Fenotyper och Genotyper i Sverige och världen

Transkript

1 Fenotyper och Genotyper i Sverige och världen Jill Storry, PhD, FIBMS Docent Processledare, blodgruppsimmunologi, KIT, Lund Ordförande, ISBT Working Party for Red Cell Immunogenetics and Blood Group Terminology Institution av laboratoriemedicin Avd. för hematologi och transfusionsmedicin Lundsuniversitet Labmedicin Skåne Klinisk Immunologi och transfusionsmedicin Lund

2 Översikt av alla kända blodgruppsantigener 354 antigener orphans ABO P1PK Lewis FORS GLOB H I 6 hög-frekvens 15 i samlingar LW Xg Duffy Lutheran Indian Scianna Raph JMH Ok a 17 låg-frekvens Serologisk identitet Klassiferade beroende på hur mycket information finns

3 Översikt av alla kända blodgruppsantigener 354 antigener orphans ABO P1PK Lewis FORS GLOB H I 6 hög-frekvens 15 i samlingar LW Xg Duffy Lutheran Indian Scianna Raph JMH Ok a 17 låg-frekvens Serologisk identitet Klassiferade beroende på hur mycket information finns

4 Inte alla blodgruppsantigener finns på människor världen runt varför inte? S.k. Founder effekt PP1Pk fenotyp i Amish folket (USA), Västerbotten Jr(a ) i Roma folket från Slovakia, Japan Spontana mutationer i isolerade område, t.ex.: låg-frekvensantigener, viss saknad av hög-freqvensantigener Patogener har drivit selektion av olika mutationer att undvika/minska infektionsförmågan, t.ex. GATAmutationen i ACKR1-genen: >95% befolkning i väst Afrika är Fy(a-b-)

5 Kända receptorer på erytrocyter Blodgruppsantigen (bärare) A B H Le b I P1 Pk Patogen Giardia; Plasmodium falciparum? Pseudomonas aeroginosa Helicobacter pylori; HIV (soluble H)? Helicobacter pylori; Norwalk virus Mycoplasma pneumoniae Pseudomonas aeroginosa Pseudomonas aeroginosa P Uropathogenic Escherichia coli; Parvovirus B19; HIV? AnWj (CD44) Sl a (CR1) Dr a (DAF) GPA, GPB, GPC Fy (DARC) Diego (AE1) Ok a (Basigin) Haemophilus influenzae Plasmodium falciparum Uropathogenic Escherichia coli Plasmodium falciparum Plasmodium vivax; Plasmodium Knowlesii; HIV? Plasmodium falciparum Plasmodium falciparum

6 Vissa antigener/fenotyper tillhör olika världsdelar GUTIpp Vel- Jk(a-b-) LW(a-) pp Di(a+) Jr(a-) Yt(a-) Ge:-2 Fy(a-b-) S-s- VS+, Js(a+) Hr(B-) O h In(b-) Jr(a-) Ok(a-) MkMk Ge:-2,-3 Jk(a-b-)

7 Det betyder att vissa blodgruppsfenotyper är sällsynta i olika världsdelar Ungefär 1 per 1000 människor ska ärva en sällsynt fenotyp. Det kan vara: Saknad av en kombination av vanliga antigener Saknad av en hög-frekvensantigen Homozygoti för en recessiv gen, t.ex. Kp(b-), Rh null Arv av en regulatorisk gen Fy(a-b-), In(Lu) Att hela protein kan saknas Vel, Lan, Jr a, Jk3

8 Världen i konflikt

9 Vad har detta för betydelse på våra verksamheter? Ärftliga blodsjukdomar som kräver regelbundna transfusion SCD, thalassemi Olika blodgruppsantigen profiler, t.ex. den vanligast afrikansk fenotyp: D+C-E-c+e+, K-k+, S-s+, Fy(a-b-), Jk(a+b-) >40% i Afrika <1:1000 svenska blodgivare

