Validering av kemiska analysmetoder

Transkript

1 SWEDAC DOC 00: ISSN Anders Nilsson, Karl-Erland Stensiö och Björn Lundgren Validering av kemiska analysmetoder

2 SWEDAC:s förord Detta dokument är framtaget för att ge vägledning och riktlinjer för kemiska laboratorier vid utveckling och validering av kemiska analysmetoder. Så som författarna skriver nedan finns utförligare litteratur för den som så önskar. Vi ber härmed att få framföra vårt tack till författarna som har lagt ner mycket arbete på att ta fram och slutföra detta dokument. Gunilla Fransson Elsbeth Johansson Författarnas förord Inom organisationen EURACHEM startade 1995 ett arbete med att beskriva validering av kemiska analysmetoder. SP, Sveriges Provnings- och Forskningsinstitut deltog i det arbetet. Kort därefter uppkom en diskussion inom SWEDAC:s kemigrupp om att ett motsvarande behov fanns i Sverige och en arbetsgrupp bildades. Den Nordiska Metodikkommittén för Livsmedelsanalyser, NMKL, hade också påbörjat ett motsvarande arbete. Ursprungstanken var att sammanställa delar av redan nedskriven erfarenhet. Åsikterna om ambitionsnivån skiftade något inom gruppen samtidigt som de tilltänkta textunderlagen förändrades. Ett ofullgånget första utkast till rapport fanns under hösten Detta utkast föranledde många och intressanta diskussioner inom och utanför arbetsgruppen. Långsamt har sedan en kortare och något mindre ambitiös rapport utvecklats. Det finns redan ett stort antal monografier och annan omfattande litteratur som beskriver kvalitetssäkring, kvalitetskontroll och validering. Vi har utnyttjat detta genom att ge en referenslista till sådan litteratur. Målet för skriften är främst det mindre laboratoriet som behöver validera sina metoder och inte alltid har tillräcklig erfarenhet. Vi tror att de mer erfarna laboranterna och laboratorierna redan har hittat till den mer omfattande litteraturen och tillgodogör sig denna. Vi försöker här beskriva varför man behöver validering och hur man enkelt skall inleda detta arbete. Vi tar upp de parametrar som är karakteristiska för en metod och till vilka man måste ta ställning under genomförandet av valideringen. Vi vill tacka alla de personer som på ett eller annat sätt bidragit med synpunkter och kommentarer under arbetets gång. Medlemmarna i SWEDAC:s kemigrupp och främst Göran Nilsson tillhör denna krets som deltagit aktivt i arbetet och bidragit med många konstruktiva diskussioner. Ulf Örnemark har varit till stor hjälp för att korrekturläsa slutversionen och kontrollera använda begrepp så att de stämmer med senaste svenska version av nomenklaturstandarden. Vi tackar också Gunilla Fransson och Elsbeth Johansson på SWEDAC för att de hjälpte oss att få rapporten i sitt slutgiltiga skick. Björn Lundgren Karl-Erland Stensiö Anders Nilsson Kan beställas hos Styrelsen för ackreditering och teknisk kontroll, SWEDAC SWEDAC SWEDAC Box 878 Box BORÅS STOCKHOLM Telefon Telefon Fax Fax Hemsida: ISSN SWEDAC DOC 00:32

3 Just Nu-tryck, Allégatan, Borås SWEDAC DOC 00:32

4 INNEHÅLL Förord 2 1 Inledning Syftet Validering och verifiering Krav på personal och utrustning Utveckling och validering Analytiska kriterier Krav vid verifiering 5 2 Metodvalidering Den analytiske kemistens ansvar Varför måste metoder valideras Kundens förväntan, krav och behov 6 3 När och i vilken omfattning ska metoder valideras? 7 4 Förutsättningar för en validering Mätprocessens steg Analytisk specifikation Metodens karakteristik Krav på validering Krav på metodens noggrannhet Vad används precisionsdata till? Hur skall analysmetoder valideras 12 5 Verktyg för valideringen Blankprover och blanklösningar Provtyper Kalibratorer Referensmaterial Försöksplanering och statistiska hjälpmedel 13 6 En valideringsprocedurs olika steg Identitetsbevis Exempel kromatografi Exempel infraröd spektrometri Selektivitet, specificitet samt matriseffekter Detektionsgräns Utförande för kvantitativ analys Utförande för kvalitativ analys Bestämbarhetsgränser Mätområde och linearitet Känslighet Riktighet SWEDAC DOC 00:32

5 6.8 Precision Repeterbarhet Reproducerbarhet Precision vid kvalitativ analys Robusthet Stabilitet 21 7 Dokumentation av validerade metoder 22 8 Att använda validerade metoder 22 9 Användningen av valideringsdata Kvalitetskontroll med hjälp av valideringsdata Kvalitetskontroll Kontrollkort Ledningens ansvar Referenser och litteratur 25 Förkortningslista SWEDAC DOC 00:32

