1. INLEDNING 2. TEORI. Arbete TD6 Kininhalten och släckning av dess fluorescens

Transkript

1 Arbete TD6 Kininhalten och släckning av dess fluorescens 1. INLEDNING Ett ämnes koncentration eller halt kan med hjälp av Lambert-Beers lag bestämmas spektroskopiskt med hjälp av dess absorptionsspektrum. Då man känner våglängdsberoendet för ett ämnes absorption av elektromagnetisk strålning kan man excitera ämnet till dess elektroniska excitationstillstånd, efter detta kommer ämnet att relaxeras genom att avge energi antingen som fluorescens eller fosforescens. Hastigheten för relaxeringen kan påverkas genom att lägga till en molekyl som släcker ( quench ) denna. Detta gör det möjligt att bestämma Stern-Volmer-konstanten för reaktionen. I detta arbete bestäms halten kinin i Tonic-vatten genom att med hjälp av absorptions- och emissionsspektroskopi undersöka energiskillnaderna mellan de olika elektroniska tillstånden. Förskjutningar mellan de olika elektroniska tillstånden sker oftast i de delar av spektret som motsvarar synligt- eller UV-ljus. Maximet för kininens absorption bestäms med absorptionsspektrometri. Efter detta exciteras kinin med ljus av denna våglängd och dess fluorescensspektrum undersöks. Genom att jämföra fluorescensen för tonic-vatten med fluorescensen för en känd jämförelselösning kan kininhalten bestämmas. I arbetet undersöks också släckningen av fluorescensen med NaCl som släckande substans. 2. TEORI Varje ämne har ett individuellt energinivådiagram i vilket de olika energinivåernas plats beror på molekylens struktur. Då ett ämne bestrålas kan det absorbera denna strålning ifall strålningens energi motsvarar energiskillnaden mellan olika energinivåer i ämnet. Då ett ämne absorberar UV- eller synligt ljus exciteras det från sitt elektroniska grundtillstånd till ett elektroniskt excitationstillstånd. Ett exciterat ämne utstrålar, emitterar, den absorberade energin som antingen ett lika stort eller mindre energikvanta efter fördröjningar av olika längd. Ifall fördröjningen är kort talar man om fluorescens medan fenomenet kallas fosforescens om fördröjningen är lång (uppkallat efter fosfor). Energin som emitteras av ett ämne dämpas enligt exponentialfunktionen som funktion av tiden. Beroende på ämnets molekylstruktur kan det ha olika övergångar från en energinivå till en annan inom molekylen (intramolekylära övergångar). Övergångarna kan vara interna övergångar inom systemet (IC, internal 1

2 absorption fluorescens Energi conversion) eller övergångar mellan olika spinsystem (ISC, intersystem crossing), dessa övergångar beror på den ämnesspecifika energitillståndsstrukturen och energitillståndstätheten (se Bild 1). Små molekyler emitterar vanligen den strålning de absorberat omedelbart medan den stora energitätheten för komplicerade molekyler påverkar emissionens händelseförlopp. Elektrontillstånden för ämnen med stor molekylstorlek innehåller som lägsta tillstånd ett grundtillstånd som ofta är ett singlettillstånd, S0 (i singlettillståndet har alla elektroner motsatt spin, i triplettillståndet har två elektroner spin med samma riktning). Det energetiskt lägsta exciterade tillståndet är en triplett, T1, och det näst lägsta en singlett, S1. Vid absorption av strålning kommer exciteringen från ämnets elektroniska grundtillstånd S0 ändå att ske till excitationstillståndet S1 eftersom spintillståndet enligt urvalsreglerna inte får ändras under absorptionen. Eftersom det energetiskt lägsta vibrationstillståndet v = 0 är lägre för T1-elektrontillståndet än motsvarande tillstånd för S1-tillståndet, kommer S1-tillståndet som uppnås till följd av absorptionen att energetiskt ligga högre än flera av T1-tillståndets vibrationstillstånd. Vibrationstillståndens täthet är också större vid förflyttning uppåt i energi (se Bild 1), därmed är det sannolikt att det nära S1-tillståndets energi finns ett exciterat vibrationstillstånd för motsvarande T1-tillstånd. Absorption till S1-tillståndet följs ofta av en koppling av tillståndet till ett T1-tillstånd, så kallad spin-orbit koppling. Bild 1. Energinivådiagram för en stor molekyl. I bilden är IC = övergång mellan likadana spintillstånd (internal conversion), ISC = övergång mellan olika spinntillstånd (intersystem crossing), VV = dämpning mellan S2 S1 EC IC VV ISC VV T1 vibrationstillstånd och EC = dämpning från högre till lägre elektroniskt fosforescens tillstånd som följd av kollisioner mellan molekyler. ISC sker på ns, IC S0 EC v = 2 v = 1 och VV omedelbart (fs) efter v = 0 excitationen. Schemat kallas för Jablonski-diagram. 2

