biologiskt material stamcellerna verksamhet

Transkript

1 Byggstenar av biologiskt material stamcellerna i forskning och i klinisk verksamhet cells & tissue

2 INNEHÅLL 2 OUti hovatta och Magnus Westgren 4 Stamceller i sjukvårdens tjänst katarina leblanc 6 Mesenkymala stamceller Bo-göran ericzon 8 Livgivande leverceller Maria eriksdotter jönhagen 10 Cellfylld kapsel räddar minnet 11 NGF Nerve Growth Factor vid Alzheimer Christer Sylvén 12 Biologisk pacemaker Edvard Smith 15 ips - nytt sätt att omprogrammera celler moustapha hassan 16 Cytostatika snart möjlig att individualisera cells & tissue olle ringdén 18 Växelbruk ger alla kraft erik sundström 20 Nervcellens lagning en utmaning mikael wendel 22 Stamceller mot tandlossning Urban Lendahl 24 DBRM ett strategiskt forskningscenter Pontus Blomberg 26 Gen- och Cellterapicentrum/Vecura Redaktör: Li Felländer-Tsai. Foto: Staffan Larsson, Lennart Nilsson (s 18), Camilla Svensk (s 25) med flera. Grafisk produktion: Kan Art. Tryck: Rapidax, mars 2009.

3 CRM Centrum för regenerativ medicin Regenerativ medicin är ett multidisciplinärt fält med mål att ersätta skadade eller sjukliga vävnader i människokroppen. Genom nya permanenta komponenter kan sjukdomssymtom elimineras och både funktion och välbefinnande öka. Gener, celler, vävnader, organ och syntetiska biomaterial både enskilt eller i hybridform kan användas här för att reparera, ersätta eller förstärka sviktande biologiska funktioner. De nya vävnaderna spelar även en viktig roll för utvecklande av nya mediciner. Utvecklingsarbetet är epokgörande ur flera aspekter och har även nått klinisk praxis inom flera fält. Regenerativ medicin ger även möjlighet att kartlägga de reglersystem som styr den normala läkningsprocessen med syfte att bättre kunna förstå och påverka bristfällig läkning. 3 Ett Centrum för regenerativ medicin i Stockholm skapar förutsättningar för ett slagkraftigt samarbete mellan forskning och klinik med en gemensam vision om att kunna ersätta sviktande mänskliga vävnader med nya biologiska och syntetiska komponenter. Avsikten är att grundforskningsidéer snabbt och effektivt skall kunna omsättas i klinisk praxis med mål att kunna ge maximal patientnytta som resultat. För att detta skall kunna ske fordras visionär höjd i en kreativ miljö som underlättar kritiskt och innovativt tänkande. Ytterligare en viktig förutsättning är korta beslutsvägar inom Karolinska Institutet och Stockholms läns landsting. Frågeställningar i kliniken skall snabbt kunna angripas i olika experimentella modeller och ge svar på kliniska frågeställningar för att etablera nya, moderna och effektiva behandlingsmetoder där människokroppen repareras genom att återskapa vävnader och organ. Denna skrift ger ett smakprov på framstående verksamheter inom klinisk regenerativ medicin. Li Felländer-Tsai, professor ordförande för interimistiska styrgruppen Centrum för regenerativ medicin i Stockholm i samarbete med Urban Lendahl, ordförande DBRM samt styrgruppen för Forskningsnätverket Tissue and Motion vid Karolinska Institutet

4 Stamceller i sjukvårdens tjänst De forskar om livets början och stamceller som kan utvecklas till alla typer av celler. På sikt kan forskningen få stor betydelse för att behandla svåra sjukdomar i alla skeden av livet. 4 De forskar om livets början och stamceller som kan utvecklas till alla typer av celler. På sikt kan forskningen få stor betydelse för att behandla svåra sjukdomar i alla skeden av livet. För snart 30 år sedan föddes världens första barn genom provrörsbefruktning. Sedan dess har assisterad befruktning blivit en allt effektivare metod för behandling av ofrivillig barnlöshet. Outi Hovatta har Sveriges enda professur med inriktning på assisterad befruktning. Hon arbetar på Enheten för gynekologi och obstetrik och utvecklar nya behandlingsmetoder för ofrivilligt barnlösa. Arbetet har också väckt hennes intresse för stamceller som kan utvecklas till olika typer av celler. Vi odlar fram stamcellslinjer från embryon som inte kan användas vid provrörsbefruktning. Sin motivation för att forska hämtar hon ifrån arbetet på kliniken. Vi utvecklar nya behandlingsmetoder utifrån de behov vi ser på sjukhuset. Som läkare har jag upplevt många situationer där stamcelltransplantationer skulle ha behövts. Behandla sjuka foster Magnus Westgren är professor på samma enhet och motiveras också av sina erfarenheter från sjukvården. Som förlossningsläkare på Karolinska universitetssjukhuset i Huddinge möter han kvinnor som tvingats avbryta graviditeten för att fostret haft en svår sjukdom. Det gjorde mig tidigt intresserad av att försöka behandla sjuka foster genom att transplantera stamceller. Magnus Westgren arbetar med stamceller som isolerats ifrån fostervävnad. Under 15 års forskning har vi isolerat lever-, hjärt- och neurostamceller samt blodbildande celler och stamceller som gör gallvävnad. Forskarna har också utfört stamcellstransplantationer på foster under graviditeten. Vi har bl a transplanterat benbildande stamceller till ett foster som led av en sjukdom som gör att benen bryts mycket lätt. Idag kan flickan gå och kroppen har accepterat den transplanterade vävnaden som sin egen. Det är ett exempel på vad man kan åstadkomma med regenerativ medicin för en sjukdom som det egentligen inte finns någon bot för. Alla slags celler Fosterstamceller är multipotenta och kan utvecklas till flera olika typer av celler och vävnader. De kan dock inte återbilda alla vävnadstyper som finns hos en vuxen människa. För att rekonstruera alla slags vävnader krävs embryonala stamceller. Dessa celler kan dela sig oavbrutet och utvecklas till alla olika celltyper. När forskarna ska utveckla sådana stamcellslinjer utgår de ifrån embryon som blivit över vid provrörsbefruktning.

5 Om embryot är av tillräckligt bra kvalitet så tar vi ut en del av cellerna, förklarar Outi Hovatta. Den nya stamcellslinjen odlas fram med hjälp av stödceller som hämtas från humana bindvävsceller. Sedan förs stamcellerna över till andra odlingsmedier där de kan differentieras till olika celltyper. Vi har ett omfattande samarbete med flera grupper som utvecklar behandlingar med hjälp av regenerativ medicin. Kardiologerna vill ha hjärtmuskelceller medan neurologerna är intresserade av nervceller för att kunna behandla vissa sjukdomar i centrala nervsystemet, berättar Outi Hovatta. Forskarna vill också lära sig mer om kroppens egen stamcellsproduktion som spontant ökar vid olika sjukdomsprocesser. Det sker t ex när ett foster drabbas av syrebrist. Genom att lära sig mer om de här styrmekanismerna kan man också utveckla nya behandlingsmetoder, tror Magnus Westgren. Kanske kan man lura kroppen att bilda mer stamceller i vissa situationer, t ex för att bilda ny hjärnvävnad eller nytt brosk. De lagar och regler som finns är tydliga och bra. Vi stöder dem helt och hållet, betonar Outi Hovatta. Forskarna har också en fortlöpande dialog med lagstiftarna. Det är viktigt att det finns en öppenhet i den här verksamheten. Att vi inte gör något i mörka garderober, säger Outi Hovatta. Stamcellsforskningen befinner sig fortfarande i ett tidigt skede. Forskarna ser dock mycket ljust på möjligheterna att i framtiden kunna behandla folksjukdomar som demens, diabetes och hjärt-kärlsjukdomar med hjälp av stamceller. Jag är övertygad om att vår forskning kommer att spela en stor roll för att behandla svåra sjukdomar som det idag saknas bot för, säger Outi Hovatta. Text: Peter Tillhammar Skapa forskningsmiljöer Vid Karolinska Institutet finns forskargrupper som odlar stamceller av olika slag. Magnus Westgren och Outi Hovatta ser gärna ett utökat samarbete mellan grupperna. Det vore bra om man kunde skapa miljöer där stamcellsforskare samverkar för att få ny kunskap om teknik och odlingsförhållanden, säger Magnus Westgren. Han jämför med situationen för stamcellsforskning i England. Där finns flera väldigt starka forskningsmiljöer tack vare målmedvetna satsningar. Trots begränsade resurser har svensk stamcellsforskning varit framgångsrik. Av världens totalt 300 embryonala stamcellslinjer har 30 linjer tagits fram på laboratoriet i Huddinge och 30 vid Göteborgs universitet. Jämfört med hur mycket pengar som de etablerade forskargrupperna i England har fått i anslag, så har vi varit effektiva, säger Outi Hovatta. Att odla stamcellslinjer är en komplicerad process. Det är små detaljer som avgör om cellerna kan utvecklas till stamcellslinjer eller inte. För att det ska fungera behövs människor med rätt känsla, framhåller Magnus Westgren. Det är lite grann som att ha gröna fingrar. Bakom framgången ligger också ett väl utvecklat kontaktnät av forskare och kliniker på sjukhuset. Outi Hovatta och Magnus Westgren betonar vikten av ett nära samarbete mellan forskning och klinik. Vi odlar de här linjerna i ett rum som ligger intill laboratoriet för klinisk provrörsbefruktning. Våra embryologer har den kunskap som dessa embryonala stamceller behöver. Jag skulle aldrig ha lyckats åstadkomma några stamcellslinjer på ett grundforskningslaboratorium, säger Outi Hovatta. Omprogrammerade stamceller (ips) Vi har nyligen också odlat fram omprogrammerade hudceller, så kallade ips celler, som beter sig på samma sätt som embryonala stamceller. Alla metoder som ursprungligen har utvecklats med embryonala stamceller kan tillämpas på ips-celler och ips-celler kan vi få från patientens egna hudceller. Bra förutsättningar I många länder är möjligheterna till stamcellsforskning begränsade. I USA får nya stamcellslinjer bara utvecklas inom den privata sektorn. Magnus Westgren ser en stor fördel i att verksamheten i Sverige bedrivs i universitetsmiljö. Här är forskningen så nära. När forskningen bedrivs i företag sprids inte informationen lika fort. Privata kliniker har inte heller tid att forska. Forskningen i Sverige gynnas också av att de lagar som reglerar området är mer liberala än motsvarande lagstiftning i många andra länder. Huvudansvarig Magnus Westgren, professor Medarbetare Cecilia Götherström Nikos Papadogiannakis Anna-Maria Jonsson Eleonor Tibladh Referenser Maternal microchimerism in human fetal tissues. Jonsson AM, Uzunel M, Götherström C, Papa-dogiannakis N, Westgren M. Am J Obstet Gynecol Fetal stem-cell transplantation. Tiblad E, Westgren M. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol Feb; 22(1): Identification of maternal hematopoietic cells in a 2nd-trimester fetus. Götherstrom C, Johnsson AM, Mattsson J, Papadogiannakis N, Westgren M. Fetal Diagn Ther Sep-Oct; 20(5): Huvudansvarig Outi Hovatta, professor Medarbetare Anne-Marie Strömberg Rosita Bergström Susanne Ström Frida Holm Maria Lindeberg Referenser Ström S, Inzunza J, Grinnemo K, Holmberg K, Matilainen E, Stromberg A, Blennow E, Hovatta O. Mechanical isolation of the inner cell mass in derivation of new human embryonic stem cell lines. Hum Reprod [Epub. ahead of print Oct 25] Unger C *, Skottman H *, Blomberg P, Dilber SM, Hovatta O. Good manufacturing practice and clinical grade human embryonic stem cell lines. Human Molecular Genetics : R48-R. Zhang P, Dixon M, Zucchelli M, Hambiliki F, Levkov L, Hovatta O *, Kere J *, equal contirbution * The NLRP gene family is involved in human preimplantation development, PLoS ONE Jul 23;3 (7):e Borgström B, Hreinsson J, Rasmussen C, Sheikhi M, Fried G, Keros V, Fridström M *, Hovatta * (equal contribution *). Fertility preservation in girls with Turner syndrome prognostic signs for presence of follicles in ovarian tissue. J Clin Endocr Metab, E-pub ahead of print 28 October

