SMIM1 som Vel blodgruppsprotein - upptäckt och betydelse för transfusionmedicin

Transkript

1 SMIM1 som Vel blodgruppsprotein - upptäckt och betydelse för transfusionmedicin Jill R. Storry, Ph.D. KIT, Medicinsk Service användarmöte oktober Lund

2 Aktuell blodgruppsklassificering 339 antigener orphans ABO P1PK Lewis FORS GLOB H I Högfrekvens Kollektioner LW Xg Duffy Lutheran Indian Scianna Raph JMH Ok a Lågfrekvens

3 Patientfall Kvinna, född 1944 i OP för ablation Tx 2006 med 2 enheter B+ blod, negativ BAStest Fick också 4 enheter trc 15/10 screening celler 3+ IAT-gel Blodgruppering: Anti-A Anti-B Anti-D Anti-D A1c Bc

4 Antikroppsutredning (Akut)

5 Ak. utredning forts.

6 Att göra idag: Fenotypa för Vel (S/s, Fy a /Fy b, Jk a /Jk b ) Ev. excludera andra antikroppar i samband med en till Vel prov (Kolla läget med patienten, förstås) Slutsats hittills: Ovanligt stark anti-vel som reagerar RT till 37C IgM och IgG

7 Bakgrund en 60-årig gåta Anti-Vel beskrevs år 1952 av Sussman och Miller Patient med antikroppar mot ett högfrekvent blodgruppsantigen som fick en kraftigt hemolytisk reaktion I Sverige saknar 1 av ~1700 individer Vel medan prevalensen i övrigt anges till 1 av ~5000 Antikroppar oftast blandning av IgG och IgM Hemolytisk in vivo och in vitro Kliniskt viktigt vid transfusion och hemolytisk sjukdom hos nyfödda ABTI är det andra antigenet i kollektionen (endast serologisk koppling) Vel celler är svagt ABTI+ ABTI celler är svagt Vel+

8 Bakgrund en 60-årig gåta Svårt att hitta de få Vel individerna i populationen kommersiella reagens finns inte monoklonala antikroppar saknas Vel-uttrycket varierar Umeå har varit världens källa pga deras stora grupp av Vel blodgivare Autosomalt recessiv nedärvning i familjer (Cedergren et al. 1976)

9 Hypotes. Den Vel-negativa fenotypen orsakas av homozygoti för en s.k. founder mutation som finns i ett kromosomområde med ett definitivt SNP-mönster

10 Prov nr. Illumina HumanOmni 2.5M BeadChip SNP-analys Vel fenotyp Array 1 Källa Prov nr. Vel fenotyp Källa 1 Vel Lund givare 17 Vel orelaterade givare Umeå 2 Vel bror 1 18 Vel orelaterade givare Umeå 3 Vel+ svag son 19 Vel orelaterade givare Umeå 4 Vel+ svag dotter 20 Vel orelaterade givare Umeå 5 Vel syskon givare Umeå 21 Vel orelaterade givare Lund 6 Vel syskon givare Umeå 22 Vel+ orelaterade givare Umeå 7 Vel syskon givare Umeå 23 Vel Lund givare 8 Vel+ svag syskon givare Umeå 24 Vel bror 1 9 Vel patient med anti Vel 25 Vel+ bror 2 10 Vel patient med anti Vel 26 Vel+ svag son 11 Vel orelaterade givare Lund 27 Vel+ svag dotter Array 2 12 Vel+ orelaterade givare Umeå 28 Vel orelaterade givare Detroit DNA från 20 Vel individer, inkl. 2 familjer 13 Vel orelaterade givare Umeå 29 Vel orelaterade givare Minneapolis 14 Vel orelaterade givare Umeå 30 Vel orelaterade givare Minneapolis 15 Vel orelaterade givare Umeå 31 Vel+ svag orelaterade givare Houston 16 Vel orelaterade givare Umeå 32 Vel+ svag orelaterade givare Lund

11 Vel-uttrycket med flödecytometri på celler från Lund och Umeå familjer 1,2 Bröder 5 Dotter 4 Son Kontroll Lund 3 Vel- syskon Umeå Kontroll (pp celler)

12 SNP analys resultat med Illumina HumanOmni 2.5M BeadChip SMIM1 CCDC27 LRRC47 DFFB CEP104 Chromosome 1

13 Kandidatgener Candidate AA (kda) Protein product Function/localisation CCDC (75.4) Coiled-coil domain-containing protein 27 Unknown SMIM1 78 (8.7) Uncharacterised protein Type 1 transmembrane protein LRRC (63.4) Leucine-rich repeat-containing protein 47 RNA-binding, phenylalanine-trna ligase CEP (104.4) Centrosomal protein 104kDa Centriole; cytoskeleton DFFB 338 (39.1) DNA fragmentation factor, 40 kda, beta polypeptide Nucleus, apoptosis factor CCDC27 SMIM1 LRRC47 CEP104 DFFB oktober

14 SMIM1 består av 4 exoner med en öppen läsram i exon 3 och 4 Icke-kodande Kodande SMIM1-mRNA detekterades i: - perifert blod - erytroleukemi-cellinjer av KML-natur (t.ex. K562, HEL) - Primär benmärg från friska frivilliga odlades i erytroid riktning oktober

15 Sekvensanalys av SMIM1 i Vel-negativa individer Upptäckte samma 17-bp deletion (c ) i alla Vel prover som sekvenserats hittills (n=43) Mest svenskt ursprung men också från bl. a. USA, Israel, England, Schweiz Mutationen ger upphov till ett läsramskifte (förlängs med >500bp) mrna detekteras med qpcr i Vel individer Dock: Inget fångades på 5 - eller 3 -RACE Degradering?

