NRMM. Nordisk Extern Kvalitetssäkringsprogram i Medicinsk Mykologi (NEQAMM) NEQAMM Resultat Erja Chryssanthou. NEQAMM 2010 Page 1/10

Transkript

1 NRMM The Nordic Reference group on Methods in medical Mycology Nordisk Extern Kvalitetssäkringsprogram i Medicinsk Mykologi (NEQAMM) NEQAMM 2010 Resultat Erja Chryssanthou NEQAMM 2010 Page 1/10

2 Extern kvalitetssäkring 2010 I denna sammanställning presenteras resultat på artidentifiering och resistensbestämning från de 22 svenska klinisk mikrobiologiska laboratorier som deltog i årets kvalitetssäkringsprogram. Substrat för primärodling De olika mykologiska och bakteriologiska substrat som användes för primärodling av panelen på de deltagande laboratorierna visas i tabell 1. NRMM rekommenderar användning av chrom- och Sabouraudagar för primärodling av svamp. Förra året rapporterade % (beroende på provmaterial) av laboratorierna att de odlar prov för isolering av jästsvamp på chromagar. I år har användningen ökat till 82-91%, vilket är mycket bra. De flesta svenska laboratorier använder Chromagar Candida (färdiga plattor från BD eller pulver från CHROMagar Candida från Frankrike), några använder Can2 från Biomeriéux och ett laboratorium har chromagar från Oxoid. Sabouraud agar är ett basmedium för odling av både jäst, dermatofyter och mögelsvamp och med tillsats av antibiotika kan bakterieväxt hämmas. Förra året rapporterade 62-82% av laboratorier användning av Sabouraud, i år 78-82%. Tabell 1. Substrat för primärodling Svampsubstrat Andra substrat Prov 1. C. guilliermondii C. lusitaniae 2. A. fumigatus 3. M. audouinii 4. C. glabrata Antal laboratorier Sabouraud Chromagar ell. motsvarande Dixon agar ell. motsvarande Andra selektiva svampsubstrat % % , % ,6 89 5,6 5,6 5,6 5,6 5, % , Blod Choklat Anaerobisk BHI & andra buljong Selektiv för G neg Selektiv för G pos Andra selektiva substrat Metoder för identifiering De flesta laboratorierna har rapporterat identifieringsresultat till art eller släktnivå på samtliga isolat. Metoderna för artidentifiering av jästisolat i prov 1 och 4 visas i tabell 2. Chromagar var den vanligaste metoden följd av corn-meal agar för morfologisk karakterisering av isolaten. Serumtest har inte använts alls, vilket är förväntat resultat eftersom chromagar har indikerat att svampen inte är C. albicans/c. dubliniensis. Snabb-trehalostest för artidentifiering av C. glabrata har använts på 45 % av laboratorierna, vilket kan jämföras med 33 % 2005 och 27 % 2007 då panelen senast innehöll ett C. glabrata isolat. Hälften av laboratorierna har tillgång till Vitek för artidentifiering av jäst och ID 32C har använts på 8 laboratorier. Sekvenseringsmetoder har fortfarande en mycket begränsad utbredning inom mykologin i Sverige. NEQAMM 2010 Page 2/10