6 6 Mesenkymala stamceller minskar risken för avstötning Så kallade mesenkymala stamceller bildas i benmärgen och kan mogna ut till ett antal olika vävnadstyper. Katarina Le Blancs forskning har visat att de mesenkymala stamcellerna, genom att bland annat utsöndra stora mängder tillväxtfaktorer, även verkar kunna hämma immunreaktioner. De skulle därför, om de ges tillsammans med blodstamceller, kunna minska risken för avstötning vid transplantation till patienter med leukemi respektive risken för allvarliga transplantat-kontra-värdreaktioner.

7 Transplantation med hematopoetiska så kallade blodstamceller är idag en väl etablerad behandling av leukemi och andra elakartade blodsjukdomar. Patienterna måste dock före transplantationen behandlas med höga doser cytostatika för att cancercellerna ska kunna slås ut. Men samtidigt slås också de egna immuncellerna ut, en förutsättning för att mottagaren ska kunna ta emot de nya blodstamcellerna från en frisk donator. För att förhindra avstötningsreaktioner ges immunhämmande medicin i samband med transplantationen. Betydligt allvarligare är en så kallad transplantat-kontra-värdreaktion, det vill säga en häftig inflammatorisk reaktion där donatorns vita blodkroppar i transplantatet uppfattar mottagarens celler som främmande och angriper dem; ett tillstånd med hög dödlighet. De organ som oftast drabbas av den här våldsamma reaktionen är hud, lever och mag-tarmkanal. Cirka hälften av de transplanterade patienterna får någon form av reaktion och måste få immunhämmande behandling. En del patienter, omkring tio procent, får dock en så svår reaktion att den inte går att dämpa med kortison, säger Katarina Le Blanc, som till en tredjedel är kliniskt verksam vid hematologiska kliniken, Karolinska Universitetssjukhuset, Huddinge. Även för annan cellterapi Utöver leukemi och andra allvarliga blodsjukdomar finns ett stort antal autoimmuna sjukdomstillstånd där förhoppningen nu är att mesenkymala stamceller också ska kunna ha god effekt. Exempelvis vid MS, Duchennes muskeldystrofi, inflammatoriska tarmsjukdomar respektive reumatologiska sjukdomar. Inom alla dessa tillstånd förekommer en inflammation, säger Katarina Le Blanc som kommer att utveckla sitt samarbete med andra forskargrupper kring sjukdomstillstånden. Det långsiktiga målet är att organisera den här typen av cellterapi så patientsäkert som möjligt. Man har även studerat effekterna av att transplantera mesenkymala stamceller i samband med medfödda metabola sjukdomar respektive olika skelettsjukdomar. För närvarande pågår en nordisk studie över patienter med avancerad diabetes som fått en ny njure och Langerhanska cellöar från en donator respektive mesenkymala stamceller från sig själva. Text: Eva Cederquist 7 Ett lovande forskningsfält I benmärgen bildas utöver blodstamceller också mesenkymala stamceller. Dessa kallas bindvävstamceller, eftersom de kan mogna ut till olika vävnadstyper som ben, brosk, senor, muskel och fett. I Katarina Le Blancs forskning undersöker de om kombinerad transplantation av blodstamceller och mesenkymala stamceller minskar risken för avstötning och dämpar allvarliga immunreaktioner. En sannolik förklaring är att de mesenkymala stamcellerna utsöndrar stora mängder tillväxtfaktorer respektive styr nybildningen av blodstamceller i benmärgen och på så sätt kan påverka lymfocyternas funktion. Till skillnad från forskningen kring blodstamceller, där de första transplantationsförsöken gjordes redan på 1950-talet, är forskningen kring mesenkymala stamceller relativt ny. När vi började transplantera mesenkymala stamceller för ett tiotal år sedan var det ett udda, men mycket lovande forskningsfält. Idag har vi behandlat ett antal patienter i samarbete med några andra europeiska forskningscentra i Leiden, Nederländerna, och Genua och Pavia, Italien. Cirka två tredjedelar av patienterna i dessa studier har svarat mycket bra på behandlingen och 43 procent mår fortfarande bra två år senare jämfört med kontrollerna. Forskarna har skapat ett register över samtliga patienter som transplanterats med mesenkymala stamceller i Europa, vilket gör det möjligt att följa behandlingseffekterna över tid och få kunskap om eventuella biverkningar. Odlade mesenkymala stamceller har en framtida potential för behandling av skador i bindväven och för att förbättra omständigheterna i samband med en samtidig transplantation av blodstamceller. Huvudansvarig: Katarina Le Blanc, professor Medarbetare Cecilia Götherström Mikael Sundin Referenser Le Blanc K, Rasmusson I, Sundberg B, Götherström C, Uzunel M, Ringden O. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesen chymal stem cells. Lancet. 2004; 363: Le Blanc K, Samuelsson H, Gustafsson B, Remberger M, Sundberg B, Arvidson J, Ljungman P, Lönnies H, Nava S, Ringdén O. Transplantation of mesenchymal stem cells to enhance engraftment of hematopoietic stem cells. Leukemia. 2007; 21: Ringdén O, Uzunel M, Sundberg B, Lönnies L, Nava S, Gustafsson J, Henningssohn L, Le Blanc K. Tissue repair using allogeneic mesenchymal stem cells for hemorrhagic cystitis, pneumomediastinum and perforated colon. Leukemia. 2007; 21: Le Blanc K, Frassoni F, Ball L, Locatelli F, Roelofs H, Lewis I, Lanino E, Sundberg B, Bernardo ME, Remberger M, Dini G, Egeler M, Bacigalupo A, Fibbe W, Ringdén O. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 2008; 371:

8 8 Livgivande leverceller Visionen är att hitta rätt portion av de mest verksamma levercellerna så att vi inte behöver transplantera så stora volymer av celler. Kan vi dessutom lära oss hur olika leverceller har specialiserat sig och identifiera dessa så kanske vi kan odla fram rätt sort hepatocyt för rätt person. Bo-Göran Ericzon är professor i transplantationskirurgi vid Karolinska Institutet. I januari genomfördes den första hepatocyttransplantationen i Skandinavien. Det var en svårt leversjuk patient som injicerades med adulta leverceller, mellan sju och åtta miljarder celler, enligt samma princip som man överför bukspottskörtelns ö-celler vid diabetes. Avsikten var att stabilisera tillståndet för en snabbt allt sämre patient, men trots att det mesta runt själva ingreppet betraktas som lyckat kom behandlingen för sent och patientens liv stod inte att rädda. Men jag är säker på att man når positiva resultat om man kan agera tidigare och lära oss mer om vilka patienter som kan klara sig med ett tillskott av friska celler i stället för ett helt organ, förklarar Bo-Göran Ericzon. De första organ som transplanterades i Sverige var njurar, på 1960-talet. 70-talet åtföljdes av bukspottskörtlar, 80-talet av levrar, hjärta och lungor. Transplantation av blodets stamceller är en sedan länge en etablerad och framgångsrik behandling vid flera typer av blodmalignitet. Många andra isolerade celltyper har varit svåra att få att fungera efter transplantation. Pancreas ö-celler är ett litet micro-organ med flera celler i samarbete som transplanteras i grupp. Den enskilda cellen är oftast i stort behov av att samverka med celler i närheten på ett sätt som vi inte känner så väl idag men där framtida forskning förhoppningsvis skall ge oss en bättre förståelse. Organ som kännetecknas av en enda eller få funktioner är möjligen lättare att ersätta på artificiell väg, som hjärtat specialiserat på pumpning. Men organ som påminner om kemiska fabriker och hämtar byggstenar från många områden i kroppen är oerhört komplicerade i sin funktion och därmed svårare att ersätta i sin helhet på konstgjord väg. Däremot kan bortfall av enskilda funktioner i organet sannolikt ersättas med en mindre men ny cell-portion. Hepatocyter i cellkultur Metoden för cellodling används nu också i leversammanhang, där man odlar hepatocyter från adulta celler och även de mer svårstyrda fetala cellerna. De adulta cellerna kan inte förökas i odling för närvarande, men har en fullgod leverfunktion. Fetala celler kan expanderas i odling men behöver utvecklas för att upprätthålla en mogen leverfunktion. Till skillnad mot vissa andra organ som man kan låta vila genom att de ges stöddrift som vid njurdialys, så finns idag inget sätt att koppla in ett reservsystem för levern för att låta

9 den återhämta sig, eller upprätthålla livet på en patient i akut leversvikt medan exempelvis omogna leverceller under någon månad får förväntad funktion och antal. I dessa fall måste cellerna börja arbeta på rätt sätt direkt efter transplantationen. Vi tror dock att injektioner med adulta hepatocyter kan hjälpa till att hålla en patient i leversvikt i livet medan den egna levern återhämtar sig. Skelleftesjukan metabol leversjukdom Bo-Göran Ericzon kom till området 1984 och den kliniska utvecklingen runt levern som organ har skett stötvis genom nya upptäckter. Successivt har nya läkargrupper engagerats i och med att sjukdomar som tidigare betraktats som obotliga kunnat behandlas med levertransplantation. Leverns roll i flera sjukdomar har inte varit helt klarlagd. Möjligheten att helt byta lever har på ett mycket påtagligt sätt visat på leverns roll i flera metabola sjukdomar där patienten inte är leversjuk på klassiskt sätt. Skelleftesjukan är ett sådant exempel. På transplantationskliniken vid Karolinska Huddinge, finns ett långvarigt intresse av metabola sjukdomar. I början av 90-talet engagerade forskarna sig i Skelleftesjukan, som fått sitt namn från trakten och är en ärftlig metabol leversjukdom som bland annat ger nervskador och leder till döden. Den debuterar efter 20-årsåldern. Utlösande faktor är okänd, men sjukdomen gör att den drabbade tynar bort på års tid. 95 procent av det felaktiga proteinet som orsakar patientskadorna produceras i levern. Lyckat genombrott 1990 gjorde vi därför första transplantationen, för att försöka rädda en patient, och det lyckades. När vi rapporterade om detta i medicinska forum blev entusiasmen stor även i Japan som har många fall och framförallt i Portugal som mer än någon annan nation är drabbad av sjukdomen. Bo-Göran Ericzon och hans teams upptäckt tillsammans med kollegorna i Umeå räddade livet på många människor. Senare utvecklades tekniken vidare till att man även kunde ta tillvara den drabbade levern och transplantera den till vissa leversjuka patienter med minimal risk att överföra sjukdomen under sin normala livstid. Metoden kallas dominotransplantation och räddar än fler människor. Det är bara 5 procent av de som föds med den genetiska defekten som utvecklar sjukdom under sin livstid och hos flertalet sker debuten efter 50 års ålder. Därför är risken liten att Skelleftesjukan skall överföras vid dominotransplantation. Nu har man i världen gjort drygt 600 dominotransplantationer, och de närmaste åren blir avgörande för att vi ska se vilka långsiktiga effekter på patienterna den nya levern ger. Skelleftesjukan är ett bra exempel på hur ett område kan växa tvärvetenskapligt, från att i starten enbart engagerat en grupp läkare deltar nu kirurger, medicinare, hepatologer, neurologer och andra för att studera effekterna på patienterna. Framtidslistan tar aldrig slut Från botten av en pappershög fiskar Bo-Göran Ericzon under intervjun fram ett papper rubricerat Utvidgad verksamhet för leverteamet med 11 arbetspunkter han tillsammans med dåvarande chefen Carl-Gustav Groth sammanställde. Det handlar om en önskelista av saker de skulle vilja se uppfyllda inom området. Den listan är bortåt 20 år gammal och jag tar fram den ibland för att se sakernas tillstånd. Samt för att pricka av vad som uppfyllts. Nu ser jag att jag kan pricka av punkt 8 som handlar om levercellstransplantationer vi då drömde om som ett regenerativt hjälpmedel. Kvar på listan finns dels punkt 9 artificiell lever, dels punkt 10 xenolever ex vivo, dels xenolever transplantation. Listan har dock vuxit för varje år och kommer aldrig att ta slut. Jag vet att vi föreställde oss alla de olika leverfunktionerna som nycklar och det handlade om att matcha med de rätta låsen, det här var då särdeles svårt vid leverxenotransplantation med organ och vävnad som inte kommer från människa. En annan som också gick runt med nyckelknippa var kollegan på Hjärtkliniken, Christer Sylvén de båda delade forskningslabb där de odlade olika celltyper, men småningom byttes erfarenheter och ett av fundamenten kring Center for Regenerative Medicine CRM föll på plats. Kylförvarade celler ett måste för behandling av akuta tillstånd Till skillnad mot många av sina kolleger arbetar Bo-Göran Ericzon med ett organ som har en osannolikt god reparationsförmåga. Den bit lever man transplanterar från en förälder till ett litet barn införlivas i växtprocessen hos barnet och antar den nödvändiga storleken när barnet växer upp. Hos donatorn kompenserar kvarvarande levern volymsbortfallet på ett par månader. Vuxna leverceller har dock svårt att överleva kylförvaring, jämfört med fetala celler. Det är något jag ser fram emot att vi hittar vägar till att lösa. Redan idag pågår det intressanta försök med kryopreservation av leverceller främst för behandling vid akut leversvikt. Sen ser jag fram emot ett genombrott i forskningen kring hur vi kan vaska fram just den cellmix som behövs för att hela patienten. Levern är ett så komplicerat organ att det sannolikt krävs en kombination av olika celler, där leverceller utgör en del för att regenerera levern. Bo-Göran Ericzon påpekar att forskningsarbetet består av en mix där man både ska kunna drömma och vara realist. I sammanhanget CRM så är det kollegiala utbytet av idéer och erfarenheter något som gynnar både drömmarna och realismen. I slutänden är belöningen vetskapen om att man kan hjälpa patienter. Flera av de japanska patienterna skriver varje år och uttrycker tacksamhet för att vi kunnat hjälpa dem till ett bättre liv genom vår forskning. Text: Mats Lundgren Huvudansvarig Bo-Göran Ericzon, professor Medarbetare Ewa Ellis Greg Nowak Carl Jorns Stephen Strom Etienne Sokal Referenser Domino liver transplantation Wilczek HE, Larsson M, Yamamoto S, Ericzon BG. Heaptobiliary Pancreat Surg. 2008;15(2): Epub 2008 Apr. Liver transplantation for familial amyloidotic polyneuropathy (FAP): a single-center experience over 16 years. Yamamoto S, Wilczek HE, Nowak G, Larsson M, Oksanen A, Iwata T, Gjertsen H, Söderdahl G, Wikström L, Ando Y, suhr OB, Ericzon BG.Am J Transplant Nov;7(11): Epub 2007 Sep 14. Feedback regulation of bile acid synthesis in primary human hepatocyte: evidence that CDCA is the strongest inhibitor. Ellis E, Axelson M, Abrahamsson A, Eggertsen G, Thörne A, Nowak G, Ericzon BG, Björkhem I, Einarsson C. Hepatology Oct;38(4): Bile acid formation in primary human hepatocytes. Einarsson C, Ellis E, Abrahamsson A, Ericzon BG, Björkhem I, Axelsson M. World J Gastroenterol Aug;6(4):