3 Om Born-Oppenheimer approximationen för en kärna och en elektron som rör sig kring denna skulle vara exakt, skulle ett ämne utstråla den energi det absorberar endast som fluorescens då det återgår till S0-tillståndet. I verkligheten är ett ämnes energitillstånd delvis blandade. Detta beror på att de naturliga bredderna för vibrationstillstånden för tillstånd S1 är större än de naturliga bredderna för motsvarande T1-tillstånd med samma energier. Därmed kan ett exciterat singlettillstånd blandas med många T1-tillstånd. Om täthet för T1-tillstånden är gånger större än tätheten för S1- tillstånden kan den ISC som sker efter absorptionen leda till en växande fyllning av T1-tillstånden och via en snabb dämpningsprocess (VV) kommer molekylen att hamna i T1-tillståndets vibrationsgrundtillstånd. Detta tillstånd är energetiskt lägre än alla S1-tillstånd och då övergång tillbaka till S1-tillståndet inte kan ske kan molekylen endast stråla från T1-tillståndet till S0-tillståndet, detta kallas för fosforescens. Om energitätheten för T1 är låg är sannolikheten för ISC liten. Då kan S1 blandas med grundtillståndets (S0) högenergetiska vibrationstillstånd. Denna övergång (IC) är inte reversibel. Energin fördelas genom kollisioner mellan molekyler eller genom dissociation av molekylens grundtillstånd. IC, ISC, EC och fotodissociation är precis som VV strålningslösa övergångar. Mängden strålningslösa övergångar kan uppskattas genom att mäta kvantförhållandet (eller kvantutbytet, quantum yield ) ΦF för ämnets fluorescens. Kvantförhållandet är förhållandet mellan antalet fotoner S1-tillståndet utstrålar och antalet absorberade fotoner. Kvantförhållandet berätta alltså en hur stor del av molekylerna som återgår till grundtillståndet S0 som avger en foton i processen. Man kan anta att alla reaktioner är av första ordningen och att antalstätheten för S0- och S1-tillstånden är n s0 respektive n s1 (enheten 1/cm 3 ). Hastigheten för ämnets absorption är k A n s0 och dämpningens hastighet (k F + k NR )n s1, där k A = absorptionens hastighetskonstant, k F = flurescensens hastighetskonstant och k NR = den strålningslösa övergångens hastighetskonstant. Antalstätheten förändras för S1-tillståndet enligt ekvation (1) om andelen andra emissions- och dissociationsreaktioner är försumbar. (1) dn S1 dt = k An S0 (k F + k NR )n s1 Då ett ämne som emitterar fluorescens (dvs en fluorofor) bestrålas med konstant effekt i volymen V uppnår S1-tillståndet snabbt en konstant koncentration. Då förändringen i antalstätheten som funktion av tiden är noll beskrivs detta av ekvation (2) (den s.k. konstantvolymsapproximationen). 3

4 (2) n s1 = k An S0 k F + k NR Fotonens (p) absorptionshastighet och fluorescensenshastighet ges i ekvationerna (3) respektive (4). (3) Φ A,p = k A n S0 V (4) Φ F,p = k F n S1 V Fluorescensens kvantförhållande följer ekvation (5). I denna är k NR = k ISC + k IC + k EC. (5) Φ F = Φ F,p = k Fn S1 V Φ A,p k A n S0 V = k F n S0 k A V (k F + k NR )k A n S0 V = k F k F + k ISC + k IC + k EC Släckning av det exciterade ämnet kräver växelverkan mellan fluoroforen och ett släckande ämne. Hastigheten på släckningen är diffusionsbegränsad och beror på lösningsmedlets temperatur och viskositet. Det släckande ämnets koncentration måste vara tillräckligt stor så att sannolikheten för en kollision mellan släckaren och fluoroforen kan tävla med det exciterade tillståndets livslängd. I ett fall som uppfyller dessa kriterier talar man om dynamisk släckning. Då effektiviteten för EC begränsats till reaktioner av andra ordningen är k EC = k S c S, k S = hastighetskonstanten för släckning av ämnet J i enheten M -1 s -1 och c S = koncentrationen för släckaren J. Å andra sidan kan kvantförhållandet för fluorescensen utan släckare uttryckas med ekvation (6). (6) Φ f = k F + k ISC + k IC k F Vidare kan fluorescensens kvantförhållande i närvaro av en släckare räknas ur ekvation (7). (7) Φ s = k F + k ISC + k IC + k s c s k F Då ekvationerna (6) och (7) divideras ledvis fås ekvation (8). Om släckarsubstansen inte påverkar emissionsspektret på annat sätt än genom att minska fluoroforens koncentration är förhållandet 4

