Arbuskulär mykorrhiza och saltstress Natriumklorids inverkan på symbiosen mellan Rhizophagus intraradices isolat BEG 141 och Medicago truncatula.

Transkript

1 EN BIOLOGISK STUDIE VID POLHEMSGYMNASIET, GÖTEBORG I SAMARBETE MED GÖTEBORGS UNIVERSITET Arbuskulär mykorrhiza och saltstress Natriumklorids inverkan på symbiosen mellan Rhizophagus intraradices isolat BEG 141 och Medicago truncatula. Johan Davidsson; Gustav Algestrand Vt 2013 Handledare: magister Bo Widerberg vid Polhemsgymnasiet, Göteborg och postdoktor Jenny Carlsson vid institutionen för biologi och miljövetenskap, Göteborgs Universitet.

2 Vi vill gladeligen tacka vår handledare postdoktor Jenny Carlsson för hjälpen vi har fått och den stora mängden energi och intresse hon tillägnat projektet. Tack till magister Bo Widerberg, vid Polhemsgymnasiet för bistånd, respons och kritik. Tack till ansvariga för möjligheten till samarbetet mellan Polhemsgymnasiet och Göteborgs Universitet, grunden till det som gjorde projektet möjligt. 1

3 SAMMANFATTNING Projektets syfte var att, i samarbete med handledare vid Polhemsgymnasiet och Göteborgs Universitet, undersöka huruvida och, i sådant fall, hur odlingsmedier med olika natriumkloridkoncentrationer påverkar fotosyntesen hos växten Medicago truncatula via arbuskulär mykorrhiza(am), bildad tillsammans med svampen Rhizophagus intraradices isolat BEG 141. Studien är baserad på observationer och mätdata som inkluderar grupperna AMplantor, NAM-plantor(Non(dvs. saknad av) arbuskulär mykorrhiza) samt NAMPi-plantor(NAM med tillskott av fosfat). Projektet var uppdelat i två steg. Under växternas fem veckor i växtstadiet utfördes omfattande observationer och undersökningar varav individuell och generell jämförelse, bladräkning och fluorescensmätning. Efter fem veckor skördades växterna och skottens samt rotsystemens torrvikt bestämdes. Därefter följde en infärgning av rötterna som sedan kunde lägga grund för uppskattade värden av svampens utbredning på samtliga rotsystem. Sista steget var att med hjälp av spektrofotometri avgöra respektive individs klorofyll- och karotenoidkoncentration. Resultaten visade att i jämförelse med resterande grupper och behandlingar, hade AM-växter odlade i högre saltkoncentrationer, allmänt lägre biomassa till skotten räknade, samt fler indikationer på stress, sämre fotosyntes och högre mortalitetsfrekvens. 2

4 INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1 Inledning Teori Medicago truncatula Rhizophagus intraradices Mykorrhiza Allmänt om mykorrhiza Arbuskulär mykorrhiza (AM) Växters Påverkan av Natriumklorid Osmos Transpiration Fotosyntes Karotenoider Odlingsmetoder Analysmetoder Spektrofotometri Fotosynteseffektivitet (pocket pea) Rotinfärgning Metoder och materiel Förberedelse av agarplattor Blandning av näringslösning Utvinning av frön och plantering på agarplattor Plantering av frön i krukor Gallring av groddar Observationsmetoder Generella observationer

5 3.6.2 Pocket pea Skörd Rotinfärgning Färgning Förberedning av preparat Analys av preparat Mätning av klorofyll- och karotenoidkoncentraion Resultat Generella observationer Observationstillfälle 1 Datum Observationstillfälle 2 Datum Observationstillfälle 3 Datum Observationstillfälle 4 Datum Observationstillfälle 5 Datum Antal blad Pocket pea pi Individuella värden Generella värden Fv/Fm Torrvikt Skott Rotsystem Rotsystem/Skott Rotinfärgning Individuell fördelning

6 4.5.2 Fördelning över behandlingar Klorofyll Koncentration X/NAM_ Karotenoider Koncentration X/NAM_ Diskussion Generella observationer Observationstillfälle Observationstillfälle Observationstillfälle Observationstillfälle Observationstillfälle Antal blad NAM NAMPi AM Pocket PEA Fv/Fm PI Torrvikt Skott Rotsystem Rotsystem/Skott Rotinfärgning

7 5.6 Klorofyllkoncentration Karotenoidkoncentration Övergripande felkällor Slutsatser Generella observationer Antal blad Pocket PEA Torrvikt Rotinfärgning Klorofyll Karotenoider Källförteckning Bilagor Data Pocket Pea Antal blad Vikt Mykorrhiza Spektrofotometri Bilder Växter

8 1 INLEDNING Symbiosen kallad mykorrhiza är ett utbyte mellan svamp och växt som sker i växtens rötter. Svampen gör det möjligt för växten att komma åt fler näringsämnen i jorden och i utbytet förvärvar svampen kolhydrater från växten. Detta gör att en mykorrhiza-växt är mycket konkurrenskraftig i miljöer med begränsade näringsresurser. Det finns till och med hypoteser som antyder att mykorrhiza spelande en avgörande roll i växternas exploatering av jorden under devon 1. (Nationalencyklopedin) Den mykorrhiza-bildande svampens förmåga att öka näringstillgången för växter har gjort den intressant i debatten om övergödning och det är en av anledningarna till varför man idag så aktivt forskar kring ämnet. Är det möjligt att kunna reducera gödsling på ett fält om odlingen har blivit behandlad med mykorrhiza-bildande svampar? (SLU) Frågan vi tänkte oss var om det möjligen finns särskilda fall där relationen mellan svamp och växt inte är mutualistisk. Där symbiosen rent utav bidrar med en negativ effekt till någon av eller båda parterna. Tillsammans med vår handledare vid Göteborgs Universitet, postdoktor Jenny Carlsson bestämde vi oss för att undersöka hur en modellärtväxt kallad Medicago truncatula infekterad av mykorrhiza-modellsvampen Rhizophagus intraradices isolat BEG 141, påverkas vid utsättning av högre saltkoncentrationer i form av natriumklorid. 1 Devon geologisk period; varade för mellan 416 och 259 milj år sedan (Nationalencyklopedin) 7

9 2 TEORI 2.1 MEDICAGO TRUNCATULA Medicago truncatula är en klöverliknande växt som både används till genomisk forskning och som djurfoder, främst i Australien. Den blir mellan 10 och 60 cm lång inkluderat de trelobiga bladen. Bladen är rundade och ofta med en mörkare fläck i mitten. Medicago truncatula binder symbioser med mykorrhiza-bildande svampar (Wikipedia) Allmänt för växter sker upptagning av oorganiska joner (exempelvis Na + och Cl - ) sker genom epidermis Exempel på modellvästen M. truncatula hämtad från projektet. Bild Gustav Algestrand 2.2 RHIZOPHAGUS INTRARADICES Tidigare Glomus irregulare, är en arbuskulär mykorrhizabildande svamp som är beroende av en värdväxt för att kunna reproducera sig. Svampen bildar symbiotiska förhållanden genom att bilda arbuskler inuti växters rotceller och hyfer som fäster på utsidan av rotcellerna och även sträcker sig ut i jorden. Majoriteten av utbytet mellan växten och svampen sker i arbusklerna där svamper får kolhydrater och bidrar med näringsämnen som fosfat till växten. Svampen kan även skydda växten mot skadedjur. (Nationalencyklopedin) 2 Ett skyddande ytterlager på växter och vävnader som inte har sekundär tillväxt. Motsvarar barken (peridermis) på växter med sekundär tillväxt. (Wikipedia) 8

