Studier på förekomst av humant papillomavirus (HPV) i munhålan. Student: Yakob Sabri

Transkript

1 Studier på förekomst av humant papillomavirus (HPV) i munhålan. Student: Yakob Sabri Mentorer: Göran Dahlöf, Professor i Pedodonti, institutionen för odontologi. Tina Dalianis, Professor i Tumörvirologi, institutionen för onkologi-patologi.

2 Abstract The original purpose of this study was to evaluate the prevalence of human papillomavirus (HPV) in the oral cavity of individuals of different ages (1-100 years). Knowledge concerning when oral HPV infection occurs may help decide at which age is best to vaccinate against HPV in the future. Furthermore, we wanted to create a baseline for oral HPV infection in order to later evaluate whether the vaccine also protects against HPV infection in the oral cavity. The project was divided into two subprojects. The first was to compare two different sampling techniques, i.e. tonsillar swab tests versus mouth washing when testing the oral cavity for HPV. The other was to collect samples from patients in order to understand to detect HPV in the oral cavity with different sampling techniques. We collected 61 samples, 24 tonsillar swabs and 37 mouth wash samples from 37 children aged 0-18 years of age. Most samples were HPV negative. However 3 tonsillar swabs were HPV positive, while the corresponding mouthwash from the same patients were HPV negative p= In conclusion, there is a tendency although not statistically significant for HPV to be more frequently found in tonsillar swabs as compared to mouth wash samples in small children. More samples are necessary to confirm if this is really the case.

3 Sammanfattning Genom att under en längre tid följa vilka humant papillomavirus (HPV) typer som förekommer i munhålan hos friska barn och vuxna kan vi lättare förstå när, hur ofta och hur länge HPVinfektion förekommer i munhålan samt hur omfattande skyddseffekten kan bli med de vaccin som finns idag. Samtidigt får vi information om hur tidigt HPV infektion förekommer och vilka HPV-typer framtida vaccin bör rikta sig emot och vilken ålder kan vara lämplig att vaccinera vid. Proverna kommer att hjälpa oss att utreda hur lätt eller svårt det är att detektera HPV i munhålan samt kunna jämföra vilken provtagningsmetod som är mest effektiv skrap- kontra sköljprov. Vi samlade 61 prover, 24 tonsillskrapp och 37 munsköljprover från 37 barn mellan 0-18 års ålder. De flesta proverna var HPV negativa. Dock var 3 tonsillskrap positiva medan munsköljprov från samma patienter var HPV negativa (p=0.23). Slutsats, det fanns en statistiskt icke signifikant tendens för HPV att vara mer vanligt förekommande i tonsillskrap jämfört med munsköljprov. Fler prov krävs dock för att bekräfta detta.

4 Introduktion Det finns fler än 100 HPV- typer hos människan. De flesta typerna ger asymptomatiska infektioner, men vissa kan ge upphov till hudvårtor, papillom eller kondylom medan andra onkogena HPV-typer kan i sällsynta fall framkalla cancer. Mest känt är att onkogena HPV-typer förekommer i livmoderhalscancer. HPV-typ 16 och 18 är de vanligaste typerna i livmoderhalscancer och tillsammans anses de förorsaka 70 % av all livmoderhalscancer. För att förhindra uppkomst av denna cancertyp förekommer ex. PAPscreening där man undersöker cellprover histologiskt från livmoderhalsen och vagina för att upptäcka tidiga cellförändringar och tidigt avlägsna förstadier av livmoderhalscancer. Detta förhindrar en stor del av all livmoderhalscancer. Idag finns det två HPV-vaccin på marknaden. Hos Gardasil (Merck) riktas svaret mot HPV-typ 16, 18, 11 och 6, och hos Cervarix (GlaxoSmithKline) mot HPV 16 och 18. Båda dessa vaccin förhindrar HPV 16 och 18 att orsaka genital infektion hos kvinnor och kommer sannolikt att förhindra en stor del av all livmoderhalscancer HPV förekommer även i andra tumörer, exempelvis i vissa huvudhalstumörer, och då framförallt tonsill- och tungbascancer, de två vanligaste formerna av orofarynxcancer. Vi har i tidigare studier visat att hos patienter som vårdats på Karolinska Universitetssjukhuset mellan så har HPV-positiv tonsillcancer ökat 7-falt och proportionen HPV-negativ cancer har istället minskat. Mer specifikt har andelen HPV positiv tonsillcancer ökat från 23% på 70-talet till 68% mellan och har ökat ytterligare därefter. Andelen HPV-positiv tonsill- och tungbascancer var % resp. 84 % och av dessa var över 90 % HPV typ 16. En ökad incidens av tonsill- och tungbascancer rapporteras i Sverige, USA, Storbritannien, Nederländerna, Finland och Norge och utgående från våra och andras data anser vi att en epidemi av HPV inducerad orofarynx cancer pågår.

5 Allmän virologi Virus består i huvudsak av gener omslutet av ett skyddande proteinhölje (capsid). Dessa gener måste komma in i en värdcell och utnyttja cellens maskineri för att uttryckas till proteiner och för att replikeras samt för att skapa ett omslutande proteinhölje. Reproduktion av virus inuti cellen förstör ofta cellen som lyseras och viruset kan därmed infektera närliggande celler. Virala genomet kan vara av DNA eller RNA-typ och det kan det vara enkelsträngat eller dubbelsträngat. Mängden DNA/RNA som kan packas inuti ett virus är begränsat och räcker därför inte till för de gener som kodar för diverse enzymer och proteiner som krävs för replikation. De enklaste typerna av virus består av ett fåtal gener som omsluts av ett proteinhölje som består av många kopior av en polypeptid. Mer komplexa virus har proteinhöljen som består av flera proteiner. (1) Humant Papillom Virus (HPV) Det finns fler än 100 HPV typer några infekterar huden andra slemhinnor. Av de HPV typer som infekterar slemhinnor så har 24 av de vanligaste typerna i sin tur blivit indelade i 3 grupper baserat på deras cancerogenicitet. Till första högrisk-gruppen hör HPV: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 och 82. Till andra gruppen som är potentiella högrisktyper hör: 26, 53 och 66. Till sista gruppen som är lågriskgruppen hör 6, 11, 42, 43, 44 och 70. Den sistnämnda gruppen orsakar i huvudsak genitala vårtor och lågt differentierade cervicala lesioner (2). HPV är mest förknippat med livmoderhalscancer och ca kvinnor insjuknar i livmoderhalscancer varje år i världen. Idag finns det vaccin mot HPV 16 och 18, samt 6 och 11 och dessa vaccin skyddar mot HPV infektion orsakade av dessa HPV- typer. HPV finns även i andra tumörer exempelvis i huvudhalscancer och anogenital (3-5). HPV och dess uppbyggnad Alla HPV-typer består av ett dubbelsträngat, cirkulärt DNA omslutet av en nm bred capsid (6). Genomet är indelat i 3 regioner: 1. Icke kodande regionen (Non coding region- NCR): består av replication origin där DNA replikation börjar. Den består också av en promotor och en enhancer region. Promotorn är en nukleotidsekvens i DNA vilket RNA polymeraset i sin tur binder till för att påbörja transkription. Enhancer region är en DNA sekvens dit regulatoriska proteiner binder. På så sätt kan transkriptionshastigheten regleras. 2.Tidiga regionen (Early region) kodar för proteiner som E1,E2 och E4-E7. Dessa är viktiga för

