Övningsarbete. Grunderna för cellbiosystem S

Transkript

1 Övningsarbete i kursen Grunderna för cellbiosystem S (Hösten 2004) Skriven av Peter Lindqvist Inlämnad den I

2 Innehållsförteckning Datorsimuleringar av lipidmembraner 1. INLEDNING DATORSIMULERINGAR MONTE CARLO SIMULERINGAR MD SIMULERINGAR LIPIDER OCH MEMBRANER MODELL AV LIPIDMEMBRANER RESULTAT SAMMANFATTNING KÄLLOR II

3 Datorsimuleringar av lipidmembraner 1. Inledning En operation som blivigt mycket billigare och lättare under de senaste åren är räknandet. Datorerna uppfanns på 1950-talet i efterkrigstidens USA för att bl.a. utveckla kärnvapen. Teorin för automatiska räknemaskiner uppkom dock redan på 1800-talet då enstaka vetenskapsmän byggde mekaniska räknemaskiner. Redan en vanlig bordsdator som finns i så gott som varje hem i Finland klarar av att utföra ca 100 miljoner räkneoperationer per sekund. Detta är redan en otroligt stor mängd då man jämför med tidigare då man var tvungen att räkna för hand med antingen tabeller eller mekaniska räknemaskiner. Då behövde en människa antagligen flera sekunder föra att utföra en räkneoperation. För att utveckla kärnvapen hade man stora avdelningar med människor som enbart höll på att göra räkneoperationer. Dagens snabbaste datorer gör ca 100 Teraflops, vilket betyder operationer per sekund. Man kan lugnt säga att sådan informationsbehandling var otänkbar för 50 år sedan. Vilken nytta har man då av att kunna räkna miljarder räkneoperationer per sekund? Förutom all informationsbehandling betyder det att man kan göra noggranna beräkningar av fysiska problem. Man kan till och med utveckla komplexa system enligt tiden. Redan Newton visste på sin tid hur kroppar påverkas i en rymd och hur de beter sig i förhållande till tiden. Det är dock inte så lätt då man känner till Newtons ekvationer att säga hur ett system utvecklas. Då vi har två kroppar som påverkar varandra, kan vi analytiskt bestämma dessas banor. Men om vi har tre kroppar är det inte mera så lätt, systemet kan ej lösas analytiskt [ 1]. Dock kan man genom att tillämpa Newtons lagar och räkna ut hur systemet utvecklas över små tidssteg få mycket bra estimat på hur kropparna kommer att röra sig. Detta är en räknemässigt mycket kostsam operation, men då räknekapaciteten blivit tillräckligt billig är detta inte mera något problem. Därmed har datorsimuleringen blivit född. Tanken om att kunna modellera komplexa system med datorer och se hur de beter sig kan tillämpas på många olika vetenskapsområden. Speciellt inom mjuka fysiska system har det visast sig vara ett bra redskap. Mjuk materia är mycket svårare att analytiskt undersöka än hård materia, som oftast har en mycket specifik form och inte heller utvecklas med tiden. Förståelsen av den flytande fasen har även dragit stor nytta av datorsimuleringar, då denna är dynamisk men ändå mycket begränsad. Biologisk forskning har redan dragit stor nytta av datorkraft i och med genteknologi, men även för att förstå enskilda celler kan man utnyttja fysiken och därmed dra nytta av datorberäkningar. Många forskningsgrupper [ 2] har byggt modeller för bl.a. cellmembraner som baserar sig på molekylerna och deras rörelse som modelleras över tiden. Jag jobbade för denna grupp under en tid på sidan om mina studier. Under denna tid bekantade jag mig med forskningsfältet och speciellt med cellmembraner. Detta övningsarbete kommer delvis att behandla samma frågor som jag arbetade med då. 1