6 1 Inledning 1.1 Syftet Ändamålet med denna rapport är att förklara en del frågor om hur man avgör om en analytisk metod är lämplig för sitt ändamål (fitness for purpose). Meningen är att öka läsarens förståelse för vad som ingår i en sådan uppgift, och varför det är angeläget. 1.2 Validering och verifiering Två uttryck brukar förekomma i detta sammanhang. Validering som ofta är intimt förknippad med en metods utveckling, och verifiering som genomförs för att säkerställa att metoden fortlöpande fungerar enligt ursprungliga specifikationer. Validering eller verifiering av en analysmetod innebär ett antal kontroller, som man genomför för att säkerställa att en metod är lämplig för sitt ändamål. Kontrollerna skall representera olika aspekter av metodens förmåga att prestera resultat. 1.3 Krav på personal och utrustning Det är underförstått i valideringen att man har kontrollerat att använda instrument utnyttjas inom sitt arbetsområde, fungerar på rätt sätt och är kalibrerade enligt sina specifikationer. På motsvarande sätt utgår vi från att den personal som genomför valideringen är kompetent inom området och har tillräcklig kunskap avseende arbetet för att kunna utvärdera resultat och fatta beslut under valideringsprocessens gång. 1.4 Utveckling och validering Valideringen är i allmänhet intimt knuten till utvecklingen av en metod. I realiteten är det ofta svårt att avgöra var utvecklingen slutar och var valideringen börjar. För ett specifikt analytiskt problem är det först nödvändigt att fastställa den analytiska kravspecifikationen. I denna anges olika gränser för ett antal egenskaper hos metoden, vilka måste vara uppfyllda för att metoden skall vara lämplig för sin uppgift. Valideringen tjänar till att bevisa att metoden uppfyller ställda krav. Valideringen tar dessutom fram kunskap, som kan användas för att säkerställa att metoden fyller kraven under tiden man använder den, underlag för utformning av verifieringen. Om man finner att metoden inte fyller kraven måste ytterligare utveckling göras med påföljande ny validering. Detta kan i många fall utveckla sig till en ständig förbättring av metoden för att den skall möta alla de uppställda kraven. 1.5 Analytiska kriterier Kriterier för allt arbete med analytiska metoder kan formuleras i några få punkter. Vi har valt att presentera dem i fem punkter såsom framgår nedan. Följer man dessa får man en bra grund för analytiska resultat med högre kvalitet. Analytiska metoder skall genomföras på ett sådant sätt att de uppfyller överenskomna krav. Analytiska mätningar skall genomföras med metoder och utrustning, som har kontrollerats med avseende på sin ändamålsenlighet. Personal som genomför analyser skall vara kvalificerad och kompetent för uppgiften. Analytiska mätdata genomförda på ett laboratorium skall vara jämförbara med resultat erhållna från andra laboratorier. Laboratorier som genomför analytiska mätningar skall ha ett väl definierat system för kvalitetsstyrning och kvalitetssäkring av verksamheten. 1.6 Krav vid verifiering Verifieringen innehåller samma element som en validering. I de flesta fallen behöver man inte verifiera alla parametrar som en gång ingick i valideringen utan endast ett antal kritiska sådana. Vilka element som man bör verifiera med lämpligt mellanrum bör framgå av valideringsunderlaget. Vi kommer nedan huvudsakligen att tala om validering, men det som sägs är också tillämpligt för verifiering. I begreppet verifiering brukar man i andra sammanhang inbegripa en vidare kontroll av att metoden även fungerar i praktiken. I den analytiska kemin ingår detta moment som en viktig del redan i valideringen SWEDAC DOC 00:32

7 2 Metodvalidering 2.1 Den analytiske kemistens ansvar När man skall börja använda en metod ställer man sig som kemist frågan vad metoden kan klara och hur väl den klarar av att ge ett ändamålsenligt resultat. Den analytiska kemisten är experten. Det är han som skall kunna ange fördelar och nackdelar, noggrannhet (riktighet och precision), begränsningar och tidsåtgång. Validering av en metod skall då ge svar på ställda frågor som normalt berör olika egenskaper hos metoden. Det finns många analysmetoder. Några är mycket enkla, andra är mer komplicerade med en rad krav som måste vara uppfyllda. Det går därför inte att ange en enkel checklista med faktorer som skall vara lika viktiga för alla metoder och som absolut skall vara uppfyllda. Däremot går det att beskriva betydelsen av egenskaperna, som var för sig måste beaktas och värderas, när man sätter upp specifikationerna för en tilltänkt analysmetod. Hur mycket som måste beaktas i varje enskilt fall är en bedömningsfråga och behöver diskuteras mellan laboratoriet och beställaren. Följande lista över egenskaper kan fungera som exempel på vad som brukar ingå i en validering. Bekräftelse på identitet Specificitet Mätområde Linearitet Känslighet Undersökning av matriseffekter Detektionsgräns Bestämbarhetsgräns Noggrannhet (riktighet och precision) Robusthet Stabilitet Utbyte 2.2 Varför måste metoder valideras I stort sett alla funktioner i vårt samhälle är i något avseende beroende av analytiska resultat för sitt beslutsfattande. Samhällets kostnader för att genomföra dessa mätningar är stora. Ytterligare kostnader kan ofta bli konsekvensen av beslut fattade på grund av redan genomförda mätningar. Resultat som visar att exempelvis betongen i en bro eller ett livsmedel inte fyller uppställda krav, kan leda till korrigerande åtgärder som kostar mycket mer än den ursprungliga analysen och leda till stora krav på ersättning. Man kan då förstå hur viktigt det är att resultatet blir rätt från början, och att man kan visa att så är fallet. 2.3 Kundens förväntan, krav och behov Ett analysresultat utan dokumentation om dess tillförlitlighet har ringa eller intet värde för beställaren. När beställaren vänder sig till ett laboratorium förväntar han sig att få hjälp av en expert med kunskaper som han inte besitter själv. Han förväntar sig att det opartiska laboratoriet besitter sådan kunskap på området så att dess resultat inte ifrågasätts. Det är ett stort ansvar som laboratoriet och dess personal tagit på sig. Det är den analytiska kemistens plikt att säkerställa att de resultat som produceras är ändamålsenliga. En dåligt genomförd validering (eller ingen validering alls) gör kemisten omedveten om riskerna för fel. Man måste känna kravet på noggrannhet i bestämningen och kunna bedöma om den är tillräcklig väl grundad för att vara ett underlag för kundens beslut. Metodens tillförlitlighet måste testas så att man kan förlita sig på resultatets giltighet i ett specificerat intervall. Mätosäkerheten måste beräknas och anges på ett för kunden tydligt sätt. Detta skall ske genom ett intervall inom vilket det s.k. sanna värdet förväntas ligga. Detta intervall kan ökas genom att multiplicera den uppskattade mätosäkerheten med en s.k. täckningsfaktor (k, vanligtvis = 2). Detta ger vad man kallar utvidgad mätosäkerhet. Sedan 1993 finns ett generellt dokument, GUM som ger vägledning i uppskattning och angivande av mätosäkerhet. EURACHEM har i sin tolkning av det dokumentet inkluderat en rad exempel från analytisk kemi. SWEDAC tillämpar för ackrediterade laboratorier de krav som baseras på dessa dokument. Under valideringsprocessen fås mycket information som kan ligga till grund för uppskattningen av mätosäkerheten SWEDAC DOC 00:32