16 Vad kodar SMIM1 för? NCBI = okarakteriserat protein = nytt humant protein! Ensembl = ingen proteinprodukt Kort typ 1 protein Ingen homologi med andra proteiner Inga funktionella motiv Hög homologi mellan alla däggdjur; 56% homologi i zebrafisk

17 Small integral membrane protein 1 78 aminosyror Type 1 transmembran- protein

18 KDa Std 1: : : :5000 Vel+ Vel Vel Vel Vel+ Polyklonala kanin-antikroppar 4 peptider syntetiserades mot den extracellulära delen Inhiberingsförsök Polyklonala antikroppar gjordes mot peptider 1 & 3 Hög specificitet och sensitivitet i Western blotting 41 A ,4 Anti-Peptid Anti-Peptid 1 41 Vel+ sv B. 15 6, Anti-GAPDH 15 6,4

19 Anti-pept. 1 SMIM1 uttrycksförsök i K562-celler cdna från Vel+ eller Vel klonades i uttrycksvektorn pef1α-ires-zsgreen1 Transfekterade i K562 celler Analyserade med flödescytometri vid 48 timmar Resulten räknade som relative ratio (RR) mot mocktransfektion med töm vektorn Mock mut. cdna wt cdna Celler analyserade med kanin anti-peptid 1 i WB

20 w/w w/w w/m w/m m/m m/m H 2 O w/w w/w w/w m/m m/m H 2 O w/m m/m w/w w/w w/w m/m m/m H 2 O w/m m/m w/w w/w m/m m/m m/m w/m Utveckling av olika metoder för DNA-screening B. RFLP A. ASP Kontroll band Allel-specifik band wild type mutant Vel+ Vel C. GSP 520 Skåne blodgivare testade: 30 heterozygoter 0 homozygot mutant 1/17 heterozygot frekvens av Vel : 1/1250

21 w/w w/w w/m w/m m/m m/m H 2 O Kp(b ) Yt(a ) HPA-1a Vel Co(a ) Vatten kontroll Sc: 1 Normal blodgivare DNA markör Ingår i enkel screening metod för högfrekvens alleler C. GSP Vel+ Vel 493 bp 352 bp 303 bp 266 bp 164 bp 138 bp Modifierade efter Wagner et al. Transfusion 2008;48: TVÅ nya Vel blodgivare har hittats i första 1800 blodgivare! Bekräftade med serologi. oktober

22 Relativt ration jämförde med Vel celler Korrelation av zygositet med antigenuttrycket *** m/m w/m w/w n=1 n=16 n=21 B w/m w/w Anti-Vel

23 VEL

24 Sammanfattning Vi har upptäckt en gen som innehåller en mutation hittades i alla Vel prover testade hittills Uttrycksförsök i K562 celler visade att proteinet på cellytan För första gång kan Vel screenas av en enkelt genomisk metod

25 May 2013 oktober

26 På en brusig telefonlinje från Japan förklarar professor Martin L. Olsson

27 Andra variationer som påverkar Vel antigen uttryck 152 T>A/G Met51Lys/Arg Cvejic et al. Nat. Genet 2013;45:542-5 Storry et al. Transfusion 2013;53:40A van der Schoot et al. Vox Sang ;107 (Suppl):16 Svagare Vel antigen uttryck, bekräftade in vitro med transfektions försök i HEK-293T celler (van der Schoot) Rs , i SMIM1 intron 2

28 SNP variation i SMIM1 intron 2 SMIM1 gene: 3,187bp - van der Haarst et al, Nature 2012 C/A G/A A/G C/A C/A ChIP-seq Transcription Factor binding sites (ENCODE)

29 Relative Quantitation (2 -DDC T) Relative Mean Fluorescence Intensity qpcr och flödescytometri visar hög uttryck kopplade till rs g 120% SMIM1 transkript nivåer i blod 120% Vel antigen uttryck på erytrocyter 100% 80% G GG A/G AG A AA 100% 80% 60% 60% 40% 40% 20% 0% 20% 0% R 2 =0.6366, n= 141 GG AG AA rs g => högst transkript nivå och anti-vel reaktivitet rs a => lågst transkript nivå och anti-vel reaktivitet 63% av variationen i anti-vel reaktivitet kopplade till rs g (i prover utan 17-bp deletionen)