4 Modellerna för cellmembran är mycket intressanta eftersom de ger mycket information om hur dessa membraner fungerar på ett mikroplan. Lipidmembraner finns i varje levande cell och i människoceller dessutom i alla viktigare organeller. Lipidmembraner är en mycket viktig del av processen som vi kallar liv. Med hjälp av modellerna kan man förutspå hur ämnen kan ta sig igenom membraner, vilket är viktigt för bl.a. läkemedelsindustrin. Man kan t.ex. använda konstgjorda membraner som kapslar för mediciner som sakta släpper ut de verksamma ämnena i kroppen [ 3]. 2. Datorsimuleringar Modern vetenskap grundar sig på två ben, observationer och förståelse. Utan att observera något har man inget att förstå och utan förståelse är observationer inte värda mycket alls. Oftast kan man tala om experiment och teori, man gör experiment för att få observationer och sedan formulerar man en matematisk teori på basis av dessa som representerar förståelsen. Simuleringar har drag både ur experiment och teori. En datorsimulering är en komplex modell som använder beräkningskapacitet istället för förenklingar. En modell som producerar exakta lösningar har oftast ett stort antal antaganden eller förenklingar, datorsimuleringar däremot kan genom fler beräkningar göra färre antaganden och istället producera en approximativ lösning. En skillnad mellan teori med exakta lösningar och datorsimuleringar är resurserna. Teorin kräver i allmänhet endast papper och penna då datorsimuleringar inom något aktuellt forsknings område kräver en superdators räknekraft. Datorsimuleringar står även nära experimenten. Då man byggt upp sin modell enligt vilken man simulerar, fungerar denna som en mikrovärld där man gör experiment och kan mäta olika storheter. Helt samma principer som för vanliga experiment gäller för dessa. Experimenten bör gå att upprepa och då producera samma resultat. Samma statistiska metoder kan användas och samplet bör vara tillräckligt stort. Skillnaden mellan vanlig vetenskaplig beräkning och simulering är just detta faktum att datorn används som ett virtuellt laboratorium för att producera mätresultat. Av detta har uttrycket in silica uppkommit. Tidigare har man i biovetenskaper skiljt på in vitro, experiment i provrör, och in vivo, experiment i levande celler. In silica betyder att experimentet utförts på ett kisel-chip i en virtuell värld. Vid simulering av ett fysikaliskt system vill man få en modell för något fenomen. Man vill då få ut resultat ur sin modell som kan jämföras med riktiga experimentella värden. Vid simuleringar, då man har fullständig information om varje liten del av systemet, kan man lätt jämföra det med alla experimentella värden som man kan komma över. Vid membran simuleringar kan dessa vara tjockleken på membraner eller diffusionskoefficienter [ 4]. Man bör minnas att en modell bör vara så simpel som möjlig enligt principen av Occam s rakblad, en komplex datormodell verkar inte uppfylla detta krav. Därför är det viktigt att då man bygger en modell, lägga till egenskaper gradvis för att se till att det inte finns några onödiga egenskaper som inte tillför något nytt [ 1]. Detta hjälper även till som 2

5 kvalitets- och felkontroll vid själva programmeringen. Det finns många olika sorter av datorsimuleringar, Monte Carlo, Molecular Dynamics (MD), cellular automata och metoder som bygger på förenklingar som Dissipativ Particle Dynamics [ 5]. Monte Carlo är ett gemensamt namn föra alla metoder som baserar sig på väldiga mängder slumptal. MD står för att systemet består av partiklar och att det utvecklas enligt Newtons lagar. Cellular automata är system som består av ett nätverk med celler som utvecklas enligt relativa positioner [ 6]. DPD är en metod där man inte mera ser enskilda partiklar utan grupper av partiklar [ 7] Monte Carlo simuleringar Monte Carlo simuleringar är datorsimuleringar som baserar sig på slumptal. Monte Carlo är inte någon speciell utan omfattar alla metoder som har samma idé, namnet kommer från det kända casinot i Monaco. Ett enkelt exempel för att illustrera Monte Carlo metoden är att Svakar vill mäta medeldjupet på en sjö. Han hoppar i en lite roddbåt med några tärningar och ett lod. Han mäter djupet och sedan ror han en bit i slumpmässig riktning och mäter djupet pånytt. Detta gör han om och om igen och om han stöter på land fortsäter han bara at ro utåt igen. Genom att sedan räkna medeltalet på sina mätresultat med statistisk felberäkning får han ett gott estimat med felgränser för djupet på sjön. Detta är ett ganska tydligt exempel på Metropolis Monte Carlo metod. Monte Carlo metoden används mest för icke dynamiska system, dvs. det används för att hitta jämvikts ställen och minimera energin. I en enkel Monte Carlo metod är tiden svår att definiera. Om vi antar ett system med N partiklar med växelverkan sinsemellan. Vi vill nu veta hur dessa skall placeras ut för att nå energi minimum. Vi börjar med att placera ut partiklarna i slumpmässig ordning i ett tomrum. Sedan går algoritmen så att man först väljer en partikel och gör en provflyttning av denna, om denna flyttning ger en mindre totalenergi av systemet än före godtar vi den och om ej godkänner vi den med en kt sannolikhet som är beroende av Bolzmanns distribution e. Genom att upprepa detta steg många gånger, här är det frågan om miljontals gånger som kan utföras på ett fåtal sekunder på en dator, får vi efter en s.k. kalibreringsperiod ett jämviktsställe som hålls mer eller mindre statiskt. Genom att börja simuleringen från början med andra utgångslägen kan man se om jämviktsstället är allmänt eller om det bara ibland nås. På detta sätt kan man studera faser för olika ämnen och hur de beter sig vid fasbyten MD simuleringar Molecular Dynamics eller molekyldynamik simulering är mycket nära ett verkligt experiment, vi väljer vårt undersökningsobjekt och en modell för det. Sedan börjar vi mäta de storheterna som vi är intresserade av. Först behöva vi dock en kalibreringsperiod för att få samplet att stabilisera sig. Sedan kan vi göra de mätningar vi vill, t.ex. temperaturen eller trycket. Ifall vi vill ha en större noggrannhet bör vi förlänga mättiden. MD simuleringens idé är mycket simpel men själva utförandet i praktiken är mer komplicerat. Vi har definierat ett system av partiklar, sedan räknar vi ut alla krafter som E 3