8 3 När och i vilken omfattning ska metoder valideras? En metod skall valideras när det är nödvändigt att bevisa att den är lämplig för att lösa det specifika analytiska problemet. Detta kan vara aktuellt i ett antal situationer, då en ny metod skall utvecklas då en etablerad metod förändras eller används för en ny applikation då kvalitetskontroll visar på förändringar av resultat över tiden då en etablerad metod flyttas till ett nytt laboratorium, och där genomförs av annan personal och/eller med ny utrustning. Omfattningen av en validering eller omvalidering beror på omständigheterna, kemistens och laboratoriets tidigare erfarenhet och de förändringar i övrigt som görs för det nya användningsområdet. Det är alltid nödvändigt att genomföra en validering, även om metoden är en välkänd och publicerad standardiserad metod. Man bör rimligen vid användning i ett nytt laboratorium eller med ny operatör minst kunna visa att man kan upprepa en standardiserad metods prestanda avseende selektivitet och repeterbarhet samt genomföra en jämförande analys hos ett ackrediterat laboratorium innan man kan åberopa den standardiserade metodens beteckning. Tabell 1 nedan kan tjäna som en första fingervisning om omfattningen av en validering. Tabell 1. Valideringens omfattning vid olika situationer Situation Ny metod utvecklad för ett problem En existerande metod prövas på ett annat problem En etablerad metod utvidgas till ett nytt område När kvalitetskontrollen indikerar att en etablerad metod ändras med tiden En etablerad metod revideras Etablerad metod används med annan instrumentering Etablerad metod i ett annat laboratorium Etablerad metod med annan operatör Omfattning av validering Fullständig Fullständig Begränsad eller fullständig Begränsad eller fullständig Begränsad eller fullständig Begränsad eller fullständig Begränsad Begränsad 4 Förutsättningar för en validering Valideringen förutsätter att det finns specificerade kriterier mot vilka en metod kan bedömas. Utvecklingen av en analysmetod är färdig först när den validerats och befunnits ha analytiska egenskaper som motsvarar uppställda krav. 4.1 Mätprocessens steg Det är ofta lämpligt att först identifiera och beskriva de steg som ingår i den totala mätprocessen (Figur 1). För den totala bedömningen av mätresultaten måste alla moment i Figur 1 beaktas men det är inte säkert att samtliga kan eller bör omfattas av valideringen. Av praktiska skäl är det ofta lämpligt att låta metodvalideringen omfatta momenten från och med att proven anlänt till laboratoriet. Valideringen gäller då metodens förmåga att bestämma den aktuella storheten i dessa prov och inte i den mängd från vilken proven tagits eller i det skick proven var före transport till laboratoriet. Det är dock nödvändigt att klart deklarera vad som omfattas av valideringen SWEDAC DOC 00:32

9 Provtagning Transport/förvaring Provbehandling (t.ex. homogenisering) Uttagning av analysprov Separation Reaktion med reagens Signalavläsning Kvantitativ signal Kvalitativ signal Omräkning till önskad skala (via kalibreringskurva) Klassificering (diagnos) Kvantitativt slutresultat Kvalitativt slutresultat Användningen av resultatet Figur 1. Exempel på de moment som ingår i en analysprocess SWEDAC DOC 00:32

10 4.2 Analytisk specifikation Nästa steg är att lägga fast den analytiska specifikationen. Detta innebär att ta en rad beslut som leder fram till en klar bild av vad som förväntas av metoden i den önskade applikationen. Metodvalideringen verifierar sedan att metoden möter specifikationen. De frågor som måste besvaras finns presenterade i tabell 2. Tabell 2. Frågor som skall besvaras för att fastlägga specifikationer för analysmetoder Typisk fråga Vilket svar krävs? Kvalitativt eller kvantitativt? Vilken är analyten och vilket mätområde är aktuellt? Är analyten närvarande i mer än en form? Vilken eller vilka former ska ingå i bestämningen? Är analyten homogent fördelad eller lokaliserad till speciell fas? Vilken är matrisen och vad består den av? Vilka matriskomponenter utgör troliga interferenser? Hur noggrant måste resultatet av analysen vara? Hur skall provet tas och har laboratoriet något ansvar för detta? Finns det några restriktioner i provstorlek och provtillgänglighet? Finns det några begränsningar beträffande analystid, kostnad, analysmiljö, personalkompetens? Skall resultaten jämföras med andra laboratoriers resultat? Skall resultaten jämföras med externa specifikationer (t.ex. myndigheters krav)? Detektions- och bestämbarhetsgräns 4.3 Metodens karakteristik Laboratoriet måste bestämma vilka parametrar som behöver preciseras för att väl karakterisera metoden. Att undersöka en metods karakteristik är en kostsam process, som naturligtvis alltid måste optimeras beroende på både kostnads- och tidsaspekter. En noggrann precisering av det aktuella mätproblemet är en förutsättning och en god början till att bygga en plan för valideringen av metoden. Laboratoriet ska göra vad det kan inom begränsade resurser, med hänsyn till kundens krav, laboratoriets erfarenhet av metoden och kravet på jämförbarhet med andra liknande metoder, som används inom laboratoriet eller av andra laboratorier. Vissa parametrar kan ha bestämts approximativt redan under metodutvecklingen. I andra fall kan en viss experimentell uppsättning ge besked om flera parametrar. På så sätt kan det med en god försöksplanering vara möjligt att erhålla nödvändig information genom ett minimum av mätningar. 4.4 Krav på validering Kraven på validering kan vara presenterade i rekommendationer eller rent av fastslagna i föreskrifter inom vissa tillämpningsområden. Valfriheten är då begränsad och det är bara att följa de rekommendationer som givits. Så finns t.ex. ibland givet att de riktlinjer som anges av AOAC skall följas för validering av metoder för livsmedelsanalyser. Genom sådana hänvisningar kan man försäkra sig om att terminologi, tillämpning, statistiskt underlag och tolkning av resultat blir densamma inom en viss sektor. I andra tillämpningar ställs krav på en kollaborativ jämförelsestudie för att en metod skall kunna accepteras för officiell kontroll. I vissa fall krävs även att en metod måste tillämpas och följas enligt bokstaven för att vara gällande även om laboratoriet anser metoden otidsenlig och opraktisk. I sådana fall kan krävas att ytterligare validering genomförs för att säkerställa inblandade laboranters skicklighet. 4.5 Krav på metodens noggrannhet Trots det som diskuterats ovan förhåller det sig i verkligheten så att de analytiska kraven sällan är överenskomna i formell mening på förhand. Lika ofta sker formella överenskommelser om analytiska betingelser i efterhand. Kunden definierar oftast sitt krav i termer av rimlig kostnad och tid utan att ha någon kunskap om kraven på noggrannhet på den tilltänkta analysmetoden, även om det finns ett underförstått krav på metoden från myndighet eller kundens kund. Tyvärr lämnas det i allmänhet till den analytiska kemisten att själv bedöma kravet på analysmetoden. Detta innebär oftast att kraven sätts i paritet med någon tillgänglig SWEDAC DOC 00:32