5 mellan kvantförhållandena i denna ekvation också förhållandet mellan intensiteten (Ii) för motsvarande fluorescenser, dvs. förhållandet mellan areorna (A i ) på fluorescensspektren. (8) Φ f k s c s = 1 + = 1 + τk Φ s k F + k ISC + k s c s = I f = A f IC I s A s I ekvation (8) är τ = det exciterade tillståndets livstid utan släckarsubstans. Då förhållandet mellan kvantutbytena mäts som funktion av släckarsubstansens koncentration kan man ur riktningskoefficienten för en linje som anpassats till mätresultaten räkna ut produktfaktorn τk s som är känd som Stern-Volmer konstanten (enhet: M -1 ). Ett annat sätt att släcka fluorescens är statisk släckning. I denna bildar släckarsubstansen och fluoroforen ett stabilt komplex vid substansernas grundtillstånd, fluoroforen strålar alltså endast då den är skild från komplexet. Minskningen i fluorescens kan räknas ut med ekvation (8) men Stern- Volmer konstanten är nu hastighetskoefficienten för komplexets bildande. Bildandet av komplex påverkar inte fluorescensens livslängd vilket innebär att upprepade mätningar av τ kan belysa ifall det är frågan om statisk eller dynamisk släckning. Genom att använda Stokes och Einsteins ekvation är det möjligt att få förhållandet mellan diffusionskonstanten DJ för ämnet J och viskositetskoefficienten η, ekvation (9). (9) D J = k BT 6πηr J I ekvation (9) är rj = radien för en molekyl av ämnet och kb = Boltzmanns konstant. Då man granskar en diffusionsbegränsad reaktion kan man anta att släckar- och fluoroformolekylerna har lika stora radier. Därmed är deras diffusionskoefficienter lika stora i samma medium. Hastigheten på reaktionen mellan släckarsubstansen och fluoroforen beror på verkningsavståndet r för reaktionen (antag: r = 2 rj) och strömmen släckarmolekyler till fluoroformolekylernas närhet (jmf. Ficks första lag). Hastighetskoefficienten för reaktionen mellan släckarsubstansen och fluoroforen ges i ekvation (10). (10) k s = 4π(r ) 2 N A D f + D s r = 4πr N A 2k BT 3πηr = 8RT 3η J 5

6 I ekvation (10) är ks = den diffusionsbegränsade hastighetskoefficienten för dynamisk släckning, R = allmänna gaskonstanten och T = absolut temperatur. Då man känner till lösningsmedlets viskositetskoefficient ηj går det att räkna ut den nedre gränsen för fluorescensens hastighetskoefficient. 3. BEGREPP SOM ANKNYTER TILL ARBETET Beer och Lamberts lag Släckning av fluorescens Stern-Volmer konstanten 4. ARBETETS UTFÖRANDE I övningsarbetet undersöks en känd fluorofor, kinin. Molekylstrukturen för kinin presenteras i bild 2. Kinin är en optiskt aktiv alkaloid som finns i små mängder i tonic-vatten. Närvaron av kinin kan konstateras genom ett svagt blåaktigt ljus som kan ses då solens strålning får belysa tonic-vattnet. Synligt och UV-ljus exciterar kinin och som en följd av detta utstrålar den energin som fluorescens vid ungefär 450 nm:s våglängd. Kinin har flera funtktionella grupper i sin struktur som kan absorbera strålning, dessa kallas kromoforer. Exempel på dessa är dubbelbindningarna i molekylen. I kinin kan man även se auxokromer, dvs. funktionella grupper som då de är konjugerade med dubbelbindningar kan underlätta absorptionen. Exempel på dessa är OH-grupper och allmänt taget grupper som har ett fritt elektronpar. Exciterad kinin fluorescerar speciellt bra i närvaro av svavelsyra. Bild 2. Strukturen för kinin Kininets spektroskopiska egenskaper undersöks med absorptions- och fluorescensspektrometrar. Deras funktionsprincip beskrivs i bild 3. 6