3 Tabell 2. Metoderna för artidentifiering av jästisolat Morfologi Snabb identifieringstest Slutgiltig identifiering (2-3 dagar) (Samma dag) (1-7 dagar) Prov 1. C. guilliermondii C. lusitaniae Antal laboratorier Chrom agar ell. motsvarande Corn Meal agar ell. motsvarande Serumtest Rapid Trehalose test (glabrata) Latex agglutination (albicans, dubliniensis och/ell. krusei) % Vitek ID32C API 20C Fermentation Sekuensering 4. C. glabrata % ,5 4,5 Prov 2 och 3 innehöll trådsvampar (Aspergillus fumigatus och Microsporum audouinii) och få laboratorier har rapporterat vilka metoder de använder för artidentifiering. Två laboratorier hade sekvenserat dermatofyten. Endast 7-8 laboratorier angav mikroskoperingen som identifieringsmetod men det är ändå sannolikt att flera laboratorier har studerat mikromorfologin av dessa isolat. Påvisning och identifiering av svampar Prov 1 Provtyp: Klinisk information: Mikro-organism: Var 35-årig kvinna med bukabscess Candida guilliermondii och C. lusitaniae Escherichia coli Provet innehöll en blandkultur av Candida guilliermondii och C. lusitaniae. Endast 5 (23 %) av laboratorierna lyckades isolera 2 stammar från detta prov och 2 (9 %) av dessa rapporterade rätt art för båda isolaten. Resultaten visar att det inte är lätt att hitta blandkulturer ens med chromagar om provet innehåller jästarter som har liknande färg och utseende. C. lusitaniae växer som lite större rosa/ljuslila kolonier på CHROMagar Candida än C. guilliermondii som har små ljusrosa kolonier, därför kan det vara bra att läsa av plattorna i 3 efterföljande dagar (Fig 1). På corn-meal agar bildar C. guilliermondii mycket mindre jästceller än C. lusitaniae, båda har pseudohyfer. Vitek kan inte skilja C. guilliermondii och C. famata och tilläggstester behövs t.ex. morfologi på corn-meal och jäsning (C. famata varken bildar pseudohyfer eller jäser sockerarter). Två av laboratorierna svarade enbart jästsvamp och en av dem skulle ha skickat isolatet till ett referenslaboratorium. Artidentifiering av jästsvamp är viktigt för isolat från bukabscess eftersom det kan styra svampbehandlingen. NEQAMM 2010 Page 3/10

4 Fig 1. C. guilliermondii och C. lusitanie i prov 1 (50 µl odlad på Chromagar) C. lusitaniae C. guilliermondii Tabell 3. Resultat av artidentifiering från prov 1 Antal laboratorier Artidentifiering 13 C. guilliermondii 2 C. guilliermondii och C. lusitaniae 1 C. guilliermondii och C. famata 1 C. lusitaniae och C. famata 1 C. lusitaniae och Candida ej albicans 1 C. lusitaniae 1 C. famata 2 jäst Totalt 22 Laboratorierna behövde 2-17 dagar (medel 6,5) för slutrapport till kliniker på artidentifiering och resistensbestämning. Elva laboratorier klarade av rapporteringen inom en vecka, vilket bör vara målet. Prov 2 Provtyp: Klinisk information: Mikro-organism: BAL 45-årig patient med kronisk lung sjukdom Aspergillus fumigatus (Klebsiella pneumoniae) Provet innehöll A. fumigatus trådsvamp. Isolering och artidentifieringen av stammen gick väldigt bra. Av de 22 laboratorierna svarade 19 (86 %) A. fumigatus. Slutsvar rapporterades till kliniker efter 2-8 dagar (medel 4) beroende på om resistensbestämning utfördes eller inte. Tre laboratorier svarade mögel och 2 av dem skulle ha skickat isolatet till ett referenslaboratorium. I NEQAMM 2007 ingick ett BAL-prov med A. fumigatus även då lyckades alla laboratorier odla fram trådsvamp men endast 70 % svarade rätt art. Det är positivt att de flesta laboratorierna kan artidentifiera A. fumigatus. Det är viktigt NEQAMM 2010 Page 4/10

5 med artidentifiering av kliniskt relevanta trådsvampisolat i BAL-prov eftersom olika kontaminerande arter t.ex. Penicillium species kan också ibland förekomma i luftvägarna. Prov 3 Provtyp: Klinisk information: Mikro-organism: Hudskrap 11-årig pojke med tinea capitis Microsporum audouinii Provet bestod av M. audouinii på snedagarrör. M. audouinii är en antropofil dermatofyt som orsakar icke-inflammatoriska infektioner i hårbotten och på huden framför allt hos barn. Hälften av laboratorierna svarade rätt art och ett laboratorium rätt släkte Microsporum. Fyra (18 %) hade identifierat dermatofyten till olika Trichophyton-arter. Odling och artidentifiering tog i genomsnitt 2 veckor för laboratorierna att utföra. M. audouinii är långsam och växer på Sabouraud-agar som en tätt, platt, gråvit eller brunvit koloni som breder sig över agarytan. Baksidan är ofta aprikos/rosa men kan ibland vara färglös. M. audouinii bildar sällan mikro- eller makrokonidier men har ofta tjock-väggiga terminala klamydokonidier (Fig 2). Så kallade pectinate bodies (kamliknande hyfstrukturer) (Fig 3) och rackethyfer kan också förekomma. Fig 3. Pectinate bodies Fig 2. Terminala klamydokonidier Tabell 4. Resultat av artidentifiering från prov 3 Antal laboratorier Artidentifiering 11 M. audouinii 1 Microsporum sp till referenslab 1 dermatofyt till referenslab 1 T. mentagrophytes 1 T. soudanense 1 T. tonsurans 1 Trichophyton sp 1 mögel 1 negativ odling 2 utför ej dermatofytdiagnostik till referenslab Totalt 22 NEQAMM 2010 Page 5/10