6 påverkar alla partiklar i systemet. Nästa steg är att integrera vi Newtons ekvationer över ett kort tidssteg. Genom att upprepa dessa två steg utvecklas systemet på samma sätt som i verkliga livet. Mätandet av en storhet baserar sig på det att de kan räknas ut som en funktion av det som vi känner till om partiklarna, t.ex. temperaturen fås som [ 8] 1 1 mv 2 k BT. 2 2 I praktiken börjar man med att placera ut N partiklar i ett system, exempelvis i ett vanligt rutfält. Man ger varje partikel en slumpmässig hastighet som skalas så att rätt temperatur nås. För att starta en algoritm behövs positionerna i flera på varandra följande tidpunkter. Detta fås exempelvis genom boot-strapping som innebär at man bara flyttar partiklarna enligt deras hastigheter utan att ta några fysiska lagar desto mera i beaktande. Nästa steg är att räkna ihop alla krafter som påverkar partiklarna, detta är en ganska direkt operation som kan försnabbas genom att man exempelvis kan använda gamla värden för krafter på långa avstånd. Integrationen av Newtons ekvationer går i praktiken till med Verlets metod [ 8] som betyder att man inte räknar med hastigheten utan istället med tidigare positioner. Detta kan lätt härledas genom att Taylor expandera kring r(t) till både t till tredje graden r( t t) r( t) v( t) t 3 f ( t) 2 t 4 t r ( t ) 2m 3! och sedan summa ihop dessa: r ( t t) 2r( t) r( t t) f ( t) 2 t. m Felet blir nu endast beroende av 4 t vilket blir mycket litet då man väljer t att vara relativt litet. Man bör dock lägga vikt på att energin konserveras, både på kort sikt och längre. Små fluktuationer på kort sikt som jämnar ut sig påverkar inte systemet just alls men avancerade integrerings algoritmer kan leda till att energin på längre sikt driver åt något håll. Detta kan ge upphov till felaktiga resultat. Ett längre tidssteg betyder att man behöver räkna ut krafterna färre gånger vilket snabbar upp simuleringen, men samtidigt bör man ta noggrannheten i betraktande. Dessa MD tekniker kallas med orsak klassiska eftersom de långt trots moderna datorer antar mekaniken såsom de uppfattades på 1800-talet. Inga kvantmekaniska eller relativistiska effekter tas i beaktande. Bristen på dessa uppkommer bl.a. då vi hela tiden i modellen antar fullständig information om systemet och att växelverkan är omedelbar mellan partiklarna. Trots detta är MD en mycket bra på approximation på de plan som de används på. Kvantmekaniska effekter uppkommer först då när energin blir tillräckligt låg eller då exempelvis atomernas frekvenser blir tillräckligt höga, h kb T. Energierna och avstånden i våra modeller hålls dessutom så låga att några relativistiska korrigeringar inte behövs. 4