7 CCD spektrometerns funktionsprincip Ocean Opticsin USB4000 miniatyrspektrometer styrs via USB-porten på en dator. I bild 4 presenteras spektrometerns funktionsprincip. Spektrometerns delar, ljusets bana inne i instrumentet och funktionsprincipen klarnar ur bild 3 samt beskrivningarna på de olika komponenterna i bilden nedan. 1. Kontakten för den optiska fibern i spektrometern. 2. Öppningen där ljuset kommer in i spektrometern. I arbete A1 används en optisk fiber istället för öppningen. 3. Ett möjlig överflödes-filter som filtrerar bort våglängder som är kortare än mätområdet som kan störa tolkningen av spektret. 4. Spegel som riktar det inkommande ljuset till gittret (5). 5. Fast gitter som delar det inkommande ljuset i olika komponenter dvs. i den synliga delen av spektret i olika färger. Öppningarnas täthet i gittret (600 öppningar per mm i detta instrument) bestämmer våglängdsområdet där instrumentet fungerar med bra verkningsgrad. Spektrometern är optimerad för våglängder i intervallet nm. I bild 3 har ljuset som kommer från gittret (5) till den fokuserande spegeln (6) delats upp i sina komponenter, även om det är svårt att se i bilden. 6. Spegel som reflekterar ljuskomponenterna som kommer från gittret till CCD-detektorn. 7

8 Bild 4. USB4000-spektrometern invändigt. 7. Cylinderlins som riktar ljuset till CCD-sensorn. Höjden på sensorns ljuskänsliga del är endast 0.2 mm vilket är klart mindre än höjden på öppningen där ljuset kommer in (2), öppningens höjd är 1 mm. 8. CCD-sensorn (Charge-Coupled Device) består av en krets som innehåller en rad ljuskänsliga kondensatorer som kopplats till varandra. I spektrometern används en endimensionell (radaktig) CCD-sensor som innehåller 3648 st ljuskänsliga kondensatorer eller pixlar (eng. Pixel = picture + element), storleken på en pixel är 8 µm (bredd) 200 µm (höjd). Liknande CCD-sensorer med en rad används t.ex. i telefax-apparater, en digitalkamera kräver en tvådimensionell CCD-sensor för att kunna spara ett fotografi. En dylik sensor kan ses som en rad enradiga CCD-sensorer. CCD-sensorn som används i detta arbete har en externt styrd elektronisk slutare med hjälp av vilken ljusets mängd som kommer till CCD-sensorn kan justeras. Då spektret har mätts börjar kontrollkretsen i sensorn mäta laddningarna i de olika pixlarna. Detta görs genom att urladda den första pixeln och mäta den spänning som bildas (digitalt), denna information överförs sedan till datorn. Efter detta flyttas laddningarna i alla andra pixlar till följande pixel så att laddningen från den pixel som ursprungligen var andra i raden kommer att finnas på den första pixelns plats. Denna information kan då avläsas och sparas i minnet 8

9 (den sista pixeln innehåller inte längre någon information). Genom att upprepa denna rutin så många gånger som sensorn innehåller pixlar kan laddningen på alla pixlar mätas. Orden Charge-Coupled kommer i själva verket precis från detta sätt att mäta spänningen på de olika pixlarna. Det är viktigt att förstå skillnaden mellan en spektrometer baserad på en svepande (eng. Scanning) monokromator och en spektrometer baserad på den nu presenterade CCDdetektortekniken. På grund av detta är metoder baserade på en CCD-detektor märkbart snabbare och känsligare. 9. och 10. Möjliga låggpass-filter. På instrumentets tillverkares www-hemsida finns en animation av spektrometerns och CCDdetektorns funktionsprincip, se och Provförberedning. Använd måttflaskor. 1. Framställ 1000 ml 0.05 M svavelsyra. 2. Späd ut 10 ml av kininsulfat-lösningen till 100 ml med 0.05 M H2SO4. (Lösning J) 3. Framställ 5 olika lösningar genom att ta prover på ml av lösning J och späda ut dem till 100 ml med 0.05 M H2SO4. (Standardserie) 4. Ta 5 ml kolsyrefritt tonic-vatten (du blir av med kolsyran i tonic-vattnet genom att skaka den öppnade flaskan) och späd ut detta till 250 ml med 0.05 M H2SO4. Ta 5 ml av denna lösning och späd ut den till 25 ml med 0.05 M H2SO4. (Lösning C). 5. Framställ 100 ml 0.05 M NaCl. (D-lösning). 6. Framställ ytterligare 6 lösningar genom att med 0.05 M H2SO4 späda ut en blandning av lösningarna J och D på följande sätt: ta 2 ml J-lösning och prover på ml D- lösning och späd ut dessa lösningar till 25 ml med svavelsyra. (Släckarserie). Mätning. Mät absorptionsspektret för J-lösningen i intervallet nm med Ocean Optics USB-4000 CCD-spektrometern till vilken det permanent har kopplats en kyvettställning och en ljuskälla (deuterium- och wolframlampor). Använd kvartskyvetter. För mätning av bakgrunden kan man använda en ca 0.05 M H2SO4-lösning. Mer detaljerade instruktioner för mätningen finns bredvid 9