10 2.3 MYKORRHIZA ALLMÄNT OM MYKORRHIZA En symbios mellan svampars mycel 3 och växters rötter. Ett utbyte sker där svampen främst får kolhydrater och själv ger växten större tillgång till vatten och salter i jorden. Svampen kan också ge växten ett bättre skydd mot sjukdomar. Mycelet fungerar som en utvidgning av rotsystemet och därmed blir växtens näringsupptag mer effektivt (Nils Lundqvist) ARBUSKULÄR MYKORRHIZA (AM) Mykorrhiza med dess utbyte av kolhydrater och näringsämnen. Bild: (Adolfsson, Carlsson, Schoefs, & Spetea, 8 Februari 2013) Arbuskulär mykorrhiza(am) eller vesikulärarbuskulär mykorrhiza är den vanligaste typen av mykorrhiza. Det som utmärker den här sortens mykorrhiza är att den bildas både i och runt växtens rotceller. I cellerna bildar svampen arbuskler som kan liknas vid träd. Det är i arbusklerna som den största delen av utbytet mellan svampen och växten sker. Svampen kan också bilda vesiklar både i och utanför rotcellerna. Vesiklarna tros användas som förvaringsutrymme för svampen. Svampens hyfer omger inte bara rotceller utan växer även utåt i jorden. Det är genom hyferna som svampen tar upp näringsämnen. (Raven, Evert, & Eichhorn, 2003) Arbuskulär mykorrhiza under mikroskop. Arbuskler som mörkare koncentrerade områden och hyfer som mörka trådar. Bild: (Wikipedia) 3 Mycel celltrådsnätverk hos svampar. (Nationalencyklopedin) 9

11 2.4 VÄXTERS PÅVERKAN AV NATRIUMKLORID Ett tidigare experiment visar att Medicago truncatula hämmas i tillväxt om den utsätts för en bevattning med en saltkoncentration på mm efter en vecka. Detta har påvisats både i lab-miljö och i växthusmiljö. (Merchan, Crespi, & Frugier, 2007) Na + - och Cl - -joner är egentligen nödvändiga för växter, men om de utsätts för en för hög mängd av jonerna blir de flesta stressade. Det är bara halofyter 4 som inte blir stressade. Olika växter blir påverkade på olika sätt och reagerar på olika sätt. Vissa tar inte upp överblivet salt, vissa tar upp salt men utsöndrar det sedan via bladen och vissa använder vakuolerna i cellerna för att förvara överblivet salt. Höga halter av Na + kan orsaka inaktivering av enzymer och dessutom bromsa proteinsyntes. (Taiz & Zeiger, 2002) Höga halter av Na + och/eller Cl - i kloroplasterna hämmar fotosyntesen. (Taiz & Zeiger, 2002) 2.5 OSMOS Osmos är när vatten som lösningsmedel diffunderar från en lägre saltkoncentration till en högre t.ex genom ett cellmembran. Osmos hjälper därför växter att suga upp vatten från marken och det skapar också ett tryck som håller bladen utspända. (Nationalencyklopedin) 2.6 TRANSPIRATION Transpirationen är avdunstningen av vatten vid växtbladens klyvöppningar och detta medför en avkylning av bladet vilket skapar ett undertryck i växtens xylem 5 som orsakar en transport av vatten och olösta ämnen. (Nationalencyklopedin) 2.7 FOTOSYNTES Växter använder ljus för att omvandla koldioxid och vatten till syre, kolhydrater och vatten: koldioxid + vatten + ljusenergi socker (glukos) + syre I fotosyntesen är det klorofyll, växtens gröna färgämne i kloroplasterna 6 som tar upp ljuset. Kolhydraterna som bildas använder växten för att växa och lagra energi. (Nationalencyklopedin) 4 Halofyt - växter som är extremt salttåliga och/eller lever i ett område med hög salthalt i marken (Wikipedia) 5 Xylem växtens ledningssystem i vilken vatten och oorganiska ämnen transporteras (Nationalencyklopedin) 6 Kloroplaster växtorganeller i vilka fotosyntesen sker (Nationalencyklopedin) 10

12 2.8 KAROTENOIDER Karotenoider är ett s.k. antipigment som i växter leder ljusenergin till själva fotosyntesen. Fungerar också som solskydd för klorofyll. Karotenoider är också antioxidanter som förhindrar bildningen och effekterna av syreradikaler 7. (Nationalencyklopedin) 2.9 ODLINGSMETODER Anledningen till fröna odlas på agarplattor är att de på så sätt får en snabb groning och att förenkla arbetet med att välja ut passande frön vilka har minst en cm lång hypokotyl 8 och samtidigt saknar krok på rotspetsen. (postdoktor Carlsson, Alternativa källor, 2013) Plantorna odlas i en blandning av odlingsmedium Agsorb 9 - terra green(i princip kattsand), ett poröst sandliknande medium som gör att det kan behålla fukt och näring bättre än vanlig jord, och två olika inokulum: AM respektive NAMinokulum. Båda sorterna innehåller terra green, purjolöksrötter och rester från LANS. Skillnaden är att AM-inokulumet innehåller svamp och det gör inte NAM-inokulumet Tanken är att alla Plantor ska ha samma förutsättningar och bas, svampinnehållet som enda undantag. (postdoktor Carlsson, Alternativa källor, 2013) Odlingsubstrat och inokulum tillblandas. Bild: Gustav Algestrand 2.10 ANALYSMETODER SPEKTROFOTOMETRI Spektrofotometri också kallad ljusabsorptionsspektrometri eller absorptionsspektrofotometri är ett sätt att mäta(ofta lösta) provs absorbans vid ett visst antal frekvenser för att sedan kunna bestämma koncentrationen av de lösa delarna i blandningen. Metoden utförs med en spektrofotometer i vilken ljusstrålar med bestämda våglängder skickas mot ett preparat. Spektrofotometern mäter vilka våglängder av ljuset som absorberas av preparatet och hur hög intensiteten av det absorberade ljuset är. (Nationalencyklopedin) 7 Syreradikal - skadliga oxiderande föreningar. (Nationalencyklopedin) 8 Hypokotyl -del på groddplanta mellan rotanlaget och groddbladens fäste. (Nationalencyklopedin) 9 (Agsorb) 11