10 Vad är sällsynt blod? A rare Blood type is any Blood type that is difficult to find.

11 Sällsynta fenotyper som är svart att hitta enligt ISBT RD WP Land Fenotyp Österrike Sällsynta Rh fenotyper Brasilien McLeod, K 0, Lan, U, RH: 29, RH: 17 Finland Vel, Ge: 2 Frankrike D U, hr S, hr B, Js(b ), RH: 46, Rh null, Jr(a ), Co(a b ) Tyskland Fy(a b ), In(b ), Ge: 2, 3, Kina(Hong Kong) Di(b ), Fy(a b ), Jk: 3 Oman & Indien D, In(b ), Co(a b ) Israel p, Jr(a ), O h, K 0, U, Vel Lan Italien Sc: 1, LW(a ), K 0, Jk: 3, U, Di(b ) Japan Ge, En(a ), M k M k, Lan Nederlanderna D U, Fy(a b ), D Lu(a b ), At(a ), Cr(a ) Nya Zeeland D, K 0, McLeod, p, Ge: 2, Js(b ), Spanien Yt(a ), Co(a ), Js(b ), Lan, Ge, I, Jr(a ) Schweiz Kp(b ), Vel, Pk, Jk: 3, D, K 0, Lan Storbritannien Rh null, Sc: 1. P1k, Ge: 2, 3, D, McLeod, U USA At(a ), En(a ), Hy, K 0, Cr(a ), Ge: 2, In(b ), Lan, Di(b ), Ge: 2, Jk: 3, Lu(a b ), hr S E, Gy, K: 2 Vel, Wes(b ) Nance ST. How to find, recruit and maintain rare blood donors. Curr Opin Hematol. 2009;16(6):503-8.

12 Att hitta blodgivare kräver ett aktivt program Y. Tani in: Donors with a rare pheno(geno)type. Reesink HW et al. Vox Sang 2008;95:236-53

13 Genomisk screening för högfrekvensalleler Kp(b ) HPA-1a Yt(a ) Vel Co(a ) Sc: 1 vattenkontroll Normalgivare DNA markör MSc Projekt 2014: DNA prover från 1799 blodgivare 493 bp 352 bp 303 bp 266 bp 164 bp 138 bp Sällsynta fenotyper hittades: 31 HPA-1(a ) 3 Co(a ) 2 Vel 35 Kr/test 90 mins hands-on tid

14 Patientfall Serbien

15 Ett fall utifrån Alloantikropp Anti-H uteslutat Antigen välutvecklad på navelceller

16 Grupp A RhD+ K, N, s

17

18 Antikropp till en högfrekvensantigen?

19 Varför testade vi dessa celler? Knops-system antigener påverkades inte av papain ganska vanliga nuisance (klinisk-insignifikanta) antikroppar Papain Varför testade vi dessa celler? Ingen reaktion med papain-behandlade celler i Gbg Möjlig specificitet 0 MNS, Ge, Fy, Xg a, Ch/Rg, In, JMH +/0 Yt + Cromer, Knops, Lu, Do, AnWj, Raph, Kell, LW, Sc ABO, P1, Rh, Le, Jk, Fy3, Di, Co, Ge3, Ok a, Ii, P, At a, Cs a, Emm, Er a, Jr a, Lan, Sd a, PEL, MAM, ABTI,Vel, Kx

20 IG

21 Enzymer och DTT Ingen effekt med DTT, trypsin eller pronas Svagare med α-chymotrypsin

22 Antigenkänslighet Papain Trypsin -ct Pronas DTT Möjlig specificitet Ch/Rg, Xg a In, JMH MN, En a TS, Ge2, Ge4 0/ N, Ss, Fy a /Fy b, Fy6 0/ Yt a En a FS w Lu, MER w Knops Kell w /0 0 Sc w 0 0 Do, Ge Cromer, w 0 0 LW Jk3, Fy3, Di b,co a, Ge3; Ok a, P, LKE, At a, Cs a, Emm, Er a, Jr a, Lan, PEL Kx /0 Vel Reid, Lomas Francis & Olsson: The blood group antigen factsbook 3rd ed Academic Press

23 Papain Trypsin -ct Pronase DTT Possible specificity X X X X X XX X X Jk3, Fy3, Di b,co a, Ge3; Ok a, P, LKE, At a, Cs a, Emm, Er a, Jr a, Lan, PEL IG IG Ingen anti-jr a till fenotypning

