Jämförelse av realtids-pcr av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen

Transkript

1 Jämförelse av av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen Författare: Malin Lager, Forskning och utveckning, Länssjukhuset Ryhov, Jönköping, Sverige Anna J Henningsson, Klinisk mikrobiologi, Länssjukhuset Ryhov, Jönköping, Sverige Vivian Kjelland, Institutet för naturvetenskap, Universitetet i Agder, Forskningsenheten, Sørlandets sjukhus, Kristiansand, Norge Åshild Andreassen, Avdelningen för virologi, Folkhälsoinstitutet, Oslo, Norge Ram Dessau, Klinisk mikrobiologisk avdelning, Slagelse sjukhus, Slagelse, Danmark Sølvi Noraas, Medicinsk mikrobiologi, Sørlandet sjukhus HF, Kristiansand, Norge Ann-Cathrine Petersson, Klinisk mikrobiologi, Laboratoriemedicin, Lund, Sverige Rimtas Dargis, Klinisk mikrobiologisk avdelning, Slagelse sjukhus, Slagelse, Danmark Maria Liljeheden, Klinisk mikrobiologi, Laboratoriemedicin, Lund, Sverige Hanne Quarsten, Medicinsk mikrobiologi, Sørlandet sjukhus HF, Kristiansand, Norge Katarina Ornstein, VO Specialiserad medicin Infektion, Skånevård Kryh, Region Skåne, Sverige Tomas Bergström, Kliniska mikrobiologi, Sahlgrenska universitetssjukhuset, Göteborg, Sverige Claus Bohn Christiansen, Avdelningen för klinisk mikrobiologi, Köpenhamn, Danmark Per-Eric Lindgren, Institutionen för klinisk och experimentell medicin, Medicinsk mikrobiologi, Linköping, Sverige

2 2 Utgitt av Nasjonalt Folkehelseinstitutt og Interreg IV A-prosjektet ScandTick mars 2015 Tittel: Jämförelse av av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen Forfattere: Malin Lager, Forskning och utveckning, Länssjukhuset Ryhov, Jönköping, Sverige Anna J Henningsson, Klinisk mikrobiologi, Länssjukhuset Ryhov, Jönköping, Sverige Vivian Kjelland, Institutet för naturvetenskap, Universitetet i Agder, Forskningsenheten, Sørlandets sjukhus, Kristiansand, Norge Åshild Andreassen, Avdelningen för virologi, Folkhälsoinstitutet, Oslo, Norge Ram Dessau, Klinisk mikrobiologisk avdelning, Slagelse sjukhus, Slagelse, Danmark Sølvi Noraas, Medicinsk mikrobiologi, Sørlandet sjukhus HF, Kristiansand, Norge Ann-Cathrine Petersson, Klinisk mikrobiologi, Laboratoriemedicin, Lund, Sverige Rimtas Dargis, Klinisk mikrobiologisk avdelning, Slagelse sjukhus, Slagelse, Danmark Maria Liljeheden, Klinisk mikrobiologi, Laboratoriemedicin, Lund, Sverige Hanne Quarsten, Medicinsk mikrobiologi, Sørlandet sjukhus HF, Kristiansand, Norge Katarina Ornstein, VO Specialiserad medicin Infektion, Skånevård Kryh, Region Skåne, Sverige Tomas Bergström, Kliniska mikrobiologi, Sahlgrenska universitetssjukhuset, Göteborg, Sverige Claus Bohn Christiansen, Avdelningen för klinisk mikrobiologi, Köpenhamn, Danmark Per-Eric Lindgren, Institutionen för klinisk och experimentell medicin, Medicinsk mikrobiologi, Linköping, Sverige Bestilling: Rapporten kan lastes ned som pdf på prosjektets hjemmeside: ISBN elektronisk utgave ISBN:

3 3 ScandTick ScandTick er et Interreg IV A prosjekt i Øresund, Kattegat og Skagerrak (ØKS) regionen, og er et grenseoverskridende samarbeidsprosjekt mellom Norge, Sverige og Danmark. Bakgrunnen for prosjektet er det stadig økende problemet med flått og flåttbårne sykdommer i de skandinaviske landene, spesielt innen ØKS-regionen. De vanligste flåttbårne sykdommene er borreliose og flåttbåren encefalitt (TBE). De siste årene har stadig flere personer blitt syke etter infeksjon med flåttbårne bakterier og virus. Et forsiktig estimat viser at over mennesker i regionen ble smittet i 2011, de fleste av disse i Sverige. Trolig er antall tilfeller enda høyere, da meldingssystemene for flåttbårne sykdommer er ufullstendige. Meldingssystemene for flåttbåren sykdom i de tre landene er også forskjellige, noe som gjør at datagrunnlaget ikke blir direkte sammenlignbart. De problemene flåttbårne infeksjoner medfører er forholdsvis like i våre tre skandinaviske land, og et sterkere samarbeid over grensene vil føre til økt samlet kunnskap om flått og flåttbårne sykdommer. ScandTick ønsker å styrke kapasiteten på forskning om flått og flåttbårne sykdommer, samt å forbedre tilhørende helsetjenester. Erfaringsutveksling over landegrensene, som vil stå sentralt i prosjektet, skal blant annet forbedre diagnostikk og risikovurderinger i de tre landene. Problemene med flåttbårne infeksjoner er relativt like i de tre landene, og ved å slå sammen datamateriale fra et større område vil dette gi et større datagrunnlag som kan gi sikrere konklusjoner. ScandTicks satsningsområde er derfor økt samarbeid, for å legge til rette for at de stadig økende utfordringene knyttet til flått håndteres på best mulig måte. Oslo, Januari 2015

4 4 Innhold ScandTick 3 Jämförelse av klinisk diagnostik av borrelios i ÖKS-regionen Borrelios 5 Metod 5 Resultat 6-7 Konklusion 7 Referenser 8-9

5 5 Borrelios Fästingen Ixodes ricinus, som är vanligt förekommande i Europa, verkar som vektor vid överföring av flera humana patogener 1. En av de medicinskt mest betydande patogenerna är Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.)-spiroketen som orsakar Lyme borrelios (LB) 2. Överföringen till människa sker via fästingbett och risken att utveckla LB i Sverige är låg 3. Hud, nervsystem och leder drabbas oftast, och sjukdomsförloppet uppvisar tämligen stor variation mellan olika individer 4,5. I dagsläget ställs diagnosen LB med stöd av patientens sjukhistoria, symtom samt kliniska undersöknings- och laboratoriefynd 6. En snabb och pålitlig metod för påvisning av LB är av stor vikt 7 för att fastställa diagnos i ett tidigt skede av infektionen så att adekvat behandling kan påbörjas 8. En tidigt insatt behandling är associerad med snabbt tillfrisknande, minskat lidande och ekonomisk besparing för vården 4,8. Antikroppspåvisning i serum och cerebrospinalvätska utgör i dagsläget den huvudsakliga kliniska laboratoriediagnostiken vid detektion av LB, men kan i vissa fall kompletteras med påvisning av Borrelia-specifik nukleinsyra (DNA), odling och histologi. Då odling uppvisar hög specificitet anses den vara gold standard, men då sensitiviteten i kliniska prover är otillfredsställande och varierande (1-70 procent) 6 tillämpas inte odling inom rutindiagnostik i de skandinaviska länderna. Påvisning av DNA uppvisar en sensitivitet på procent beroende på provtagningsmaterial, och används av några laboratorier som komplement till antikroppspåvisning vid vissa indikationer utfördes en kartläggning över Borreliadiagnostiken inom Danmark, Finland, Norge och Sverige laboratorier deltog och av dessa erbjöd 6 laboratorier påvisning av Borrelia-specifikt DNA. Av dessa laboratorier var i genomsnitt 2 procent av undersökningarna positiva på prov från cerebrospinalvätska, mot 13 procent för prov från hud eller leder. Under hösten 2013 gjordes inom ramen för ScandTick en kartläggning över vilka molekylärbiologiska metoder som användes för klinisk diagnostik av LB inom ÖKS-regionen. Tre kliniska laboratorier inom ÖKS-regionen hade metoder för detektion av Borrelia-specifikt DNA som komplement till antikroppsdiagnostiken, en så kallad polymerase chain reaction (PCR)-metod. Vidare fanns även två forskningslaboratorier som utförde påvisning av Borrelia-specifikt DNA med PCR-diagnostik, vilka vore intressanta att jämföra med de metoder som används vid klinisk diagnostik. Syftet med jämförelsen är att försöka förbättra diagnostiken så att den blir mer tillämpbar i klinisk diagnostik samt likrikta tolkningen och bedömningen av resultat mellan olika laboratorier i ÖKS-regionen. Metod Påvisning av Borrelia-specifikt DNA i fästingar uppvisar en högre känslighet än i kroppsvätskor såsom serum och cerebrospinalvätska. För att utvärdera känsligheten bland metoderna som används inom ÖKS-regionen har DNA från fästingar skickats till fem laboratorier (tre kliniska laboratorier och två forskningslaboratorier). De fem laboratorierna har med sina molekylärbiologiska metoder analyserat förekomst av Borrelia-specifikt DNA och sedan rapporterat sina resultat samt diagnostiska protokoll.