13 För att räkna ut den totala klorofyll- och karotenoidkoncentrationen används formlerna: - För klorofyll: (Chl a+b) = 4,44A ,71A 653 µg/ml - För karotenoider: (Chl x+ c) = (1000A 470-2,86 Chl a - 129,2 Chl b )/245 (Lichtenthaler & Wellburn, 1983) FOTOSYNTESEFFEKTIVITET (POCKET PEA) I växters blad finns klorofyll som absorberar ljus. Då klorofyllet absorberar ljuset exciteras en elektron vilket ger molekylen högre energi, men också gör den instabil. Energin kan antingen användas till fotosyntesen genom donering av elektronen till en annan molekyl eller så kan den strålas ut i form av fluorescens när elektronen faller tillbaka. Om något skulle påverka fotosyntesen så att energin som går åt till den minskas skulle detta innebära en ökning av energi som strålas ut som klorofyllfluorescens. Därmed kan man märka om en växt utsätts för stress som på något sätt försämrar energiöverföringen till fotosyntesen. Stressen skulle leda till att mer energi strålades ut som klorofyllfluorescens. Fv/Fm-värdet som mäts med Pocket PEA(se fig ) är ett mått på den maximala effektiviteten i fotosystem två i fotosyntesen och kan ge indikationer på om växter är stressade eller inte. Ett värde på ungefär 0,85 innebär att växten mår bra. (Hansatech Instruments, 2006) Man ska dock inte fokusera för mycket på de absoluta värdena, utan det är viktigt att jämföra värdena för de olika plantorna med varandra. Det finns inget absolut värde för alla olika växter i världen som ses som optimalt. Optimala värden varierar mellan olika arter. (postdoktor Carlsson, Alternativa källor, 2013) PI, eller Performance Index, är också ett mått på hur bra fotosyntesen fungerar i en växt. Skillnaden mellan PI-värdet och Fv/Fm-värdet är att PI-värdet beräknas utefter fler parametrar. Det är därför ett bättre mått på hur bra fotosyntesen fungerar, om man vill se till helheten. (Continuous Excitation Chlorophyll Fluorescence Measurement) En Hansatech Pocket PEA chlorophyll fluorimeter (Hansatech Instruments). Bild: Gustav Algestrand 12

14 ROTINFÄRGNING Rotinfärgning är en metod att fastställa en svamps när- respektive frånvaro samt att räkna ut: - Frekvensen av mykorrhiza i rotsystemet(f%) - Mykorrhizakoloniernas intensitet i rotsystemet(m%) - Arbuskulära densiteten i de mykorrhiziella delarna av rotsystemet(a%) (INRA DIJON, 2001) Det första steget i rotinfärgningen är att tillsätta kaliumhydroxid. Detta görs för att rötterna skall förstöras något så att bläcket kan tränga in i rötterna och färga svampen och arbusklerna. Man avslutar processen genom att tillsätta ättiksyra. Den har till uppgift att skölja bort färg som inte sköljts bort av destillerat vatten och hjälper dessutom till att fixera färgen. (postdoktor Carlsson, Några frågor och lite problem, 2013) 13

15 Färgade rötter observeras under mikroskop. Enligt mallen underst på föregående sida uppskattas varje enskild rotdels mykorrhiziella kolonisationsstorlek på en värdeskala mellan 0 till 5 och densitet mellan A1, A2 och A3. Värdena sätts in i tabell som på nästkommande sida är illustrerad och utefter den beräknas, mha formlerna nedan: F% = (N fragments with mycorrhiza / N total number of fragments ) * 100 M% = (95n5 + 70n4 + 30n3 + 5n2 + n1) / N total number of fragments A% = a * (M/100) (INRA DIJON, 2001) Conclusion A3 A2 A1 A0 A3 A2 A1 A0 A3 A2 A1 A0 A3 A2 A1 A0 A3 A2 A1 A Total Total 0 14

16 3 METODER OCH MATERIEL 3.1 FÖRBEREDELSE AV AGARPLATTOR 1. En enlitersflaska fylldes med 500 ml milliq-vatten (dubbeldestillerat vatten). 2. 3,5 g bacto-agar tillsattes. 3. Locket skruvades löst på och bägaren autoklaverades i femton minuter i 120 C 4. Ett dragskåp rengjordes grundligt med etanol (koncentration = 70%). 5. Petriskålar fylldes till hälften med Bacto-agar 6. När Bacto-agaren hade stelnat vändes petriskålarna uppochned, täcktes med aluminiumfolie och placerades därefter i ett kylrum (4 C). 7. Alla använda ytor desinficerades åter. 3.2 BLANDNING AV NÄRINGSLÖSNING 1. En liter av lösning A blandades. Följande ämnen (inklusive deras slutliga koncentrationer) löstes i milliq-vatten: MnSO 4 * H 2 O Koncentration: 0,010 mm CUSO 4 * 5 H 2 O Koncentration: 0,001 mm ZnSO 4 * 7 H 2 O Koncentration: 0,001 mm H 3 BO 3 Koncentration: 0,050 mm NaCl Koncentration: 0,100 mm 2. En liter av lösning B blandades. Ämnet (NH4)6Mo7N6O24 * 4H2O löstes i milliq-vatten så att den slutliga koncentrationen blev 0, mm 3. 0,1M FeNa EDTA-lösning blandades 4. En liter modifierad LANS (Long Ashton Nutrient Solution) blandades. Följande ämnen (inklusive deras slutliga koncentrationer) löstes i milliq-vatten: KNO3 Koncentration: 8,000 mm Ca(NO 3 ) 2 * 4 H 2 O Koncentration: 8,000 mm MgSO 4 * 7 H 2 O Koncentration: 1,500 mm 15

17 Lösning A - 10 ml Lösning B - 1 ml FeNa EDTA-lösning - 5 ml Koncentration: 0,05 mm Vid bevattning av plantorna tillsattes 100 ml av den modifierade LANS:en i en enlitersflaska. Beroende på vilka plantor som skulle vattnas tillsattes även: 0 eller 5 ml 1M fosfatlösning (lösning av NaH 2 PO 4 * H2O) 0, 50 eller 100 ml 1M NaCl-lösning. Sedan fylldes flaskan upp till en liter med milliq-vatten. 3.3 UTVINNING AV FRÖN OCH PLANTERING PÅ AGARPLATTOR 1. De inkapslade fröna lades i vatten. 2. Efter en liten stund påbörjades utvinning av frön. Kapslarna drogs i ändarna och blev då spiralformade. Den tekniken tillsammans med vätningen av kapslarna underlättade processen frön slipades försiktigt med sandpapper i en petriskål. 4. Fröna placerades i en te-sil Fröna ovan slipades med sandpapper. Bild: Gustav Algestrand 5. En klorinlösning (koncentration: 3%) blandades till och hälldes i en bägare. 6. Te-silen med fröna placerades i bägaren i fem minuter. 7. Te-silen sköljdes med destillerat vatten 5 gånger. 8. Fröna fördelades jämnt i fyra petriskålar med bactoagar Petriskålar ovan med frön. Bild: Gustav Algestrand 16

18 3.4 PLANTERING AV FRÖN I KRUKOR 1. Ungefär två liter inokulum utan svamp (NAM-inokulum) mättes upp och hälldes i ett stort kärl. 2. Åtta liter terra green mättes upp och hälldes i samma stora kärl. 3. Allt i det stora kärlet blandades med händer. Efter tillsats av tre liter LANS (utspädd 1+9 med destillerat vatten) blandades allt igen. 4. Autoklaverade småstenar lades i botten av krukorna. 5. NAM-inokulum + terra green-blandningen hälldes i 24 krukor så att krukorna nästan blev fulla Agarplattor med M. truncatula-skott. Bild: Gustav Algestrand 6. Med pincett gjordes två hål i blandningen i varje kruka och ett Medicago truncatula-skott (från agarplattorna) lades i varje hål. 7. Hålen trycktes igen men en bit av skotten lämnades ovanför ytan. Stenar lades ovanpå men inte så att de täckte skotten. 8. Krukor och lock till krukorna fuktades lätt innan allt ställdes in i odlingsskåpet. 9. Ungefär en liter inokulum med svamp (AM-inokulum, svampart: Rhizophagus inraradices) mättes upp och hälldes i ett stort kärl. 10. Fyra liter terra green mättes upp och hälldes i samma stora kärl. 11. Allt i det stora kärlet blandades med händer. Efter tillsats av en och en halv liter LANS (utspädd 1+9 med destillerat vatten) blandades allt igen Krukorna täcktes till sist med ytterligare stenar för att behålla jorden fuktig. Bild: Gustav Algestrand 12. Autoklaverade småstenar lades i botten av krukorna. 13. AM-inokulum + terra green-blandningen hälldes i 12 krukor så att krukorna nästan blev fulla. 17