10 mätinstrumentet. J-lösningens absorptionsmaximum är vid 348 nm. Energin som motsvarar denna våglängd används för att excitera kinin i fluorescensmätningen. Fluorescensspektren mäts med spektrofluorometern. Lämpliga inställningar på spektrofluorometern är integration time = 3950 ms och boxcar width = 10. Den första inställningen har att göra med hur länge ljus samlas på CCD-sensorn och den senare med spektrets resolution. Mät bakgrundsspektret med 0.05 M svavelsyra-lösning. För att bestämma kinin-halten i Tonic-drycken bör du med instrumentet mäta fluorescensspektren för C-lösningen och standardseriens lösningar (5 st). Mät även fluorescensspektren för släckarseriens lösningar (6 st) för att undersöka släckningen av kininets fluorescens. Den exakta höjden på spektralbältet får du fram genom att klicka på spektrets maximum med musen. Fyll i mätblanketten under arbetets gång. Kom ihåg att subtrahera bakgrunden! 5. BERÄKNINGAR OCH ARBETSBESKRIVNING Räkna med hjälp av Beer och Lamberts lag (A = c j εl, där A = absorbans, ε = 5500 dm 3 mol -1 cm -1 vid våglängden 348 nm och l = 1 cm) ut J-lösningens koncentration. Räkna också ut koncentrationerna för lösningarna i standardserien. Rita upp fluorescensens styrka i standardseriens lösningar som funktion av lösningens koncentration och anpassa en linjes ekvation till punktgruppen. Ifall mätningen har lyckats idealiskt bör linjen gå igenom origo. Ifall så inte sker, subtrahera värdet på den punkt där linjen skär y-axeln från intensiteten på fluorescensen du uppmätt för C-lösningen. Dividera den erhållna summan med linjens riktningskoefficient, på detta sätt kan du bestämma C- lösningens koncentration. Räkna ännu ut massan kinin i en 0.33 liters flaska tonic-vatten. Molekylmassan för kinin som innehåller tre molekyler kristallvatten är g mol -1. Bestäm med hjälp av ekvation (8) Stern-Volmer konstanten för släckningen av kininets fluorescens. Rita för detta upp den relativa intensiteten för fluorescensen som funktion av NaCl-koncentrationen (mätresultaten från släckarserien). Räkna också ut den nedre gränsen för fluorescensens livstid genom att använda ekvation (10) och Stern-Volmen konstanten [η H2 O= kg m -1 s -1, 25 C]. Gör en felkalkyl genom att använda felen på riktningskoefficienten och skärningspunkterna som du fått ur anpassningen av linjen. 10

11 Skriv en arbetsbeskrivning som följer de allmänna instruktionerna. Svara dessutom skriftligt på följande frågor. 1. Varför mäter man i bild 3 inte absorbansen vinkelrätt från den exciterande strålen som då man mäter fluorescensen? 2. Ämnet J exciteras med 300 nm och excitationen frigörs som fluorescens och fosforescens. Illustrera med en bild på ett spektrum hur absorptions- och emissionsspektrena för ämne J ser ut som funktion av våglängden. Motivera ditt påstående. 6. LITTERATUR P. W. Atkins och J. de Paula, Atkins Physical Chemistry, 8. Uppl., 2006, s och P. W. Atkins och J. de Paula, Atkins Physical Chemistry, 7. Uppl., 2002, s , 927 och 930. K. Kalliorinne, A. Kankaanperä, A. Kivinen och S. Liuokkonen, Fysikaalinen kemia 3, Raumo, 1990, s och