10 10 Cellfylld kapsel ska rädda minnet Primärt mål är att frysa Alzheimers skadliga effekter och boostra kroppens egenproduktion av det protein som sjukdomen sakta slår ut upptagning av. Men vi vill förstås även långsiktigt nå så mycket kunskap att sjukdomen kvävs i sin linda, förklarar Maria Eriksdotter Jönhagen, överläkare och forskningsledare vid Geriatriska kliniken, Karolinska Universitetssjukhuset, Karolinska Institutet, Huddinge. Kunskapen om Alzheimers sjukdom har ökat de senaste åren, även om läkarna långt ifrån förstår alla mekanismer som kan oskadliggöra dess degenerativa process. Alzheimer har glömska som symtom och när väl processen startat kan den idag inte hejdas, tvärtom blir demenssjukdomen värre i takt med tiden. Vad vi ser hjärnan kapabel att göra vid exempelvis en hjärnblödning är att oskadade områden till viss del kan ersätta skadade områdens funktioner. Vid Alzheimer är denna kompensationsförmåga kraftigt nedsatt och när sjukdomen pågått en tid kan inte de försämrade minnesfunktionerna hjälpas upp av nervceller i närliggande områden. Minnesförlust Maria Eriksdotter Jönhagen och hennes team forskar hur man kan stoppa sjukdomens minnesförstörande förlopp genom att implantera proteinet NGF (nerve growth factor), vilket man sett att nervcellerna sakta förlorar förmågan att ta upp. Patienter som drabbas av Alzheimer har kolinerga nervceller i basala framhjärnan med nervtrådar till hippocampus och storhjärnebarken där NGF produceras. Områdena är viktiga för minne, uppmärksamhet (attention), omdöme och impulskontroll. Av något skäl avtar nervcellens förmåga att via sin tråd suga upp NGF, vilket på sikt leder till att nervceller dör och minnesförmågan försämras. Processen verkar vara en central del i Alzheimers förlopp. Och det här har Maria Eriksdotter Jönhagen siktat in sig på, hos initialt tre patienter som har sjukdomen i ett ganska tidigt stadium. I mars fick samtliga en liten kapsel med NGF-producerande celler inopererad i bägge hjärnhalvorna. Vi ska nu kontrollera om den tillförda produktionen kan stoppa nervcellerna från att förtvina. Kapslarna är placerade i nervcellernas kärnområde för att ge bästa effekt då man slipper förlita sig på nervtrådarnas försämrade transportförmåga av NGF. De inkapslade cellerna är framtagna i samarbete med ett danskt biotechföretag, NsGene. Stort protein Hjärnan har ett särskilt lager mot det omgivande blodet, kallat blod-hjärn-barriären. Detta som ett skydd mot ämnen som kan tänkas utgöra fara för organismens centrala styrenhet, hjärnan, och barriären stoppar molekyler över en viss storlek. Detta är den reella orsaken till att man varken kan injicera NGF eller ge det i tablettform. Proteinet är helt enkelt för stort. I nuläget är primärt viktigast att se ifall utifrån tillförd NGF kan stoppa Alzheimer. Att försöka ändra proteinet, så att det kan passera blod-hjärnbarriären, blir därmed en senare fråga.

11 Kapsel med NGF Genom magnetröntgen skapar man en exakt bild över hur patientens hjärna ser ut och var exakt kapseln ska placeras. Själva operativa ingreppet är ganska litet, neurokirurgen sågar upp ett litet hål i skallbenet, kapseln förs ner till området med de kolinerga nervcellerna. Innehållet är mycket litet, det rör sig om så små mängder som nanogram. Med en känslig så kallad PET-kamera kan man mäta ämnesomsättning, blodflöden och ansamlingar hos vissa receptorer. Vi kommer också att avläsa NGF-nivåerna vid kontrollpunkter 3, 6 och 12 månader efter operationen samt effekter på minnesfömåga och uppmärksamhet, säger Maria Eriksdotter Jönhagen. Hoppas på normalvärden Internationellt pågår liknande forskning, amerikanska kolleger injicerar NGF-producerande celler direkt i området där nervcellerna utsätts för Alzheimers påverkan. Det låter som en rakare väg, varför anlitar inte det svenska forskarteamet samma metod? Nej det ger sämre precision, och NGF kan komma ut i de vätskor som finns i det centrala nervsystemet. Vi vet att NGF på fel ställen kan ge smärtförnimmelser, något som kapselplaceringen ska förhindra. De inkapslade cellerna kan också lätt avlägsnas, vilket inte går med injicerade fria celler. Under ett års tid genomförs olika mätningar för att se effekten av hur väl kapselns celler fungerar. Forskarna hoppas egentligen att NGF-tillskottet ska göra patientens tillstånd normalt, att ingen försämring äger rum. Att testa minnesförmågan är en bra kontrollmetod, för även om Alzheimerprognosen är individuell, finns sjukdomens olika uttryck där och kan observeras. Årslång kapselaktivitet Kapseln är fäst vid en liten tråd om fästs i skallbenet, och är lätt att avlägsna efter provtiden. Patienten kommer därefter att erbjudas en ny kapsel. Får vi de positiva resultat vi hoppas på, planerar vi utöka med en ny försöksomgång med tre personer. Det är en lång väg att hitta exakta svar när det kan vara så många okända faktorer inblandade i sjukdomen. Självfallet är målsättningen att först stoppa Alzheimer, sedan vända förloppet och få kroppen att reparera skadorna. Cellterapin vi anlitar nu gränsar ju till stamcellsområdet och vi delar visionen om att få nervcellerna att regenerera. Det är fullt möjligt att rätt sorts stamceller i en välforskad framtid kan injiceras i blodet och placera sig rätt för att både bota och förhindra Alzheimers sjukdom. Men vi behöver alltså stoppa förstörelsen innan vi kan vända trenden positivt. Om ett år vet vi ifall första steget är taget, säger Maria Eriksdotter Jönhagen. Text: Mats Lundgren Cellmedierad behandling med Nerve Growth Factor (NGF) vid Alzheimers sjukdom En helt ny metod prövas nu på Karolinska Universitetssjukhuset för att motverka Alzheimers sjukdom. Patienter med Alzheimers sjukdom har fått små kapslar med proteinproducerande celler inopererade i hjärnan. Cellerna i de inopererade kapslarna tillverkar proteinet NGF (Nerve Growth Factor). NGF har förmågan att stimulera tillväxten av kolinerga nervceller. Dessa är viktiga för minnet och andra avancerade hjärnfunktioner. Hos alzheimersjuka bryts de kolinerga nervcellerna ner successivt. Syftet med den nya tekniken är att hindra den nedbrytningen och därmed kunna hämma sjukdomsförloppet. NGF måste tillföras direkt till hjärnan för att kunna verka lokalt. Kapslarna med NGF-producerande celler är utvecklade på företaget NsGene i Danmark. Huvudansvarig Maria Eriksdotter Jönhagen, docent Medarbetare Layth Aladellie Per Almkvist Ove Almqvist Thomas Andersson Nenad Bogdanovic Vesna Jelic Ahmadul Kadir Göran Lind Bengt Linderoth Agneta Nordberg Åke Seiger Eva Sellden Erik Sundström Michael Söderman Ann-Christine Tysen-Bäckström Lars Wahlberg Lars-Olof Wahlund Maria Wiberg Bengt Winblad Elisabet Åkesson Referenser Eriksdotter Jönhagen M, Nordberg A, Amberla K, Bäckman L, Ebendal T, Meyerson B, Olson L, Seiger Å, Shigeta M, Theodorsson E, Viitanen M, Winblad B, Wahlund L-O. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer s disease. Dement Geriatr Cogn Disord 9: , Eriksdotter Jönhagen M, Linderoth B, Aladellie L Lind G, Nordberg A Almqvist O, Bogdanovic Na, Andersson C Söderman M, Wiberg M Kadir A, Jelic V Wahlund LO Sellden Ef, Wall Ag W Winblad Ba, Almqvist P, Sundström E, Seiger Åa Wahlberg L Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer s disease. disease patients. Abstr Am Soc Neurosci, Washington DC, Nov Kadir A, Almqvist O, Wall A, Långström B, Nordberg A. PET imaging of cortical 11Cnicotine binding correlates with the cognitive function of attention in Alzheimer s disease. Psychopharmacol , Williams BJ, Eriksdotter Jönhagen M, Granholm A-C, Nerve growth factor in and pathogenesis of Alzheimer s disease. Progress in Neurobiol. 80: ,

12 Biologisk pacemaker snart möjlig Svensk stamcellsforskning nära genombrott om hjärtat 12 Ett lyckat spårbyte inom forskningen kring hjärtmuskelceller har fört Hjärt- och Thoraxklinikerna vid Karolinska Universitetssjukhuset till ett förestående genombrott. Redan nu i år kommer vi ha funnit en egen markör som medför att vi kan odla fram våra egna hjärtmuskelceller. Och det öppnar vägen för att bland annat forska fram biologiska pacemakers, avslöjar professor Christer Sylvén, som leder arbetet.