7 3. Lipider och membraner Cellmembranen är den tunna hinnan som skiljer åt cellens eller bakteriens inre, cytosolen, från omgivningen. Denna hinna, kallad cellmembran, bör selektivt kunna släppa igenom ämnen för att cellen skall kunna överleva. Näringsämnen bör tas upp i rätt mängder och slagprodukter skall transporteras ut. Dessutom bör skadliga ämnen hållas ute och dessutom skall olika signaler både skickas ut och tas emot. Lipidmembraner finns även inne i celler i membranerna i olika organeller samt i det endoplasmatiska retikulumet. Bild 1. Strukturen för en DPPC lipid, två långa kedjor som hör till svansgruppen och en polär huvudgrupp [ 2]. Bild 2. Strukturen för en kolesterolmolekyl i en membran. Den cykliska strukturen ger styvhet [ 2]. Grunden för denna cellmembran är lipidmolekylerna. De är i princip fettsyror med en polär huvudgrupp. Svansgruppen är icke-polär vilket innebär att vatten inte gärna blandar sig med den. Bild 1 visar schematiskt en DPPC lipid, som är en av de vanligaste i människans celler. Den polära huvudgruppen kallas hydrofil, vilket betyder att den blandar sig med de starkt polära vatten molekylerna. Svansgrupperna däremot, två stycken kolvätekedjor, är hydrofobiska. Då dessa lipider blandars med vatten klumpar de av sig själva ihop sig till dubbelmembraner, se Bild 3. Svansgrupperna bildar ett hydrofobiskt gränsområde som vatten molekylerna inte kan penetrera. Denna lipid dubbelmembran gör inte ännu så många av cellmembranens uppgifter, på sin höjd skapar den en barriär som polära molekyler inte kan tränga igenom. Lipiderna i membranen finns i en fas som liknar vätskefasen, d.v.s. lipiderna kan fritt flyta omkring och byta plats 5

8 med varandra. Detta gör att membranen är mycket böjlig och kan bete sig som en såpbubbla, men den kan inte sträckas. En utvidgning av arean på mera än några få procent kan få membranen att spricka sönder. Bild 3. Lipiderna bildar en av sig själva dubbelmembran i vatten eftersom denna struiktur är mest fördelaktig energimässigt p.g.a. skillnaden i polariteten mellan vattnet och lipidernas icke-polära delar. [ 2], [ 13] I en cellmembran finns det förutom lipider även kolesterolmolekyler, se Bild 2. Dessa kan utgöra en stor del av lipid-kolesterol membranen. Kolesterolmolekylen är mycket mera styv än lipiderna. Detta bidrar med att stärka membranen. Funktionerna hos membranen sköts av olika slags proteiner. Proteiner finns på membranen och en del sträcker sig igenom den. En del proteiner är förankrade i cellens stomme, cytoskelettet medan andra fritt kan flyta omkring. Proteinerna sköter om att rätt ämnen kan passera cellväggen. Somliga fungerar som passiva jonkanaler som nästan kan ses som rör igenom. Andra är mera komplexa och fungerar som jonpumpar som använder energi för transporten. Så gott som alla signaler som går igenom membraner går via proteiner som kan känna igen något ämne på utsidan och sedan reagera genom att låta något annat ämne släppas ut inne i cytosolen och på detta sätt ge signaler till cellen om dess omgivning. En del proteiner behöver en viss slags lipider och kolesteroler omkring sig för att fungera. Detta är ett sätt som cellen kan reglera vilka aktiva proteiner. Cellens form upprätthålls av cytoskelettet, det är ett nätverk av filiament som spänner upp hela cellen. Detta nätverk av filiament gör att cellen håller yttre spänningar som lipidmembranen inte ensamt skulle tåla. Dessa filiament är uppbyggda av många små proteiner som bildar långa helheter då de placeras efter varandra. Cytoskelettet är hela tiden i ett dynamiskt tillstånd, det växer och bryts ned och förändras. Genom att reglera denna process kan cellen ändra form och röra på sig. Därtill har cytoskelettet många andra funktioner som har att göra med transporten av ämnen inne i cellen. 6