19 14. Med pincett gjordes två hål i blandningen i varje kruka och ett Medicago truncatula-skott (från agarplattorna) lades i varje hål. 15. Hålen trycktes igen men en bit av skotten lämnades ovanför ytan. Stenar lades ovanpå men inte så att de täckte skotten. 16. Krukor och lock till krukorna fuktades lätt innan allt ställdes in i odlingsskåpet. Noteringar: Alla arbetsytor och allt materiel desinficerades innan användning. Förhållanden i odlingsskåpet: 16 timmar dag: 25 C 400 mikromol fotoner per m 2 och sekund 60% relativ luftfuktighet 8 timmar natt: 19 C 0 mikromol fotoner per m 2 och sekund. 60% realtiv luftfuktighet 3.5 GALLRING AV GRODDAR Efter en vecka plockades de groddar som växte sämst i varje kruka bort. Då återstod endast en grodd i varje kruka. 18

20 3.6 OBSERVATIONSMETODER GENERELLA OBSERVATIONER Vid varje observation räknades varje utvecklat blad samt varje blad som befann sig i ett påbörjat stadium av tillväxt, för varje enskild planta. Jämförelse av färgskillnader, samt utmärkande detaljer (exempelvis fläckbildning på blad), antecknades. Eventuellt utfördes också generell översikt på enskilda plantors eller kategoriers styvhet på grenarna POCKET PEA 1. Klämmor fästes på ett blad per planta. 2. De isolerade bladloberna i klämmorna täcktes över med en skjutbar platta. 3. När detta gjorts på alla plantor väntade vi i 10 minuter. 4. Mätaren sattes mot klämmorna, plattan sköts bort och fluorescensen mättes (nedan) Klämman isolerar en bladlob i väntan på pocket PEA. Bild: Gustav Algestrand (nedan) Mätaren sänder en ljusstråle genom bladet i en sekund och mäter flourescensen. Bild: Gustav Algestrand 19

21 3.7 SKÖRD 1. Några små metallkulor lades i eppendorfrör. 2. Ett hål gjordes i varje eppendorfrör (i locket) med en vass pincett. 3. Rören märktes med plantornas behandling (AM, NAM, NAMPi) och nummer. 4. Tre rör per planta användes. Inga rör användes för AM 2,3,6,7 eftersom de dött Eppendorfrör (ovan) med hål och metallkulor. Bild: Gustav Algestrand 5. Två bladlober per planta rycktes loss och lades i var sitt eppendorfrör. Rören lades genast i ett kärl med flytande kväve för förvaring. 6. Ytterligare två bladlober rycktes loss men dessa lades på en skärbräda. En cirkel med ungefär en centimeter i diameter stansades ut ur varje bladlob. 7. Den ena cirkeln lades i ett eppendorfrör och röret frystes ned i flytande kväve inför förvaring Eppendorfrör (ovan) med bladlober hastigt nedkylda i flytande kväve. Bild: Gustav Algestrand 8. Den andra cirkeln lades i ett aluminiumkärl för vägning. Aluminiumkärlet hade vägts på förhand. OBS: Cirklarna vägdes INTE för sig. De vägdes ihop med andra cirklar från plantor som fått samma behandling. Alltså vägdes cirklarna från AM 0 mm i ett kärl, cirklarna från AM 50 mm i ett kärl, cirklarna från AM 100 mm i ett kärl osv. Totalt hade vi åtta behandlingar så åtta kärl vägdes. 20

22 9. Plantorna klipptes av med en sax, ungefär där de stack ner i terra-greenen (jorden). 10. De avklippta, gröna delarna lades i olika aluminiumkärl och vägdes individuellt Aluminiumkärlen hade vägts på förhand. 11. Resterna av plantorna, dvs. rötterna, togs upp ur terra-greenen och sköljdes av så att alla korn försvann. Rötterna lades på papper i ett par minuter för att torka. 12. Rötterna lades i olika aluminiumkärl och vägdes individuellt. Aluminiumkärlen hade vägts på förhand. 13. Rötterna klipptes sedan i ungefär två lika stora delar. 14. De första halvorna vägdes i samma aluminiumkärl som tidigare. 15. De andra halvorna lades i tuber (dessa var som stora provrör, fast med lock) och tuberna fylldes med vatten Tuber(ovan) med halva rotsystem lagrade i vatten. Bild: Gustav Algestrand 17. Tuberna märktes med plantans behandling (AM, NAM, NAMPi + 0 mm, 50 mm, 100 mm) och nummer. 18. Tuberna ställdes i ett kylrum för förvaring. 19. Aluminiumkärlen med bladcirklar, plantdelar ovan terra-green och halva rötter ställdes i ett värmeskåp för torkning. 21

23 3.8 ROTINFÄRGNING FÄRGNING 1. Rötterna och vattnet i tuberna hälldes i en sil. 2. Rötterna sköljdes i destillerat vatten. Även tuben och locket sköljdes av Rötter(ovan) torkas på filterpapper. Bild: Gustav Algetsrand 3. Rötterna, tuben och locket lades/ställdes på filterpapper för torkning. 4. Rötterna lades sedan tillbaka i tuberna och kaliumhydroxid (koncentration=10%) tillsattes. Locket skruvades på. Steg 1-4 utfördes med alla tuber Tuber(under) sköljs med kaliumhydroxid. Bild: Gustav Algestrand 5. Tuberna ställdes i ett värmeskåp (90 C) i en timme. 6. Steg 1-4 upprepades men sköljningen gjordes mer noggrant och istället för att tillsätta kaliumhydroxid tillsattes bläck. 7. Tuberna ställdes i ett värmeskåp (90 C) i fem minuter. 8. Steg 6 upprepades men istället för att tillsätta bläck tillsattes ättiksyra (koncentration=8%) Torkning på filterpapper. Bild: Gustav Algestrand 9. Tuberna stod i rumstemperatur i 20 minuter. 10. Steg 6 upprepades men istället för att tillsätta bläck tillsattes vatten. 22

24 3.8.2 FÖRBEREDNING AV PREPARAT 11. Par med objektglas märktes med namnet för respektive planta. 12. Ett tunt lager glycerol penslades ut på objektglasen. 13. Innehållet i en tub (färgade rötter och vatten) hälldes ut i en petriskål. 14. Med hjälp av skalpell och pincett skars 1,5-2 cm långa rotdelar av, 30 delar per rotsystem. 15. Rotdelarna placerades i en rad på objektglasen, 15 delar per objektglas. 16. Ett täckglas lades över varje objektglas med rotdelar Mikroskoperingsförberedelse av färgade rötter. Bild: Gustav Algestrand Steg utfördes för alla rotsystem ANALYS AV PREPARAT Preparaten undersöktes en och en. När NAM-rötter och NAMPi-rötter undersöktes kontrollerades att mykorrhizabildning inte skett och när AM-rötter undersöktes kontrollerades att det hade bildats mykorrhiza. Dessutom uppskattades mängden arbuskler i rötterna och hur utbredd svampen var på rötterna när AM-rötterna undersöktes. Uppskattningarna gjordes efter en mall och antecknades i en tabell Observation av rötter under mikroskop. Bild: Gustav Algestrand 23