13 Spårbytet kom sedan man insett att den fleråriga forskningen med en amerikansk patenterad markör för hjärtmuskelceller, Islet-1, riskerade att bland annat leda till en återvändsgränd av juridiska problem och rättsprocesser ifall man med dess hjälp hade framgång i forskningen. Men hjälp från forskarkolleger inom närbesläktade områden, som nyligen formaliserade sitt samarbete under namnet Center for regenerative medicine (CRM), har man på bara två år lyckats hitta en snabb väg fram. En egen markör som identifierar de eftersökta hjärtmuskelstamcellerna gör det möjligt att ur en större cellmassa urskilja just dessa för odling på monolayer (alltså på ett ytlager och inte i en sfär). Vi står nu nära ett genombrott, vilket även överträffar Bostongruppens arbete då deras markör arbetar med musceller. Vi tog tidigt ett strategiskt beslut att gå direkt på humant material, förklarar Christer Sylvén, professor vid Hjärtkliniken på Karolinska. Tre målsättningar Det finns tre kliniska målsättningar med Hjärtklinikens stamcellsforskning. Christer Sylvén förklarar: Vi vill använda cellerna för att motverka hjärtsvikt genom att injicera dessa direkt i hjärtat. Här har vi funnit att fetala celler har en bättre överlevnad, möjligen för att de är vana vid fostrets syrefattiga miljö samt att de sannolikt avsöndrar ämnen som motverkar avstötning. Vi vill kunna behandla AV block III, livshotande förmakskammarblockering hos foster. Om den elektriska impulsen som utgör ett hjärtslag stoppas mellan förmak och kammare så betyder det med stor säkerhet att fostret inte överlever. Genom att injicera hjärtmuskelceller direkt i fostrets hjärta hoppas vi att skapa en biologisk pacemaker. Den tredje målsättningen är att kunna testa läkemedels hjärtpåverkan via framodlade hjärtmuskelceller. Varje läkemedelskandidat kräver testning med över tusen försöksdjurs liv. Dessa liv kan sparas. Stamceller har olika potens En embryonal stamcell är omnipotent vilket betyder att cellen kan bilda alla typer av celler. Är stamcellen däremot pluripontent kan den bilda några typer av celler, och sedan blir den allt mer specialiserad mot ett organ då stamcellen kallas progenitorstamcell. På Hjärtlaboratoriet är man intresserad av celler som har hjärtat som bestämmelseort. Och det svåra uppdraget är att hitta en markör för just dessa celler i det stora cellhavet. Varför satsar inte forskarna på att försöka fånga och tygla omnipotenta celler istället? Christer Sylvén resonerar: På ett sätt är det att föredra, eftersom ju ursprungligare de är desto starkare delningsförmåga har de, men de har också förmågan att bilda oönskade celler. Vid något experiment i ett specialiserat laboratorium fann man bindvävsstamceller som bildade ben i hjärtat. En risk med embryonala stamceller är att de bildar teratom alltså tumörer som består av olika typer av celler, det kan vara en blandning av hårceller, benbrosk, skelettmuskelceller, tänder etc. Kvinnor kan få cystiska svulster som är teratom. När man undersöker dessa kan de innehålla vävnad som ligger huller om buller. Vi har också sett teratombildning när vi sprutat human embryonala celler i våra djurförsök. Så det blir en balansgång. Hjärtteamet är intresserat av progenitorceller som kan bilda kammarmuskelcell, kärlmuskelcell och åderhinnecell (en hinna som är en barriär i kärlet mellan blod och vävnad). Orsaken till att vi för närvarande inte satsar på att utveckla hjärtmuskelceller redan av embryonala celler är att forskningen hittills inte klarat av de oftast svåra bieffekter som uppstår. Största problemet är felkodningar som betyder att det ibland kan bildas benvävnad i hjärtmuskeln, eller att delar av innehållet i celltillväxten liknar tumörer teratombildningar, förklarar Christer Sylvén. Genforskning blev till cellforskning Tidigt 1996, samma år man startade Genterapicentrum, började det komma rapporter om att man genom genterapi och olika stimulationsfaktorer kunde stimulera kärltillväxt. Konceptet ansågs vara så intressant att Karolinska Universitetssjukhuset vågade en satsning, som också blev startskott för Hjärtlaboratoriets forskning inom området. Regenerationsforskningen har alltså pågått i drygt 12 år med start i gener. Från den då ledande forskaren inom området kärltillväxt i hjärtat fick man en plasmid i gåva. Denna plasmid uttryckte en stark kärltillväxtfaktor: Vascular Endthelial Growth Factor (VEGF). Man genomförde två kliniska studier, och lyckades påvisa kärltillväxt, men intresset i omvärlden dog ut och forskningen bytte inriktning. Enligt Christer Sylvén har området genomgått flera intresserusningar. Det blev en hype runt genterapin då denna kom. Men den dog ut när nästa hype kom med cellterapin. Nu finns tendenser till att även denna håller på att svalna då förhoppningarna på de revolutionerande resultaten inte infriats. Nu talar man om att stimulera vävnadernas egna inneboende förmåga till att bilda nya celler. Forskningen följer lite av aktiebörsens utveckling; uthålligheten är kanske 4-5 år och händer inget inom det intervallet så avtar förtroendet och intresset riktar sig mot nya avkastningsobjekt. I fundamentet till att man sökte ett eget spår för stamcellsforskningen finns dock det faktum att gåvan ovan var patenterad och i förlängningen en återvändsgata då potentiella forskningsresultat plötsligt kunde byta ägare enligt juridiken. Det ironiska i sammanhanget är att cellen som karaktäriseras av markören Islet-1, faktiskt upptäcktes på Karolinska Institutet i bukspottkörteln. Men för hjärtapplikationer så var det en grupp i Boston som patenterade den. Fokus på unika resurser När stamceller gjorde entré i forskarvärlden, var det en lyckträff för Sverige. Till skillnad mot omvärlden som arbetade med djurvävnad fanns här både kunnande och erfarenhet kring olika typer av humana stamceller. Både vi och sjukhuset ändrade fokus, minns Christer Sylvén. Vi arbetade då med bindvävsstamceller, och med humana embryonala stamceller där lyckades vi odla upp en kardiosfär med tillräckligt många hjärtceller för att den ska dra ihop sig för det krävs cirka 20 celler. Däremot misslyckades vi med att rena cellerna från andra celltyper som också fanns där. Samtidigt hade vi lyckats odla upp hjärtvävnad från abortmaterial. Där var vi definitivt unika och beslöt att satsa enbart på fetala celler. Med Islet-1 som markör kunde vi identifiera hälften av de celler som bygger upp hjärtat. Och därifrån har man satsat resurser på att utveckla odlingsbetingelser för massproduktion. I detta arbete är man nu alltså nära ett genombrott med en egen markör som ska kunna identifiera celler som ska odlas upp och kapar bindningen till Islet-1. 13

14 14 Från stamceller har vi odlat fram hjärtmuskelceller som kan häfta mot underlaget och bildar vad som kallas monolayer som i sin tur gör det mycket lättare att producera stora mängder celler. Sparar försöksdjur Ett fosters hjärta är mycket känsligare än en vuxens, och då hjärtat drabbas av hjärtrusningar eller för långsam hjärtrytm påverkar det organutvecklingen. Ett stort antal läkemedel kan påverka hjärtats rytm. Varje ny läkemedelskandidat måste därför testas avseende hjärtpåverkan. Men räknar med att varje testning kräver cirka tusen försöksdjur i form av möss, kaniner och annat. Förklaringen är att man saknar humana celler att testa på. Men eftersom vi har det, och kan sannolikt snart lyckas odla upp ett stort antal hjärtceller, så kan man ändra testförfarandet. CRMs betydelse stor Jämfört med kollegernas nerv- och levercellsforskning som pågått 6-7 år, är hjärtcellsteamets nuvarande forskningsspår kring progenitorceller ungt, alltså bara två år. Men den regenerativa kardiologiforskningen är totalt sett äldre. Vilken betydelse har forskargrupperingen Center for regenerative medicine (CRM), haft i sammanhanget? Om bara vårt laboratorium funnits hade vi inte kunnat syssla med det här. Forskningen kräver så mycket utbyte av erfarenheter med de andra grupperna samt även andra på sjukhuset till exempel med patologer som är experter på cellseparering. Man måste ha alla dessa kompetenser på nära avstånd så att man lätt kan komma i kontakt med dem. De metodologiska frågeställningarna är mycket likartade oberoende typen av vävnad. Nerver, lever, hjärta, ben och brosk omges av samma frågor: hur odlar man, behövs stödjeceller, fästning mot underlaget, kan de frysas, vad händer vid transplantation, varför dör så många, behövs någon form av stödjevävnad etc. Det finns alltså en rad formulärfrågor för alla forskare som måste besvaras. Och det blir en stark organisation om arbetet kan intensifieras och forskarna hittar lösningarna på grundfrågorna alla berörs av. CRM knuffar forskningen framåt CRM har alltså på kort tid blivit en källa till korsstimulering. Många gånger leder forskningen in i områden man själv inte behärskar, och då kan insatserna från andra specialiteters experter vara helt avgörande för att man kommer vidare. Immunologi är ett område som kan förklara en del underligheter man stöter på i forskning på annat håll, säger Christer Sylvén. Han tar ett exempel och berättar om hur kollegerna på nervoch leversidan har en sorts apparat med vars hjälp de kan få fram stora mängder nervceller för sin forskning. Utan att direkt avslöja hur, testade man att göra likadant med hjärtmuskelcellerna. Det visade sig dock att nervceller gick att klyva möjligen pga av sin geléaktiga form, vilket inte fungerade på hjärtcellerna som är mer stela. Efter försöket kunde hjärtteamet lägga allt fokus på sin platta odlingsyta monolayer istället för odling i en sfär. Utbytet av erfarenheter är helt prestigelöst, annars skulle det inte fungera. Och i det här arbetet känner man sig väldigt liten. Det krävs mycket ödmjukhet i den gemensamma forskningsresan vi gör, där är vi alla i en lärande position och måste hjälpa varandra till resultat. Text: Mats Lundgren Huvudansvarig Christer Sylvén, professor Medarbetare Karl-Henrik Grinnemo Matthias Corbascio Agneta Månsson Broberg Rami Genead Moa Simonsson Christian Danielsson Eva Wärdell Agneta B Andersson Referenser Kastrup J, Jørgensen E, Rück A, MD 2, Tägi K, Glogar D, Gyöngyösi M, Ruzyllo Bøtker HE, Dudek D, Drvota V, Hesse B, Thuesen L, Blomberg P, Sylvén C, Efficacy of Direct Intramyocardial Plasmid VEGF-A165 Gene Therapy in Patients with Stable Severe Angina Pectoris ˆ A Randomized Double-blind Placebo-controlled Study - The Euroinject One Trial. J Am Coll Cardiol 2005;45: Grinnemo KH, Månsson A, Dellgren G, Klingberg D, Wärdell E, Drvota V, Ringdén O, Sylvén C, LeBlanc K. Transplantation of human mesenchymal stem cells into infracted rat myocardium: Engraftment and immune response. J Thor Surg 2004;127: Grinnemo KH, Corbascio M, Månsson-Broberg A, Skottman H, Kumagai-Braesch M,Hao X, Siddiqui A, Andersson A, Strömberg AM, Hovatta O, Sylvèn C, Dellgren G. Human Embryonic Stem Cells induced immunity when transplanted to immunologically competent mice. Reprod Biomed Online. 2006;13: Grinnemo KH, Genead R, Danielsson C, Wardell E, Andersson A, Månsson-Broberg A, Dellgren. G, Hovatta O, Sylvèn C, Corbascio M. Costimulation blockade induces tolerance to HESC transplanted to the testis and induces regulatory T-cells to HESC transplanted into the heart. Stem Cells 2008;26:

15 Bilden visar strukturen av ett protein kallat Btk, vars gen är muterad vid en ärftlig immunbristsjukdom (Källa: Mohamed AJ et al. Immunological Reviews 228: 58, 2009). ips ett helt nytt sätt att omprogrammera celler Varje gång en ny människa blir till så utvecklas alla kroppens celler från en enda, det befruktade ägget. Det innebär att den cellen har en alldeles speciell förmåga den kan ge upphov till alla olika organ. Många har undrat över hur det kan gå till. 5 a. Vad är det som gör denna cell så unik? Vore det möjligt att kunna få vanliga celler från en vuxen människa att utvecklas till nya organ? Skulle det gå att omprogrammera celler genom att på något vis skriva om cellens egen kod och i så fall vad är egentligen cellens egen kod? År 2006 lyckades japanska forskare med att göra just detta. De utgick från bindvävsceller från en mus och genom att tillföra fyra arvsanlag blev cellerna omprogrammerade så att de uppträdde som de mest omogna celler som existerar. Dessa celler hade fått egenskapen att kunna växa ut till vilket organ som helst! Cellerna kallades för ips, som betyder inducerbara, pluripotenta stamceller, vilket betyder att dessa celler just har förmågan att ge upphov till alla olika celltyper. Året därpå lyckades samma forskargrupp och även amerikanska forskare uppnå samma resultat med celler från människa. Resultaten har kunnat verifieras i många laboratorier. Detta öppnar för en mängd spännande möjligheter, samtidigt som det är mycket viktigt att betona att det rör sig om forskning på celler och att det är en väldigt lång väg kvar innan resultaten kan omsättas i behandling av människa. Det är exempelvis inte ofarligt att överföra arvsanlag och det är för tidigt att säga om effekterna är bestående. Vi vet helt enkelt för lite om de omprogrammerade cellerna för att kunna säga om de är användbara eller inte. Det viktiga med dessa fynd är att de har lärt forskarsamhället enormt mycket om hur man kan gå till väga för att skapa nya vävnader. Från att ha varit rena spekulationer om hur man i princip skulle kunna göra, så har den svarta lådan istället börjat dechiffreras. Nu vet vi att det är möjligt. Nu gäller det att förstå mekanismerna mer i detalj och förbättra metoden. Om man ser in i framtiden öppnas fantastiska möjligheter där man kan skapa nya vävnader genom att ta celler från en patient. Man kan också tänka sig att ta celler från patienter med ärftliga sjukdomar och reparera skadan och återinföra cellerna. Vid CRM har Outi Hovatta redan använt sig av ips-teknologin. Vi har själva ett stort intresse av att sätta upp tekniken för att studera hur man kan reparera skadade gener hos patienter med ärftliga immunbristsjukdomar. Den globala forskningen kring ips går med en rasande fart och det är viktigt att CRM etablerar denna teknologi så att många kan använda sig av den som ett forskningsverktyg. Text: Edvard Smith Huvudansvarig Edvard Smith, professor Medarbetare Anna Berglöf Karin Lundin Abdalla J Mohamed Beston Nore Leonardo Vargas Referenser Vetrie D, Vorechovsky I, Sideras P, Holland J, Davies A, Flinter F, Hammarström L, Kinnon C, Levinsky R, Bobrow M, Smith CIE, Bentley DR. The gene involved in X-linked agammaglobulinemia is a member of the src family of protein-tyrosine kinases. Nature 1993, 361: Ge R, Heinonen M, Svahn MG, Mohamed AJ, Lundin KE, Smith CIE. Zorro locked nucleic acid induces sequence specific gene silencing. FASEB J 2007, 21: Yu L, Mohamed AJ, Simonson OE, Vargas L, Blomberg KEM, Björkstrand B, Arteaga HJ, Nore BF, Smith CIE. Proteasome dependent auto-regulation of Bruton s tyrosine kinase promoter via NF-κB. Blood 2008, 111: Raberger J, Schebesta A, Sakahuchi S, Boucheron N, Blomberg KEM, Berglöf A, Kolbe T, Smith CIE, Rülicke T, Ellmeier W. The transcriptional regulator PLZF induces the development of CD44-high memory-phenotype T cells. Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:

16 Cytostatika snart möjlig att individualisera 16 Hälften av alla cancerpatienter som genomgår stamcellstransplantation har i stort sett glömts bort i forskningen då deras tumörer måste behandlas med cellgifter, inte strålning. Få forskningsinsatser kring cytostatika gör området svårt och kostsamt att utforska, men genom ett svenskt initiativ ser en ändring ut att vara på väg. Inom 18 månader beräknar vi kunna ge förslag på en ny behandlingsmetod med anti-kroppar som hindrar att transplanterad benmärg angriper den egna kroppen, så kallad Graft-versus-host disease, förklarar Moustapha Hassan, professor i Experimental Cancer Medicine vid KFC Novum. Moustapha Hassan leder ett forskarteam på sex personer vars ena forskningsområde är cytostatikaoptimering och handlar om att individualisera patientbehandlingen inför stamcellstransplantation. Det andra området är den balans som måste finnas i kroppen för att transplanterad benmärg ska få maxmalt läkande effekt. Trots att cytostatika används sedan 1945 vet man väldigt lite om alla dess effekter. Oftast utsätts patienterna fortfarande för en standarddos trots att Moustapha Hassan under sina senaste tio års forskning tydligt sett att det borde finnas en metodik i själva behandlingen. Om man behandlar med cytostatika i lägre doser men ett fler antal gånger så ger det bättre resultat. Det är en tydlig effekt, påpekar han. Svår balansgång Graft-versus-host disease (GVHD) och Graft-versus-leukemi effect (GVL) är två tillstånd vid behandling av leukemi. Det gäller att slå ut kroppens egen benmärg samtidigt som antalet cancerceller minimeras. Detta för att skapa bästa möjliga förutsättningar för att den transplanterade nya benmärgen ska accepteras och börja fungera i sin nya värd, GVL. Läkarna måste också trycka ner immunförsvaret för att hantera avstötningsfaktorer likväl som allergiska reaktioner. Det allvarligaste tillståndet uppstår när T-celler från den nya benmärgen uppfattar kroppens egna celler som fientliga, med effekten att kroppen då börjar angripa sig själv, GVHD. GVHD tilldrar sig stor uppmärksamhet i forskarvälden eftersom det drabbar procent av alla patienter som transplanteras, men Moustapha Hassans team är de enda som arbetar med GVHD som förekommer i samband med cytostatikabehandling. Flertalet andra grupper jobbar med GVHD efter strålbehandling. Strålning populärforskad Den stora mängd modeller inom området har tagits fram via försök på möss. Begränsningen är att de baseras på strålning. Efter två års arbete har vi precis tagit fram en GVHDmodell som är baserad på cytostatikabehandling av möss. Effekterna var precis som hos cytostatikabehandlade patienter; med effekter på tarmen, levern och på hud. Det här har aldrig gjorts tidigare och det ger oss löftesrika möjligheter att kunna testa olika behandlingsmetoder. Fyra olika strategier att förhindra GVHD ska nu testas, och efter 1,5 år bör vi ha svar på vad som fungerar. Individuella anpasssningar snart möjliga Forskarna har kontroll på mössens fortplanting vilket gör att man kan eliminera alla okända faktorer. Då får man möjlighet att kunna förutsäga testresultaten, och i förlängningen hur patienterna kommer att reagera. Man kan testa olika behandlingsmetoder för att förhindra GVHD men behålla GVL. De generella symptomen som mössen visar öppnar upp för att man så småningom kan göra individuella anpassningar för patienten. Även om Moustapha Hassan är mycket försiktig i sin förutsägelse om hur stor sannolikheten är att man ska stå med ett lyckat resultat om 1,5 år, så andas hans entusiasm annat än de taktiskt rätta uttalanden varje forskare måste göra.