6 den patogena- och transformationsförmågan (7,8). E1 är viktigt för viral replikation. E2 har med regleringen av virala transkriptionen att göra. E6 och E7 är klassade som onkogener, gener som befrämjar tumörväxt. E6 binder till värdcellens protein p53 (tumörsupressor-gen som reglerar cellcykeln) och förstör den. E7 binder till retinoblastoma protein (Rb) som är en tumörsupressorgen och förhindrar celldelning. 3. Sena regionen (Late region) proteinerna L1 och L2 kodar för capsid proteiner. L1 är det största capsidproteinet och capsiden består av 360 x L1 molekyler och 10 x L2 molekyler (7). HPV i huvudhalscancer Cancer i huvud/halsregionen står för 3-4 % av all cancer i Sverige. Exkluderat esophaguscancer diagnostiseras 1000 nya fall varje år där män drabbas nästan dubbelt så ofta jämfört med kvinnor (9). Tonsillcancer är den vanligaste oropharyngeala cancern och tumörerna är huvudsakligen av typen skivepitelcancer (10-12, 13). När patienter söker för symtom som smärta vid sväljning eller svårt att svälja så är tumören oftast stor då mindre tumörer inte yttrar sig i form av ovanstående symtom (11). Behandlingen är kirurgi och/eller strålbehandling och i vissa fall cellgifter (12,13). HPV i tonsillcancer, ökad incidens och prognostisk faktor Patienter med mindre oropharyngeal cancer har en 5-års överlevnad på 60-70% medan patienter med större tumörer ( TNM stadium III-IV) har en 5-års överlevnad på % (12, 13). Senare rapporter har visat på att incidensen av tonsillcancer har ökat och indikerar på att patienter med HPV-positiv tonsillcancer har en bättre prognos jämfört med de med HPV-negativ tonsillcancer (12, 14-17). HPV DNA har visat sig vara påvisbart i % av alla tonsillcancrar (10,12, 18-20). Variationen beror delvis på påvisningsmetodiken och materialet som är tillgängligt för analys (19, 20). Nedan några ord om HPV diagnostik. HPV diagnostik Identifikation av HPV görs idag oftast genom PCR (Polymerase Chain Reaction, se beskrivning nedan). Tidigare användes immunohistokemiska metoder med antikroppsfärgning av olika HPV produkter men dessa metoder är mindre känsliga. PCR görs antingen genom reguljärt PCR eller kvantitativ PCR. Skillnaden är att i kvantitativ PCR så används fluorescens och till skillnad från reguljär PCR kräver detta en särskild utrustning (19, 20, 21-23). Själva screeningen för HPV kan ske först med generell HPV PCR där man använder generella primrar t.e x GP5+/6+ eller

7 CPI/IIG. Detta tillåter detektion av flera HPV-typer (21,22). Efter generell HPV screening så kan typning ske på olika sätt, t.ex. med HPV typ specifika primers och PCR eller sekvensering. Det finns dock många nya metoder. Multiplex/Luminex teknik är också en PCR baserad teknik som är mycket känslig och som lätt kan användas för att analysera många prover med begränsat provmaterial samtidigt, och det är också detta vi använt här. Metoden beskrivs i mer detalj nedan. Epidemiologiska studier om HPV och tonsillcancer Stockholmsstudien från 2006 (23) visar på en trefaldig ökning av tonsillcancer- incidensen och proportionen av HPV-positiva tonsillcancer i stockholmsområdet under I enlighet med Swedish Cancer Registry har alltså incidensen av tonsillcancer ökat 2.8-faldigt (2.6 hos män och 3.5 hos kvinnor) mellan åren 1970 och Analys av 203 paraffininbäddade tumörbiopsier från samma period och område visade en 2.9-faldig ökning av proportionen HPV positiva cancrar. Proportionen var 23 % under 1970-talet, 29 % under 1980-talet, 57 % under 1990-talet och 68 % mellan åren Detta visar att HPV kan spela en viktig roll i den ökade incidensen av tonsillcancrar. D Souza et al (24) har visat liknande resultat att HPV fanns påvisbart i 72 % av all oropharyngeal cancer i Baltimore området i USA. I båda studierna (Stockholmsområdet och Baltimore) var majoriteten män likaså var också HPV-16 den vanligaste HPV typen (24, 25). Att HPV-16 kan spela en stor roll i tonsillcancer grundas inte bara på dess roll i ökningen av incidensen av tonsillcancer utan också pga ökade incidensen av funnet uttryckt HPV16- E6 och E7 mrna i tumörer (17). Nyligen har HPV-16 E6 och E7 mrna analyserats i 53 HPV-16 positiva tonsillcancerprover. I 94 % av fallen fann man HPV-16 E6 mrna och/eller HPV-16 E7 mrna (17). I 79 % av fallen hittade man både E6 och E7. Vad gäller prognosen för HPV positiv tonsillcancer så anses HPV vara en fördelaktig prognostisk faktor (12,17,19,26). I en studie (12) med 52 patienter med tonsillcancer hade 27 av dessa HPV positiva tumörer och 52 % av de sistnämnda var tumörfria 3 år efter diagnosen jämfört med de patienter med HPV-negativ tumör där 21 % var tumörfria efter 3 år. Detta oberoende av tumörstadium, ålder, kön, differentiersgrad och p53 uttryck (12, 27). En annan studie (26) på 253 patienter med huvud/halscancer gjordes där 60 av dessa hade oropharyngeal cancer (mestadels tonsillcancer). Där visades att patienter med HPV-positv