25 3.9 MÄTNING AV KLOROFYLL- OCH KAROTENOIDKONCENTRAION Laborationen utfördes med släckta lampor. 1. Eppendorfrören som preparerats under skörningen sattes i en bead beater, en maskin som skakade dem mycket snabbt vilket ledde till att bladcirklarna krossades. Eftersom rören hade förvarats i flytande kväve sattes de i en nedkyld adapter innan de placerades i maskinen så att temperaturskillnaden inte skulle orsaka problem. 2. Rören lades i is för att hålla dem kalla och 1 ml kall metanol tillsattes i varje rör. Rören blandades lätt. 3. Rören sattes i en maskin som snurrade rören vertikalt och proven inkuberades i ett kylrum (ca. 4-8 C). 4. Samtliga rör placerades i en centrifug inställd på rpm (rotationer per minut) i fem minuter i temperaturen 4 grader celsius. 5. Supernatanten i varje rör pipetterades över till ett nytt tomt eppendorfrör. 6. Av prov 1 gjordes en spädningsserie. 200 µl av prov 1 och 800 µl metanol tillsattes i ett tomt eppendorfrör. 100 µl av prov 1 och 900 µl metanol tillsattes i ett tomt eppendorfrör. 50 µl av prov 1 och 950 µl metanol tillsattes i ett tomt eppendorfrör. 20 µl av prov 1 och 980 µl metanol tillsattes i ett tomt eppendorfrör. 10 µl av prov 1 och 990 µl metanol tillsattes i ett tomt eppendorfrör ml pipetterades ur ett rör till en kyvett. Det gjordes med alla fem rören. 1 ml metanol pipetterades till en kyvett 8. De sex kyvetterna placerades i en spektrofotometer och mätningarna utfördes. Kyvetten men metanol användes som en kontroll. Efter analys av resultaten gjordes en ny späningsserie för att försöka få bäst resultat. 9. Den nya spädningsserien gjordes genom att tillsätta 300 µl av prov 2 och 700 µl metanol i ett tomt eppendorfrör och 200 µl av prov 2 och 800 µl metanol i ett tomt eppendorfrör Spektrofotometer (syns i mitten) länkad till dator. Bild: Gustav Algestrand 10. Steg 7 upprepades men endast med de två nya rören. Samma kyvett med metanol återanvändes. 24

26 11. De två kyvetterna placerades i spektrofotometern och mätningarna utfördes. Genom analys av resultaten konstaterades att 300 µl prov och 700 µl metanol skulle användas under resterande mätningar för att få ett bra resultat µl prov och 700 µl metanol pipetterades över i ett eppendorfrör. Blandningen pipetterades sedan över i en kyvett som sattes i spektrofotometern. Steg 12 utfördes för rör 3-17, men maximalt fem åt gången. 4 RESULTAT 4.1 GENERELLA OBSERVATIONER OBSERVATIONSTILLFÄLLE 1 DATUM AM-plantorna verkar ta sig bättre än de andra. AM-plantorna har alla utvecklat hjärtblad och nästan alla har även ett utvecklat förstablad. Vissa har även ett andrablad på gång. NAM- och NAMPi-plantorna verkar ta sig ungefär lika bra. Alla plantor har ungefär samma färg. Hos de plantor som utvecklat ett första blad ser vi att det är något ljusare än hjärtbladen OBSERVATIONSTILLFÄLLE 2 DATUM Det verkade som att NAMPi hade växt bäst under veckan. De NAMPi-plantor som överlevt verkade ha kommit ikapp AM-plantorna storleksmässigt. Betydligt fler AM-plantorna har överlevt. NAM-plantorna har fortfarande ganska dålig tillväxt jämfört med de andra två grupperna. Alla plantor har ungefär samma färg. Alla plantor hade mörklila fläckar på bladen men vissa hade inte fläckar på förstabladen. Plantor med hjärtblad som såg missfärgade och/eller vissnade ut: AM: 2,9,12 NAM: 2,10 (+12, men den är förmodligen död) NAMPi: 1,4,8 (+5, men den är förmodligen död) 25

27 4.1.3 OBSERVATIONSTILLFÄLLE 3 DATUM Grupp 100mM: AM-plantorna verkar ha stannat av en del i tillväxten. De är nu mindre än båda NAMPi- och NAM-plantorna. Vi ser tendenser till vissnande (hängande) blad. Vi kan även, när vi kollar noggrant, se att bladen hos AM-plantorna är något mindre gröna än bladen hos NAM och NAMPi. NAMPi ser ut att växa ohindrat. Grupp 50 mm: Vi tycker att tillväxten verkar ganska jämn, men även i denna grupp ser vi något ljusare blad hos AM och även tendenser till vissnande blad. Grupp 0 mm: I denna grupp är NAMPi-plantorna störst. AM- och NAM-plantorna är ungefär jämnstora och vi ser ingen direkt skillnad i grönheten. Generellt: NAMPi ser ut att växa bäst, AM ser ut att ha stannat av lite och NAM ser ut att ha kommit ikapp lite. Det skiljer inte speciellt mycket i grönhet mellan plantorna. Plantor med hjärtblad som såg missfärgade och/eller vissnade ut: 100mM: AM: 3,6,7,9 NAM: 8,10 NAMPi: 8,9 50mM: AM: 2,4,11 NAMPi: 10,12 0mM: AM: 1,5,12 NAM: 2,9 NAMPi: 4 Plantor med minst ett blad som har fått gula kanter: AM: 2,6,7,10 NAM: - NAMPi: 8,12 26

28 4.1.4 OBSERVATIONSTILLFÄLLE 4 DATUM Grupp 100mM: 3 av 4 AM-plantor hade dött! Den enda som överlevt ser nu ut att vara minst. NAMPi-plantor fortsätter att växa starkt och är med god marginal större än NAM-plantorna. Grupp 50mM: 1 av 3 AM har dött! NAMPi 12 är betydligt större resten i gruppen. Resten (NAMPi 10, AM 4, 11) ser ganska jämna ut. Grupp 0mM: Denna grupp ser ut att ha en jämn tillväxt. AM-plantorna och NAMPi-plantorna ser i princip jämnstora ut. NAM-plantorna är något mindre. De är ungefär lika stora (eller kanske till och med något större) än de minsta AM-plantorna. AM: Växer med högre saltbehandling är mindre än de med lägre.. NAMPi: Ser ut att växa bra, oavsett saltkoncentration. NAMPi-plantorna ser lite mer styva och grova ut - främst syftat till petiolerna 10. Tydligt exempel är skillnaden mellan NAMPi 4 med AM 12. NAM: Ser jämna ut. De i 0mM-gruppen är kanske något större men det kan vara så att man luras av att NAM 9 är lite extra stor. Det gick inte att se några speciella skillnader i grönheten hos plantorna. AM 1 och 10 var de enda plantorna som fortfarande hade ett hjärtblad som såg ut som i början (dvs grönt och normalformat). Resterande plantor har hjärtblad som ser beige-gula och torra ut och hos vissa plantor syns inte hjärtbladen till. Plantor med minst ett blad som har fått gula kanter: 100mM: AM: 9 NAM: Petiole- eng. för bladskaft: där bladen fäster i grenen. (Wikipedia) 27