11 metods prestanda utan vidare kontakter med kunden för att säkerställa tillräcklig noggrannhet. Till vad skall den analytiska mätningen användas? Vad krävs av metoden egentligen? Ekonomiska begränsningar kan hindra utvecklingen mot nödvändiga analytiska krav. Det är då viktigt att beslutet vilar på rätt grund, och på den här punkten måste kund och genomförande laboratorium vara överens. Kan de analytiska kraven sänkas eller är kundens krav sådana att en ny bedömning av kostnaderna faktiskt krävs. Med ett mätresultats noggrannhet (engelskans accuracy ) avses graden av överensstämmelse mellan ett observerat, beräknat eller skattat värde och ett sant värde. Noggrannhet beskrivs ofta av de två komponenterna riktighet (engelskans trueness ) och precision. Man behöver göra klart för sig skillnaden mellan dessa uttryck. Riktighet är graden av överensstämmelse mellan ett provs verkliga innehåll av analyten och det ur ett stort antal mätvärden erhållna resultatet. Begreppet precision används för att beskriva mätresultats repeterbarhet (grad av överensstämmelse mellan resultaten av upprepade mätningar av samma mätstorhet genomförda under samma mätförhållanden) och reproducerbarhet (grad av överensstämmelse mellan resultaten av mätningar av samma mätstorhet, genomförda under olika mätförhållanden). Precisionsmått uttrycks ofta i form av en standardavvikelse eller en relativ standardavvikelse (RSD, variationskoefficient). Se vidare 6.8. Den instrumentering som används i modern kemisk analys, t.ex. spektrometriska och kromatografiska instrument, uppvisar ofta en mycket hög precision. Repeterbarheter kring 1 % är inte ovanliga. Tyvärr är det sämre ställt med riktigheten. Svårigheter i samband med provtagning och provhantering, brister i kalibrering och avsaknad av lämpliga referensmaterial leder ofta till stora fel som inte täcks av en ofta bristfälligt uppskattad total mätosäkerhet. Detta framgår tydligt i samband med provningsjämförelser. Exemplet i Figur 2 illustrerar skillnaden mellan riktighet och precision. god riktighet god precision god riktighet dålig precision dålig riktighet god precision dålig riktighet dålig precision Figur 2. Varje vertikal linje representerar medelvärde för bestämningarna (prickar). Den vertikala linjen vid noll representerar sant värde. Det finns många metoder och de kan användas i olika sammanhang. Det viktiga är att man är medveten om vilken precision och riktighet som krävs i varje tillämpning. Det går att leva med sådana metoder som de i Exempel 3 och 4 (Figur 2) och de kan eventuellt säkert förbättras om behov föreligger. Det är viktigt att man för Exempel 3 inte förväxlar den goda precisionen med en god noggrannhet och tror att metoden automatiskt har en god riktighet. Metoderna som använts i Exempel 1 och 2 har båda god riktighet medan precisionen skiljer sig åt. Tillförlitligheten för en bestämning grundad på metoden i Exempel 2 kan möjligen öka genom att SWEDAC DOC 00:32

12 öka antalet analyser i enlighet med statistikteori. Statistiska metoder är ett viktigt verktyg i bearbetandet av mätresultat. Observera att riktigheten aldrig kan beräknas enbart med hjälp av statistik utan måste bestämmas på annat sätt. Uppgifter om repeterbarhet och reproducerbarhet ger en uppfattning om vilken noggrannhet som skulle kunna uppnås. Det är dock inte praktiskt eller ekonomiskt möjligt för ett enskilt laboratorium att ta hänsyn till alla faktorer som påverkar en mätning. Repeterbarhet och reproducerbarhet, angivna som t.ex. standardavvikelser, är ett mått på mätosäkerheten men svarar oftast inte mot den totala mätosäkerheten. Under senare år har en ny generell modell för uppskattning av den totala mätosäkerheten tagits fram. Den ökade internationaliseringen medför att det blir allt viktigare att angivna mätosäkerheter är realistiska och presenteras på ett konsekvent och tydligt sätt. Oförmåga att leva upp till detta kan leda till brist på förtroende och ökade kostnader till följd av kontroller och upprepade analyser. Många kemiska mätproblem är komplicerade och en realistisk uppskattning av mätosäkerheten kan förefalla svår att utföra. Det är därför viktigt att kemisten utnyttjar information från så många källor som möjligt. Metodutvecklings- och metodvalideringsarbetet ger mycket information som kan användas i en senare sammanställning (osäkerhetsbudget) av mätosäkerhetsunderlaget. Regelbundna kvalifikationsprövningar (engelskans proficiency testing schemes ) är en form av provningsjämförelser som kan ge indikationer om mätosäkerheten för en viss tillämpning. I den totala spridningen av resultat från sådana jämförelser ingår en stor mängd faktorer som varierats (olika kemister, laboratorier, instrument, tider, platser, kalibratorer m.m.). Analysarbetet försvåras i regel då halterna av analyterna minskar. Detta tar sig uttryck i sämre precision (Figur 3) och riskerna för fel ökar. Figur 3. Precisionen (variationskoefficient) som funktion av analytkoncentrationen. Data är sammanställda från ett stort antal provningsjämförelser och ger en uppfattning om noggrannheten för rutinbestämningar. 4.6 Vad används precisionsdata till? Vid utveckling eller inkörning av en metod genomför man i allmänhet ett antal upprepade analyser för en uppsättning prover eller provmatriser. Från resultaten beräknas medelvärden och någon typ av spridningsmått, t.ex. standardavvikelsen. Dessa används tillsammans med annan tillgänglig information för att med statistiska metoder undersöka; om mätresultat ligger över eller under en viss specifikationsgräns SWEDAC DOC 00:32