6 Prov 4 Provtyp: Klinisk information: Mikro-organism: Blododling 50-årig man på intensiv vård Candida glabrata Provet innehöll C. glabrata. Av de 22 laboratorierna svarade 20 (91 %) rätt art. Två laboratorier rapporterade endast fynd av jästsvamp, men bara en av dessa skulle ha skickat isolatet till ett referenslaboratorium. C. glabrata ingick I NEQAMM panelen 2005 och då rapporterade 85 % av laboratorierna rätt art. Det är mycket viktigt med artidentifiering av alla blodisolat eftersom olika jästsvampar har olika resistensmönster. Snabb-trehalostest användes i 45 % av laboratorierna för artidentifiering av C. glabrata, denna kommersiella test (Fumouze) är bra för att artdiagnos kan fås inom 20 min. Tid för slutsvar tog 2-8 dagar (medel 4). Laboratorierna bör sträva efter att klara artidentifieringen snabbt eftersom C. glabrata har nedsatt känslighet för flukonazol och de övriga azolerna. Resistensbestämning Antalet laboratorier som har utfört resistensbestämning visas i tabell 5. Antalet varierade beroende på om svampen var jäst- eller trådsvamp. Tabell 5. Antal laboratorier som har rapporterat resultat på resistensbestämning Antal Prov laboratorier 1. C. guilliermondii C. lusitaniae 4 2. A. fumigatus 3 4. C. glabrata 13 De använda metoderna för resistensbestämning De flesta laboratorierna använder E-test för resistensbestämning av jästsvamp och 4 laboratorier har Viteksystem. Inget laboratorium har rapporterat användning av lappmetoden. EUCASTreferensmetoder för resistensbestämning av jäst- och trådsvamp är uppsatta på Karolinska universitetslaboratoriet, Solna. MIC-resultat MIC-värdet har översatts till nästa spädning i de fallen där värdet har rapporterats som större eller lika med ett värde t.ex >32 har ändrats till 64 och 256 till 512 mg/l. Mellanspädningar i E-test har höjts till nästa spädning för att motsvara 2-stegsspädningar t.ex 0,094 har ändrats till 0,125 mg/l. Vitek MIC har lämnats oförändrade t.ex 0,25 presenteras som 0,25 mg/l för amfotericin, 0,12 som 0,125 mg/l för vorikonazol och 1 som 1 mg/l för flucytosin. Inrapporterade MIC-värden från de deltagande laboratorierna visas i tabellerna NEQAMM 2010 Page 6/10

7 Tabell 6. Referens MIC-värden för svamppanelen MIC (mg/l) C. guillermondii C. lusitaniae A. fumigatus C. glabrata Amfotericin 0,25 0,25 0,25 0,25 Flukonazol 2 0,5 >64 Itrakonazol 0,25 0,016 >8 >8 Vorikonazol 0,063 0, Posakonazol 0,25 0, Caspofungin 1 0,5 0,125 >16 Anidulafungin 16 0, Micafungin 1 0,032 2 Tabell 7. MIC-distribution för C. guilliermondii (prov 1) MIC (mg/l) 0,002 Amfotericin B Flukonazol Itrakonazol 0, ,008 0, , , , , , Vorikonazol Posakonazol Flucytosin Caspofungin Anidulafungin Tre laboratorier skriver att de skulle ha skickat C. guilliermondii stammen till ett referenslaboratorium för resistensbestämning. Resistensbestämning bör utföras på isolat från bukabscess. Denna stam är känslig för de flesta antimykotika förutom echinocandiner (caspofungin, anidulafungin, micafungin). Det finns studier som visar att C. guilliermondii och C. parapsilosis stammar svarar sämre på behandling med echinocandiner än med flukonazol. C. lusitaniae stammen är känslig för alla antimykotika. NEQAMM 2010 Page 7/10