8 oropharyngeal cancer hade högre överlevnad jämfört med patienter med HPV-negativa tumörer. Liknande tendens sågs inte hos cancer i andra lokalisationer. Nyligen har det också visats i en större studie (17) omfattande 203 patienter med tonsillcancer (där 150 patienter fick behandling) att patienter med HPV-positiv tonsillcancer hade en 5 årsöverlevnad på 81 % jämfört med 36 % hos patienter med HPV-negativ tonsillcancer. En uppföljning av Stockholmstudien publicerades 2009 (28). Man ville se om incidensen av tonsillcancer och proportionen av HPV-positiv tonsillcancer hade fortsatt att öka under som under (29). Materialet omfattade alla patienter diagnostiserade med tonsillcancer av skivepiteltyp i Stockholm under Totalt fanns 120 patienter i registret med diagnostiserad tonsillcancer och 98 paraffininbäddade tumörbiopsier fanns tillgängliga. Av de 98 patienterna var 76 män och 22 kvinnor. HPV DNA påvisades i 83/98 % (85 %) av fallen och av de HPV-positiva tumörerna var 77/83 % (93 %) positiva för HPV-16. HPV-16 E6 och/eller E7 RNA uttryck påvisades i 50/51 % (98 %) av de fall där RNA extraktion för analys kunde göras. Precis som i studien så fortsätter proportionen av HPV-positiv tonsillcancer att öka. Om man analyserar hela perioden dvs så finner man att 23 % av tonsillcancer var HPV positivt under 1970 talet, 29 % under 1980-talet, 57 % under 1990-talet och 79 % under Vad gäller incidensen av HPV-positiv tonsillcancer så har den ökat från 0.74/ personer/år under åren till 1.65/ personer/år (incidensdata från 2007 fanns ännu inte tillgängligt i registret). Medelåldern för de 98 patienter som fick diagnosen tonsillcancer under var 61 år och medianen 60. Maximumåldern var 101 och minimumåldern 41. Patienter med HPV-positiv tumör var yngre än patienter med HPVnegativa tumörer och medelåldern för förstnämnda var 59 (vid diagnos) och de sistnämnda hade en medelålder på 68. För män var medelåldern hos HPV-positiv tonsillcancer 59 medan medelåldern var 69 för patienter med HPV-negativ tumör. Analys av kvinnor gick inte att göra eftersom att endast en kvinna hade HPV-negativ tumör. HPV och tungbascancer Tungbascancer av typen skivepitelcancer är den näst vanligaste oropharyngeala cancern i Sverige efter tonsillcancer (9). Behandlingen är en kombination av strålning, kirurgi och ibland cellgifter, alternativt palliativ vård. Kirurgi orsakar ofta livslånga svårigheter med att svälja medan cellgifter och strålbehandling kan ge bieffekter som muntorrhet, esophageal sammandragning och osteoradionekros. Riskfaktorer för huvud/halscancer är t.ex. tobaksbruk och alkohol. Men

9 trots minskad konsumtion av tobak och tobaksassocierad cancer så har incidensen av tonsillcancer ökat både i Finland och Sverige (14, 30). Enligt ovanstående studie har det visats att HPV troligtvis är en viktig faktor i ökningen av tonsillcancer i Stockholmsområdet. Men hur är det med tungbascancer? I följande studie (31) ville man utreda prevalensen av HPV i tungbascancer mellan åren Målet med studien var att utreda huruvida incidensen av tungbascancer har ökat i Sverige under och om prevalensen av HPV-positiv tungbascancer har ökat i Stockholmsområdet under åren 1998 och Incidensdata om tungbascancer i Sverige och Stockholmsområdet mellan åren erhölls genom Nationella Cancerregistret. För analys av prevalensen av tungbascancrar i Stockholmsområdet mellan identifierades alla patienter som fått diagnosen tungbascancer i Stockholmsområdet under denna tidsperiod. Samtliga patienter hade behandlats på Karolinska Universitetssjukhuset i Stockholm. 109 patienter fanns i sjukhusdatabasen och 95 paraffininbäddade tumörbiopsier fanns tillgängliga. Påvisandet av HPV DNA gjordes genom PCR där man använde generella primer pairs GP5+/6+ (21) och CPI/IIG (22). Test för närvaro av HPV-16 och HPV-33 gjordes genom att testa alla prover med typspecifika primrar (32). Påvisning av HPV-16 E6 och E7 mrna gjordes på 20 slumpvis utvalda HPV 16 DNA positiva prover. Vad gäller incidensen av tungbascancer i Sverige under perioden så har den ökat från 0.15/ personer under till 0.47/ personer under Incidensen var 0.3/ personer under till en ökning av incidens till 0.5/ personer under åren och När det sedan kommer till de 95 paraffininbäddade tumörbiopsierna (65 från män, 30 från kvinnor) från Stockholmsområdet mellan så påvisades HPV DNA i 71/95 (75 %) av alla prover. Av de HPV positiva tumörerna var 61/71 (86%) HPV-16 positiva och 7 var HPV-33 positiva. Inga av proverna var infekterade av både HPV-16 och 33. Man analyserade RNA från 20 slumpvis utvalda HPV16 -DNA positiva prover med avseende på E6 och E7- mrna uttryck. Av dessa prover var 17/20 (85 %) positiva för både E6 och E7. De övriga var HPV-16 E6 och E7 negativa. Statistisk analys av materialet mellan 1998 och 2007 indikerar på HPV-positiv cancer gradvis har ökat under den här perioden. 15/26 (58 %) av all tungbascancer var HPV positiva under , 18/25 (75 %) under och 22/26 (85 %) under och 16/19 (84 %) under Alltså fann man en signifikant ökning av HPV-positiv cancer från 58 % under till 84 % under

10 Sammanfattning Som tidigare nämnts förekommer HPV i nästan all livmoderhalscancer. Likaså beskrivs ovan en sjufaldig ökning av HPV-positiv tonsillcancer från 1970-talet till 2007 och att nästan all (>90 % ) tonsillcancer var HPV-positiv. Motsvarande tendens visades för tungbascancer där > 80 % var HPV positivt. Dessutom beskrivs ovan hur patienter med HPV positiv tonsill- och tungbascancer har bättre prognos än patienter med HPV-negativ cancer. Med anledning av ovanstående presenterade data ville vi utreda förekomsten av HPV både hos friska barn och vuxna samt patienter med HPV-positiv tonsillcancer.

11 Syfte Projektets huvudsyfte var att jämföra olika provtagningstekniker, d.v.s. skrapprov från tonsill kontra sköljprov hos normala individer för att få en uppfattning av prevalensen av HPV i munhålan hos friska barn och vuxna samt att undersöka om det fanns skillnader i känslighet mellan skrapprov och munskölj. Dessutom fanns planer att göra en longitudinell studie där man följde förekomst av HPV i munhålan över tid. Mera specifikt var projektet uppdelat i tre delar: 1. Att jämföra två provtagningstekniker, skrapprov kontra sköljprov i munhålan för eventuella skillnader för närvaro d.v.s. möjlighet att fånga upp HPV infektioner 2. Att undersöka prevalensen av olika HPV-typer i munhålan i olika åldrar (barn och vuxna). Vilka HPV-typer som finns i munhålan innan och efter att allmän HPV-vaccinering påbörjas hos unga kvinnor och män kan vara vägledande avseende hur omfattande skyddet kommer att vara med de vaccin som finns idag. Detta kan också visa på vilka grupper som bör vaccineras ex. både unga flickor och pojkar och vilka HPV-typer som nya vaccin bör innehålla. 3. Att longitudinellt följa patienterna med avseende på HPV-prevalens kan hjälpa oss att förstå hur ofta och hur länge HPV-infektion förekommer i munhålan. Vi hann utföra delprojekt 1 och 2 hos barn i olika åldrar men inte hos vuxna och delprojekt 3 att följa patienterna longitudinellt hanns inte med under perioden. Den longitudinella studiens syfte var att genom att under en längre tid följa vilka HPV-typer som förekommer i munhålan hos friska barn och vuxna kan vi lättare förstå hur ofta och hur länge HPV-infektion förekommer i munhålan samt hur omfattande skyddseffekten kan bli med de vaccin som finns idag. Samtidigt får vi information om vilka grupper (unga flickor och pojkar?) och vilka HPV-typer framtida vaccin bör rikta sig emot. Dessutom får vi information om huruvida orala hälsan och socioekonomiska förhållanden predisponerar för HPV- infektion. Att ta prover kommer dessutom att hjälpa oss förstå mer om hur lätt eller svårt det är att detektera HPV i munhålan. Var det också så att vissa personer aldrig blev av med sin HPV infektion i munhålan hade de större risk att utveckla tonsillcancer? Dessa frågor kvarstår och kan bli föremål för andra studier.

