen tävlar mot substratet om den aktiva ytan hos ett protein men kan inte bearbetas av enzymet då det väl har bundit. Skulle koncentrationen enzym öka kan inhibitorn förlora sin effekt. Icke-kompetetiva inhibitorer binder till enzymer på en annan plats än den aktiva ytan och orsakar antingen en konformationsändring som förhindrar bearbetning av substrat eller på annat sätt sänker aktiviteten. Denna typ av inhibitor kan binda både före och efter substratbindning. En parameter som används in samband med inhibitorstudier är IC 50 som avser koncentrationen inhibitor som krävs för att sänka enzymets aktivitet till 50%. 17

18 4 STRUKTURELL OCH FUNKTIONELL KARAKTERISERING 4.4 Massrelaterade tekniker Masspektroskopi (ng) Denna metod kan anva ndas fo r att verifiera strukturen hos en molekyl. Med hja lp av spridningsmo nster fra n enzymklyvning kan man fa ett fingeravtryck fra n proteiner Sedimentation ( µg) Metoden kan anva ndas fo r att underso ka interaktioner mellan molkyler i lo sning. Vid sedimentation kan man tydligt se skillnaden i ro relse mellan monomerer och dimerer Ljusspridning (> 100 µg) Ljusspridningstekniker a r anva ndsbart da man studerar stora molekyler och komplex. Molekyler oavsett storlek saẗts i vibration na r de tra ffas av ljus. De laddade komponenterna i molekylen agerar vid vibrationer som dipoler och sa nder ut ljus. Det ljus som sa nds ut a r beroende ba de av va gla ngden fra n exitationsljuset och storleken hos molekylen. En dimer sprider dubbelt sa mycket ljus som tva monomerer och denna fo rsta rkning av spridning o kar kraftigt med molekylstorlek. Pa grund av detta ma ste man ha mycket rena prov. Ett enda dammkorn kan utan problem generera mer signal a n alla proteinmolekyler i ett prov tillsammans. Tekniken bygger pa konceptet optisk kontrast som a r kvoten mellan brytningsindex hos medium. En la g kvot mellan tva medium leder till enklare genomstro mning av ljus. Ett tydligt exempel a r torr respektive bloẗ cellulosa (papper). Den optiska kontrasten a r mindre mellan vatten och cellulosa a n mellan luft och cellulosa vilket go r att ljus laẗtare passerar genom den bloẗa varianten (man ser igenom bloẗt papper). Metoden har en ho g responstid signalma ssigt fo rutsatt att man observerar ett provflo de och ger fo rdelen att man oberverar ett ren homogen lo sning. Ljusspridning fungerar pa mycket sto rre molekyler och kan ge information om dessa baẗtre a n massspektroskopi. Det a r a ven mo jligt att fa information om stora proteinkomplex med stort antal subenheter (virus), studera diffussion och fo ra ndringar i effektiv massa. 4.5 Membraninteraktion Krav pa ett anva ndbart la kemedel Ett anva ndbart la kemedel ma ste ha en specifik effekt pa en ma lstruktur samt la g effekt pa andra strukturer, sa kallade biverkningar. La kemedlet ma ste ocksa ha en god fo rma ga att na ma let, vilket ofta inneba r att passera membraner The rule of five Som en riktlinje fo r hur ett la kemedel skall tillverkas finns The rule of five, tre punkter som alla har en femma i sina va rden. Molekylmassan skall helst vara under 500 Da fo r att den inte skall binda till fel saker. La kemedlet fa r ha ho gst 5 OH-grupper eller motsvarande fo r att kunna ga igenom membraner. log(k) fo r fo rdelningen mellan organisk fas och vattenfas skall vara under 5 fo r att inte fastna inuti membraner. 18