8 Tabell 8. MIC-distribution för C. lusitaniae (prov 1) MIC (mg/l) 0,004 Amfotericin B Flukonazol Itrakonazol 0, ,016 0,032 0,064 0, , , Vorikonazol Posakonazol Flucytosin Caspofungin Anidulafungin Tabell 9. MIC-distribution för A. fumigatus (prov 2) MIC (mg/l) Amfotericin B Flukonazol Itrakonazol 0, ,008 0, ,032 0, , , , Vorikonazol Posakonazol Caspofungin Anidulafungin NEQAMM 2010 Page 8/10

9 Denna A. fumigatus stam är resistent mot itrakonazol, vilket är konfirmerad med sekvensering av resistensgenen (TR/L98H resistens). Stammar med den här typen av resistens visar oftast border line känslighet för vorikonazol, som är förstahandsmedel för Aspergillus och resistens mot posakonazol. Kliniska MIC-brytpunkter för A. fumigatus är inte fastställda men epidemiologiska cutoff värden är 1 mg/l för itrakonazol och vorikonazol och 0,25 mg/l för posakonazol. Aspergillus-arter är inte känsliga för flukonazol och behöver inte testas för detta. Resultaten visar att det erhållna MIC-värdet påverkas av metodval. Referensmetoden och E-test ger inte helt överenstämmnande resultat för Aspergillus. Sex laboratorier rapporterade att de skulle ha skickat isolatet till ett referenslaboratorium för resistensbestämning. Det är viktigt att resistensbestämma kliniskt relevanta Aspergillus-isolat från patienter med kronisk lungsjukdom om behandling är planerad att sättas in eller vid positiva odlingsfynd under svampbehandlingen. Tabell 10. MIC-distribution för C. glabrata (prov 4) MIC (mg/l) 0,002 0,004 Amfotericin B Flukonazol Itrakonazol 0, ,016 0, ,064 0, ,25 4 0, Vorikonazol Posakonazol Flucytosin Caspofungin Anidulafungin Resistensbestämning av C. glabrata för azoler rekommenderas inte pga resistens eller nedsatt känslighet. Dessutom saknas tillräcklig evidens att C. glabrata skulle vara bra target för behandling med vorikonazol eller posakonazol. Tre laboratorier har rapporterat att de ger kommentaren: Candida glabrata har nedsatt känslighet för flukonazol i sina svar, vilket är att rekommendera. Denna stam är echinocandin resistent och resistensmutation i FKS1-genen har påvisats med sekvensering. Resistenta stammar är korsresistenta mot alla echinocandiner dvs caspofungin, anidulafungin och micafungin. NEQAMM 2010 Page 9/10

10 Tabell 11. ECOFF och kliniska MIC-brytpunkter enligt EUCAST-AFST (brytpunkterna för posakonazol och anidulafungin är ett förslag från EUCAST-AFST gruppen) Flukonazol Vorikonazol Posakonazol Anidulafungin ECOFF kliniska brytpunkter ECOFF kliniska brytpunkter ECOFF kliniska brytpunkter ECOFF kliniska brytpunkter S /R> S /R> S /R> S /R> C. albicans 1 2/4 0,125 0,125/0,125 0,06 0,06/0,06 0,016-0,03 0,03/0,03 C. tropicalis 2 2/4 0,125 0,125/0,125 0,06 0,06/0,06 0,03-0,06 0,06/0,06 C. parapsilosis 2 2/4 0,125 0,125/0,125 0,06 0,06/0,06 4 PT C. glabrata 32 IE 1 IE 1 IE 0,03-0,06 0,06/0,06 C. krusei 128 NR 1 IE 0,5 IE 0,06 0,06/0,06 C. guilliermondii 0,25 IE PT andra Candida arter 2/4 saknas saknas saknas ECOFF= epidemiologiskt cutoff värde IE = otillräcklig evidens för att arten skulle vara god target för detta antifungala medel NR = resistensbestämning rekommenderas inte PT = dålig target för anidulafungin NEQAMM 2010 Page 10/10