12 Patienter och metoder Patienter Patienter: 37 barn som kom på besök till avdelningen för pedodonti vid tandläkarhögskolan Karolinska Institutet var med i analysen. Prover togs med munskölj från alla barn och 24 barn gick med på skrapprov. Pat informerades muntligt och skriftligt (se bilagor) om provtagningen och tillfrågades om den ville vara med och fick sedan ge sitt samtycke på papper Provtagning: HPV testning och typning har utförts på material som samlats med munskölj- och skrapprov. Skrapprov har gjorts med samma prov som görs vid Chlamydiatest där skrap med bomullspinne har utförts på en av tonsillerna. Munsköljsprovet bestod av vanligt vatten som patienten sköljde runt med i munnen och som sedan utspottades i en bägare med Listerine (för aseptisk funktion). Dessa prover från den orala slemhinnan togs i samband med rutinåtgärder för kontroll eller besök på Tandläkarhögskolan vid KI. Provet kom direkt till Inst för Onkologi- Patologi, där DNA extraherades, analyserades och förvarades och där det kom att ingå i Karolinska Universitetssjukhusets och Tandläkarhögskolans biobank. Allt material som kom till Inst för Onkologi-Patologi kom i kodform och enligt etikansökan som skrivits av Tina Dalianis och godkänts av Regionala Etiknämnden i Stockholm. Journalföring sköttes av de kliniskt verksamma tandläkare och vid barnavdelningen vid tandläkarhögskolan KI i ett datorbaserat patientadministrativt system Effica/Opus. Data registrerades i kodform. Patienterna vid Tandläkarhögskolan kommer följas upp över tid då många patienter följs upp under längre perioder. Prov tas vid återbesök men med minst 3 månaders intervall. I detta arbete har vi inte hunnit följa upp dessa patienter.

13 Metoder Vid Inst. för onkolog-patologi extraherades DNA dvs vi renade fram DNA från proverna för att sedan kunna analysera med avseende på HPV (Se bilagor). För HPV DNA amplifiering användes Polymerase Chain Reaction (PCR) (se nedan) med typspecifika primers. Anledningen till att PCR användes är för att den teknik som sedan användes för att identifiera HPV dvs Multimetrix Luminex är en mycket känslig teknik där det krävs större mängder DNA material från viruset för att identifiering skall kunna ske. Man får troligtvis små mängder genetisk virusmaterial vid provtagning i munhålan. Generell beskrivning av PCR: PCR är en metod som används för att kopiera vissa delar av ett genom. Man känner alltså redan i förväg till DNA-sekvensen som skall amplifieras. Därför använde man sig av två syntetiska DNA oligonukleotider där varje är komplementär till vardera kedja och motsatt sida av regionen som skall amplifieras. Dessa oligonukleotider kallas primers och dessa får hjälp av DNA polymeras som i vanliga fall fungerar som katalysator vid DNA replikation. Steg 1: PCR sätts igång och nu finns dubbelsträngat DNA och DNA värms upp för att separera det dubbelsträngade DNAt. Steg 2: Därefter sänks temperaturen något i närvaro av 2 primrar som ger primrarna möjlighet att hybridisera (binda) till specifika regionen på DNA.t. Steg 3: Inkubering av blandningen sker. DNA syntes sker. Alltså får man komplementära kopior av förutbestämda sekvenser med avseende på primern. Dessa steg upprepas sedan och i praktiken behövs sådana cyklar för att få ut ett användbart, amplifierbart DNA. En cykel tar ungefär 5 min (1). Därefter skickades proverna Cancer Center Karolinska för testning avseende HPV förekomst. Vid identifiering av HPV användes ett Genotypningskit från företaget Multimetrix där man använder luminex. Med detta kit så kan 24 HPV typer analyseras samtidigt. Av dessa tillhör 15 högriskgruppen (16, 18, 31,33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 och 82), 3 den potentiella högriskgruppen (26, 53 och 66) och 6 lågriskgruppen (6, 11, 42, 43, 44 och 70). PCR-produkten hälls i en bead mix som innehåller 26 olika kemiska ämnen (beads) där 24 av dessa används för typning av 24 olika HPV-typer. De andra två är för β-globin som kontrollerar att amplifierat DNA finns tillgängligt och hybridiseringskontroll för att kontrollera att hybridisering är korrekt.

14 Dessa olika beads har en DNA sekvens bundet till sig och de binder som tidigare nämnts till specifika HPV-typer. Lösningen renas och endast de beads som är bundet till en specifik HPV typ finns kvar, resten sköljs bort. Därefter färgar man in det och detta läses av en luminex maskin kopplat till en dator som sedan både kan specificiera HPV typ och kvantifiera mängden. Statistik Fischers exact two tailed användes för analys på om det fanns skillnader i HPV positivitet mellan tonsillskrap och munsköljsprover.

15 Resultat Prov togs på 37 barn där deras ålder och kön sammanfattas i Tabell I. Medelåldern var 15 år och det var 22 pojkar och 15 flickor som deltog i studien. Den yngste pojken som deltog var 4 år och den yngsta flickan 6 år. Således fanns inga barn under 2 år med i studien. Försök till att få med barn under 2 år gjordes men det var mycket svårt att ta prover på dessa små barn. Det var inte heller lätt att samla prover under vissa perioder då patienter ofta uteblev. Från de 37 barnen togs 24 skrapprov och 37 munskölj prov (Tabell II). Det var inte alla 37 barnen som hade möjligt eller ville delta i tonsillskrap troligtvis pga rädsla inför eventuell smärta/obehag vid tonsillskap. Samtliga munsköljprov var negativa för HPV. Gällande tonsillskrap var 3 av 24 prover (12.5%) positiva för HPV (Tabell II). Samtliga HPV- positiva tonsillskrap togs från pojkar i åldrarna 12,16 och 17 år gamla (Tabell III) där motsvarande pojkes munsköljprov således var negativt. I samtliga 3 prover fann man HPV typer som tillhör högriskgruppen och i detta fall var det HPV typ 18, 51, 56 och 82. I två av proverna fann man HPV typ 42 som tillhög lågriskgruppen. Det fanns således en tendens att tonsillskrap oftare var HPV positiva jämfört med munsköljsprov (3/24 jämfört med 0/24 p=0.23) och att de tonsillskrap som var positiva till mestadelen bestod av HPV-typer från högriskgruppen. För var femte prov vid DNA extraktion kördes ett blankt prov som förbereddes på samma sätt som övriga prover. Alla blanker var negativa för HPV DNA vilket är förväntat om ingen kontamination förekommer.