13 om mätresultat skiljer sig signifikant från varandra om två analysmetoder ger lika bra resultat om mätresultat indikerar en större spridning än vad som förväntas med metoden bidrag till mätosäkerheten från olika delar av metoden om egna värden faller inom resultatet för en genomförd provningsjämförelse om ett mätvärde skiljer sig så markant att det inte ingår i den normala populationen och därmed skall förkastas (engelskan outliers ). Korrektionsfaktorer kan användas för att korrigera mätvärden som är behäftade med kända systematiska fel ( bias ). Observera dock att korrektionsfaktorerna inte är perfekta utan åtföljs av ett osäkerhetsbidrag som man kan behöva ta hänsyn till då metodens totala mätosäkerhet uppskattas. 4.7 Hur skall analysmetoder valideras I samband med utvecklingsprocessen genomgår vissa metoder en validering av bl.a. standardiseringsorganisationer såsom ISO eller CEN. Detta gäller i regel metoder som kommer att få stor spridning och valideringen kan ske i form av särskilda provningsjämförelser. Det laboratorium som använder en sådan standardiserad metod i sitt arbete måste för att man skall få hänvisa till den, kunna visa att det kan uppnå de prestandamått som anges i standarden. Valideringsunderlaget är naturligt nog mindre för metoder som är framtagna för att användas på det egna laboratoriet eller som ska få begränsad spridning. I sådana fall är det viktigt att metodens prestanda dokumenteras genom användning av (certifierade) referensmaterial eller genom jämförelse med resultat som erhållits vid varierande tillfällen eller på andra laboratorier på samma material eller med annan etablerad och validerad metod. Huruvida en metod som validerats av enbart ett laboratorium uppfyller en myndighets krav beror på de riktlinjer som myndigheten själv tillämpar. Det är normalt möjligt att få ett besked om den policy som är aktuell för myndigheten. Ett exempel på tillämpad policy (Guidelines, Drinking water inspectorate, UK) ges nedan: Ett laboratorium som använder en analytisk metod som inte är en standardiserad metod eller annan genom provningsjämförelse validerad metod förväntas kunna visa att metoden är fullt dokumenterad och prövad till den nivå som gäller för en fullt användbar referensmetod. Det skall kunna visas att: alla mättoleranser avseende volym, massa, temperatur, etc. har undersökts specificiteten i bestämningen har undersökts inklusive ämnets specificering om så krävs en bred kontroll av interferenser har utförts och att effekterna av dessa har kvantifierats alla signifikanta felkällor har identifierats och att lämpliga metoder för kontroll har vidtagits. 5 Verktyg för valideringen 5.1 Blankprover och blanklösningar Användningen av olika typer av blankprover/-lösningar gör det möjligt att bestämma hur mycket av den uppmätta signalen som härrör från analyten och hur mycket som kan ha andra orsaker. Olika typer av blanklösningar är: Reagensblank Reagens som används i den analytiska processen inklusive lösningsmedel för extraktion eller upplösning analyseras separat för att se om de bidrar till mätutslaget. Eventuellt kan analytsignalen korrigeras. Provblank Detta är hela matriser utan analyt. Det är ofta svårt att få fram hela matrisen. Man tvingas göra en syntetisk matris som inte helt motsvarar provets matris. I grunden behöver man ett riktigt underlag för att få ett realistiskt mått på de interferenser som en matris kan leda till vid analys av ett prov SWEDAC DOC 00:32

14 Fältblank Fältblank är i princip detsamma som reagensblank, men fältblanken har varit med provlösningen ute i fält och utsatts för all den påverkan som provet erhållit. 5.2 Provtyper Användningen av riktiga prover i samband med utveckling/validering är betydelsefullt därför att de ger besked om de interferenser som kommer att uppträda när i det normala analysarbetet. Om analythalten är känd kan provet användas för att bedöma metodens noggrannhet. Förstärkta prov Detta är material eller lösningar till vilka den intressanta analyten har adderats i olika portioner. Dessa material eller lösningar kan i sig innehålla en viss mängd av analyten, därför är det viktigt att vara observant på att totalmängden analyt inte hamnar utanför metodens område. Förstärkningen ger möjlighet att med en känd mängd analyt mäta responsökningen per viktsenhet (eller annan enhet och under antagandet att utbytet är 100 %) även om absolut mängden analyt före eller efter tillsatsen inte är känd. Observera dock att vid de flesta additionsmetoder tillsätts analyten på ett sådant sätt att den inte binds så hårt till provmatrisen som den skulle ha gjort om analyten varit närvarande naturligt. Det är därför risk att utbytesbestämningar på förstärkta prov ger för höga mätvärden. Spikade prov Dessa prov är ibland identiska med förstärkta prov. En spikning behöver dock inte vara begränsad till analyten. Spikning kan göras med allting som behöver adderas till provet för att studera effekten. Så till exempel kan provet spikas med olika koncentrationer av en speciellt interfererande substans så att det är möjligt att bestämma den koncentration vid vilken bestämningen av analyten börjar att påverkas. Oberoende karakteriserade prov Det är svårt att bestämma en metods riktighet utan att använda prover med känd halt av analyter. Om ett prov har karakteriserats med en annan väldokumenterad metod kan provet användas som referensmaterial med vilket den nya metodens riktighet kan bestämmas. 5.3 Kalibratorer Kalibratorer är lösningar eller substanser använda för kalibrering eller identifiering. Uttryck som standard eller mätstandard bör undvikas i svenskan. Traditionellt är kalibratorerna tänkta att vara lösningar av en substans men de kan vara i vilken form som helst där en specifik parameter eller egenskap har karakteriserats så noga att den kan användas som referens eller för kalibreringsändamål. 5.4 Referensmaterial Ett referensmaterial (RM) är ett material eller ett ämne som är tillräckligt homogent i fråga om ett eller flera väl bestämda egenskapsvärden för att kunna användas för kalibrering av en apparat, bedömning av en mätmetod eller åsättande av värden på material. Ett RM kan vara gasformigt, vätskeformigt eller fast samt utgöra ett rent ämne eller en blandning. RM är vanligen inte karakteriserat i samma höga grad som certifierade referensmaterial. Det är vanligt att referensmaterial förväxlas med certifierade referensmaterial (CRM). Ett CRM är ett RM försett med ett intyg som styrker att egenskapsvärdena är framtagna på ett sådant sätt att de skall vara spårbara till den enhet som de uttrycks i. Varje egenskapsvärde åtföljs av en uppgift om mätosäkerheten på en angiven konfidensnivå. Karaktäriseringen av ett blivande CRM sker ofta i form av en särskild provningsjämförelse där flera erfarna laboratorier applicerar en eller flera metoder. Vilka metoder som ingår bestäms bl.a. av den mätosäkerhet som man strävar efter att egenskapsvärdena ska ha. 5.5 Försöksplanering och statistiska hjälpmedel En rätt upplagd försöksplanering ger den analytiska kemisten mer information kring en speciell mätnings inneboende möjligheter och svagheter. Experiment med upprepade analyser skall konstrueras så att de tar SWEDAC DOC 00:32