17 Jag har forskat länge och jag vet att forskningen kan spela en ett spratt, men jag ser flera positiva spår här som gör att jag känner mig säker på att vi ska lyckas. Och här skymtar en dörr på glänt som kan intressera läkemedelsindustrins forskare. Absolut. Detta öppnar för nya typer av läkemedel, som kan skydda patientens vävnader under cytostatikabehandling samtidigt som den positiva effekten bibehålls. Det här ansluter ett område som många, många jobbat med i åtskilliga år utan framgång eftersom det är så svårt. Benmärgens ursprung styr förloppet Forskarna arbetar med olika typer av benmärg. Säkrast resultat får man genom s k autolog transplantation, patienten behandlas med sin egen benmärg som skördats tidigt i sjukdomsutbrottet. Metoden är möjlig eftersom djupfrysning av den egna benmärgen dödar en del cancerceller mycket effektivt. Syngen transplantation med benmärg från bror/syster betyder genetiska likheter och minskar komplikationsriskerna. Mest lyckade scenario är så kallad allogen transplantation då donatorn inte är besläktad, men trots det fungerar det kolossalt bra. Framförallt gäller detta stamceller från navelsträngen, som är naiva (otränade). De liksom i autologfallet ger dessutom en stark effekt på kroppens interna resning, cancern elimineras effektivt av kroppen på egen hand, säger Moustapha Hassan. Ett enda skott och som måste träffa rätt Varje transplantationstyp ger alltså sin egen speciella förutsättning i kombination med patientens fysionomi och de cytostatika man tvingas använda. Slutmålet är att kunna förutsäga hur effekterna blir av cytostatika vid behandling av varje enskild individ på grundval av personens kroppsliga och genetiska förutsättningar. Vid cellgiftsbehandling har man egentligen ett enda skott på sig att träffa rätt, eftersom tillståndet oftast är akut hos patienten. Jämför det med andra farmakologiska sammanhang då man till exemplen vid en struma kan finjustera dosen av levaxin den tiden finns inte här, påpekar Moustapha Hassan. Minskad barnadöd i cancer Moustapha Hassan har varit aktivt inom fältet sedan han blev doktorand 1982, idag är han professor med 20 procent av sin tid förlagd till forskningen. Under dessa år har enbart behandlingen av barn betytt att procent överlevnad i leukemi stigit till procent. Främst beror det på att man nu har förståelse för cytostatika tillsammans med bättre understödjande behandlingar bl.a. antivirala, antibiotika och antimyktotika som effektivt hjälper immunsystemet. Det är ett resultat av allas forskning. Men ett konkret personligt bidrag till detta är ett beviljat USA-patent. På spädbarn 4-5 veckor gamla har sedan 1952 medicinens konsistens varit ett problem. Cytostatika i substansen Busulfan har av tradition med få undantag alltid varit i tablettform, som måste pulveriseras och sondmatas ner i barnets mage. Men där har Moustapha Hassan och hans teams forskning nått framgång. Vi har fått ett USA-patent på en variant av Busulfan som kan injiceras. Vår lösning är rensad från många av de ämnen som gav kraftiga biverkningar och är mycket mildare för patienten, samt att cellgiftet nu går mest till benmärg och mjälte där flertalet av leukemicellerna finns. Det är ett direkt resultat av vår forskning här, påpekar han. Test på humana celler Förlängningen av forskningen kring GVHD leder in till teamets andra stora forskningsområde att förbättra behandlingen och individualisera cytostatika. Man ska samtidigt veta att det finns olika typer av cytostatika, och effektiviteten hos dessa styrs förstås självklart av individuella förutsättningar hos patienten. Kroppstyp likväl som sjukdomar och arv är påverkansfaktorer, det hela är mycket komplext. Bland cytostatika finns det sådan som är ofarligt vid intaget och måste nå levern för att aktiveras och bli ett cellgift. Hur påverkar exempelvis effekten om patienten är alkoholist? Och vad händer med den som är kroppsbyggare och använder anabola steroider. Variablerna verkar vara oändliga. Han ingår i den nybildade gruppen Center for Regenerative Medicin (CRM). Till skillnad mot övriga kolleger där arbetar han prekliniskt. Det betyder att han kan ta sina egna och i förekommande fall kollegernas forskningsresultat från patienter och testa vidare på möss i en testmiljö som i stort sett utesluter naturliga variationer. Testresultaten blir då mycket pålitliga. Vi siktar liksom de andra inom CRM på att ta fram egna humana celler som vi kan testa direkt på. I vårt fall gäller det antikroppar för att kunna testa mot de båda Graft-varianterna. Beprövat tryggt Han återkommer till det faktum att forskningen styrt in så hårt på strålbehandling av tumörpatienter, trots att dessa bara utgör hälften av fallen. Det är alltid så att forskning uppmuntras då det finns tillgängliga forskningsresultat att utgå från. Det är lättare att forska vidare än att försöka nytt. Det sistnämnda brukar ändå vara ett känt sätt att dra till sig Nobelpris. Nja, just nu har vi inget spår på något Nobelprisaktigt, men området är som sagt inte helt kartlagt och det kan ju hända att vi finner mekanismer i detta som har mycket mer vittomfattande effekter. Och just detta med att se helheten är något som glömts bort på vägen mot att allt fler blir allt mer specialiserade, menar han. Det är för övrigt en av de stora poängerna med CRM, att man kan hjälpa varandra med pusselbitarna till en större helhet. Vilket förstås leder in samtalet till vilken stor vision han när med sin forskargärning? Jag skulle vilja hitta det perfekta diagnostikverktyget som gör att man individuellt kan ge precis rätt behandling, framförallt inom cytostatikaområdet där man dessutom brottas med små tidsmarginaler. Ett sorts lackmuspapper? Ja, precis, ler han stort. Text: Mats Lundgren Huvudansvarig Moustapha Hassan, professor Medarbetare Zuzana Hassan Behnam Sadeghi Hatem Sallam Fredrik Sjöö Sulaiman Al-Hashmi Mona Fares Referenser J M Carethers. Prospective evaluation of fluorouracil chemotherapy based on the genetic makeup of colorectal cancer. Gut.2006; 55: Rosell R.; Taron M.; Alberola V.; Massuti B.; Felip E.;Genetic testing for chemotherapy in non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2003; 41: Jean Abraham, Helena M. Earl, Paul D. Pharoah and Carlos Caldas. Pharmacogenetics of cancer chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta 2006; 1766: Parvaneh Afsharian, Ylva Terelius, Zuzana Hassan, Christina Nilsson, Stefan Lundgren and Moustapha Hassan. The effect of repeated administration of cyclophosphamide on CYP2B in rat. Clin. Cancer Res, 2007, 13,

18 18 Växelbruk ger alla kraft Jag ser ett fruktbart växelbruk mellan forskning och klinisk verksamhet när det gäller stamceller. Det blir kanske extra tydligt här där så många patienter avlider för att de är så svårt sjuka. Samtidigt klarar vi idag att rädda många som för bara lite sedan var hopplöst förlorade, säger Olle Ringdén, professor och överläkare vid Centrum för Allogen Stamcellstransplantation. Olle Ringdén har varit transplantationskirurg sedan Idag klarar man att hjälpa patienter som då var obotligt sjuka, även leukemi och andra blodcancerformer som är den patientgrupp som behandlas på CAST som kliniken kallas. Det här beror på att läkarna har så mycket mer förståelse kring immunologi, stamceller och deras funktioner än då för 35 år sedan. Men det handlar lika mycket om vunna framsteg genom attityd och till viss del att bryta tabun. Även om pengar till forskningen inte ska underskattas. Vi ser vad finansiella resurser kan åstadkomma. Jag har arbetat i USA och där kan de starta en forskning flera år efter oss, på samma område, med utgångspunkt från våra rön, men hinna ikapp och förbi med en oerhörd fart. Samtidigt finns här en relation mellan läkare/forskare och patienter som vilar på ett förtroende på ett helt annat sätt. Många gånger vågar vi göra saker här som är omöjliga där, och patienterna här anser det vara en självklarhet att kunna hjälpa läkarvetenskapen ifall de kan. Därav att Olle Ringdén och hans team har kunna göra en del genombrott mycket snabbare. När en leukemipatient med mycket liten tid kvar att leva sade ja till att få en transplantation av mesenkymala stamceller, bindvävsstamceller, så blev det ett genombrott. Dittills användes inte dessa så, men vi ville undersöka om denna celltyps kända immunologiska egenskaper kunde göra skillnad här. Resultatet av det testet blev mycket gott och medförde att ny behandling kunde utvecklas. Proffsforskare Att detta inte är en effekt av en lycklig slump, visar flera andra framgångsrika insatser. Exempelvis transplanterades immunkompetenta blodstamceller i syfte att slå ut metastaser hos en svårt sjuk coloncancerpatient. Vid obduktionen efter att patienten avlidit i lunginflammation hade metastaserna gått i nekros. Det senaste vi gjort är att vi har anställt basala proffsforskare med specialkompetens inom olika områden som vi måste utveckla för att lyckas i våra behandlingar, men som vi inte har tid att övervaka just för att vi står mitt upp i den kliniska verksamheten med sjuka patienter. Forskare med olika kompetens är avgörande för att vi ska lyckas med vår behandling, påpekar Olle Ringdén. Förutom läkare med olika specialområden och kunskap, behövs också forskare med olika specialområden. Vi har bland annat en molekylärbiolog som utvecklat känslig DNA-teknik för att upptäcka en leukemicell bland miljontals celler. Detta möjliggör tidig behandling med immunterapi om patienterna får leukemiåterfall efter transplantationen. Vidare kan denna teknik användas för att tidigt upptäcka avstötning av ett transplantat, säger Olle Ringdén. Analytiker Man har också en forskare som är biomedicinsk analytiker och expert på cytokiner, immunsystemets hormoner, och som dess-