16 Diskussion Totalt togs 61 prover från 37 barn varav 24 prover var från tonsillskrap och 37 med munskölj under perioden juli-september Det var 25 pojkar och 17 flickor som deltog i studien och där medelåldern var 15 år. Det var ojämnt med besökare på mottagningen och vissa dagar kom inga barn. Många fler barn tillfrågades, men alla ville inte vara med i studien och det var svårare att få ta prov från tonsillen än att få munskölj. Detta kanske berodde på rädsla över att barnen trodde att skrapprovet skulle medföra smärta. I vissa fall var det inte lämpligt och svårt att ta prov då barnen hade en svår underliggande sjukdom som gjorde att bedömningen var att inte ta prov överhuvudtaget p.g.a. den etiska aspekten. Vid själva provtagningarna uppkom inga större hinder förutom att många barn hyste rädsla över att göra tonsillskrap. Många av de tillfrågade barnen var tandvårdsrädda och det var ibland svårt att motivera dessa till att genomföra munsköljprov och tonsillskrap. För vissa av proverna gjordes extraktion av DNA på labb redan samma dag för att sedan frysas in medan vissa av proverna förvarades 2-3 dagar i kylskåp. Vi vet inte med 100% säkerhet om det fanns en viss risk att en del av det genetiska materialet förstördes speciellt i de fall där mycket svaga signaler för HPV finns. Därför är det mest optimala att DNA-extraktion av proverna görs vid samma dag men av logistiska skäl är det ibland svårt och där proverna får förvaras ett par dagar innan detta sker. Munsköljproverna förvarades i Listerinlösning medan tonsillskrapen förvarades i en speciell buffertlösning som är gjord för att kunna bibehålla DNA:t intakt under ett par dagar. Kanske är det så att bufferlösningen som tonsillskrapen förvarades i bevarade det genetiska materialet bättre än Listerinet. Dessutom kan det vara så att HPV-viruset ligger djupare ner i epitelet i slemhinnan och att ett munsköljprov inte kan ta med detta virus-material medan ett skrapprov som ändå medför en mer mekanisk borttagning av epitelet i slemhinnan får med sig mer av HPV-materialet och därmed

17 medför att HPV-detektion blir mer tillförlitligt. Vid analys visade det sig att 3/24(12.5%) prover från tonsillskrap var HPV positiva medan 0/24(0%) munsköljprover från samma patienter och totalt 0/37 (0%) av alla munsköljsprover var HPV negativa (p=0.23). Antalet testade individer är mycket få och prevalensen HPV är också låg. Det är därför svårt att göra några säkra slutsatser och skillnaderna är inte statistiskt signifikanta mellan de olika provtagningsmetoderna. Resultaten kan möjligen tala för att prov från tonsillskrap är känsligare än att ta HPV prov med munskölj men detta måste naturligtvis testas genom att analysera flera prover. Preliminära resultat från patienter med tonsillcancer visar på liknande tendens men alla dessa resultat är mycket preliminära (opublicerade). Nyligen publicerades en studie (33) där man undersökte prevalensen av HPV i Milano i Italien hos177 nyfödda barn där 104 var pojkar och 73 var flickor. Provtagningen gjordes med skrapprov i oro-pharynx (provtagningsmetod anges inte). Åldersgruppen var 0-6 månader. HPV- DNA material identifierades i 25 av de 177 nyfödda barnen (14.1%).En möjlig orsak till att just prevalensen av HPV i ovanstående studie (33) var högre än i vår studie kan bero på att barnen kan ha blivit smittade av HPV vid förlossningen (genom mamman) dessutom kan det också bero på att barnen troligtvis ammar och kan bli smittade av HPV den vägen. I en annan studie (34) undersökte man just detta; korrelationen mellan HPV i den orala mukosan hos nyfödda och transmissionen av HPV till det nyfödda barnet via placentan och navelsträngen. I studien som bestod av 329 gravida kvinnor och deras sedan nyfödda barn kom man fram till att en mamma som bär på HPV kan överföra viruset till barnet vid födseln genom placenta eller genom navelsträngsblodet men att denna infektion hos det nyfödda barnet kan försvinna efter ett par månader. Det var dessutom vanligare att se HPV hos äldre än yngre barn, då de barn som hade HPV positiva prover var 12, 16 och 17 år gamla och samtliga barn var pojkar. Sedermera så tillhörde nästan alla HPV-typer från de positiva proven Högriskgruppen i detta fall HPV typ 18, 51, 56 och 82 förrutom 2 av proverna som innehöll HPV-typ 42 som tillhör lågriskgruppen.

18 Intressant är att hos barnen så var alla munsköljprover HPV negativa. Detta är att jämföra med resultat på en ungdomsmottagning i Stockholm där munsköljprover togs från ungdomar som var mellan år och där 10% av ungdomarna hade HPV positiva munsköljprover (opublicerad studie). Sannolikt beror dessa skillnader på att vi på tandläkarhögskolan framförallt behandlar barn som är relativt unga och som inte är sexuellt aktiva. Styrkan med denna studie är att vi har tonsillskrap- prov där även munsköljprov tagits samtidigt. Den allra största svagheten med studien är att det fortfarande ingår väldigt få individer i studien. Detta gör att vi inte har så många individer från olika åldersgrupper och vi saknar fortfarande friska vuxna individer i vår analys. Detta gör att vi således endast kan spekulera kring huruvida skrapprov är mer tillförlitligt än munsköljprov. En annan svaghet med studien var att vi inte har kunnat utföra den longitudinella studien. Vi har inte kunnat få många individer i studien och vi har inte kunnat följa upp dem för att kunna förstå infektionsprocessen hos HPV i munhålan. Kommer den och går, eller försvinner den efter något år som i cervix eller stannar den kvar i flera år? Konklusion Sammanfattningsvis. I dessa studier hos barn finns det en tendens att tonsillskrap kan vara känsligare för att undersöka för närvaro av HPV jämfört med munsköljprov. Studien består dock av få individer och fler prov bör tas för att kunna bekräfta detta fynd. Det kommer att bli enklare att validera prov-data när jämförelser kan göras med fler yngre patienter från Tandläkarhögskolan, patienter med HPV positiva tonsillcancrar från ÖNH kliniken och den nu icke publicerade studien från ungdomsmottagningen. Övriga delar av studien måste också fortsätta men det kommer sannolikt att ta en längre tid upp till flera år. Acknowledgements Vill tacka mina mentorer Tina Dalianis och Göran Dahlöf för deras hjälp med att genomföra studien. Deras forskningserfarenheter och engagemang har betytt mycket för denna studie.