29 NAMPi: 8,9 50mM: AM: 4 NAMPi: 10,12 0mM: AM: 5,10,12 NAM: - NAMPi: 4, OBSERVATIONSTILLFÄLLE 5 DATUM Grupp 100mM: NAMPi är fortsatt störst, men inte med så stor marginal. NAM är fortfarande något större än den enda överlevande AM-plantorna. Grupp 50mM: Gruppen ser ganska jämn ut, NAMPi 12 är extra stor. Det är ingen markant skillnad sedan veckan innan. Grupp 0mM: Inte heller i den här gruppen ser vi några större förändringar jämfört med veckan innan. AM och NAMPi är ungefär lika stora, men värt att notera är att alla AM inte är lika stora (det är framför allt AM 1 som drar ner snittet). Snittstorleken för AM kan vara något lägre än för NAMPi men om man tar en växt som ser ut att representera AM-gruppen bäst är AM och NAMPi ungefär lika stora. NAM ser nästan lika stora ut som AM. AM: Samma som veckan innan. NAMPi: Ungefär jämnstora överlag. NAM: Precis som veckan innan ser växterna i 0mM-gruppen ut att vara snäppet större men det skiljer inte mycket. Alla plantor verkade vara i princip lika gröna. Det gick inte att se hjärtbladen hos någon av plantorna. Ännu fler plantor än föregående vecka hade gula kanter på minst ett blad. Faktum var att alla hade det utom AM 1 och NAM 9. 28

30 4.2 ANTAL BLAD Diagrammet beskriver veckovis medelvärdet av antalet räknade blad hos respektive grupp och behandling. Efter vecka 2 införs saltstress. AM 100 är from vecka fyra enbart baserad på en individ. AM 50 är from vecka 4 enbart baserad på två individer. 29

31 4.3 POCKET PEA PI INDIVIDUELLA VÄRDEN 10 9 AM1_0 mm AM2_50 mm AM3_100 mm AM4_50 mm AM5_0 mm AM6_100 mm AM7_100 mm AM9_100 mm AM10_0 mm AM11_50 mm AM12_0 mm NAM2_0 mm NAM8_100 mm NAM9_0 mm NAM10_100 mm NAM11(död innan behand.) NAMPi4_0 mm NAMPi8_100 mm NAMPi9_100 mm NAMPi10_50 mm NAMPi11_0 mm NAMPI12_50 mm Observationstillfälle Diagrammet beskriver de individuella PI-värdena efter Pocket PEA. Efter observationstillfälle 2 införs saltstress. 30

32 GENERELLA VÄRDEN Observationstillfälle AM 100mM AM 50mM AM 0 mm NAM 100 mm NAM 0 mm NAMPi 100 mm NAMPi 50 mm NAMPi 0 mm Diagrammet beskriver de genomsnittliga PI-värdena efter Pocket PEA för respektive kategoris behandling. Efter observationstillfälle 2 införs saltstress. AM 100 är from vecka fyra enbart baserad på en individ FV/FM 0,86 0,84 0,82 0,8 0,78 0,76 0,74 0,72 0,7 0, Observationstillfälle AM 100mM AM 50mM AM 0 mm NAM 100 mm NAM 0 mm NAMPi 100 mm NAMPi 50 mm NAMPi 0 mm Diagrammet beskriver de genomsnittliga Fv/Fm-värdena efter Pocket PEA för respektive kategoris behandling. Efter observationstillfälle 2 införs saltstress. AM 100 är from vecka fyra enbart baserad på en individ. 31

33 VIkt (gram) Planta Behandling Fv/Fm v. 3 Överlevde till v. 5 AM 2 50 mm 0,755 Nej AM 4 50 mm 0,833 Ja AM mm 0,825 Ja AM mm 0,773 Nej AM mm 0,652 Nej AM mm 0,683 Nej AM mm 0,828 Ja Tabellen ovan beskriver de individuella Fv/Fm-värdena vid observationstillfälle 3 samt överlevande individer vid observationstillfälle TORRVIKT SKOTT 6,6 6,4 6,2 6 5,8 5,6 5,4 AM NAM NAMPi 5,2 0mM 50 mm 100 mm Behandling (mm) Diagrammet ovan beskriver den genomsnittliga torrvikten i gram för respektive kategoris skott efter behandling. AM 100 mm och AM 50 mm är enbart baserad på en respektive två individer. 32

34 Vikt (gram) ROTSYSTEM 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 AM NAM NAMPi 0,1 0 0mM 50 mm 100 mm Behandling (mm) Diagrammet ovan beskriver den genomsnittliga torrvikten i gram för respektive kategoris rotsystem efter behandling. AM 100 mm och AM 50 mm är enbart baserad på en respektive två individer ROTSYSTEM/SKOTT 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 AM NAM NAMPi 0,02 0 0mM 50 mm 100 mm Behandling (mm) Diagrammet ovan beskriver förhållandet mellan rotsystemens genomsnittliga torrvikt efter grupp samt behandling och skottens genomsnittliga torrvikt efter grupp samt behandling. AM 100 mm och AM 50 mm är enbart baserad på en respektive två individer. 33

35 4.5 ROTINFÄRGNING INDIVIDUELL FÖRDELNING F% M% A% 20 0 AM1_0mM AM4_50mM AM5_0mM AM9_100mM AM10_0mM AM11_50mM AM12_0mM Diagrammet ovan beskriver AM-groddarnas individuella fördelning för god svampinfektion. Resultat för vissa rör blev "dåliga" då de hade ett förhöjt värde i en kolumn. Resultaten för NAM8 100 mm och NAMPi 11 0 mm är inte helt pålitliga. OBS resultat saknas för AM 2,3,6 och FÖRDELNING ÖVER BEHANDLINGAR 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 F% M% A% 20,0 0,0 0_mM 50_mM 100_mM Behandling (mm) Diagrammet ovan beskriver AM-groddarnas genomsnittsliga fördelning för god svampinfektion mellan saltkoncentrationerna. Resultaten för AM 100 mm och AM 50 mm är enbart baserade på en respektive två plantor. 34

36 mikrogram/milliliter 4.6 KLOROFYLL KONCENTRATION AM 100 AM 50 AM 0 NAM 100 NAM 0 NAMPi 100 NAMPi 50 NAMPi 0 Grupp och behandling(mm) Diagrammet ovan beskriver den genomsnittliga klorofyllkoncentrationen efter grupp och behandling. AM 100 mm och AM 50 mm är enbart baserade på en respektive två plantor X/NAM_ % AM 100 AM 50 AM 0 NAM 100 NAM 0 NAMPi 100 NAMPi 50 NAMPi 0 Grupp och behandling(mm) Diagrammet ovan beskriver den genomsnittliga klorofyllkoncentrationen i respektive grupp med behandling i förhållande till NAM 100 räknat i procent. AM 100 mm och AM 50 mm är enbart baserade på en respektive två plantor. 35