30 På gång i labbet Kliniken: Fortsätta screena Forskningslabbet: Titta närmare på polymorfismer i intron 2 som påverkar Vel-antigenets uttryck (MKC) Utreda transmembran GXXXG-motivets roll och extracellulära cysteiner (AN bl.a.) Uttrycka löslig Vel för struktur-bedömning/ inhibitionsmedel

31 Varför bryr vi oss om Vel?

32 Fallbeskrivning Antikroppsscreen reagerar positivt på 72-årig kvinna (B RhD neg) inkom för planerad operation Tidigare utredd på annat regionsjukhus i samband med ortopediskt trauma för ~8 år sedan Det tidigare serologiska mönstret tolkades som AIHA: DAT-positiv Egna celler reaktiva Hemolys med papainbehandlade celler Patienten har aldrig fått blod

33 Fallbeskrivning Pågående utredning: Stark reaktivitet med papainbehandlade celler i gel Egna celler negativa 8 av 9 panelceller reaktiva med gel-iat Reaktivitet från + w till 2+ Egna celler negativa Myntrullar i koksalt-rörmetod i 4 o C och RT DAT var negativ 6 av 10 erytrocytenheter förenliga i gel-iat

34 AK-identifiering panel D C E c e M N S s P K k Fy a Fy b Jk a Jk b Gel 1 IAT Pap- 37C sv sv sv 3+ Egna 0 0

35 Vidare utredning Papain autoadsorbering gav ingen effekt, dvs kvarstående positiva reaktioner Gjort baserat på tidigare undersökning Ingen inhibering med poolad plasma AK8 känd som Rg- och Kn(a-) Operationen påbörjades, trots icke slutförd ak-utredning, med relativt lågt Hb kirurgi med liten risk för blödning

36 Vidare utredning Enzym- och DTT-behandlade celler:? Gel-IAT Papain 3+ Trypsin 3+ α-chymotrypsin 2+ Pronas mM DTT 1+ w

37 Enzymtolkning Papain Trypsin -ct Pronas DTT Möjligt specificitet Ch/Rg, Xg a In, JMH MN, En a TS, Ge2, Ge4 0/ N, Ss, Fy a /Fy b, Fy6 0/ Yt a En a FS w Lu, MER w Knops Kell w /0 0 Sc w 0 0 Do, Ge Cromer, w 0 0 LW Jk3, Fy3, Di b,co a, Ge3; Ok a, P, LKE, At a, Cs a, Emm, Er a, Jr a, Lan, Vel, PEL Kx Reid, Lomas Francis & Olsson: The blood group antigen factsbook 3rd ed Academic Press

38 Patienten transfunderades Postop dag 1: patienten drabbades av hjärtinfarkt Transfusion påbörjades med en av de korstestnegativa enheterna Efter ~50 ml reagerade patienten med frossa och kräkning Transfusionen avbröts och prover skickades till labbet Serologisk mönster tillsammans med kliniska reaktionen ser ut som misstänkt anti-vel?

39 Varför anti-vel? Tankar i efterhand Patientens plasma svagare med DTT-behandlade celler Rainer T. et al. The effects of dithiothreitol-treated red blood cells with anti-vel. Transfusion 2004;44:122A (Suppl.) 4/10 anti-vel visade försvagade reaktioner mot DTT-behandlade celler

40 Bekräftat i Lund: flera anti-vel reagerar svagare med DTT-behandlade celler I Lund: Ej behandlade DTT-behandlade Antikropp Vel+, K- Vel-, K+ Vel-, K- Vel+, K- Vel-, K+ Vel-, K- 1.Vel + K Vel Vel + K Vel Vel w 0 0

41 Fortsatt undersökning Patientens celler typades som Vel-neg Plasman var förenlig med 3 Vel-neg testerytrocyter Antikroppar mot HLA-antigener också påvisbara Trots tillgång på fruset kompatibelt blod, nekade patienten ytterligare transfusioner

42 Sammanfattning Utredningen visade ett svårtolkat mönster: Vel-antigenuttrycket på våra panelceller varierar Antikropp reagerade från RT till 37 o C Var det verkligen myntrullar? Fanns anti-vel även vid 1:a undersökningen? Vel-antigen kan påverkas av DTT-behandling Anti-Vel är en lömsk serologisk specificitet som kan ge svåra transfusions-komplikationer om den inte upptäcks

43 Varierar Vel-uttrycket så mycket som visats på den första panel? D C E c e M N S s P K k Fy a Fy b Jk a Jk b Pt Känd 1 anti- Vel st sv sv 2+ st sv 2+

44 En av ARDPs mest efterfrågade fenotyper

45 Aktuell blodgruppsklassificering 342 antigener orphans ABO P1PK Lewis FORS GLOB H I Högfrekvens Kollektioner LW Xg Duffy Lutheran Indian Scianna Raph JMH Ok a Lågfrekvens

46 Tack Samarbetspartners: Blodgruppen, Lund Johan Malmström, Lund Joyce Poole, Bristol Jan Hamilton, Detroit Hein Hustinx, Bern Vered Yahalom, Tel Aviv Er för att ni lyssnade! ALF