19 Tabell I. Ålders intervall på de deltagande patienterna Åldersintervall Antal Patienter Antal Pojkar/män AntalFlickor/kvinnor > Medelålder: 15 Min ålder: 4 Min ålder: 6 Max ålder: 26 Max ålder: 74

20 Tabell II. Prover som tagits och antalet HPV positiva prover hos 37 barn Antal barn Skrapprov Munsköljprov Positiva Skrapprov Positiva Munsköljprov ; 3/24 (12.5%) 0 %

21 Tabell III. HPV typer hos de tre HPV positiva skrapproverna Prov Typ Positiv HPV-typ Ålder Kön 1 Skrapprov HPV Pojke 2 Skrapprov HPV 42, 51, Pojke 3 Skrapprov HPV42, Pojke

22 Referenser: 1. Essential Cell biology, Bruce Alberts et al. 2 nd ed. 2.(Multiplex HPV genotyping kit for research in epidemiology Version Higging G, Uzelin D, Philips G, Pieterse S and Burell C: Differing Characteristics of human papillomavirus RNA positive and RNA negative anal carcinomas. Cancer 68: , Heino P, Eklund C, Fredriksson-shanazarian V, Goldman S, Scheller J and Dillner J: Association of serum immunoglobulin G antibodies against humant papillomavirus type 16 capsids with anal epidermoid carcinoma. J Natl Cancer Inst 87: , Snijder, PJF, Van den Brule AJC, Meijer CJ and Walboomers JM: Papillomaviruses and cancer of the upper digestive and respiratory tracts. Curr Top Microbial Immunol 186: , Shah K and Howley PM: Papillomaviruses In: Fields BN, Knipe DM, Chanoch RM, Hirsch MS, Melnick JL, Monath TP and Roizman B (eds): Virology 2 nd edition, pp l , Zur Hausen H: Papillomavirus infections-a major cause of human cancers. Biochim Biophys Acta 1288: 9 F55-78, Syrjanen SM and Syrjanen KJ: New concepts on the role of human papillomavirus in cell regulation. Ann Med 31: , Cancer incidence in Sweden 2007, Swedish Cancer Registry, The National Board of Health and Welfare (ed), The Nationalt Board of Health and Welfare, Sweden, Snijders PJF, Cromme FV, van den Brule AJ, Schrijnemakers HF, Snow GB and Walboomers JM: Prevalence and expression of human papillomavirus in tonsillar carcinomas, indicating a possible viral aetiology. Int J Cancer 51: , Snijders PJF, Scholes AGM, Hart A, Jones AS, Vaughan ED, Woolgar JA, Meijer CJLM, Walboomers JMM and Field JK: Prevalence of mucosotropic human papillomaviruses in squamous cell carcinomas of the head and neck. Int J cancer 66: , Mellin H: Friesland S, Lewensohn R, Dalianis T and Munck Wiklund E: Human papillomavirus (HPV) DNA in tonsillar cancer: clinical correlates, risk of relapse, and survival. Int J cancer 89: , Nathanson A, Lewin F, Lind M, Lundgren J and Strander H: Huvudhals och esofaguscancer, onkologisk Centrum stockholms-gotland, Hammarstedt L, Dahlstrand H, Lindquist D, Onelov L, Ryott M, Luo J, Dalianis T, Ye W and Munck-Wikland E: The incidence of tonsillar cancer in Sweden is increasing. Acta Otolaryngol 127: , Syrjanen S: HPV infections and tonsillar carcinoma. J Clin Pathol 57 (5): , 2004.

23 16. Frisch M, Hjalgrim H, Jaeger AB and Biggar RJ: Changing patterns of tonsillar squamous cell carcinoma in the United Sates. Cancer Causes Control 11(6): , Lindquist D, Romanitan M, Hammarstedt L, Nasman A, Dahlstrand H, Lindholm J, Ramqvist T, Ye W, Munck Wikland E and Dalianis T: Human papillomavirus is a prognostic factor in tonsillar cancer and its oncogenic role is supported by the expression of E6 and E7. Molecular Oncol 1: , Paz IB Cook N, Odom-Maryon T, Xie Y and Wlczynski SP: Human papillomavirus (HPV) in head and neck cancer an association of HPV with squamous cell carcinoma of waldeyer s tonsillar ring. Cancer 79: , Mellin H, Dahlgren L, Munck-Wiklund E, Lindholm J, Rabbani H, Kalantari M and Dalianis T: Human papillomavirus type 16 is episomal and a high viral load is correlated to better prognosis in tonsillar cancer. Int J Cancer 102: , Dahlstrand H and Dalianis T: Presence and Influence of human papillomavirus in tonsillar cancer. Adv Cancer Res 93: 59-89, de Roda Husman AM, Walboomers JM, van der Brule AJ, Meijer CJ and Sneijders PJ: The use of general primers GP5 and GP6 elongated at ther 3 ens with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR. J General Virol 76: , Tieben LM, ter Schegget J, Minnaar RP, Bouwes Bavinck JN, Berkhout RJ, Vermeer BJ, Jebbink MF and Smits HL: Detection of cutanous and genital HPV types in clinical samples by PCR using consensus primers. J Virol Methods 42: , Hannah Dahlstrand, Anders Näsman, Mircea Romantan, David Lindquist, Torbjörn Ramqvist and Tina Dalianis: Human papillomavirus accounts both for increased incidence and better prognosis in tonsillar cancer. Anticancer Research 28: (2008). 24. D Souza G, Fakhry C, Sugar EA, Seaberg EC, Weber K, Minkopp HL, Anastos K, Palefsky JM and Gillison ML: six-month natural history of oral versus cervical human papillomvirus infection, Int J Cancer 121 (1): , Hammarstedt L, Lindquist D, Dahlstrand H, Romanitan M, Dahlgren L, Joneberg J, Creson N, Lindholm J, Ye W, Dalianis T and Munck-Wikland E: Human papillomavirus as a risk factor for the increase in incidence of tonsillar cancer. Int J Cancer 119: , Gilison ML, Koch WM, Caoibe RB, Spafford M, Westra WH, Wu L, Zahurak ML, Daniel RW, Viglione M, Symer DE, Shah KV and Sidransky D: Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. J Natl Cancer Inst 92: , Friesland S, Mellin H, Dalianis T, Munck-Wikland E and Lewensohn R: Human papilloma virus (HPV) and p53 immunostaining in advanced tonsillar carcinoma- relation to radiotherapy response and survival. Anticancer Res 21: , 2001.