9 Proteiner som sträcker sig igenom membranen har oftast kolhydrat-grupper på utsidan. Detta är till en stor del för att skydda proteinerna mot oönskade protein-protein interaktioner, men de fungerar även som igenkänning mellan celler. Proteiner som kallas lektiner kan känna igen speciella kolhydratkedjor på cell ytan. 4. Modell av lipidmembraner Som för det mesta i fysiken bör man förenkla för att kunna förstå verkligheten. Cellmembranen är ett mycket komplext system som man inte riktigt förstår idag. För att bygga en fungerande modell av membranen är man tvungen att förenkla avsevärt. De modellerna [ 9] som är betraktade i detta arbete består endast av lipider och kolesterol. Alla proteiner och cytoskelettet är borttagna och dessutom finns det vanligtvis inga joner heller utan endast vatten kring membranen. En modell som denna kan dock ge svar på frågor om hur membranen beter sig och vilka egenskaper den har. Modellen [ 9] består av 128 stora molekyler som antingen är DPPC lipider eller kolesterol som formar en dubbelmembran med 8x8 molekyler i vartdera skiktet. Denna membran är löst i vatten som är modellerat med 3655 H 2 O molekyler. Liknande modeller har även använts och verifierats i flera publikationer [ 10], [ 11]. Modellens rymd består av ett rätblock med sidor kring 6,5 nm med periodiska gränsytor. Detta betyder att då en molekyl går ut på en sida hoppar den in på den motsatta. Krafter mellan molekylerna kan gå igenom dessa gränsytor utan att påverkas. På detta sätt kan man modellera ett oändligt system med ändlig kapacitet. Systemet simulerades med Gromacs programvaran [ 12] i en NpT ensemble. Trycket i systemet jämnas ut i algoritmen genom att storleken kan variera och temperaturen låses till T=323 K genom att koppla det till ett värmebad. Tidssteget i algoritmen är 2 fs. Lennard-Jones växelverkan, dvs. hur atomer och molekyler påverkar varandra, skärs av vid 1 nm och elektrostatiska växelverkan på över 1 nm räknades bara var tionde steg. Den elektrostatiska växelverkan är mycket intressant i biologiska material då många molekyler är har polära eller laddade delar samt att de oftast växelverkar i vatten som är mycket polärt i sig. Dessa elektrostatiska krafter påverkar dessutom på längre avstånd. Detta betyder att en molekyl påverkar alla andra på ett större område och gör att uträknandet av växelverkan tidskrävande. I artikeln [ 9], [ 13] behandlas denna växelverkan och det har gjort experiment för att bestämma hur dessa bäst kan modelleras. Här jämförs den traditionella metoden som helt enkelt klipper av växelverkan på ett visst avstånd med en annan metod PME [ 8] där summan av växelverkan mellan alla partiklar i ett periodiskt rutfält kan räknas ihop. Tidsperspektivet på dessa undersökningar är upp till 100 ns för systemet. Dessa är tagna efter att kalibreringen är gjord vilket innebär att över 20 ns av data har kasseras. Då man jämför denna tidsrymd med 2 fs som var det minsta steget ser man att det behövs närmare 100 miljoner steg för att få dessa resultat. Under varje litet steg räknas det ut alla krafter som påverkar varenda av de 3655 H 2 O molekylerna och nästan varje atom i de 128 lipidmolekylerna. Detta redan är ett oerhört tung arbete. Simulationerna är utförda på CSC superdatorer i Esbo och för att göra simuleringarna som artikeln [ 9] baserat sig på 7

10 har det tagit många månader av CPU-tid. Gromacs [ 12] som är använt för simuleringarna är en program vara med öppen källkod under GNU lisens. Det kostar alltså inget men det är ändå i klass med kommersiella program. Det är egentligen menat för superdatorer men kan även användas för vanliga arbetsdatorer. Gromacs kan använda standardformat för molekyler (.pdb) och kan använda många olika slags algoritmer och funktioner för simulering och analys. 5. Resultat Resultaten i artikeln [ 9] som jag även behandlade i mitt specialarbete [ 13] visar att avklippning av den elektromagnetiska växelverkan i modeller producerar spår i resultaten. Det visar sig att PME metoden hellre bör användas för simuleringar och i en senare artikel [ 13] How to Handle Electrostatic Interactions in Molecular Dynamics Simulated Lipid Membranes, Special Arbete, Peter Lindqvist (2003) [ 14] framkommer det att den inte heller är väsentligt långsammare än avklippningsmetoden. Bild 4. Definition på radiell distribution g(r), g(r+dr) är antalet grannar som är på avståndet [r,r+dr] från en viss molekyl. Medelvärdet på alla molekyler räknas sedan för att få en bättre kurva. Det visade sig att då man ritar ut den radiala distributionsfunktionen, g(r), som visar hur molekylerna är distribuerade i förhållande till sig varandra, se Bild 4. Som jämförelse kan man se typiska distributionsfunktioner för ämnen i de tre faserna, fast, flytande och gas i Bild 5. Då vi ser på g(r) funktionerna för lipiderna i simuleringarna ser vi att det uppkommer extra toppar då avklippningsmetoden använts, se Bild 7. Dessa toppar är placerade precis på samma avstånd från partikeln som avklippningsradien når. För PME metoden existerar ingen dylik topp utan g(r) ser mera ut som den för flytande faser som teorin förutspår. 8