24 Reference allele ABCG2*01 encodes Jr1 (Jr a ) Phenotyp e Jr(a+) Allele Name Nucleotide change Intron/ Exon ABCG2*01 Amino acid change Null phenotypes Jr(a ) ABCG2*01N C>T Exon 4 Gln126X Jr(a ) ABCG2*01N C>T Exon 7 Arg236X Jr(a ) ABCG2*01N G>A 706C>T Exon 2 Exon 7 Val12Met Arg236X Jr(a ) ABCG2*01N C>T Exon 7 Arg246X Jr(a ) ABCG2*01N C>T Exon 4 Arg113X Jr(a ) ABCG2*01N G>T Exon 7 Gly262X Jr(a ) ABCG2*01N.06 34G>A 1591C>T Exon 2 Exon 13 Val12Met Gln531X Jr(a ) ABCG2*01N _197delATATTATCGAA Exon 2 Ile63TyrfsX Jr(a ) ABCG2*01N _543insA Exon 6 Phe182ValfsX Jr(a ) ABCG2*01N C>T Exon 7 Gln244X Jr(a ) ABCG2*01N _792delTT Exon 7 Leu264HisfsX Jr(a ) ABCG2*01N _878dupACTT Exon 8 Phe293LeufsX Jr(a ) ABCG2*01N _1112delAC Exon 9 Thr371LeufsX Jr(a ) ABCG2*01N.13 34G>A 244_245insC Exon 2 Exon 3 Val12Met Thr82HisfsX Jr(a ) ^ ABCG2*01N _1019delCTC Exon 9 Ser340del Altered phenotypes Jr(a+ w ) ABCG2*01W C>A Exon 5 Gln141Lys Jr(a+ w ) ABCG2*01W G>A Exon 16 Asp620Asn

25 ABCG2 exon 7 sekvensering Patient Kontroll c.706 C>T => p.arg236ter

26 Klinisk betydelse av anti-jr a Enligt Reid, Lomas Francis & Olsson: The blood group antigen factsbook 3rd ed Academic Press Möjlig reducerade cell överlevnade Barnet sannolikt DAT+, men. Två olika fall av fatalt HDFN Inte mycket känd

27 Vad gjorde Göteborg? Följd fostrets utveckling Med ultraljud, Doppler MCA Antikroppstitrering Köpt 4 enheter O RhD Jr(a ) från Spanien Kvinnan förlöst v. 39 Barnet var DAT+ Båda friska, inget blod behövdes

28 Patientfall Spanien

29 Ett klurigt fall hos ett DAT+ barn Gosse, född

30 Vad ska göras? DAT på barnets erytrocyter var 4+ Ökat bilirubin => tyder för hemolysis trots negativt ak.screen Mamma och barn grupperade som O RhD+ Vad det ett antikropp till en lågfrekvens ag? Vad kan/skulle göras? Eluera antikropp från barnets celler Testa mot olika celler med lågfrekvensantigener Testa mammans plasma och eluatet med pappans ery

31 Eluering Ta bort IgG (och IgM) från cellerna Syra (lågt ph) Värme (56 o C) Frys-tina Eter Antikroppen eluerades med Elu-Kit II Lågt ph lösning (0,3 M glycin-hcl, ph 3.0) Neutralisera efter eluering till ph ~7.0 ~500 ul eluat Vilka celler skulle vi testa?

32 Antikroppsscreening med eluatet Ak-screen var negativ Testade alla sällsynta celler som finns i kylen för att många högfrekvensantigener har en lågfrekvens partner Kollade också på patientdetaljer Barnet hade en Spansk efternamn

33 Tester med mammans plasma visade

34 Tester med mammans plasma visade Hög titer anti-di a

35 Anteckningar på Di a Di a och Di b är antigener i Diego blodgruppssystem på Band 3 Anti-Di a hittades först som orsaken till fatalt HDFN Di a är lågfrekvens med prevalens varierar mycket i olika världsdelar: Sydamerika >25% Chippewa indianer (Kanada) 11% Indianer (USA) 4% Kina 4 10% Japan ~13% Spanien 1% Polen 0.5% Finns inte på våra screening celler

36 Hur gick det för barnet? Behandlades först med UV-ljus, men en vecka senare behövdes en enhet barnblod Han har inte fått blod sedan dess Kontrollprov begärt om 6 mån men vi har inte fått det ännu I samband med barnets transfusion fick vi ett prov från pappan: Fenotyp Di(a+b+) Lyckad utgång men antikroppar mot lågfrekvensantigener kan vara farliga

37 Patientfall Australien

38 Storry JR, Condon J, Hult AK, Harrison A, Jørgensen R, Olsson ML. Transfusion. 2015:55:422-6.

39 Patient fall Mammans blod Grupp: A 2 B, RhD-positiv, C-c+E+e+ (sannolikt R 2 r) Negativ med anti-a1 lektin Positiv med anti-h lektin Navelsträngsblod Grupp: O, RhD-negativ, C-E-c+e+ (rr), H+ Bekräftad att mamman var mamman! Inget konstigt med andra blodgruppsantigener Polyagglutination och förvärvad B uteslutade En Svag A-subgrupp kände osannolikt p.g.a. reaktivitet CisAB?