24 28. Anders Näsman, Per Attner, Lalle Hammarstedt, Juan Du, Mathilds Eriksson, Geraldine Giraud, Sofie Ährlund-Richter, Linda Marklund, Mircea Romanitan, David Lindquist, Torbjörn Ramqvist, Johan Lindholm, Pär Sparrén, Weimin Ye, Hanna Dahlstrand, Eva Munck-Wikland and Tina Dalianis. Incidence of human papillomavirus (HPV) positive tonsillar carcinoma in Stockholm, Sweden: An epidemic of viral-induced carcinoma? Int. J. Cancer: 125, (2009). 29.Hammarstedt L, Lindquist D, Dahlstrand H, Romanitan M, Dahlgren LO, Joneberg J, Creson N, Lindholm J, Ye W, Dalianis T, Munck Wikland E. Human Papillomavirus as a risk factor for the increase in incidence of tonsillar cancer. Int J Cancer 2006;119: Syrjanen S: HPV infections and tonsillar carcinoma. J Clin Pathol 57:449-55, Per Attner, Juan Du, Anders Näsman, Lalle Hammarstedt, Torbjörn Ramqvist, Jphan Lidholm, Linda Marklund, Tina Dalianis and Eva Munck-Wikland: The role of human papillomavirus (HPV) in the increased incidence of base of tongue cancer. Int J of cancer. 32. Karlsen F. KM, Jenkins A, Pettersen E, Kristensen G, Holm R, Johansson B, Hagmar B: Use of multiple PCR Primer Sets for optimal Detection of Human papillomavirus. Journal of clinical Microbiology 34: , Martinelli M, Zappa A, Bianchi S, Frati E, Colzani D, Amendola A, Tanzi E.; Human papillomavirus (HPV) infection and genotype frequency in the oral mucosa of newborns in Milan, Italy. Clin Microbiol Infect Mar 12. doi: /j Koskimaa HM, Waterboer T, Pawlita M, Grénman S, Syrjänen K, Syrjänen S: Human Papillomavirus Genotypes Present in the Oral Mucosa of Newborns and their Concordance with Maternal Cervical Human Papillomavirus Genotypes. J Pediatr May;160(5): Epub 2011 Dec 2.

25 Bilagor 1) Informerat samtycke för vuxna 2) Informerat samtycke för barn 3) Protokoll för DNA extraktion av munsköljsprov genom användning av Centra Puregene Buccal Cell Kit

26 Patientinformation till vuxna Du har tillfrågats om deltagande i projektet Studier på förekomst av olika typer av humant papillomvirus i munhålan hos friska barn, ungdomar och vuxna och patienter med huvudhalscancer. Bakgrund och syfte Humant papillomvirus (HPV) är en grupp av virus som kan finnas i munhålan utan att vi märker det. Vi vill undersöka den naturliga variationen i förekomsten av olika HPV typer hos barn, ungdomar och vuxna samt hos patienter med huvudhalscancer. Undersökningen kommer att ske på tandläkarhögskolan vid Karolinska institutet, Huddinge och Öron Näs Halskliniken vid Karolinska Universitetssjukhuset i Solna. Vanligast är att HPV ger upphov till ofarliga vårtor i underlivet. HPV kan också ge upphov till vårtor i munhålan. I sällsynta fall kan HPV ge upphov till livmoderhalscancer och vissa former av huvudhalscancer. Vårt mål är att se vilka HPV typer man kan hitta i munhålan innan allmän HPV vaccinering införs hos unga och vuxna friska samt hos patienter med huvudhalscancer. Detta kommer ge värdefull information om vilka HPV typer för som vanligen förekommer i munhålan samt ge oss möjlighet framåt i tiden undersöka om införandet av HPV vaccin skyddar mot eller påverkar deras förekomst. Det kommer också att hjälpa oss få information om HPV förekommer i munhålan hos patienter med huvudhalscancer och om virusets förekomst i munhålan är möjligen vanligare hos patienter med t.ex. HPV positiv huvudhalscancer. Undersökning Du får göra ett spottprov och ett skrapprov med bomullspinne i munhålan. Dessa prover är helt smärtfria. Provet görs i samband med tandläkarundersökningen. Proven kommer att användas för forskning och för att undersöka eventuell förekomst och typ av HPV. Proverna analyseras och endast forskningsansvariga kommer att känna till personuppgifterna på proverna. Resultaten publiceras helt anonymt och ingen annan kommer känna till ditt provsvar. Biobanksprover Proverna kommer förvaras kodade i Karolinska Universitetssjukhusets biobank. Kodnyckel krävs för att provet skall hänföras till dig och provet får endast användas till det som du givit ditt samtycke till. Vi planerar inte att använda provet för något annat. Skulle det sparade provet användas för en framtida ännu inte planerad forskning kommer i så fall en helt ny etisk prövning göras och du kommer i så fall att kontaktas igen för samtycke för detta.

27 Fördelar med att delta Studien innebär inte någon omedelbar nytta för dig personligen men kan förhoppningsvis vara till nytta för utveckling av framtida vaccin mot HPV. Om du medverkar eller inte påverkar på inget sätt din vanliga tandläkarundersökning. Hantering av data och sekretess Patientuppgifterna behandlas i enlighet med lagen om personuppgifter 19 PUL 1998:204 och Karolinska Universitetssjukhuset är personuppgiftsansvariga. Du har själv rätt att ta del av uppgifter om dig själv enligt 19 PUL. För personuppgifter råder sekretess enligt sekretesslagen 9 kap 4 vilket ger ett gott säkerhetsskydd. Hur får jag information om studiens resultat Om du önskar kan du få information om studien. Försäkring, ersättning Patientskadeförsäkring gäller. Frivillighet Det är helt frivilligt för dig att delta i denna studie. Alla undersökningsresultat och provresultat kommer att kodas och ingen kommer kunna identifieras i den vetenskapliga rapporten. Provtagningen kommer att ske i samband med din undersökning på Tandläkarhögskolan, Huddinge.

28 Deltagande i studien I samband med din undersökning/behandling på Tandläkarhögskolans vuxenavdelning frågar vi dig om du vill vara med i studien. Ansvariga Ansvariga för studien är Karolinska Institutet: Ann Roosaar, lektor Institutionen för Odontologi, Avd 3. Karolinska Institutet Postadress: Box Huddinge Tel Ann.Roosaar@ki.se Göran Dahlöf, professor Inst för Odontologi, Avd. 6, Karolinska Institutet Postadress: Box Huddinge Tel Goran.Dahllof@ki.se Besöksadress: Alfred Nobels Allé 8, Huddinge. Tel: , vx , dir Fax: Tina Dalianis, professor, Inst. för Onkologi-Patologi, Karolinska Institutet. Karolinska Universitetssjukhuset, R8: Stockholm Tel: Tina.Dalianis@ki.se

29 INFORMERAT SAMTYCKE för patient Undertecknad har tagit del av den skriftliga informationen och har fått tillfälle att ställa frågor, fått dem besvarade och godkänner till att delta i studien Studier på förekomst av olika typer av humant papillomvirus i munhålan hos friska barn, ungdomar och vuxna. Datum: Underskrift: Personnummer: Upprättas i två original varav patienten behåller det ena och det andra arkiveras av ansvarig prövare.