6 6 Resultat Sammanställningen visade att varje laboratorium hade sitt eget diagnostiska protokoll. Vid en jämförelse mellan samtliga laboratorium fann vi samstämmiga positiva resultat hos 29/96 prover och samstämmiga negativa resultat hos 51/96 prover. Detta ger en acceptabel överenstämmelse på 83.3% när positiva och negativa resultat tolkas tillsammans. Ett laboratorium påvisade 38 positiva prover medan övriga påvisade positiva prover. Ctvärdet, ett mått på metodens känslighet och effektivitet, var generellt lägre för ett protokoll, men det förelåg inget samband mellan lågt Ct-värde och antalet positiva prover (Tabell 1). Tabell 1. Borreliadiagnostik: Resultat och PCR**-metoder som används för påvisning av Borrelia-specifikt DNA vid kliniska laboratorier samt forskningslaboratorier i ÖKS-regionen. Laboratorium PCR-metod Referens Antal positiva Institutitionen för Csv*, hud, naturvetenskap ledvätska, fästingar: Universitetet i Agder Kristiansand (Forskningslaboratorium) regioner i 16S rrna-genen amplifieras med Tsao et al. 10, (modifierat)**** Medelvärde Ct*** 34 Ct Medel = 32,5 Klinisk mikrobiologi Länssjukhuset Ryhov Jönköping (Forskningslaboratorium) nested PCR av rrs (16S)-rrl (23S) intergenic-spacer (IGS) regionen följt av sekvensering Fästingar: regioner i 16S rrna genen amplifieras med Bunikis et al. 11, Portnoi et al. 12 (modifierade)**** Wilhelmsson et al Ct Medel = 35,9 Klinisk mikrobiologi Laboratoriemedicin Lund (Kliniskt laboratorium) nested PCR av 5S- 23S rrna intergenic-spacer (IGS) regionen följt av sekvensering Csv *, hud, ledvätska: regioner i 16S rrna-genen amplifieras med Postic et al. 14 Tsao et al Ct Medel = 33,1

7 7 Medicinsk mikrobiologi Sørlandet sjukhus HF Kristiansand (Kliniskt laboratorium) nested PCR av ospa-genen följt av sekvensering Csv*, hud, ledvätska: regioner i 16S rrna-genen samt OspA-genen amplifieras parallellt och analyseras med Ornstein et al. 15 Tsao et al Ct Medel = 31,5 Gooskens et al. 16 Klinisk mikrobiologisk avdelning Slagelse sjukhus Slagelse (Kliniskt laboratorium) Utförs inte Csv*, hud, ledvätska: regioner i 16S rrna-genen amplifieras med Tsao et al Ct Medel = 30,5 nested PCR av ospa-genen följt av sekvensering Ornstein et al. 15 * Csv: cerebrospinalvätska. ** PCR: polymerase chain reaction. *** Medelvärdet av prover som uppnår detekterbara nivåer DNA. **** Modifierade protokoll finns sammanställda i Kjelland et al. 17 Konklusion Jämförelsen mellan de olika laboratorierna i ÖKS-regionen visar att samtliga laboratorier, både kliniska laboratorier och forskningslaboratorier, använder PCR-baserad diagnostik för DNApåvisning. Dock varierar protokollen samt dess sensitivitet och specificitet mellan laboratorierna. Eventuella skillnader avser vi att systematiskt analysera vidare genom att jämföra de olika testprotokollen samt försöka att optimera olika steg i analyserna. Förhoppningsvis kan resultaten utgöra ett stöd för kliniska laboratorier i valet av analysmetod så att den molekylärbiologiska diagnostiken i regionen kan förbättras. Detta är till stor nytta för befolkningen, då rätt diagnos och behandling givetvis är högsta prioritet för alla som drabbas av en Borrelia-infektion.