37 mikrogram/milliliter 4.7 KAROTENOIDER KONCENTRATION 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 AM 100 AM 50 AM 0 NAM 100 NAM 0 NAMPi 100 NAMPi 50 NAMPi 0 Grupp och behandling(mm) Diagramet ovan beskriver den genomsnittliga karotenoidkoncentrationen efter grupp och behandling. AM 100 mm och AM 50 mm är enbart baserade på en respektive två plantor X/NAM_ % AM 100 AM 50 AM 0 NAM 100 NAM 0 NAMPi 100 NAMPi 50 NAMPi 0 Grupp och behandling(mm) Diagrammet ovan beskriver den genomsnittligakarotenoidkoncentrationen i respektive grupp med behandling i förhållande till NAM 100 räknat i procent. AM 100 mm och AM 50 mm är enbart baserade på en respektive två plantor. 36

38 5 DISKUSSION 5.1 GENERELLA OBSERVATIONER OBSERVATIONSTILLFÄLLE 1 Svampsymbiosen har en uppenbar effekt på plantornas tidiga utveckling. Sannolikheten att just alla AM-plantor skulle utvecklas bättre än resterande plantor på grund av individvariation är mycket låg. Troligtvis är det så att svampen hjälper plantan att ta upp mer näringsämnen än vad plantan hade kunnat göra på egen hand. Det leder till bättre utveckling. Att NAMPi-plantorna inte har märkbart bättre tillväxt än NAM-plantorna kan bero på att plantorna inte klarar av att tillgodogöra sig det extra fosfatet eller att de kanske blir stressade av den stora mängden OBSERVATIONSTILLFÄLLE 2 NAMPi-plantornas starka tillväxt beror troligtvis på att de börjat dra nytta av fosfattillskottet. Att betydligt fler AM-plantor överlevt kan tyda på att symbiosen på något sätt ger ett skydd under plantans tidiga utveckling. Det skulle senare visa sig att mörklila fläckar på bladen var helt naturliga och förekom på alla plantor. De har inget att göra med saltkoncentrationen. Det skulle också visa sig att samtliga plantors hjärtblad avvecklades och därför kan inte missfärgning eller avveckling av hjärtblad ses som en följd av förhöjd saltkoncentration. Detsamma gäller även missfärgning av bladens kanter. Eftersom alla plantor utom två, AM 1 och NAM 9, påverkades kan fenomenet inte kopplas till förhöjd saltkoncentration Observationstillfälle 3 Redan efter en vecka med behandling kan man se tendenser till allmänt sämre hälsa hos AMplantorna i 100 mm-behandlingen. De något hängande bladen kan vara ett tecken på att plantan inte kan hålla uppe strukturen på grund av vatten eller glukosbrist. Bristen på vatten kan bero på osmos på grund av den höga saltkoncentrationen och brist på glukos kan bero på att fotosyntesen är försämrad för dessa plantor. Försämrad fotosyntes bekräftas för plantorna AM 3, 6 och 7 i diagrammet och tabellen AM-plantorna i 50 mm-behandlingen ser ut att påverkas på samma sätt och sannolikt av samma anledningar som de i 100 mm-behandlingen. NAMPi-plantorna fortsätter att ha god tillväxt, tack vare deras extra fosfat. Det kan vi vara nästan helt säkra på eftersom det är det enda som skiljer NAM- och NAMPi-plantorna åt. 37

39 Generellt sett verkar det som att NAM. och NAMPi-plantorna klarar av saltstressen bättre än AM-plantorna OBSERVATIONSTILLFÄLLE 4 Tidigare observationer och tankar bekräftas eftersom 3/4 av AM-plantorna i behandlingen 100 mm har dött. Att den sista plantan är minst av alla i behandlingen tyder på att den har problem. Anledningarna till problemen finns beskrivna under vecka tre. Även i behandlingen 50 mm har en AM-planta dött. Eftersom de andra AM-plantorna ser ut att må ganska bra, jämfört med de övriga i behandlingen, kan det vara så att just AM-plantan som dog var en känsligare planta än de andra. AM-plantorna verkar få det tuffare och tuffare desto högre saltkoncentration de utsätts för. NAM- och NAMPi-plantorna är till synes opåverkade av saltkoncentrationen. Det är märkligt att NAM- och NAMPi-plantorna är så opåverkade som de är. De borde enligt tidigare undersökningar få problem då saltkoncentrationen i deras omgivning ligger på ungefär mm. En tänkbar anledning till att de klarar sig är att de inte tar upp mer salt bara för att det finns tillgängligt. På så sätt undviks i så fall en skadlig mängd salt i plantorna. En annan möjlig anledning är att vi testar med för låg saltkoncentration. Om man skulle upprepa vår undersökning skulle det vara intressant att behandla plantor med ännu högre saltkoncentration för att se om man får någon effekt OBSERVATIONSTILLFÄLLE 5 Inga större skillnader i tillväxt eller utseende hos plantorna jämfört med veckan innan. De tidigare tankarna om att AM-plantorna får det tuffare desto högre saltkoncentrationen är och att NAM-plantorna och NAMPi-plantorna inte påverkas märkvärdigt av saltkoncentrationen förstärks. 5.2 ANTAL BLAD NAM Diagrammet visar tydligt att saltkoncentrationen inte påverkar tillväxten av blad hos gruppen NAM. Det resultatet är intressant eftersom experiment visat att tillväxten hos M. truncatula hämmas då de växer i förhållanden där saltkoncentrationen är mm. NAMplantorna i gruppen 100 mm bör alltså ha hämmats något i tillväxten men har klarat sig lika bra, sett till antal blad. En möjlig förklaring till detta är att saltkoncentrationen inte var tillräckligt hög för att plantorna skulle ta skada. En annan förklaring är att plantorna fick växa i två veckor innan de började behandlas med en förhöjd koncentration av salt. I experimentet behandlades de med förhöjd saltkoncentration efter en vecka. Plantorna i vårt experiment kan ha utvecklats mer innan 38

40 de blev utsatta för saltbehandlingen och därmed bättre hanterat situationen eftersom de varit på en högre nivå i utvecklingen NAMPI Hos gruppen NAMPi syns inte heller något samband mellan antalet blad och saltbehandling. Precis som hos gruppen NAM är detta ett intressant resultat eftersom de bör påverkas av den höga salthalten på samma sätt som NAM kunde tänkas ha gjort AM I gruppen AM kan man se ett tydligt samband mellan antalet blad och saltbehandling. Ju högre saltkoncentration desto färre antal blad. Visserligen är dessa resultat något osäkra då grafen för AM 50 mm från och med den fjärde veckan är baserad på två överlevande plantor av tre och grafen för AM 100 mm från och med den fjärde veckan är baserad på en överlevande planta av fyra. Samtidigt kan plantornas död ses som ett tecken på att de inte klarar av för hög saltkoncentration när de har en symbios med R. intraradices. Att just plantor som befann sig inom gruppen AM dog känns inte helt slumpmässigt. En tänkbar anledning till att AM-plantorna haft det svårt ju högre saltkoncentrationen varit är att svampen har bistått plantorna för mycket, det vill säga tagit upp för mycket salt vilket lett till förhöjd saltstress. De höga koncentrationerna av Na +- och Cl - -joner kan ha skadat plantan på flera sätt. Dels kan Na + -jonerna orsakat inaktivering av enzymer. Dels kan osmos vara en anledning till att plantorna torkat ut. På grund av att AM-plantorna haft så stor tillgång till NaCl eftersom svampen har osmos gjort att vatten inte tagits upp som det borde. Eftersom saltkoncentrationen är så hög på utsidan plantam och relativt låg inuti plantan och eftersom det finns en strävan efter jämvikt kommer vatten inte att tas upp och till och med möjligen dräneras ur plantan. Det leder till uttorkning av plantan. 5.3 POCKET PEA Under arbetets gång förlades anteckningarna som beskrev vilket mätvärde som tillhörde vilken planta för den sista mätningen med Pocket PEA:n. Datan finns, men vi har valt att inte analysera den då vi inte kan vara helt säkra på vilka värden som tillhör vilka plantor. Följande diskussion kan därför inte väga lika tungt då essentiella värden saknas i underlaget FV/FM Diagrammet visar att fotosyntesen hos grupperna NAM och NAMPi inte påverkats negativt av förhöjd saltkoncentration. Däremot syns två tydligt avvikande linjer som tillhör gruppen AM och behandlingarna 50 mm och 100 mm. Inom dessa behandlingar fanns det plantor som dog mellan mätningarna vecka tre och vecka fyra. I tabell ser man tydligt att det är Fv/Fm-värdet hos plantorna som dog som dragit ner genomsnittsvärdena. Alltså har överlevande AM-plantor, enligt Fv/Fm-värdena klarat av att hantera saltkoncentrationen utan att deras fotosyntes har påverkats negativt. Vad det beror på är svårt att 39