40 Huvud ABO alleler A 1 A 2 B cdna O 1 = translated, A 1 consensus = nucleotide substitution, leading to amino acid change = translated, non-a 1 consensus

41 ABO alleler, forts. > 200 ABO alleler Mutationer ändrar: Effektivitet av glycosyltransferas att bygga antigenet Eller/och Number of alleles Unusual/weak phenotype Common/expected phenotype Specificitet av enzymet >40 olika A subgrupp alleler kodar för A svag uttryck A B O AB Blood group specificity

42 ABO Glycosyltransferas Struktur cleft Exon a. Corresponding to synthetic and naturally soluble glycosyltransferase c c b Globular enzymatically active domain Stem region Transmembrane domain Cytoplasmic tail N Proteolytic cleavage N c. C-terminal recognizes acceptor cleft N-terminal recognizes donor

43 Post-serologisk analys ABO genomisk typning DNA sekvensering ABO exoner 1-7 FACS analys Monoklonal anti-a (clone ES-15) Monoclonal anti-h (BRIC 231) 3D modelling: CN3D (

44 Resultat - Genotypning PCR-ASP/PCR-RFLP Mamma(A 2 B): A 1 B Barn(O): A 1 O 1 DNA sekvensering 311T>A i exon 6 på den A 1 allel Ny mutation! Aminosyra utbyte: Ile104Asn b-pleated sheets 2 helix Residue104 Catalytic Cleft Mn 2+ -binding DVD motif Stemregion

45 Flödescytometri med Anti-A Mamma Nyfödd Nyckel: O ery B ery A x ery A 2 ery Test ery

46 Omgruppering av barnet vid 11 månader Erytrocyter: Svaga reaktioner med anti-ab Negativ med anti-a ochanti-b Plasma gruppering: Svaga reaktioner med A 1 (4+), A 2 (1+) och B ery (2+) Reagerar lite som A x fenotyp

47 Flödescytometri med Anti-A O Nyfödd Första prov 11 månader A 2 O Senare prov A 2 A x A x O ery Första prov Senare prov

48 Flödescytometri med Anti-H Anti-H Bombay Prov 11 mån O H-antigenuttryck lika med vuxna grupp O erytrocyter A-antigenuttryck är typiskt för denna allel Antigenuttryck kom när sockerkedjer blev mogna Utökad branching p.g.a CGNT2 aktivering (I-antigenet) GT-B i mamman stödjer defektivt GT-A

49 ISBT Working party on Red Cell Immunogenetics and Blood Group Terminology 20 medlemmar

50 Från genotyp till fenotyp hur förklarar vi vad vi menar? Daniels G, van der Schoot CE, Olsson ML. Report of the Second International Workshop on molecular bood group genotyping. Vox Sanguinis 2007;93:83-88

51 ISBT blodgruppallelnomenklatur Syfte: att skapa ett internationellt plattform att namnge blodgruppsalleler med fokus på antigen-kodande polymorfismer Fokus på rapportering resultat av genomisk typning, särskilt kommersiella produkter som analysera antigen-specifika SNPs Tillhandhålla ett numeriskt system att man kan namnge nya alleler Begränsade till varianter som påverkar blodgruppsantigen uttryck Tysta mutationer får inget namn Svårt att beskriva komplex hybrid alleler

52 En tabell skapade för varje blodgruppssystem

53 En tabell skapade för varje blodgruppssystem

54 Hur stämmar genotyp med fenotyp egentligen? Möller et al. Blood Advances 2016;1(3): (27 Dec)

55 Att skapa koppling mellan genomdatabaser och blodgrupp nomenklatur

56 Erythrogene Databas Study metadata ~1.75 million bp per genom analyserade 2,504 individer från 26 populationer världen runt 43 blodgruppgener Summa nucleotider = 8,501,108,720 bp Vi identifierade 210,412 olika blodgruppalleler 50,076 SNPs 2,168 insertion/deletioner Möller et al. Blood Advances 2016;1(3):

57 Tolkning av1000g data jämfort med kända blodgruppalleler Möller et al. Blood Advances 2016;1(3):

58 Sju av 42 referens-sekvenser behövdes ändras

59 Ojämn distribution av alleler mellan olika folkgrupper

60

61 Erythrogene databasen en forward genetics arbetssätt? Kan vi använda database att prediktera nya blodgruppsantigener? Bara 241 av 1,241 upptäkta kodande varianter var kända blodgruppsalleler 200 av kvarvarande 1,000 varianter finns I glycosyltransferaser Kanske ändrar kolhydratantigenuttrycket 357 av kvarande 1,000 okända varianter ändrar aminosyror på cellytan De kan vara oupptäckta blodgruppantigener! Möller et al. Blood Advances 2016;1(3):