8 8 Referenser 1 Belova, O. A., Burenkova, L. A. & Karganova, G. G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid ticks--evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks and tickborne diseases 3, , doi: /j.ttbdis (2012). 2 Berglund, J. et al. An epidemiologic study of Lyme disease in southern Sweden. The New England journal of medicine 333, , doi: /nejm (1995). 3 Fryland, L. et al. Low risk of developing Borrelia burgdorferi infection in the south-east of Sweden after being bitten by a Borrelia burgdorferi-infected tick. International journal of infectious diseases : IJID : official publication of the International Society for Infectious Diseases 15, e , doi: /j.ijid (2011). 4 Berglund, J., Stjernberg, L., Ornstein, K., Tykesson-Joelsson, K. & Walter, H. 5- y Follow-up study of patients with neuroborreliosis. Scandinavian journal of infectious diseases 34, , doi: / (2002). 5 Vrethem, M. et al. Chronic symptoms are common in patients with neuroborreliosis -- a questionnaire follow-up study. Acta neurologica Scandinavica 106, (2002). 6 Stanek, G. et al. Lyme borreliosis: clinical case definitions for diagnosis and management in Europe. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 17, 69-79, doi: /j x (2011). 7 Mygland, A. et al. EFNS guidelines on the diagnosis and management of European Lyme neuroborreliosis. European journal of neurology : the official journal of the European Federation of Neurological Societies 17, 8-16, e11-14, doi: /j x (2010). 8 Henningsson, A. J., Malmvall, B. E., Ernerudh, J., Matussek, A. & Forsberg, P. Neuroborreliosis--an epidemiological, clinical and healthcare cost study from an endemic area in the south-east of Sweden. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 16, , doi: /j x (2010). 9 Dessau, R., Eliasson, I., Skarpaas, T. & Nyman, D. Report from a survey of laboratory methods used in Scandinavia. Testing for Lyme Borreliosis in the Nordic countries-variations in strategies and rate of seropositivity (2011). 10 Tsao, J. I. et al. An ecological approach to preventing human infection: vaccinating wild mouse reservoirs intervenes in the Lyme disease cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, , doi: /pnas (2004). 11 Bunikis, J. et al. Sequence typing reveals extensive strain diversity of the Lyme borreliosis agents Borrelia burgdorferi in North America and Borrelia afzelii in Europe. Microbiology 150, , doi: /mic (2004). 12 Portnoi, D. et al. A single-run, real-time PCR for detection and identification of Borrelia burgdorferi sensu lato species, based on the hbb gene sequence. FEMS microbiology letters 259, 35-40, doi: /j x (2006). 13 Wilhelmsson, P. et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of clinical microbiology 48, , doi: /jcm (2010).

9 9 14 Postic, D., Assous, M. V., Grimont, P. A. & Baranton, G. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato evidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf (5S)-rrl (23S) intergenic spacer amplicons. International journal of systematic bacteriology 44, (1994). 15 Ornstein, K. & Barbour, A. G. A reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay of Borrelia burgdorferi 16S rrna for highly sensitive quantification of pathogen load in a vector. Vector borne and zoonotic diseases 6, , doi: /vbz (2006). 16 Gooskens, J., Templeton, K. E., Claas, E. C. & van Dam, A. P. Evaluation of an internally controlled real-time PCR targeting the ospa gene for detection of Borrelia burgdorferi sensu lato DNA in cerebrospinal fluid. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 12, , doi: /j x (2006). 17 Kjelland, V., Stuen, S., Skarpaas, T. & Slettan, A. Prevalence and genotypes of Borrelia burgdorferi sensu lato infection in Ixodes ricinus ticks in southern Norway. Scandinavian journal of infectious diseases 42, , doi: / (2010).