15 med alla variationer i experimentbetingelser som man kan tänka sig vid en normal rutinanvändning av metoden. Avsikten är att skaffa sig information om och att bestämma en sannolik spridning och inte en minsta tänkbara. Den analytiska kemisten behöver vara bekant med åtminstone de mera grundläggande delarna av statistisk teori, speciellt som hjälpmedel för att utvärdera riktighet, precision, linjärt område, bestämbarhetsgräns och osäkerheter i kvantifieringen. Ibland kan avsevärt mer komplexa samband mellan prov och mätsignaler behöva bestämmas. Ett antal bra böcker finns upptagna i referenslistan. 6 En valideringsprocedurs olika steg 6.1 Identitetsbevis Det är nödvändigt att fastställa att ett utslag som vi antar härrör från vårt sökta ämne verkligen kommer enbart från det sökta ämnet och inte från något annat kemiskt ämne eller fysikaliskt fenomen, som råkar sammanfalla med det sökta ämnet. I visst avseende erhåller man också på detta sätt en upplysning om både selektivitet och specificitet (se vidare nedan). Denna del av valideringen skall utföras tidigt i valideringsprocessen så att ett klart bevis erhålls på att t.ex. toppen i ett kromatogram verkligen härrör från analyten eller derivatiserad analyt. Flera oberoende mätprinciper kan användas för att bekräfta resultatet med en metod. Konfirmering av resultatet blir säkrare om en signifikant olik princip används för den konfirmerande tekniken. I en del applikationer t.ex. att identifiera okända organiska substanser med GC är användningen av konfirmerande tekniker mycket viktiga Exempel vätskekromatografi med UV-detektion En topp i ett kromatogram kan identifieras som kommande från analyten genom retentionstidsjämförelse med en kalibreringslösning, ett prov eller ett referensmaterial innehållande analyten. Frågan blir om toppen verkligen kommer från analyten eller är en helt annan substans som av en slump kommer på samma ställe. Toppen kan också vara en blandning av flera substanser. Identifikation av analyten på detta sätt är inte särskilt pålitligt och det är önskvärt med någon form av ytterligare bevis. Förslagsvis kan en eller flera av följande saker göras: Användning av andra principer för detektion (diod-array, elementspecifik, masspektrometri). Analys av provet med annan kromatografisk teknik t.ex. GC. Byte till kolonn med annan polaritet. Preparativ kromatografi. Därefter kan en identitetskontroll med t.ex. NMR eller IR göras Exempel infraröd spektrometri Identifikation av en okänd analyt kan göras genom att jämföra absorbanser hos analytens spektrum med referensspektra från ett bibliotek. Då man tror att en korrekt identifikation har gjorts så tas ett spektrum av det rena ämnet upp under samma förhållanden som för provet. Bekräftande tekniker används för att kontrollera identitet och mängd hos analyten. Ju mer bevis desto bättre men naturligtvis måste man väga den tid det tar att identifiera analyten mot den grad av säkerhet som krävs för att analyten har identifierats korrekt. 6.2 Selektivitet, specificitet samt matriseffekter Selektivitet och specificitet Selektiviteten hos en metod beskriver den grad med vilken metoden kan bestämma en eller flera analyter i en komplex blandning utan interferens från andra substanser i blandningen. En metod som är helt selektiv sägs vara specifik SWEDAC DOC 00:32

16 I allmänhet kan analytiska metoder sägas bestå av ett bestämningssteg vilket eventuellt föregås av ett isoleringssteg. Interferens från andra substanser i bestämningssteget beror på isoleringsstegets effektivitet och bestämningsstegets specificitet. I de fall detektionssteget inte är specifikt är det möjligt att visa vilka analyter som inte interfererar. Det är bra mycket svårare att säga att ingenting stör eftersom det alltid finns möjlighet att råka på någon hittills okänd störfaktor. Det är kemistens uppgift att besluta när man skall sluta att titta efter ytterligare störningar. Om interferenser är närvarande antingen därför att de inte kan separeras från analyten eller också därför att man inte vet att de är närvarande så har de ett antal effekter. Beroende på hur analytens identitet bestäms kan interferenserna försvåra bekräftelsen genom att störa analytens spektrala signaler (t.ex. i ICP-OES). De kan också öka analytens koncentration genom att ingå i den kromatografiska topp som tillskrivs analyten. De kan ibland också minska analytens koncentration om de ger en negativ signal. Det är nödvändigt att visa att metoden inte störs av, Kända tillsatser, t.ex. formuleringshjälpmedel Kända föroreningar, t.ex. biprodukter från syntesen eller utgångsmaterial Nedbrytningsprodukter (genom inverkan av värme, ljus, fukt, syra, baser, oxidationsmedel m.m.) Metaboliter Övriga ämnen i matrisen För att få bestämma eventuella interferenser måste kanske accelererad nedbrytning utföras. Det är nödvändigt att delvis gissa vad som kan störa och därefter kontrollera detta. Det är också en fråga om stegvis uteslutning eftersom det i början av ett arbete inte är bekant vilka nedbrytningsprodukter eller metaboliter som kan bildas. Vid accelererad nedbrytning skall substansen brytas ner till minst % genom t.ex. värme (50 C), ljus, 0.1M HCI, 0.1M NaOH, 3 % H 2 O 2, fuktighet (85 % relativ fuktighet). Specificitetsundersökningar görs lämpligen genom att syntetiska blandningar med tänkbara interferenser analyseras. Om det är kromatografiska metoder noteras retentionstiderna, annars mäts responsen av analyten och jämförs med responsen av analyten i en lösning som bara innehåller analyten. Även blankextrakt (gärna mer koncentrerade) och prov, båda med tillsatser, kan användas. Utbytesförsök (6.7) kan vara ett bra sätt att studera specificitet. Höga värden (>>100 %) tyder på en samtidig bestämning av en annan komponent. Däremot är inte ett korrekt utbyte ett tillräckligt bevis för hög specificitet. Specificitetskraven är baslinjeupplösning på minst 1,5 (se Figur 4.) från alla studerade interferenser. Om detta inte är möjligt måste man bestämma sig för hur mycket slutresultatet är tillåtet att påverkas av närvaron av störsubstansen i fråga. Figur 4. Definition av upplösning av två toppar i ett kromatogram SWEDAC DOC 00:32