19 utom är skicklig på cancerepidemiologi och statistik. Han kan snabbt ta fram viktiga data i klinikens patientmaterial. Dessa produktkontroller är viktiga för att kliniken ska kunna förbättra sin behandling. För att få tillgång till större kliniska material samarbetar man inom Norden där man gör prospektiva randomiserade studier, samt inom Europa och det Internationella Stamcellstransplantationsregistret som finns i USA. Med deras databaser kan vi få tillgång till tusentals patienter. Vi har också nyligen anställt en basal forskare som är expert på att ta fram cytotoxiska T-celler för att användas för immunterapi i olika sammanhang. Vi har också en post doc som är skicklig på immunkompetens, ett viktigt forskningsfält, då våra patienter drabbas av svår immunbrist, förklarar Olle Ringdén. Cytostatikachock Modellen med rollfördelning känns igen från andra sammanhang liknande en kapten och besättning under upptäcktsresa i outforskade världar, men där de olika kompetenserna adderas varandra och resultatet blir ny kunskap. Men det är inte alla som vill eller ens vågar delta i Olle Ringdéns alltid mycket resultatinriktade studier. Ibland för att det inte är politiskt korrekt ( man gör inte så ), ibland för att det kan riskera stöta sig med de stora läkemedelsbolagen ( oönskade resultat ). Möjligen fick Olle Ringdén med sig lite av denna mer rättframma metodik att ifrågasätta rådande behandlingsmetoder under sin tid hos Donald Thomas i USA, då det kliniska genombrottet med stamcellstransplantation kom 1978/79. Thomas tog sig för att redan 1957 med totalkroppsbestrålning helt slå ut patientens egen benmärg och immunsystem med målsättningen att slå ut så många leukemiceller som möjligt. För att rädda patientens blodbildande förmåga transplanterades frisk benmärg från ett syskon. Det visade sig sedan att den immunologiska effekten av de transplanterade immunkompetenta cellerna hade en kraftig antileukemisk effekt. Denna antitumöreffekt kan även användas vid andra typer av cancer, säger Olle Ringdén. Genombrott med vård hemma Efter en transplantation har patienterna inget immunförsvar och är därför extremt infektionskänsliga. På vissa håll utomlands skyddas patienterna därför i sterila rum eller sterila tält. På Karolinska Huddinge har patienterna vårdats i vanliga isoleringsrum och man har haft traditionen att låta en anhörig bo tillsammans med patienten under isoleringen på sjukhus. Efter ungefär två veckor kommer den nya benmärgen igång med produktion av blodkroppar. Ett radikalt grepp som prövades på Karolinska Huddinge var att patienterna fick vårdas hemma när de inte hade något immunförsvar. En specialutbildad sköterska från avdelningen gjorde hembesök och gav transfusioner och de mediciner som behövdes. Denna behandling slog ovanligt väl ut och patienterna som vårdades hemma fick en rad positiva effekter, bland annat mindre transplantat-kontra-värd-reaktion och förbättrad överlevnad, berättar Olle Ringdén. Målsökande celler Endast två procent av cellerna som tas från en benmärgsdonator är stamceller. Den idealiska donatorn av blodstamceller är ett så kallat HLA-identiskt syskon. Endast cirka 30 procen av patienterna har tillgång till ett passande syskon. Då kan man söka frivilliga obesläktade givare som är vävnadstypade. Det finns flera olika donatorregister, bland annat det svenska Tobiasregistret. Idag ger världens alla register tillgång till 13 miljoner frivilliga givare, vilket betyder att procent av alla patienter kan behandlas med stamcellstransplantation. Hos dem som inte har en passande benmärgs- eller stamcellsgivare, kan man använda navelsträngsstamceller. Med dessa kan man hitta en givare till i stort sett alla patienter som behöver transplanteras. Bara det att transplantera benmärgsstamceller är något fantastiskt. På en tiondels sekund efter att vi injicerat stamcellerna i blodet har de olika typerna av celler med fantastisk precision styrt iväg till kroppens alla benområden och fäst sig i märgen för att bygga kolonier och starta produktion. Det är viktigt att ge en stor stamcellsdos. Genom mycket celler får man bättre anslag och en bättre tumöreffekt. Ibland behöver man fylla på och ge immunkompetenta så kallade T-celler från givaren för att förhindra en avstötning eller för att påverka ett tidigt leukemirecidiv. När man tar celler från navelsträngsblod har man inte tillgång att ge mer immunterapi. Därför försöker några av våra forskare expandera T-celler från navelsträngsceller för att kunna använda dem för immunterapi mot avstötning och leukemirecidiv. Eftersom vår verksamhet är mycket kliniskt inriktad så tror vi att många andra stamcellsforskare som än så länge håller på i djurmodeller, med hjälp av vår erfarenhet kan ta steget att försöka bota patienter med olika defekter. Det är lite det som är meningen med Centrum för Regenerativ Medicin, att kliniker och grundforskare tillsammans ska lösa olika medicinska problem, menar Olle Ringdén. Patientfokus Vid Centrum för Allogen Stamcellstransplantation (CAST) är patienterna svårt sjuka och det händer ofta att de avlider. I längden är det här svårt att hantera, även för läkarna. Olle Ringdén ser det han kallar för växelbruk som en bra väg att skapa positiva effekter i detta svåra. Man går över till forskningen under ett tag när det tär för mycket då cancern tar liv, man återvänder till patienterna då forskningen börjar bli allt för mycket rutin. För Olle Ringdén är det övergripande målet ändå självklart. Djurförsök i all ära, men det är för patienterna vi göra allt detta. Målsättningen kan inte vara annan än att vi ska hjälpa människor och det är ute hos patienterna vi gör det. Det finns en dynamik i all god behandling. Läkning är ett samspel mellan patient och vårdande personal. Text: Mats Lundgren Huvudansvarig Olle Ringdén, professor Medarbetare Zuzana Hassan Helen Karlsson Jonas Mattsson Richard Olsson Brigitta Omazic Mats Remberger Britt-Marie Svahn Michael Uhlin Mehmet Uzunel Referenser Uzunel M, Mattsson J, Jaksch M, Remberger M, Ringdén O. The significance of graft-versus-host disease and pretransplantation minimal residual disease status to outcome after allogeneic stem cell transplantation in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood 98: , Svahn B-M, Remberger M, Myrbäck K-E, Holmberg K, Eriksson B, Hentschke P, Aschan J, Barkholt L, Ringdén O. Home care during the pancytopenic phase after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is advantageous compared to hospital care. Blood 100; , Söderdahl G, Barkholt L, Hentschke P, Mattsson J, Uzunel M, Ericzon BG, Ringdén O. Liver transplantation followed by adjuvant nonmyeloablative hemato poietic stem cell transplantation for advanced primary liver cancer in humans. Transplantation 75: , Ringdén O, Uzunel M, Sundberg B, Lonnies L, Nava S, Gustafsson J, Henningsohn L, Le Blanc K. Tissue repair using allogeneic mesenchymal stem cells for hemorrhagic cystitis, pneumomediastinum and perforated colon. Leukemia 21: ,

20 Nervcellens lagning en utmaning 20 Den nära målsättningen är att börja behandla ryggmärgspatienter snarast möjligt så vi kan förbättra deras liv. Samtidigt är förstås visionen att helt kunna bota ryggmärgsskador, även om det målet ligger längre bort, förklarar Erik Sundström, neurobiolog och docent vid NVS-institutionen Novum. Erik Sundström och hans team arbetar med forskning kring stamceller från hjärna och ryggmärg. Han gled in på området för 4-5 år sedan efter att under nära 15 års tid ha koncentrerat sig på ryggmärgsskador. Steget var kort då ryggmärgsskador ger irreparabla skador trots dagens medicinska resurser. Stamceller öppnade chansen att möjligen skapa de verktyg som saknas för en framtida behandling. För dem som skadat ryggmärgen och blivit förlamade kan även en liten förbättring påverka hela personens livssituation, till exempel att man kan styra sin rullstol själv, kontrollera blåsan etc, säger Erik Sundström. Det här är saker som kan förändra personens hela uppfattning om sin belägenhet. Erik Sundström påpekar också att smärta dessutom är ett område som är vanligt men inte uppmärksammat, där kan små förändringar ge väldigt stora effekter. Vi ser en stor fördel med att använda centrala nervsystemets stamceller eftersom dessa inte kan bli något annat än nervceller och gliaceller, en typ av stödjeceller. Dessutom har ingen sett att dessa stamceller bildar tumörer. Ursprungsmaterialet kommer från aborterade foster. Vi tar tillvara celler som öppnar möjligheter som annars skulle förloras. Nu är vi flera forskarlag som har olika specialiteter inom stamcellsforskning, och vi kan därmed tillvarata stamceller från olika organ. Organisk tillväxt som matematisk formel Celler styrs av gener. En gen motsvarar en kodsnutt som får cellen att producera ett visst protein. I den här stora framväxten under fosterstadiet av det som ska bli en människa är det många samspelande utvecklingsfaser där vissa celler når en viss utvecklingsnivå, som utlöser subrutiner för produktion av vissa substanser som i sin tur skapar