11 Bild 5. Exempel på hur en g(r) av ämne i olika faser kan se ut. I den ideella gasen a) existerar ingen som helst struktur mellan partiklarna, en vätska b) där endast struktur på kort avstånd existerar och ett gitter där strukturen är bestämd. Därtill visar det sig att membranens area krymper då avklippningsmetoden används med kortare avstånd. Detta är dock inget allvarligt problem då det kan kompenseras för genom att välja andra parametrar, men faktumet att de använda parametrarna gav olika areor med olika avklippningsradier verkar skumt. Det gjordes en undersökning genom att med Voronoi metoden [ 15] räkna ut arean som varje molekyl upptar i planet som membranen spänner upp. Distributionerna på dessa ritades upp, se Bild 6. Distributionerna är nära Gaussiskt formade vilket överens stämmer med tidigare resultat [ 16]. 9

12 Bild 6. Run 4&6 är körda med PME samt 1&2 och 3&4 är med avklippning på 1.8 nm respektive 2.0 nm. Vi ser en tydlig uppdelning av medelareorna för de olika metoderna. Area distributionerna är liknande för allihopa. [ 13] 6. Sammanfattning Vi har på ett allmänt plan behandlat olika simuleringsmetoder och sedan noggrannare betraktat ett aktuellt forskningsobjekt där datorsimulering tillämpas på cellforskning. Med tanke på att dessa forskningsområden är mycket nya, endast ett 10-tal år, är det mycket spännande att följa med och se vad som händer i framtiden på dessa fält. Datorutvecklingen har ännu förutspåtts växa enligt Moores lag i ett tiotal år. Metoderna för simulering, bl.a. coarse-graining, där man försöker förenkla sådana delar av systemet som inte aktivt behövs för att producera väsentliga resultat. Man kan t.ex. byta ut de komplexa lipiderna mot förenklade modeller som består av ett mycket färre antal rörliga delar men som ändå beter sig på samma sätt. Detta leder till mycket snabbare beräkningar och man kan se på större system under längre tider för att studera händelser på detta nya tidsplan. Därtill då man tar med förståelsen för biologiska system som växer hela tiden kan man bara föreställa sig om vad som är möjligt om några decennier. 10

13 Bild 7. Vi ser g(r) för de olika simuleringsgångerna och kan lägga märke till toppen som uppkommit vi avklippningsstället i a) och b) fallet. I c) fallet däremot då PME är använt förekommer inget dylikt. 11

14 7. Källor [ 1] D.C. Rapaport, The art of molecular dynamics simulation (Cambridge University Press, 1997) [ 2] [ 3] R. Langer, Nature (Supp.) 392, 5 (1998). [ 4] I. Vattulainen and O.G. Mouritsen, Diffusion in Membranes, Submitted to Diffusion in Condensed Matter (Springer-Verlag) on [ 5] A. G. Schlijper, P. J. Hoogerbrugge, and C. W. Manke, J. Rheol. 39, 567 (1995). [ 6] [ 7] [ 8] D. Frenkel and B. Smit, Understanding Molecular Simulation (San Diego, Academic Press, 2002) [ 9] M. Patra, M. Karttunen, M.T. Hyvönen, E. Falck, P. Lindqvist and I. Vattulainen, Biophys. J. 84, (2003) [ 10] D. P. Tieleman and H. J. C. Berendsen, J. Chem. Phys. 105, 4871 (1996). [ 11] O. Berger, O. Edholm, and F. Jahnig, Biophys. J. 72, 2002 (1997). [ 12] [ 13] How to Handle Electrostatic Interactions in Molecular Dynamics Simulated Lipid Membranes, Special Arbete, Peter Lindqvist (2003) [ 14] Patra, M. Karttunen, M.T. Hyvönen, E. Falck, I. Vattulainen, (2004) [ 15] N.W. Ashcroft and N.D. Mermin, Solid State Physics (Philadelphia, Saunders, 1976) [ 16] J.F. Nagle and S. Trisran-Nagle, Biochim. Biophys. Acta.1469, 159 (2000) 12