17 Upplösningen R mellan två toppar i ett kromatogram ges av ekvationen, ( t R = 2 W R2 R1 = 2 2 t + W 1 ) där t R2 och t R1 är respektive retentionstid för komponenterna 2 och 1. W 2 och W 1 är respektive topps bredd vid basen mätt i tidsenheter. För näraliggande toppar som med ungefär samma bredd (W 2 = W 1 ) gäller att R = t / W 2. W 2 t + W SWEDAC DOC 00:32

18 Matriseffekter Matrisen är den miljö i vilken analyten befinner sig. Matrisen kan i vissa fall vara mycket komplicerad (blod, vävnad, jord, spannmål, luft, vatten). Det är viktigt att i så tidigt skede som möjligt få en uppfattning om vilka störningar matrisen kan ge upphov till. Till skillnad från den specificitet som diskuterats ovan är matriseffekterna närmast okända till sin natur. Det behöver inte heller vara så att matrisen ger upphov till störande ämnen som syns som toppar i ett kromatogram utan detektorsystemets känslighet kan drastiskt påverkas t.ex. genom quenchning av fluorescensen och förändringar av den kemiska jonisationen i en GC-MS metod. Matriseffekter kan studeras genom att matrisen arbetas upp utan närvaro av analyten. Tänk på att ord som t.ex. jord, spannmål, avloppsvatten inte definierar matrisen kemiskt. En analyt kan existera i olika former. Till exempel är det stor skillnad på följande två analytiska krav: 1. Bestämma totalmängden järn i ett födoämne. 2. Bestämma mängden järn som är tillgängligt för konsumenten i samma födoämne. Järn kan vara närvarande i många olika former t.ex. metalliskt järn, oorganiska järnsalter (både vattenlösliga och vattenolösliga) eller organiskt bundet järn. Totalmängden järn kan vara samma eller högre än den järnmängd som kan tillgodogöras av en konsument som äter födoämnet. När en metod utvecklas för att bestämma de krav som gavs ovan kan slutbestämningen av järn vara densamma i båda fallen men provupparbetningen skiljer sig åt och måste ta hänsyn till metodkraven. För att bestämma totaljärn används en aggressiv uppslutningsmetod som helt förstör provmatrisen. För att bestämma tillgängligt järn används en mildare extraktion som liknar människans matsmältning. Problemet blir svårare när metoden skall behålla analytens oxidationsstadium eller komplextyp. 6.3 Detektionsgräns Detektionsgränsen är den lägsta koncentrationen vid vilken analyten med en viss statistisk säkerhet kan upptäckas med metoden. Detektionsgränsen kan bestämmas både för kvantitativa och kvalitativa metoder. Detta är en viktig parameter vid t.ex. spåranalyser. Problemen vid bestämningen av detektionsgräns hänger samman med att sannolikheten för att detektera en signal för analyten inte plötsligt ökar från 0 till 1. Det finns inget tröskelvärde som skall passeras, utan hela tiden finns störningar från instrument och matrisen som ger en mätsignal utan att någon analyt finns närvarande. Matrisen har mycket stor betydelse och störningarna varierar för olika matriser vilket innebär att detektionsgränsen varierar med matrisen även om metoden är densamma. Det finns flera olika tekniker för att komma fram till ett numeriskt värde för detektionsgränsen. Vi ger här enbart några exempel Utförande för kvantitativ analys 1. Skaffa provblankar av de matriser som metoden skall täcka. 2. Analysera tio oberoende provblankar en gång vardera. 3. Registrera mätsignalen (area, topphöjd, absorbans, volym titratorlösning etc.) och beräkna standardavvikelsen (s). 4. Beräkna detektionsgränsen; detektionsgränsen = mätsignal + 3s skall ge en säkerhet på 99 % att signalen kommer från analyten. 5. Konvertera mätsignalen till analytkoncentration med hjälp av kalibreringskurvan även om det en extrapolation utanför mätområdet. 6. För vissa metoder fås inte någon säker signal från blankproven. Bästa sättet är då att förstora upp instrumentbruset och ange detektionsgränsen som 3 gånger bruset. Helst bör ett mer koncentrerat extrakt användas än vad som erhålls när ett vanligt prov upparbetas. Ett annat sätt att bestämma detektionsgränsen finns beskrivet av Schwartz och Kroll genom: detektionsgränsen = 3,3 s / lutningen för kalibreringskurvan SWEDAC DOC 00:32