41 säga. En tanke är att det har med individvariation att göra. En annan tanke är att det kan ha haft med mykorrhizeringen att göra. Om plantorna som dog (AM 2, 3, 6 och 7) hade en mycket god mykorrhizering tidigt kanske svampen bidrog med så mycket för tidigt vilket stressade plantorna till döds. Om de överlevande plantorna inte hade lika god mykorrhizering så tidigt kan det ha lett till sämre utbyte med svampen, alltså mindre mängd salt, och därmed mindre stress PI Generellt sett ser PI-värdena i diagrammet ut att ligga på ungefär samma nivå eller kanske stiga något från vecka två till vecka fyra. Återigen ser man ett undantag, linjen för AM 100 mm sjunker dramatiskt till vecka tre men återhämtar sig till vecka fyra. Vid studering av diagrammet ser man samma sak som man såg i Fv/Fm-tabellen( ). De plantor som dog mellan vecka tre och vecka fyra drar ner genomsnittet för gruppen AM 100 mm. Förklaringen misstänks vara densamma som förklaringen som till de liknande resultaten för Fv/Fm-värdena. En intressant notering är att AM 9, plantan som överlevde i behandlingen 100 mm, har lägst PIvärde vid observations fyra. Det antyder att fotosyntesen egentligen inte fungerar så bra, även om den överlever. 5.4 TORRVIKT SKOTT Diagrammet visar tydligt att NAMPi-plantorna haft den största biomassan och inte påverkats i tillväxten av hög saltkoncentration. Dessa resultat var något intressanta på samma sätt som resultaten för antalet blad. Då högre salthalt bör innebära problem för plantan bör biomassan minska ju högre salthalten är. Våra resultat visar istället att NAMPi-plantorna växer opåverkat av saltkoncentrationer upp till 100 mm. En anledning till det kan vara att M. truncatula har en förmåga att inte ta upp överdrivna mängder av näringsämnen, även om det finns möjlighet. Man ska dock inte fokusera för mycket på de absoluta värdena, utan det är viktigt att jämföra värdena för de olika plantorna med varandra. Det finns inget absolut värde för alla olika växter i världen som ses som optimalt. Optimala värden varierar mellan olika arter. En annan tanke är att plantorna har en förmåga att lagra mycket salt i vakuolerna. NAM-plantorna har växt ganska jämnt oavsett saltbehandling. Man kan dock se att plantorna som behandlats med den högsta saltkoncentrationen har en något lägre genomsnittlig biomassa. Det kan vara ett tecken på att den höga saltkoncentrationen faktiskt har påverkat plantorna negativt, som den i teorin bör göra. Det måste dock understrykas att det endast skiljer cirka 0,4 gram i genomsnittlig biomassa vilket är mycket lite. Det skulle exempelvis kunna vara individuella plantors egenskaper som ger den lilla skillnaden. Om man studerar AM-plantornas genomsnittliga biomassa ser man att den sjunker drastiskt för plantorna som behandlats med mellanhög och hög saltkoncentration. Skillnaden i genomsnittlig 40

42 vikt ligger hos AM på ungefär 0,7-0,8 gram. Det är en betydligt större skillnad jämfört med skillnaden mellan NAM-plantorna. Det kan ses som ett tecken på att AM-plantorna inte har någon nytta av symbiosen utan snarare påverkas negativt av den. Anledningarna till detta tros vara desamma som anledningar till att AM-plantorna utvecklat färre blad ROTSYSTEM Man kan tydligt se i diagrammet att rotsystemets vikt i gruppen AM minskar med ökad saltkoncentration. Rotsystemens biomassa blir lägre och lägre desto högre saltkoncentrationen är och detta kan ses som ett tecken på att den höga saltkoncentrationen påverkar tillväxten av rotsystemet. En tanke är att det sker en signalering som får plantan att minska utvecklingen av rotsystemet eftersom den redan tar upp en mycket stor mängd salt, troligtvis på grund av svampsymbiosen. En annan tanke är att rötterna helt enkelt skadas av den höga salthalten och som följd hämnas tillväxten vilket leder till lägre biomassa. Inom gruppen NAM syns samma tendens som i AM-gruppen. Effekten verkar dock inte vara så kraftig som i AM-gruppen. Den svagare effekten kan bero på att plantan inte tar upp en lika stor mängd salt som AM-plantorna utan bara något mer än vad den skulle gjort om den befann sig i ett odlingsmedium med normal saltkoncentration. Signaleringen att minska utveklingen av rotsystemet kan då tänkas bli svagare. Eller så kan här också rötterna tagit skada som i avsnittets första stycke. Inom gruppen NAMPi är det svårt att konstatera någon tendens eftersom genomsnittsvikten för rotsystemen i behandlingen 50 mm är mycket högre än genomsnittsvikten för rotsystemen i behandlingarna 0 mm och 100 mm. Plantan NAMPi 12 har höjt genomsnittet i behandlingen 50 mm rejält då dess rotsystem vägde markant mer än rotsystemet hos någon annan planta. Om den hade vägt mindre hade genomsnitten för de olika behandlingarna troligtvis hamnat ungefär lika och därför går det inte riktigt att konstatera att rotsystemens utveckling varken påverkas positivt eller negativt av högre saltkoncentration. Totalt sett verkar rotsystemen hos NAMPi-gruppen ha påverkats minst av förhöjd saltkoncentration. Endast i behandlingen 0 mm är genomsnittsvikten för NAMPi lägre än genomsnittsvikten för AM. Man måste dock tänka på att AM-plantorna även vuxit tillsammans med en svamp, vars vikt också är inräknad. Det skulle kunna vara så att rotsystemens biomassa hos AM-plantorna (utan svampen) i själva verket är lägre än biomassan hos NAMPi-plantorna. Detta kan vår data inte bekräfta, men det skulle vara intressant att undersöka hur stor biomassa svampen utgör av AM-plantornas rotsystem ROTSYSTEM/SKOTT Diagrammet är nästan identiskt med diagrammet över rotsystemens torrvikt( ). För grupperna NAM och AM kan man säga att rotsystemens biomassa i förhållande till skottens biomassa minskar med högre saltkoncentration. Detta kan vara ytterligare ett tecken på att 41