19 5 ÖVERGRIPANDE STRATEGI OCH FRAMÅTBLICK Studier av membraninteraktion Fo r att studera membrainteraktionen fo r en substans, exempelvis ett la kemedel, finns det ett antal olika tekniker: man kan analysera fo rdelningen mellan vatten och en organisk fas, exempelvis oktanol; man kan ko ra kromatografi med liposomer eller membrandiskar som stationa r fas; eller man kan ko ra elektrofores med liposomer eller membrandiskar tillsatta till bufferten. Diffusionsflo det per areaenhet av en substans genom ett membran ges av J = KD (C 2 C 1 ) l (4.1) da r K a r partitionskoefficienten, D a r diffusionskoefficienten av substansen inuti membranet, C 2 och C 1 representerar koncentrationen utanfo r membranet och l a r membranets tjocklek Immobiliserad liposom-kromatografi (ILC) ILC bygger pa att man immobiliserar liposomer eller lipiddiskar i en stationa r fas, antingen genom kovalent bindning eller genom att de a r infa ngade av andra fiberliknande strukturer som ha ller dem pa plats. Detta ger en sa a kta membranmiljo man kan a stakomma, och man kan la ta proteinerna vandra genom kolonnen och se hur de separeras av membran. 5 Övergripande strategi och framåtblick 5.1 Buffertlösningar En buffertlo sning bereds genom att ha ba de syran och basen i ett syra-baspar na rvarande. pht kommer att stabiliseras enligt ph = pka + log( [A-] / [HA] ). Fo rma gan fo r en buffert att stabilisera ph kallas buffertkapacitet (β) och bera knas enligt β = 2.3 [A ] [HA] [A ] + [HA]. (5.1) Fo r en given totalkoncentration av A och HA kommer buffertkapaciteten att vara ho gst da ph = pka, den a r dock god i ett sto rre intervall, vid ph = pka ± 1 kommer en tredjedel av kapaciteten att finnas kvar Buffertberedning Titrering Recept Vid titrering tas en besta md ma ngd av en svag syra eller bas varpa en start bas respektive syra sakta droppas i till o nskat ph har uppna tts. Fo r att fa r raẗt volym spa ds blandningen. Buffertekvationen kan anva ndas direkt fo r att ta fram precisa ma ngder som beho vs. A ven ha r spa ds blandningen till o nskad volym. Ett alternativ till detta a r att anva nda sig av fa rdiga stamlo sningar med syran och basen redan i raẗt koncentration, dessa kan sedan blandas med olika proportioner fo r att fa fram raẗt ph. 19

20 5 ÖVERGRIPANDE STRATEGI OCH FRAMÅTBLICK Sto rningar Da en buffert blandas kan det uppsta sto rningar. Exempel pa detta a r att pka pa verkas av temperatur, jonstyrka med mera. Jonstyrkan påverkar pk a -värdet enligt I pk a = pk a (idealt) N I (5.2) där I är jonstyrkan I = 0.5 c i Z 2 i (5.3) för alla jonslag i lösningen och N = 2Z a 1 (5.4) där Z a är laddningen hos syran. ph kan alltsa fo ra ndras vid spa dning av koncentrerade stamlo sningar eller om ph har sta llts in i en annan temperatur a n den man senare skall anva nda bufferten i Flyktiga buffertar och frystorkning Frystorkning a r en metod som kan anva ndas om man vill ha lla proteinineha llet i en lo sning eller i ett prov stabilt info r la ngtidslagring eller distribuering. Metoden go r att proteinet ha lls stabilt under en la ngre tid. Det blir dessutom mo jligt att na r som helst lo sa upp proteinet i en la mplig buffer och fortsaẗta arbete pa den. En tydlig nackdel a r att frystorkning a r mycket tidskra vande vid uppskalning av volymer. Det a r a ven no dva ndigt att nogrannt kontrollera upva rmingen av frystorkade a mnen. Om man skall frystorka lo sningar, eller lo sa upp redan frystorkade lo sningar ma ste man anva nda sig av flyktiga buffertar. Detta a r buffertar da r ba da jonerna kommer fra n flyktiga a mnen, exempelvis ammoniumacetat eller ammoniumvaẗekarbonat. Flyktiga buffertar inneha ller inte metalljoner Avsaltning och buffertbyte Om man vill byta buffert i ett prov kan man anva nda gelkromatografi eller dialys. I gelkromatografi kommer alla sma joner som finns i systemet att sla pa efter de stora molekylerna. Detta a r den ba sta metoden om man ka nner systeet va l och vet att ingenting fa ller ut. Dialys anva nder sig av diffusion, da r placerar man lo sningen i en pa se och omger den med en lo sning med den koncentrationer man vill ha, sedan byter man na gra ga nger. Detta bildar en ja mvikt innanfo r och utanfo r membranet. En gelkromatografiko rning inneba r hundratals sa dana byten och a r mycket mer effektiv Proteinveckning Ett protein kan finnas i tva huvudsakliga sekunda rstrukturer, alfahelix och betaflak. Tertia rstrukturen hos proteiner kan anta ma nga ka nda standardstrukturer. Peptidbindningarna kan endast vridas kring tva bindningar pa grund av partiella dubbelbindningar. Om man plottar dessa mo jliga vridvinklar i ett diagram fa r man en sa kallad Ramachandran plot som visar tilla tna omra den fo r vissa speciella strukturer, baserat pa prima rstrukturen hos proteinet. Pa detta saẗt kan man fo rutsa ga sekunda rstrukturen hos proteinet. 20