30 Patientinformation till föräldrar Ditt barn har tillfrågats om deltagande i projektet Studier på förekomst av olika typer av humant papillomvirus i munhålan hos friska barn, ungdomar och vuxna. Bakgrund och syfte Humant papillomvirus (HPV) är en grupp av virus som kan finnas i munhålan utan att vi märker det. Vi vill undersöka den naturliga variationen i förekomsten av olika HPV typer hos barn, ungdomar och vuxna. Undersökningen kommer att ske på tandläkarhögskolan vid Karolinska institutet, Huddinge. Vanligast är att HPV ger upphov till ofarliga vårtor i underlivet. HPV kan också ge upphov till vårtor i munhålan och vårt mål är att se vilka HPV typer man kan hitta i munhålan innan allmän HPV vaccinering införs och dessutom följa vilka HPV typer som förekommer 5-10 år framåt i tiden för att undersöka om införandet av HPV vaccin påverkar deras förekomst. Undersökning Ditt barn får göra ett spottprov och ett skrapprov med bomullspinne i munhålan. Dessa prover är helt smärtfria. Provet görs i samband med den årliga tandläkarundersökningen. Proven kommer att användas för forskning och för att undersöka eventuell förekomst och typ av HPV. Proverna analyseras och endast forskningsansvariga kommer att känna till personuppgifterna på proverna. Resultaten publiceras helt anonymt och ingen annan kommer känna till ditt barns provsvar. Biobanksprover Proverna kommer förvaras kodade i Tandläkarhögskolans/Karolinska Universtitetssjukhusets biobank. Kodnyckel krävs för att provet skall hänföras till dig och provet får endast användas till det som du givit ditt samtycke till. Vi planerar inte att använda provet för något annat. Skulle det sparade provet användas för en framtida ännu inte planerad forskning kommer i så fall en helt ny etisk prövning göras och du kommer i så fall att kontaktas igen för samtycke för detta. Fördelar med att delta Studien innebär inte någon omedelbar nytta för ditt barn personligen men kan förhoppningsvis vara till nytta för utveckling av framtida vaccin mot HPV. Om du medverkar eller inte påverkar på inget sätt ditt barns vanliga tandläkarundersökning.

31 Hantering av data och sekretess Patientuppgifterna behandlas i enlighet med lagen om personuppgifter 19 PUL 1998:204 och Karolinska Universitetssjukhuset är personuppgiftsansvariga. Du har själv rätt att ta del av uppgifter om ditt barn enligt 19 PUL. För personuppgifter råder sekretess enligt sekretesslagen 9 kap 4 vilket ger ett gott säkerhetsskydd. Hur får jag information om studiens resultat Om du önskar kan du få information om studien. Försäkring, ersättning Patientskadeförsäkring gäller. Frivillighet Det är helt frivilligt för ditt barn att delta i denna studie. Alla undersökningsresultat och provresultat kommer att kodas och ingen kommer kunna identifieras i den vetenskapliga rapporten. Undersökningen kommer att vara kostnadsfri och för barn äger den rum på avdelningen för pedodonti, Alfred Nobels Allé 8 Huddinge (tandläkarhögskolan).

32 Deltagande i studien När du kommer för den årliga undersökningen av ditt barn kommer vi att fråga om du vill delta eller inte. Ansvariga Ansvariga för studien är Karolinska Institutet: Ann Roosaar, lektor Institutionen för Odontologi, Avd 3. Karolinska Institutet Postadress: Box Huddinge Tel Ann.Roosaar@ki.se Göran Dahlöf, professor Inst för Odontologi, Avd. 6, Karolinska Institutet Postadress: Box Huddinge Tel Goran.Dahllof@ki.se Besöksadress: Alfred Nobels Allé 8, Huddinge. Tel: , vx , dir Fax: Tina Dalianis, professor, Inst. för Onkologi-Patologi, Karolinska Institutet. Karolinska Universitetssjukhuset, R8: Stockholm Tel: Tina.Dalianis@ki.se

33 INFORMERAT SAMTYCKE för patient/målsman Undertecknad har tagit del av den skriftliga informationen och har fått tillfälle att ställa frågor, fått dem besvarade och godkänner till att delta i studien Studier på förekomst av olika typer av humant papillomvirus i munhålan hos friska barn, ungdomar och vuxna. Datum: Underskrift: Personnummer: Upprättas i två original varav patienten/målsman behåller det ena och det andra arkiveras av ansvarig prövare.

34 Protokoll Samla 14 ml av munsköljsprovet som ligger i listerine i ett 15 ml provrör 1. Centrifugera i 10 min i 3000 x g (5315 rpm) och i I och med centrifugering har det vi vill analysera från själva munprovet (d.v.s. celler osv.) hamnat i botten. Den överliggande vätskan i form av listerine häller man ut. Därefter löser man det som ligger i botten med Fosfat Buffert Sialine (PBS) och rör om provet förhand. 3. Centrifugera i 10 min i 3000 x g (5315) i Efter centrifugering ses en massa i botten. Den vill vi ha kvar. Häll ut den överliggande vätskan. Lös massan i botten med 3 ml PBS och genom att röra om med pipetten och vortexa (en slags vibrerande maskin) löser sig massan i PBS. 5. Dela upp den blandade lösningen till 2 provrör á 1,5 ml i vardera provrör. Ena provröret ska vi använda vidare. Det andra används för att kunna gå tillbaka om det visar sig att kontaminering har skett under arbetets gång. 6. Förvärm vattenbad till 65 för steg 21. Gentra Puregene Buccal Cell kit : 1. Tag det preparerade 1,5 ml provet och centrifugera i 10 min i 4000 x g (6600 rpm) 2. Avlägsna försiktigt överskottsvätskan genom att pipettera eller hälla ut. Man lämnar pelleten i botten intakt. 3. Tillsätt 1 ml Cell Lysis Solution och blanda genom att vänta provet upp och ner 50 gånger. 4. Inkubera i 15 min i rumstemperatur. 5. Tillsätt 10 μl Puregene Proteinase K och blanda genom att vänta upp o ner 3 gånger. 6. Vortexa i hög fart i 20 sekunder för att blanda.nkubera i 10 i rumstemperatur. 7. Om RNA-fritt DNA krävs så tillsätt 1,5 μl Rnase och vänd upp o ner på rört 25 ggr. Inkubera i 15 minuter i 37. Lägg provet i is. 8. Tillsätt 340 μl protein precipitation solution och vortexa i 20 sekunder i hög hastighet. 9. Inkubera i 10 min på is. Detta är viktigt för att upprätthålla en fast pellet i nästa steg. 10. Centrifugera i 10 min i 2000 x g (4600 rpm). Proteinerna som tillsattes i steg 9 bör ha bildat en fast grön pellet. Om inte bör inkubering ske på is i 5 min och centrifugering bör göras igen. 11. Tillsätt 1 ml isopropanolol och 2,5 μl Glycogen Solution till ett rent 15 ml provrör. 12. Häll supernatatenten innehållandes DNA (precipitated protein pellet lämnas kvar)