19 Standardavvikelsen kan komma från en blank eller kalibreringskurvans skärning med y-axeln (y-interceptet). Oavsett vilken metod som använts skall den dokumenteras och ett lämpligt antal spikade blankar med en koncentration kring detektionsgränsen skall analyseras för att validera nivån Utförande för kvalitativ analys För kvalitativa mätningar finns det ett koncentrationströskelvärde under vilket positiva resultat inte är säkra. Responsområdet skall undersökas genom att pröva en rad prov och kalibratorer bestående av blankar och prov som innehåller olika koncentrationsnivåer för analyten. På varje koncentrationsnivå är det nödvändigt att göra tio mätningar. En responskurva med % positiva (eller negativa) resultat mot koncentrationen konstrueras. Från denna är det möjligt att bestämma tröskelkoncentrationen vid vilken metoden blir oanvändbar. I exemplet nedan blir en positiv identifikation av analyten i 100 % av fallen omöjlig under 100 mg g -1. Koncentration Antal replikat Positiva / negativa resultat mg g / / / / / Bestämbarhetsgräns Bestämbarhetsgränsen är den lägsta analytkoncentration som kan bestämmas med acceptabel riktighet och precision. Tänk på att det normalt är en gråzon mellan detektionsgräns och bestämbarhetsgräns, där det är möjligt att säga att analyten finns närvarande men där den kvantitativa bestämningen är alltför osäker och har en avsevärt större mätosäkerhet än vad analyskraven anger. Utförande 1. Skaffa provblankar av de matriser som metoden skall täcka. 2. Analysera tio oberoende provblankar en gång vardera. 3. Registrera mätsignalen (area, topphöjd, absorbans, volym titratorlösning etc.) och beräkna standardavvikelsen. 4. Uttryck bestämbarhetsgränsen som mätsignalen + 10s. Det är vanligast att använda 10s men det finns också analytiker som i stället använder 5s eller 6s beroende på den osäkerhet som man kan acceptera. 5. Analogt med vad som beskrivs under avsnittet detektionsgräns kan bestämbarhetsgränsen beräknas ur: Bestämbarhetsgränsen = 10s / lutningen för kalibreringskurvan. Även om det är möjligt att ur blankvärden uppskatta en bestämbarhetsgräns är det bättre använda förstärkta prover eller lämplig matris till vilken analyten tillsätts i olika mängd (utbytesförsök). Det är nödvändigt att veta vilken noggrannhet som analysen kräver för att fatta ett riktigt beslut. Mät tio oberoende replikat på varje successivt lägre nivå och bestäm s. Ange bestämbarhetsgränsen som den lägsta koncentration som kan bestämmas med acceptabel precision. 6.5 Mätområde och linearitet Mätområdet för en analysmetod är det koncentrationsområde inom vilket metoden har acceptabel riktighet och precision. Mot områdets lägre sida sätter bestämbarhetsgränsen stopp och åt andra hållet ligger begränsningen hos detektionsprincipen. En kalibreringskurva visar sambandet mellan mängden av analyt i provlösningen och mätresponsen. Vad som i varje enskilt fall är acceptabel riktighet och precision bestäms av kemisten i kontakt med kunden. Ett exempel på hur den relativa standardavvikelsen ökar vid minskad provkoncentration visas i Figur 6. Ibland har metoden experimentellt undersökts i ett relativt smalt område och kan med bibehållen noggrannhet SWEDAC DOC 00:32

20 användas i ett utvidgat område. Om det är önskvärt att utvidga mätområdet måste en ny validering ske. Kalibreringskurvans lineära område skall bestämmas. Kurvan skall täcka hela mätområdet (minst % av provernas koncentration). Inom det lineära området kan en kalibreringspunkt räcka vid daglig analys och förutsatt att kurvans lutning är känd. Annars krävs flerpunktskalibrering (vanligen 3-6 punkter). Att en kalibreringskurva böjer av vid högre koncentrationer är vanligt vid spektroskopi. För vätskekromatografi med ljusspridningsdetektion är det lineära området mycket smalt och kalibreringskurvan böjer av både vid höga och låga koncentrationer. Normalt försöker man att arbeta med lineära kalibreringskurvor och i de fall man inte gör det skall den kurvanpassning som används motiveras. Krökta kalibreringskurvor kan erhållas bl.a. vid vätskekromatografi med ljusspridningsdetektion, vid jonkromatografi och vid MS-SIM. Modern datateknik gör det lätt att anpassa värden till krökta kurvor. Ibland är det inte motiverat att pröva linearitet t.ex. vid vissa titrimetriska och gravimetriska metoder, men ofta bör en bestämbarhetsgräns ändå bestämmas. Sammanfattning av utförande vid bestämning av mätområde och linearitet Vad skall analyseras / bestämmas Blank plus referensmaterial eller spikade blankar med minst 6 olika koncentrationer Referensmaterial eller spikade blankar för minst 6 koncentrationer inom det lineära området Bestämbarhetsgränsen 10 Replikat på varje koncentration Antal analyser Utförande Anmärkning 1 Rita upp respons mot koncentrationer. Kontrollera visuellt approximativt lineärt område och övre och nedre gräns för mätområde. 3 Rita upp respons mot koncentrationer. Kontrollera visuellt outliers. Beräkna regression koeff. Bra linearitet kräver >0,99. Beräkna och rita upp residualvärden (skillnaden mellan uppmätt och beräknat y-värde, det givet av linjen) mot varje x-värde. Slumpmässig fördelning kring den räta linjen stöder linearitet. En systematisk trend pekar på ickelinearitet Idealt skall olika koncentrationer framställas oberoende och inte genom spädning från samma startlösning Ta inte bort outliers utan att först kontrollera genom nya mätningar på näraliggande koncentrationer. I vissa fall är det bättre att använda icke-lineär kurvanpassning. Arbeta med successivt lägre koncentrationer tills riktighet och precision inte längre är acceptabla 6.6 Känslighet Med känslighet avses i regel graden av ändring i instrumentrespons som funktion av ändringen i analytkoncentration (lutningen hos kalibreringskurvan). I de fall där kalibreringskurvan är lineär med avseende på koncentrationen har metodens lineära område bestämts och när interceptet är känt är lutningen en användbar parameter att beräkna och använda i formler för kvantitativa beräkningar. Känsligheten är också metodens svar på små förändringar i analytkoncentration. Den kan bestämmas genom analys av prover med successivt närliggande halter och bestämning av den punkt där en statistiskt signifikant skillnad kan mätas upp SWEDAC DOC 00:32